本发明涉及核酸序列分析领域。具体地，本发明涉及与下一代测序(NGS)有关的方法和工具。DNA测序是解码一些人类疾病，包括参与癌症发展的不同类型的基因的有力方法。
下一代测序(NGS)技术的出现将测序成本降低了数个数量级并显著提高了通量，从而使全基因组测序成为获得采取临床操作的患者相关的全基因组信息的可能方法。DNA测序可以用于确定个别基因、较大基因区域(即基因或操纵子簇)、完整染色体或整个基因组的序列。根据所使用的方法，测序可以提供DNA中或分离自动物、植物、细菌等的细胞或事实上任何其它遗传信息来源的核苷酸的顺序。分子生物学或遗传学的研究人员可以使用所得序列并用于进一步科学进步，或者医务人员可以使用所得序列以做出治疗决策或辅助遗传咨询。在个性化医学或伴随诊断应用的背景中经常引用后两种用途。
不考虑NGS技术所提供的益处，在它们可以从研究工具转化为常规临床实践前，必须充分解决一些问题。用于诊断目的的NGS技术应需要尽量少的手动步骤，包括防止来源于在给定时间点进行分析的临床样品以外的其它来源的核酸材料的污染的充分机制，并且所述方法应快速并且应易于临床实验室中的工作人员进行。
已开发了不同的NGS技术，其涉及导致在各个核酸序列分析中使用的不同方法的物理化学机制。这些技术通常是技术领域中已知的。最广泛应用的技术是离子半导体(Ion Torrent)测序、焦磷酸测序和合成序列(Illumina)。
定义
通过一般地描述本发明所述的方法，将更详细地描述该方法的每个方面。
如本文所使用的，将正在测序的核酸称为靶标核酸(或靶标)。靶标核酸包括但不限于DNA，如但不限于基因组DNA、线粒体DNA、cDNA等，和RNA，如但不限于mRNA、miRNA等。靶标核酸可以来源于任何来源，包括天然存在的来源或合成来源。所述核酸可以是PCR产物、粘粒、质粒、天然存在或合成的文库成员或种类等。本发明不意欲限制于该方面。所述核酸可以来自动物或病原体来源，其包括但不限于哺乳动物，如人，和微生物，如细菌、病毒、真菌、寄生虫和分枝杆菌属。在一些实施方式中，所述核酸不是病毒核酸。靶标核酸可以得自任何体液或组织，其包括但不限于血液、唾液、脑脊髓液(“CSF”)、皮肤、毛发、尿液、大便和粘液。靶标核酸还可以来源于但不限于环境样品(如水样)、食品样品、森林样品，所述样品可以是新鲜样品(例如，直接进行核酸提取的活组织检查材料)，或已处理能够储存的样品，例如，福尔马林-固定和/或石蜡包埋的样品(FFPE样品)。
使用本领域中已知的任何方式制备靶标核酸。举例来说，可以根据本领域中已知的技术从样品收获基因组DNA(参见，例如，Sambrook等人，“Maniatis”)。收获后，可以使DNA断裂以获得较小长度的核酸。所得片段的长度可以为约数百、数千或数万个核苷酸。在一些实施方式中，所述片段为50-1000个核苷酸长度、100-1000个核苷酸长度、200-1000个碱基对长度或300-800个碱基对长度，尽管它们不限于此。可以通过任何方式使核酸片段化，其包括(但不限于)机械、酶促或化学方法。实例包括剪切、超声、雾化和核酸内切酶(例如，DNA酶I)消化，或本领域中已知产生核酸片段(优选地，具有所需长度)的任何其它技术。在片段化后，可以是用于富集或分离特定长度的片段的大小选择技术。这些技术也是本领域中已知的并且包括但不限于凝胶电泳或SPRI。
可选地，可以使用已具有所需长度的靶标核酸。这些靶标核酸包括来源于外显子富集方法的那些。参见Albert等人Nat Meth 4(l l):903-905(2007),Porreca等人,Nat Meth 4(11):931-936(2007),Okou等人,Nat Meth 4(11):907-909(2007)对于测序前分离和/或富集序列(如外显子)的方法，因此，所述靶标可以是天然存在的核酸或者可以较短、可用的长度分离，如mRNA、cDNA、外显子、PCR产物(如上所述)等，而不是使较长的靶标核酸片段化(随机或非随机)。
一般地，将靶标核酸在5'和3'端之一或两者处连接到序列。这些衔接头序列包括在本发明所述的测序方法中使用的测序引物位点(即，测序引物将杂交到的位点)。
在一些实施方式中，如以下所讨论的，将进行扩增的靶标具有相同或类似长度(例如，靶标间5-10％的变化)。在一些实施方式中，可以保持尽可能小的这种变化，以确保均匀使用所有模板。
可以通过多种方式将扩增产物固定在支持物表面(例如，玻璃表面)上。例如，可以在溶液中进行扩增过程，然后将最终产物连接到支持物表面。可以将扩增产物在其5'端或其3'端连接到固体支持物。连接可以通过与固定在支持物表面上的核酸的杂交或者它可以通过扩增产物末端上的部分与支持物表面上的部分之间的相互作用。实例包括使用生物素或双重生物素标记的DNA(Margulies等人,Nature437:376(2005))与链霉亲和素/亲和素/中性抗生物素蛋白包被的支持物表面、DIG(洋地黄毒苷)和抗DIG抗体或抗体片段、荧光素和抗荧光素抗体或抗体片段(Gore等人,Nature 442,836-9(2006))，或通过使用杂官能化的交联剂，如生物素化的琥珀酰亚胺基丙酸酯-PEG，其可以偶联(例如)至胺-官能化的玻璃并通过链霉亲和素夹心(即核酸生物素-链霉亲和素/亲和素/中性抗生物素蛋白-生物素固体支持物相互作用)用于固定生物素-标记的DNA。
