一种海藻共生菌及其制备间苯三酚的方法与流程

文档序号:18684815发布日期:2019-09-13 23:47阅读:491来源:国知局

本发明涉及一种能产生间苯三酚的海藻共生菌,并生产间苯三酚的方法。



背景技术:

间苯三酚又称均苯三酚或1,3,5-苯三酚,别名斯帕丰(Spasfon),俗称根皮苷酚,英文名称为phloroglucinol、m-trihydroxybenzene、Phloroglucinol dihydrate,简称为phl。间苯三酚及其衍生物在自然界中分布广泛,主要分布在植物和海洋植物中,是一种重要的医药中间体,具有良好的抗病毒、抗肿瘤、抗菌、消炎、止血及子宫收缩等药理活性。

目前已用于工业化大生产的均苯三酚的合成方法主要有4种:①三硝基甲苯法,最早由M.L.Kasrens等人开发出来,以2,4,6-三硝基甲苯(TNT)为原料,进行工业化生产间苯三酚。此法的优点是原料便宜、生产工艺成熟,存在的缺点是后处理较难、污染环境且原料存在安全隐患。②异丙苯法,简称TIP法,是由日本的Chiyoda开发出来的以1,3,5-三异丙基苯(TIP)为原料的工艺合成路线,此方法有点在于污染小,成本低。尽管此法经过后期不断改进和工艺优化,但是因为原料获得困难的问题,限制了该方法的推广应用。③苯胺法,以苯胺为原料,先合成三溴苯酚,再生成间苯三酚,或者直接以三溴苯酚为原料合成,该法收率高,成本低,原料来源广泛,价格相对较低,是合成间苯三酚的一种新型方法。缺点是路线长,影响因素较多,生产稳定性不够,并且溴水对设备有一定的腐蚀。④六氯苯法,1981年美国专利报道以六氯苯为原料合成间苯三酚。该方法反应条件温和,副产物少,成本较低,是合成间苯三酚的一种十分有效的方法。此路线的主要问题是酸分解,收率较低且废酸的处理困难,同时原料六氯苯毒性较大也是需解决的问题之一。目前,我国对间苯三酚的合成研究较少,大部分集中在化学有机合成。例如中国发明专利申请02137588.7,公开了一种合成均苯三酚的方法,其采用络合剂无水三氯化铝与1,3,5-三甲氧基苯进行络合反应,然后在浓盐酸中进行水解反应,水解液经冷却结晶得均苯三酚粗品。中国发明专利申请03128817.0公开以1,3,5-三甲基苯为原料,先在烃类有机溶剂中与路易斯酸反应形成中间体,然后经无机酸酸性水解、分层、水层结晶、再度结晶而制备均苯三酚的方法。这些化学合成方法虽然成本低,但是产物复杂,环境污染严重。

由于化学法存在各种弊端,生物合成法成为制备间苯三酚的潜在手段和研究热点。采用生物法具有原料来源丰富,安全环保,成本低等优点。

生物法合成间苯三酚的研究主要是基于发现phlD基因是控制产生间苯三酚的关键基因,因此,目前的很多研究通过将phlD基因转化到大肠杆菌体内进行异源表达,并利用大肠杆菌细胞内的生物酶体系和原料来合成间苯三酚。

2005年,Jihane Achkar等发现仅将phlD基因转入大肠杆菌JWF1(DE3)中异源表达,就能够产生间苯三酚,并且产量达到780mg/L。2009年,Gao等采用pET28载体克隆了荧光假单胞杆菌2P24菌株中的phlD基因。在震荡培养条件下经过36~48h,可检测到的间苯三酚的最高产量为166mg/L。2008年,Zha等对phlD酶进行分子定向进化来提高其催化活性,从而提高间苯三酚产量。他们筛选到的两个突变株的间苯三酚产量比野生菌株分别提高了4.2倍和5.7倍。为了进一步提高间苯三酚的产量,2009年,Zha等把磷酸转乙酰基酶-乙酸激酶A和乙醇脱氢酶同时敲除,同时阻断了乙酸途径和乙醇途径,检测到间苯三酚的产量达到原来 的3.7倍,产量达1280mg/L。与Achkar等的研究相比,间苯三酚的产量随着培养时间的增长而增加。2011年,Cao等将marA基因和大肠杆菌中的ACCase基因共表达,在间歇发酵培养条件下,目的菌株的间苯三酚积累量可高达3.8g/L。在Cao的另外一篇论文中发现,使用源自fic基因的稳定期启动子及高拷贝质粒在大肠杆菌中表达phlD,在摇瓶条件下此工程菌株的间苯三酚产量可以达到0.28g/L,消耗的葡萄糖中有9.2%转化成了间苯三酚。对phlD基因进行定点突变也可以提高间苯三酚的产量。2010年,咸漠等在其专利中定点突变phlD基因为phlD1基因,使间苯三酚的产量达到8g/L。2013年,Guo等对phlD基因进行定向改造,提高了其热稳定性,使间苯三酚的产量达到3.65g/L。