模板可以是指随机固定至表面上。这表示基于序列，模板未放置到固体支持物表面上。然而，以在聚合酶-介导的掺入反应期间和/或在模板延伸期间确保每个模板被未被另一模板占据的区域(并因此，体积)所围绕的方式将它们置于固体支持物上。也就是说，在一些情况下，将模板以彼此之间足够的距离布置在表面上以防止模板之间的任何相互作用。
固体支持物是指模板所结合或固定的部件，其可以由任何材料组成，所述材料包括但不限于玻璃或其它二氧化硅基材料、塑料或其它聚合物基材料，然而前提是所述材料对测序反应和清洗中使用的模板、引物、聚合酶、dNTP和其它成分是相对惰性的。固体支持物可以或可以不是刚性的。它可以是多孔的。它可以或可以不是连续的。在一些实施方式中，固体支持物是玻璃载玻片。在一些实施方式中，所述支持物是本身固定在固体支持物上的多个珠或颗粒(如微粒)。这些珠可以是多孔的。所述支持物可以是筛网。在一些实施方式中，所述固体支持物本身是检测器或传感器，如但不限于接触成像仪。
应理解可以将多个模板(无论是否相同)连接至固体支持物，前提是所述多个模板的每个部件与其它部件之间的间隔足够远，从而在模板之间不会发生重叠。
通常，模板必须连接到其游离端上的可观察(或可检测)部分。该部分旨在表示模板的游离端，并因此其位置和在作用力方向上的移动表明了模板的长度。所述可观察部分可以是任何数目的部分，并且本发明不受限于其性质。可观察部分的性质将决定适于观察(或检测或监控)模板长度变化的传感器或检测器的类型。在一些重要的实施方式中，所述可观察部分为珠，如微珠，并且更具体地，如磁珠。
所述部分可以通过多种方法并且使用多种相互作用连接到模板，其包括但不限于非共价相互作用，如生物素/链霉亲和素、DIG/抗-DIG抗体和荧光素/抗荧光素抗体结合对，以及共价相互作用，如本文中对于模板(或引物)与支持物表面共价固定化所讨论的那些。
所述固体支持物是流通池的一部分或邻近于流通池。如本文所使用的，流通池是具有至少入口和出口的室，其中液体通过入口和出口移动。根据用于观察模板的检测系统的位置，模板所栓系到的固体支持物可以在流通池的下方、上方或旁边。所述固体支持物可以是流通池的壁，包括下壁、侧壁或上壁。
如将理解的，模板准确且快速的测序取决于未引入的核苷酸从系统移除的程度和速率。因此，未引入的核苷酸的快速且完全(或接近完全)的移除是重要的。还必须设计微流体系统以使清洗最大化，从而可能导致较小的清洗体积和清洗时间。
还可以通过腺苷三磷酸双磷酸酶的使用部分或完全促进未掺入的核苷酸的清除，所述腺苷三磷酸双磷酸酶将未引入的dNTP降解并使它们不适于进一步掺入。一旦任何给定核苷酸三磷酸盐类型的掺入停止(如通过模板末端可检测部分的任何上述背景移动的停止所指示的)，则腺苷三磷酸双磷酸酶可以自由流动，加入到清洗缓冲液中并引入到流通池中。可选地或者额外地，腺苷三磷酸双磷酸酶可以固定或固定化到流通池内，如(例如)，固体支持物表面(模板也固定或固定化到该表面)。这可以通过接头的使用进行，以使所述酶更可接近并去除与表面密切邻近有关的任何空间位阻。腺苷三磷酸双磷酸酶可以连接到长度不同的多个接头。以这种方式，腺苷三磷酸双磷酸酶可以存在于流通池内的多种液流中，包括与壁更接近的那些和与中央更接近或位于中央的那些液流。如以上所讨论的，接近壁的液流以低速移动，并且这些液流中存在的未掺入的dNTP不易清除。这些液流中具有腺苷三磷酸双磷酸酶应改善这些dNTP的去除。这将增加以下可能性：模板长度的变化是新引入到流通池的dNTP的掺入的结果，而不是清洗后流通池中保留的残余和未掺入的dNTP的结果。
在本发明的一些方面中，所述测序方法被称为通过合成反应的测序。这表示确定第一核酸的序列需要使用第一核酸作为模板的第二核酸的合成。以这种方式，根据掺入的dNTP的顺序和数目确定第二核酸的序列，并且将第一核酸的序列确定为第一核酸序列的互补物。本发明所述的方法通过模板长度的变化并且不是通过直接观察dNTP向正在合成的核酸中的添加来检测dNTP的掺入。因此，dNTP可以是天然的dNTP(即，缺少任何修饰(包括任何外源可检测标记物，如荧光团)的dNTP)。如根据本发明公开应清楚的，本发明的测序方法还需要模板保持完整。本发明的一些方面包括描述为在不存在荧光的情况下发生或以非荧光方式发生的测序方法。这些表征意指可以在不检测荧光(特别是在不检测来自每个掺入的dNTP的荧光)的情况下进行所述方法。因此，这些方法的实施方式可以使用未通过添加外源荧光团修饰的天然dNTP。然而，这些表征不排除以下可能性：缀合至模板游离端的可观察部分本身是发荧光的。在该后一种情况下，可以通过可观察部分的荧光而不是来自个别掺入的dNTP的任何荧光来使模板长度变化可视化。
类似地，还将理解本文所提供的测序方法能够通过检测可观察部分本身来检测核苷酸掺入(例如，如通过CMOS接触成像仪所可能的)。因此，在一些实施方式中，直接检测可观察部分，并且无需酶-介导的事件。酶促检测核苷酸掺入的实例是偶联释放的无机焦磷酸的硫酸化酶和荧光素酶介导的检测的焦磷酸测序。(参见Leamon and Rothberg,Chemical Reviews,"Cramming More Sequencing Reactions onto Microreactor Chips",2006)。因此，本发明的方面被认为是非酶促法(或者作为非酶促检测核苷酸掺入)，这是因为可以在不存在酶产生的信号的情况下检测核苷酸掺入。
在多个实施方式中，特别感兴趣的分析物是氢离子，并且具体地配置了根据本发明公开的大规模ISFET阵列来测量pH。在其它实施方式中，正在监控的化学反应可以涉及DNA合成过程，或者其它化学和/或生物过程，并且可以具体地配置chemFET阵列以测量pH或提供与目的具体化学过程有关的相关信息的一个或多个其它分析物。在各个方面，使用常规CMOS处理技术制造chemFET阵列，并且具体地配置chemFET阵列以有利于从整个阵列快速采集数据(扫描所有像素以获得相应的像素输出信号)。优选的测序系统是Ion PGM系统，然而，还考虑了其它基于质子检测的测序系统。例如，焦磷酸测序系统和Illumina通过合成测序是选项。相对于分析物的检测和测量，应理解在以下更详细地讨论的多个实施方式中，通过根据本发明公开的chemFET阵列测量的一个或多个分析物可以包括提供一个或多个目的化学过程(例如，多个核酸链的结合，抗体与抗原的结合等)的相关信息的任何各种化学物质。在一些方面，除了仅检测分析物的存在之外，测量一种或多种分析物的水平或浓度的能力还提供了与化学过程有关的有价值的信息。在其它方面，仅检测一种或多种目的分析物的存在可以提供有价值的信息。本发明最优选的测序方法包括Ion Torrent's PGM系统的使用。
在另一个方面，本发明提供了用于测序核酸的方法，其包括将模板核酸片段化以产生多个片段化核酸，将来自多个片段化核酸的每一个的一条链单独连接至珠以产生分别具有连接其上的单链片段化核酸的多个珠，将具有连接其上的单链片段化核酸的多个珠递送到对该区域中每个传感器具有单独的反应室的chemFET阵列，并且其中仅一个珠位于每个反应室中，并且在多个室中同时进行测序反应。
本发明考虑在相同流通池内或在相同固体支持物上同时进行多个不同的测序反应。每个测序反应获得了固定在固体支持物上的一个模板的相关信息。单次运行中可以测序的模板数目将取决于模板的预期长度以及固体支持物的面积。因此，根据实施方式，可以将至少100、至少200、至少300、至少400、至少500、至少600、至少700、至少800、至少900或至少1000个模板固定在固体支持物上并因此同时测序。在其它实施方式中，可以同时测序100-500、100-750、100-1000、500-1000、600-1000、700-1000、800-1000、900-1000、1000-2000、2000-3000、3000-4000、4000-5000、5000-10000个或更多个模板。表1显示可以将固体支持物配置成具有每2.8μm珠具有1.6个像素。
通过将dNTP引入到杂交至模板的新合成的核酸链来进行测序反应。新合成的链可以衍生自结合至模板的引物或衍生自可以进行聚合酶-介导的延伸的其它分子。
在一个非限制性实例中，可以通过在允许杂交的情况下将模板与引物接触，并将模板/引物的杂交物与聚合酶接触来开始测序反应。这种接触可以在固定化至固体支持物之前、期间和/或之后发生。在一个重要的实施方式中，在固定化至固体支持物之后发生。
一旦将引物和聚合酶固定到模板，则将试剂的重复循环流入并通过流通池。当试剂流含有与直接在引物3'端的下游的模板上的核苷酸互补的核苷酸时，聚合酶将掺入dNTP。如果模板上邻接的下游位置未被相同的核苷酸(本文中称为均聚物)占据，则聚合酶将掺入相同数目的互补dNTP。当流中的dNTP与模板上下一个可用的核苷酸不互补时，这种掺入将停止。流动的dNTP的量和这种流动的时间将分别超过模板上互补碱基的数目和掺入所有可能的dNTP所需的时间。
重要地，互补dNTP的掺入在超过一种结合引物上发生。更优选地，掺入在至少10％、至少25％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或在全部结合的引物上发生。引物的百分比可以取决于模板中靶标拷贝的数目。对于一些实施方式，每个单个模板中，掺入在至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100个或更多个引物上发生。将理解本发明考虑在给定模板上的尽可能多的杂交引物上掺入dNTP以通过增加所发生的长度变化的幅度(无论长度增加或减少)来提高信噪比。
如果其互补核苷酸存在于模板核酸上的相同位置，作为测序反应的一部分，将dNTP连接至(或如本文所使用的“掺入至”)新合成链的3'端(或就第一个掺入的dNTP来说，测序引物的3'端)。引入的dNTP的掺入将模板的单链区转化为双链区，并且然后这种转化反映在张力作用下模板长度的变化。通过确定和监控模板游离端的可观察部分(例如，珠)的位置，检测长度变化。因此，如果在任何给定流经过后，珠位置未改变，则无dNTP掺入，并且可以推断流过的dNTP与模板中下一个可接近的核苷酸不互补。如果检测了所述部分位置的变化，则流过的dNTP是互补的并且掺入到新合成的链中。dNTP可以以任何顺序流动，前提是所述顺序是已知的并且优选地在整个测序试验中保持恒定。