此外,中国发明专利申请CN 101724662 A公开了一种利用工程大肠杆菌细胞生产间苯三酚的方法,其利用HNO2和LiCl复合诱变筛选抗间苯三酚突变菌株,以荧光假单胞菌pf-5基因组DNA为模板,PCR扩增获得phlD基因,酶切后连接到pET载体上,转化到抗间苯三酚大肠杆菌突变菌株中,IPTG诱导目的蛋白表达,即可获得间苯三酚。CN 101724662 A中克隆间苯三酚合成关键基因phlD,直接将phlD转入大肠杆菌进行基因改造,产物间苯三酚产量低,菌株对间苯三酚耐受性差,菌株遗传稳定性差,培养基成本高,工业化可能性低,且此方法生产的间苯三酚是完全转基因产物,具有一定的安全风险。



技术实现要素:

本发明涉及生物法筛选能产生间苯三酚的海藻共生菌,并对其进行生物驯化以及基因改造,使其生产间苯三酚的产量大大提高。

本发明所采用的间苯三酚的生物合成法是筛选一种自身具有产生间苯三酚能力的海洋野生菌株,并对其进行驯化和抗性基因改造,达到安全、环保、低能耗、高品质生产间苯三酚的目的。此种方法生产间苯三酚可以避免化学法生产中对环境的高污染和产物复杂品质差的缺点,也可以避免完全转基因生产间苯三酚的安全隐患,并且海洋来源的海藻共生菌可以利用资源丰富的海藻作为培养基,大大降低了生产成本。

本发明的海藻共生菌已由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏,保藏编号为11722,分类名称:假单胞菌Pseudomonas sp.,保藏日期:2015年11月22日,保藏地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

所述海藻共生菌通过筛选、基因改造等步骤制备得到,具体如下:

1.产间苯三酚的海藻共生菌的筛选

在固体培养基中加入不同浓度的间苯三酚,挑选对间苯三酚耐受性好、生命力强的海藻共生菌株。

将挑选出的间苯三酚耐受海藻共生菌,接种到液体培养基中,将培养液用乙酸乙酯萃取,检测有无间苯三酚的产生,从而挑选出产间苯三酚的菌株。

2.制备海藻共生菌感受态

将挑选出的海藻共生菌落接种于培养基中,培养过夜;将过夜培养物接种于新鲜的培养基中,将培养物进行第二次传代,接种于感受态培养基(含基本营养物质及一定浓度的CaCl2)中,得到的培养物即为海藻共生菌感受态细胞。

3.海藻共生菌的基因改造

提取大肠杆菌DH5α基因组,PCR扩增获得多重抗药基因(marA),连接到双基因表达载体pET28a的多克隆位点中,获得PET28a-marA重组表达质粒。将重组质粒转化到筛选出的海藻共生菌中,使用卡那霉素抗性的海带固体培养基平板进行抗性筛选,经PCR、测序鉴定获得具备高效合成间苯三酚的菌株。IPTG诱导marA目的蛋白表达,大大提高海藻共生菌的间苯三酚耐受性,从而提高间苯三酚产量。

表达载体可以是pET28b(+)、pET28c(+)、pET30a(+)、pET30b(+)、pET30c(+)、pET32a(+)、pET32b(+)、pET32c(+)等pET系统载体,也可以是pQE2、pQE9等pQE系统或者其他系统的原核表达载体。

4.海藻共生菌发酵制备间苯三酚

使用海带粉末配制海带培养基,灭菌冷却后进行无菌接种。通过全自动发酵罐控制温度、转速及pH值。

5.间苯三酚的提取

收集发酵液浓缩制得间苯三酚,最终产量可达10g/L,纯度可达70%。

所述培养基可以使海带培养基、羊栖菜培养基、紫菜培养基、铜藻培养基等褐藻或红藻。

术语解释如下:

phlD基因:控制产生间苯三酚的关键基因

marA基因:多重抗药基因

ACCase基因:乙酰辅酶A羧化酶

pET:pET系统是大肠杆菌中克隆表达重组蛋白的原核表达系统,包括pET28b(+)、pET28c(+)、pET30a(+)、pET30b(+)、pET30c(+)、pET32a(+)、pET32b(+)、pET32c(+)等。

DH5α:大肠杆菌的一种,是一种诱变菌株,主要表现对外源DNA的免疫缺乏。是用于基因工程的菌种,相比于正常菌种缺少了一定的免疫机制。

本发明从海洋中筛选到一株可以生产间苯三酚的天然海藻共生菌,对其进行驯化和抗性基因改造后其产品品质与现有的大肠杆菌转基因工程菌产品相比更加安全天然,杂质更少。本发明采用在野生菌中转入marA抗性基因,使野生菌抗抗生素类的不利环境的能力大大提升,提高产品的产量,降低产品成本。本发明中使用海带培养基代替传统的发酵培养基,提高生产效率降低生产成本。相对与化学合成,本发明方法降低了成本,提高了收率,改善了产品质量,反应条件温和,安全程度高,适合于工业化生产。

具体实施方式

1.产间苯三酚的海藻共生菌的筛选

在固体培养基中加入不同浓度的间苯三酚,制备成间苯三酚梯度抗性筛选培养基,将从不同海藻中分离的细菌接种于间苯三酚筛选平板上,30℃培养48h。挑选对间苯三酚耐受性好、生命力强的海藻共生菌株。

将挑选出的间苯三酚耐受海藻共生菌,接种到液体培养基中30℃,160rpm,培养48h。将培养液用乙酸乙酯萃取,旋转蒸发浓缩后,采用TLC和HPLC检测有无间苯三酚的产生,从而挑选出产间苯三酚的菌株。

固体培养基配方包括如下成分:蛋白胨、酵母粉、NaCl、葡萄糖、琼脂、间苯三酚;

液体培养基配方包括如下成分:蛋白胨、酵母粉、NaCl、葡萄糖、间苯三酚。

2.制备海藻共生菌感受态

将挑选出的海藻共生菌落接种于海带培养基(海带粉、葡萄糖、NaCl)中,30℃130-150r/min振荡培养过夜;将过夜培养物按10%接种量接种于25mL新鲜的海带培养基中,30℃200-230r/min振荡培养3.5h;再将培养物以10%进行第二次传代,接种于5mL感受态培养基(含基本营养物质及一定浓度的 CaCl2)中,37℃200-230r/min振荡培养90min;取1mL培养物,5000r/min 4℃离心5min,用1/10体积0.1mM CaCl2重新悬浮细菌沉淀,即为海藻共生菌感受态细胞。

3.海藻共生菌的基因改造

提取大肠杆菌DH5α基因组,PCR扩增获得多重抗药基因(marA),连接到双基因表达载体pET28a的多克隆位点中,获得PET28a-marA重组表达质粒。将重组质粒转化到筛选出的海藻共生菌中,使用卡那霉素抗性的海带固体培养基平板进行抗性筛选,经PCR、测序鉴定获得具备高效合成间苯三酚的菌株。IPTG诱导marA目的蛋白表达,大大提高海藻共生菌的间苯三酚耐受性,从而提高间苯三酚产量。

4.海藻共生菌发酵制备间苯三酚

使用海带粉末配制海带培养基(海带粉、葡萄糖、NaCl、蛋白胨,NaOH调pH值8.0),灭菌冷却后进行无菌接种。通过全自动发酵罐控制温度、转速及pH值。

5.间苯三酚的提取

离心、收集发酵液上清,乙酸乙酯萃取(发酵液:乙酸乙酯=1:2)三次,旋转蒸发(温度40℃)浓缩制得间苯三酚,最终产量可达10g/L。纯度达到70%。

本发明采用天然生产间苯三酚的海藻共生菌,进行抗性改造和菌株驯化,得到的菌株间苯三酚产量高,产品单一,菌株对间苯三酚耐受性高,遗传稳定(具有选择压力),适于工业化生产。

尽管发明人已经对本发明的技术方案做了较为详细的阐述和列举,应当理解,对于本领域一个熟练技术人员来说,对上述实施例作出的修改和/或变通或者采用等同的替代方案是显然的,并未脱离本发明精神的实质。

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