对于本发明的一些方面，典型的测序循环可以包括用清洗缓冲液清洗流动室(和孔)，测量连接到模板核酸末端的可观察部分的位置，在存在聚合酶的情况下将第一dNTP物质(例如，dATP)引入到流动室，测量可观察部分的位置，任选地在清洗缓冲液中的腺苷三磷酸双磷酸酶流过，清洗缓冲液的流过，在存在聚合酶的情况下第二dNTP种类的引入等。该过程持续直至所有4种dNTP(即dATP、dCTP、dGTP和dTTP)已流过所述室并允许掺入到新合成的链中。这种4-核苷酸循环可以重复任何次数，包括(但不限于)10、25、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000次或更多次。循环次数将取决于正在测序的靶标长度和补充反应试剂(具体地，dNTP储备溶液和清洗缓冲液)的需要。因此，可以使用本发明所述的方法确定的序列长度可以为至少50个核苷酸、至少100个核苷酸、至少200个核苷酸、至少300个核苷酸、至少400个核苷酸、至少500个核苷酸、至少600个核苷酸、至少700个核苷酸、至少800个核苷酸、至少900个核苷酸、多至并且包括1000个核苷酸、1500个核苷酸、2000个核苷酸或更多个核苷酸。
适合的聚合酶可以是DNA聚合酶、RNA聚合酶或其亚基，前提是这些亚基能够基于模板合成新的核酸链并能够从杂交引物开始。适合的聚合酶亚基的实例是缺少3'至5'外切核酸酶活性的大肠杆菌(E.coli)DNA聚合酶I的Klenow片段的外切形式。其它适合的聚合酶包括T4exo-、Therminator和Bst聚合酶。聚合酶在溶液中可以是游离的(并且可以存在于清洗和/或dNTP溶液中)或者它可以固定在固体支持物、流通池的一个或多个壁、模板或引物上。
将理解本文所提供的测序方法具有一些应用，其包括但不限于确定核酸(或者一系列核酸，如存在于基因组中的核酸，包括哺乳动物基因组并且更具体地人基因组)的部分或完全的核苷酸序列，确定样品中是否存在核酸(如在(例如)诊断和法医学方法中可以是有用的样品)，确定核酸在序列中是否包括突变或变化(如(例如)等位变化，包括单核苷酸多态性)，确定已知核酸是否经历导致新物种产生的的突变(如可能是抗生素耐受性微生物的潜在原因)，确定基因修饰的生物或基因工程核酸的存在，确定两种样品(如(例如)正常组织和患病组织)间是否存在遗传学差异并且存在何种遗传学差异，确定对于患有如可以通过受试者的遗传构成确定的特定病况的受试者的治疗哪种治疗方案将最有效，和基因分型(例如，分析一个或多个基因座以确定(例如)载体状态)。在这些实施方式的一些中，可以将使用本发明所述的方法确定的核苷酸序列与已知或参考序列相比较以定向所获得的序列和/或鉴定两条序列间的差异。这可以帮助鉴定遗传变化和突变。所述已知或参考序列可以是先前确定的序列(例如，由物种完整的基因组测序所产生的)。
本文所述的方法也可以用于帮助鉴定和治疗病况。例如，所述方法可以用于鉴定与特定病况有关的序列或用于鉴定用于诊断特定病况不存在的序列。所分析的样品可以来自于任何受试者，包括人。所述病况可以是癌症或感染。
所述方法也可以用于鉴定与对试剂的阳性反应有关的序列。所述方法可以包括使用本文所提供的一种或多种测序方法对来自多位对试剂显示出阳性反应的受试者和来自多位对试剂显示出阴性反应的受试者的DNA测序，和鉴定多位显示阳性反应的受试者中的共有序列和来自显示出阴性反应的受试者中的共有序列，并且该共有序列不存在于其它多位受试者中。优选地，所述受试者是哺乳动物，并且更优选地，是人。
本文所述的方法可以自动化进行从而通过机器人进行测序反应。另外，得自检测器或传感器的测序数据可以输入到个人电脑、个人数字助理、移动电话、电视游戏系统或电视中，从而使用者可以远程监控测序反应的进行。
本发明还考虑了包含进行扩增和/或测序反应所必需的多种试剂的试剂盒，以及根据本文所述方法的使用说明书。
本文所提供的方法依赖于检测模板中每个靶标拷贝的单个核苷酸。分辨率极限依赖于所使用的检测系统的分辨率。
尽管在本文中已描述和说明了一些发明性实施方式，但是本领域那些技术人员将容易地设想用于实施功能和/或获得结果的各种其它方式和/或结构和/或本文所述的一种或多种优势，并且这些变化和/或改变中的每一个被认为在本文所述的本发明的实施方式的范围内。更一般地，本领域技术人员将容易地理解本文所述的所有参数、尺寸、材料和配置意在为示例性的，并且实际参数、尺寸、材料和/或配置将取决于本发明教导内容所使用的一种或多种特定用途。仅使用常规实验方法，本领域技术人员将认识或能够确定与本文所述的具体的本发明的实施方式等价的多种实施方式。因此，应理解仅通过举例的方式提供了上述实施方式，并且上述实施方式在所附权利要求及其等价形式的范围内；可以以如本文具体所述和所主张的之外的其它方式实践本发明的实施方式。本发明公开的发明实施方式涉及每个单独的本文所述的特征、系统、制品、材料、试剂盒和/或方法。另外，如果这些特征、系统、制品、材料、试剂盒和/或方法彼此不一致，则这些特征、系统、制品、材料、试剂盒和/或方法中的两种或更多种的任意组合包含在本发明公开的发明范围内。
应理解如本文所定义和使用的所有定义优先于词典定义、通过引用并入的文档中的定义和/或所定义术语的常规含义。
除非上下文中明确规定，否则如本说明书和所附权利要求中所使用的，单数形成的“一个”和“所述”包括复数对象。
具体实施方式
本发明尤其涉及用于从样品分离核酸的独特的半自动化方法、(RT-)PCR反应设置、基于(RT-)PCR的核酸扩增、PCR后标准化和扩增产物的清理、PCR扩增产物的片段化、与衔接子的连接，其特征在于(A)和(B)中所列的以下步骤：
方法(A)
(a)从样品提取核酸；
(b)任选地，在进行(RT-)PCR反应前，将尿嘧啶-DNA-糖基化酶(UDG)加入至(RT-)PCR混合物中以消化来自先前扩增反应的交叉和残留污染。
(c)根据分离核酸的类型，即RNA或DNA，使用核苷三磷酸构建块(即各个核苷酸)，包括A、T、C、G，任选地还包括尿嘧啶，进行(RT-)PCR；
(d)RT-PCR中获得的核酸的标准化(使用载体结构，例如顺磁微珠(例如，AxyPrep Mag PCR Normalizer,Axygen)用于标准化，其中所述珠结合所需序列长度的核苷酸序列)，其包括在PCR之后使RT-PCR混合物结合至所述珠，在PCR-产物结合后彻底清洗所述微珠，从微珠洗脱PCR扩增产物；
(e)将步骤(d)中获得的洗脱的PCR扩增产物片段化(剪切)；
(f)使步骤(e)的产物结合至载体结构，例如，微珠，然后清洗和洗脱所结合的核酸；
(g)将衔接头序列(包括条型码序列，从而使得能够将核酸归为特定样品(例如，临床样品和患者))连接至步骤(f)中获得的产物；
(h)使用载体结构清洗步骤(g)中获得的产物，所述载体结构例如先前步骤(d)和/或(f)中使用的微珠；
(i)使步骤(h)中获得的产物进行测序反应(例如，使用Ion PGM系统)，和
(j)分析步骤(i)中获得的测序反应的结果。
方法(B)
(a)从样品提取核酸；
(b)任选地，在进行(RT-)PCR反应前，将尿嘧啶-DNA-糖基化酶(UDG)加入至(RT-)PCR混合物中以消化来自先前扩增反应的交叉和残留污染。
(c)根据分离核酸的类型，即RNA或DNA，使用核苷三磷酸构建块(即各个核苷酸)，包括A、T、C、G，任选地还包括尿嘧啶，进行RT-PCR；
(d)引物的部分消化(例如，使用Life Technologies的FuPa试剂)；
(e)将衔接头序列(包括条型码)连接至步骤(d)中获得的产物；
(f)RT-PCR中获得的核酸的标准化(使用载体结构，例如顺磁微珠(例如，AxyPrep Mag PCR Normalizer,Axygen)用于标准化，其中所述珠结合所需序列长度的核苷酸序列)，其包括在PCR之后使RT-PCR混合物结合至所述珠，在PCR-产物结合后彻底清洗所述微珠，从微珠洗脱PCR扩增产物；
(g)使用载体结构清理步骤(g)中获得的产物，所述载体结构例如先前步骤(d)和/或(f)中使用的微珠；
(i)将步骤(h)中获得的产物进行测序反应(例如，使用Ion PGM系统Ion Torrent)，和
(j)分析步骤(i)中获得的测序反应的结果。
以上工艺流程方法的独特性使得能够降低用于分析的核酸的提取和最终NGS反应的过程中所需的时间量，在此之后是结果分析。UDG的使用很大程度上降低了用于核酸提取、PCR装置、PCR后的纯化步骤、文库制备和NGS的自动系统中的污染风险。使用以上方法的这些步骤的自动化降低了(具体地)诊断应用所需的时间和成本。
意外地，注意到可以在下一代测序文库的制备中使用本文所述的新型替代方法。可以在不同类型的NGS-文库的制备中使用本发明的方法，例如，用于Illumina测序或用于Ion Torrent测序的NGS-文库。可以将该方法引入到上述NGS工艺流程中。
通常，使用包含缓冲液的适合于该目的的可商购的试剂盒制备NGS文库。不考虑GC-含量，为了NGS-文库的稳健、高保真扩增，具体地优化了这些缓冲液。由于用于NGS文库制备的自动化开放系统可以容易具有对来自先前试验的PCR扩增子的临床样品污染残留的高风险，因此目标为减少所述危险。为了防止残留污染，将dUTP加入至(RT-)PCR预混液(master mixes)中。PCR预混液的尿嘧啶脱氢酶(UDG)-处理除去了来自先前试验并且可能偶然残留至后续反应混合物中的污染物扩增子。尿嘧啶脱氢酶(UDG)是通过水解脱氧核糖和碱基之间的N-糖苷键来从DNA除去尿嘧啶，从而留下无嘌呤或无嘧啶位点(AP位点)的酶。
然而，用于NGS-文库制备的缓冲液(例如，具有Taq High Fidelity的SuperScriptTM III One-Step RT-PCR系统)通常不适合于在扩增反应期间掺入dUTP。意外地注意到可以用非高保真酶的常规Taq聚合酶取代专门为NGS-文库制备开发的特异性高保真酶。可以使用常规(RT-)PCR缓冲液(例如，含有100mM Tris-HCl，pH 8.3，500mM KCl，15mM MgCl2的缓冲液)。NGS-文库制备规程的这一改变使得能够在扩增期间掺入dUTP。
因此，在一个方面，本发明涉及制备NGS文库的方法，其包括在不使用专门的高保真PCR缓冲液的情况下在扩增期间掺入dUTP，但是其中使用了适合于PCR的基本上任何DNA聚合酶(例如，Taq聚合酶)。缓冲液和酶的这种相当简单的更换使得能够引入dUTP和使用UDG进行后续处理以防止污染物残留。
此外，本发明涉及使用用于dUTP掺入的野生型(重组或天然)Taq聚合酶，在用于下一代测序文库的制备的核酸扩增反应中，用于除去残留污染物，即用于消除包含应分析的提取核酸和来自于先前(RT-)PCR反应的可能的污染DNA的试剂混合物的污染的方法，其包括以下步骤：
a)使得自样品的核酸片段化，
b)加入适合于降解扩增反应混合物中存在的任何污染核酸扩增物的降解酶；
c)扩增核酸模板，以在存在dUTP的情况下在第一核酸扩增反应中提供第一核酸扩增物；和
d)使所述降解酶失活。
在上述方法(在使用用于dUTP掺入的野生型(重组或天然)Taq聚合酶或其衍生物用于制备下一代测序文库的核酸扩增反应中除去残留污染的方法)的优选实施方式中，所述降解酶为UDG。UDG处理通常需要几分钟，例如，多至10分钟，优选地，多至5分钟。随后，将所述酶失活，例如，通过暴露于约50℃的温度约5分钟。
在上述方法(在使用用于dUTP掺入的野生型Taq聚合酶用于制备下一代测序文库的核酸扩增反应中除去残留污染的方法)的另一个优选实施方式中，所述降解酶为UDG，所述Taq聚合酶为重组或天然聚合酶。
在上述方法(在使用用于dUTP掺入的野生型(重组或天然)Taq聚合酶用于制备下一代测序文库的核酸扩增反应中除去残留污染的方法)的优选实施方式中，所述降解酶为UDG，并且在下一代测序方法中将UDG-处理的文库进行其它步骤，其包括：
a)使得自样品的核酸片段化，
b)加入适合于降解扩增反应混合物中存在的任何污染核酸扩增物的降解酶；
c)扩增核酸模板，以在存在dUTP的情况下在第一核酸扩增反应中提供第一核酸扩增物；和
d)使所述降解酶失活。
在权利要求中还描述了用于DNA文库产生或在以上DNA文库制备过程中消除反应混合物污染的本发明方法的优选实施方式。
以上方法(A)和(B)的优选实施方式涉及其中由于一些致癌基因中的修饰赋予了某些药物耐药性，因此存在于临床样品中的靶标核酸(例如，致癌基因或来源于如HCV、HIV等的病原体的核酸)的序列相关知识有助于医师为患者选择最有希望的治疗的体外诊断应用，例如，在伴随诊断中的应用。
在方法(A)的优选实施方式中，所述样品是得自(例如)患者，优选地人患者的新鲜样品。样品材料可以是(例如)血液、血浆、血细胞亚群(例如，T细胞)、脑脊髓液、痰液、大便等。
在方法(A)的优选实施方式中，样品是为了分离其中存在的核酸材料的血浆，所述核酸材料例如，病毒、细菌、真菌或寄生虫-来源的核酸或含有这些核酸的材料，例如，病毒粒子、细菌等。
在方法(A)的优选实施方式中，样品材料是血浆并且所述核酸材料来源于病毒，例如，HCV、HIV等。当靶向HCV时，目的区域优选地为NS5B基因区，其很适合鉴定6个主要的HCV基因型和大量亚型。HCV基因组中的靶标区优选地从核苷酸8616延伸至核苷酸9298，但是该区域可以稍微更长或更短一些，只要6个HCV基因型的鉴定是可能的。优选的引物结合至HCV基因组的核苷酸8616-8638、8614-8635、9276-9298和9171-9191。所述引物可以包括如本领域中已知的天然或修饰的核苷酸构建块。
在方法(B)的优选实施方式中，所述样品是得自(例如)患者，优选地人患者的新鲜样品。样品材料可以是(例如)血液、血浆、血细胞亚群(例如，T细胞)、脑脊髓液、痰液、大便等。在方法(B)的另一个优选实施方式中，所述样品不是新鲜样品，而是获得后(例如)使用福尔马林-固定和/或石蜡-包埋处理的样品(FFPE样品是用于多个致癌基因分析的优选样品)。
在方法(B)的优选实施方式中，样品材料是来源于人患者的FFPE-样品，例如，来自可以福尔马林-固定和/或石蜡-包埋的任何组织的样品，例如，来源于皮肤、乳腺组织、结肠、肺、肝、肌肉等的样品。在非常优选的实施方式中，样品是用于参与黑素瘤形成的基因分析的皮肤样品。在该方面，靶向的优选基因包括以下基因中的至少一种或多种：NRAS、AKT3、MAP2K1、GNA11、ERBB4、PIK3CA、FGFR3、KIT、BRAF、CDKN2A和GNAQ。这些基因已知参与了黑素瘤的发展并且可以在各个基因的不同位点含有不同的点突变。特定突变的分析使得治疗医师能够选择适合的疗法，这是因为已知一些突变赋予了耐药性，而其它是药物可控制(对药物敏感)。
本发明的另一个方面是提供可以用作来自FFPE组织的核酸提取的对照材料的新的FFPE细胞系。这些细胞系可以携带对应于靶标序列的遗传信息，例如，先前通过转化或使用其它方法引入的遗传物质。可选地，这些基因可能未进行基因修饰，例如，当细胞已携带目的靶标基因(例如，致癌基因)或当靶标基因应不同于实际测定中的所靶向的基因时。例如，当测定靶向临床样品中一个或多个致癌基因的突变时，FFPE细胞系中靶向的基因可以是管家基因或非突变野生型基因。所述细胞系提供了可计量的量的靶标核酸的来源，这是因为可以选择FFPE细胞系材料的量以达到各个测定的要求。本发明的细胞系可以作为用于任何给定测定的试剂盒的一部分提供。所述试剂盒还可以包含适合于核酸提取、纯化、扩增或其它操作的其它化学试剂，例如，引物、缓冲液、酶等。
本文提供的另一个方面是DNA文库标准化的方法。在其它实施方式中，这些DNA文库用于涉及载体颗粒(如磁性微珠)的使用的后续NGS。
在现有方法中，DNA文库的标准化需要在衔接子连接前对(RT-)PCR反应中获得的片段化DNA扩增产物进行定量和/或大小选择。意外地发现涉及微珠使用的文库制备不需要大小选择和/或预先定量，优选的微珠为Axygen(AxyPrep MAG-PCR-CL-5Kit)提供的那些或类似产品。这些微珠的使用还消除了核酸扩增和/或衔接子与扩增产物连接后仍存在的较短的片段。
此外，意外地发现与其中在连接之后包含衔接子的文库再次扩增的现有技术方法不同，因此产生的DNA文库的PCR扩增不是必需的。
根据珠的量和所述珠与DNA文库的孵育时间，可以限定结合的DNA的量，这是因为珠随时间被核酸饱和。
本发明的自动核酸提取、扩增和文库制备方法(例如，使用Vela Diagnostic的Sentosa SX101平台)使得通常能够减少时间、试剂的量和成本并且避免与用于NGS的DNA文库的手动制备有关的风险。
本发明还考虑了用于制备同类文库的试剂盒。
更进一步，本发明提供了简化且改善的文库制备方案。如上所述，用于使用后续NGS方案的DNA文库的制备的标准化磁珠是极其重要的以获得用于进一步分析的核酸的正确的量。出于该目的，在(RT-)PCR之后具有可以使用的有限结合表面的DNA结合珠可以用于扩增核酸的标准化。
此外，为了获得用于以下下一代测序步骤的预先限定量的DNA，现有技术方法基本需要以下步骤：
1)(RT-)PCR
2)使用磁珠和清理缓冲液清理PCR产物
3)清洗珠(例如，用乙醇)
4)洗脱结合至磁珠的PCR产物
5)使用标准化磁珠和标准化缓冲液的PCR产物的标准化
6)清洗珠(例如，用乙醇)
7)标准化PCR产物的洗脱。
标准化磁珠(定义)对RT-PCR缓冲液很敏感，可能是因为一步RT-PCR缓冲液中的dTT抑制扩增DNA产物与标准化珠的结合。在现有技术方法中，先前需要进行以上步骤2)至4)，其在进行扩增之后除去了RT-PCR混合物中存在的试剂。
意外地，本发明人发现当将(RT-)PCR产物暴露于新的本发明的组合物(包含用于标准化的用于NGS文库制备的珠，包含溶剂，例如聚乙二醇和碱金属盐，例如NaCl、MgCl等)时，可以省去繁重、耗时且昂贵的步骤2)至4)。在一些实施方式中，所述组合物包括，例如，约2.0至约5.0M的NaCl，例如，约2.0M至约4.0M的NaCl，优选地，2.5至约3.5M的NaCl，非常优选地，约2.5至约3.0M的NaCl，并且最优选地，本发明的缓冲液中碱金属的浓度为2.5M NaCl。本发明用于NGS文库制备的标准化珠的缓冲液还包括约10％至约30％的溶剂，例如，约12.5％至约25％，或15.0％至约25％，或17.5％至约22.5％，优选地约20％的溶剂。所述溶剂优选地为聚乙二醇，例如，高分子量PEG，如聚乙二醇(PEG)8000。还可能用其它碱金属盐替换NaCl，如Mg、K等。在非常优选的实施方式中，本发明用于NGS文库制备的标准化珠的缓冲液包含约2.5M NaCl和20％的聚乙二醇(PEG)8000。
在本发明用于NGS文库制备和改善的NGS工艺流程的方法中，将上述缓冲液直接加入到含有扩增核酸的所获得的RT-PCR扩增混合物中。优选地，将本发明的缓冲液以2:1至1:2的比值加入到扩增混合物中，并且最优选地，将本发明的缓冲液以约相等的量(例如，1:1)加入到PCR扩增混合物中。在非常优选的实施方式中，本发明用于NGS文库制备的标准化珠的缓冲液包含约2.5M NaCl和20％聚乙二醇(PEG)8000，并以1:1的比值加入到PCR扩增混合物中。
因此，可以大大减少用于NGS的文库制备的时间和步骤。此外，加入(RT-)PCR产物的缓冲液相当便宜，具体地，它比清理珠和清理缓冲液便宜许多。
以下所述的实施例仅用作实例并且决不应视为对本发明范围的限制。
实施例
实施例1：使用Vela Diagnostic的自动化平台Sentosa SX101的用
于NGS的HCV文库的制备
1.RT-PCR
·从人血浆分离HCV病毒RNA并合成cDNA。在本发明中，使用自动化平台Sentosa SX 101进行该步骤。
·在进行RT-PCR之前，将尿嘧啶-DNA-糖基化酶(UDG)加入至RT-PCR混合物中以消除来源于先前测定的可能的污染物。在扩增之前，在25℃用UDG进行扩增子残留污染物消化4min。
2.RT-PCR之后的标准化
·参考图1中所示的工作平台。
·制备试剂96-孔板的孔(图1，位置C1)：
·将试剂96-孔板(图1中的TEMP2)的温度设置为15℃；
·将25μl的每个样品的每个PCR产物(总计4个)合并至限定位置。
·混合5次并转移195μl的标准化珠至1500μl PCR清洗缓冲液(Lib Prep Reagent)；
·混合10次并转移86μl的PCR清洗缓冲液(Vela Diagnostics)和标准化珠(Axygen)。混合(文库制备试剂)至合并的PCR产物的限定位置并混合10次。
·在室温下孵育3min；
·将PCR板转移至图1中的平台中的位置B5处的磁性支架；
·孵育2min；
·通过吸取40μl三次和50μl一次来弃去上清液；
·将100μl 80％的EtOH加入至PCR板上所选的孔中；
·将PCR板转移至恒温混合器(TMX)并以1000rpm振荡2min；
·将PCR板转移回到图1中的位置B5处的磁性支架；
·打开TMX的温度控制并设置为56℃。
·孵育2min；
·通过吸取70μl三次和40μl一次弃去上清液；
·将PCR板转移至先前设为56℃的恒温混合器(TMX)；
·将板干燥2min；
·将PCR板转移至位置C1；
·加入35μl洗脱缓冲液(Lib Prep Reagent 1A至PCR板)；
·通过抽吸混合5次；
·将PCR板转移至恒温混合器；
·在恒温混合器上在56℃以1400rpm振荡5min；
·将板转移回到磁性板(B5)并等待2min；
3.剪切
·将63μL剪切缓冲液(Life technologies)和30μL转移至限定位置并混合5次。将80μl混合物分别转移至剪切酶(Life technologies)(C4和D4)混合20×；
·转移15μl至限定位置。转移15μl洗脱样品(来自步骤2)至相同限定位置并混合。；
·将PCR板转移至恒温混合器并孵育12min，在38℃孵育13分钟。
3.PCR珠清理；
·混合PCR清理珠并将50μl来自Lib Prep Reagent的珠转移到限定的PCR板的孔；
·将PCR板转移至TMX并以1200rpm在26℃振荡3min；
·将PCR板转移回到位置B5处的磁性支架并等待2min；
·通过分别吸取70μl和30μl弃去上清液
·加入100μl，80％的EtOH(文库制备试剂至PCR板)；
·将PCR板转移回到TMX并以1200rpm在26℃振荡3min；
·将PCR板转移至B5处的磁性支架。等待3min；
·通过吸取70μl一次和50μl一次弃去上清液；
·等待5min使珠干燥；
将PCR板转移回到位置C1；
加入28μl洗脱缓冲液(将洗脱缓冲液从文库制备试剂转移至所选的PCR板的孔中)；
将PCR板转移至TMX并在26℃以1200rom振荡2min；
将PCR板转移至B5上的磁性支架，并等待2min；
5.连接
·将90μl连接酶缓冲液(Enzymatics)、18μl dNTP、36μl T4连接酶(Enzymatics)、18μl Manta聚合酶(Enzymatics)和108μl水从限定的试剂板孔转移到另一个限定的管中并混合10次；
·将另外15μl的混合物从试剂板限定的孔转移至另一限定的孔；
·随后，转移10μl条型码衔接子至相同的限定的孔。
·将25uL从步骤4洗脱的样品转移至相同的限定的孔并混合10次。用25uL矿物油覆盖混合物。
·将PCR板转移回到TMX并在26℃孵育10min；
·将温度升高至65℃，并孵育另外5min。
实施例2：AmpliSeqTM文库自动化
使用AmpliSeqTM试剂(Life technologies,Inc.)，制备试剂96-孔板的孔(图1，位置C1)：)：
使用自动化平台Sentosa SX 101(Vela Diagnostics)的Ampliseq文库自动化)
1.PCR
·将位置TEMP2的温度设置为4℃。
·将4μl PCR预混液从试剂板中限定的孔转移至其它所选孔中的引物混合物；
·通过抽吸10次混合；
·分别将7μl PCR混合物从所选的试剂96-孔板的孔中转移到所选的PCR 96-孔板的孔中；
·分别将3μl gDNA样品从限定的洗脱板的孔中转移至所选的PCR 96孔板的孔中(总PCR体积＝10μl)；
·手动密封PCR板并转移至PCR以使用以下程序扩增：
步骤1：99℃，2min
步骤2：99℃，15秒
步骤3：60℃，4min
重复步骤2(21次)
保持在10℃
·PCR之后，将PCR板返回至Sentosa平台SX 101上的C1位置(图1)；
·将恒温混合器的温度设置为52℃。
2.FuPa反应
·将2μl FuPa(Life technologies)从所选的试剂96-孔板的孔中转移至预定的96-孔板的孔中(使用自动化系统转移极少量的粘稠试剂)；
·将限定的孔中的10μl PCR产物合并至含有FuPa试剂的PCR板上的孔中，并通过抽吸5次混合；
·将40μl油覆盖物加入到上一步骤中的PCR板孔中。(文库制备试剂->PCR板)；
·将PCR板转移至TMX并在52℃以300rpm振荡10min，57℃振荡10min和62℃振荡20min；
·将PCR板转移回到SX 101上的位置C1。
3.连接反应
·将4μl转换溶液(Life technologies)从限定的试剂板孔加入到其它限定的PCR板孔中；
·将2μl连接酶从限定的试剂板孔转移至另一个限定的PCR板孔；
·将2μl条型码衔接子从限定的试剂板孔转移至预定的PCR板孔；
·将5μl水从含有文库制备试剂的预定的孔加入到另一个预定的PCR板孔；
·加入17μl样品并通过抽吸5次混合；
·将整个样品从所选的PCR板孔转移至已含有连接酶的孔并通过抽吸5次混合；
·将40μl油覆盖物加入到所选的PCR板孔B5。(Lib制备试剂至限定的PCR板孔)；
·等待20分钟；
·将恒温混合器设置为72℃，并等待另外10min；
·将PCR板转移至TMX并以300rpm在72℃振荡10min；
4.珠标准化
·通过抽吸10次混合标准化珠；
·将10μl Lib制备试剂中的标准化珠加入到200μL Lib制备试剂中的结合缓冲液中；
·将PCR板从TMX送至位置C1；
·将恒温混合器的温度设置为25℃；
·在转移100μl珠溶液至所需的PCR板孔之前，将限定孔中的珠溶液混合10次；
·将25μl样品从一个所选的PCR板孔转移至另一个用于结合的限定的孔并通过抽吸10×混合；
·等待5分钟；
·将PCR板送至TMX；
·在25℃，以1200rpm振荡1min；
·孵育4min；
·将PCR板转移至磁性板支架B5并孵育2min；
·通过吸取50μl两次和20μl一次，弃去上清液；
·100μl 80％的EtOH转移至所选的PCR板孔；
·将板送回到TMX并以1000rpm在25℃振荡1min；
·孵育1min；
·将PCR板送回到磁性板支架B5并孵育2min；
·通过吸取50μl两次和20μl一次，弃去上清液；
·将板送回到TMX并以1000rpm在25℃振荡1min；
·孵育1min；
·将PCR板转移回到磁性板支架B5并孵育2min；
·通过吸取50μl两次和20μl一次，弃去上清液；
·将TMX设置为58℃；
·将PCR板转移回至TMX并干燥2分钟除去EtOH；
·将PCR板转移回至位置C1；
·将25μl洗脱缓冲液加入至PCR板所选的孔；
·将PCR板转移回至TMX并以1200rpm振荡2min；
·将PCR板转移至磁性板支架B5并孵育2min；
·从一个限定的PCR板孔吸取25μl洗脱样品至另一个限定的孔。
所述方法和与这些方法有关的其它方面为与非自动化或需要更多手动步骤的相应方法相比，需要较少的劳动力、安全成本、试剂并且较不易污染。