检测癌症的方法和生物标记物与流程

本申请涉及并要求2014年4月22日提交的、名称为“检测癌症的方法和生物标记物”、申请号为PCT/CN2014/075946的PCT申请的优先权，其全部内容通过引用在此并入。

发明领域

本申请总体上涉及分子和细胞生物学领域以及癌症的检测试剂。

发明背景

癌症是涉及细胞失控生长的一大类疾病。在癌症中，细胞失控地分裂和生长，形成恶性肿瘤，其可能侵入身体的邻近部分。癌细胞还可以通过淋巴系统或血流扩散到身体的远距离部分。已知有超过200种不同的癌症影响着人类。

能够通过多种方式检测癌症，包括存在某些体征和症状、筛查测试或医学成像。大部分癌症最初被识别是由于出现了体征或症状，或者是通过筛查识别的。然而，这些方法通常不会带来确定的诊断，其需要病理学家对组织样品进行检查。病理学检查通常耗时，并且具有侵入性。因此，对开发检测癌症的新方法具有持续的需求。

ERM蛋白家族包括埃兹蛋白(ezrin)、根蛋白(radixin)和膜突蛋白(moesin)。ERM蛋白主要在细胞质中表达，并且集中在富含肌动蛋白的细胞-表面结构中。ERM蛋白充当着细胞质膜与基于肌动蛋白的细胞骨架之间的结构连接体。ERM蛋白在种间和分子间具有高度的同源性。ERM蛋白通常具有三个结构域：称为FERM结构域(条带4.1、埃兹蛋白、根蛋白和膜突蛋白同源结构域)的N-末端结构域(因为其与条带4.1蛋白具有同源性)、中心螺旋结构域和C-末端结构域。C-末端结构域与F-肌动蛋白结合，而N-末端结构域负责与细胞质膜中的粘附分子结合(Louvet-Vallee(2000))。一些证据表明，ERM蛋白的NH₂-和COOH-末端结构域在胞质中细胞内和/或细胞间结合，这分别抑制其与整合的膜蛋白和肌动蛋白丝的结合能力(Ken Hayashi等，J.Cell Sci.112:1149-1158(1999))。

膜突蛋白位于对于细胞间的识别和发送信号以及对于细胞运动具有重要作用的丝状伪足和其他膜突起中(参见Louvet-Vallee,Biol.Cell 92:305-16(2000))。人膜突蛋白含有577个氨基酸并且通常由三个结构域组成：N-末端FERM结构域、中心螺旋结构域和C-末端结构域。而且，人膜突蛋白与其他物种的膜突蛋白(如小鼠和牛的膜突蛋白)具有高度的序列同源性(Sato等，Cell Sci.J.103:131-143(1992))。

发明简述

本申请的发明人令人惊讶地发现，膜突蛋白C-末端区段(而非全长膜突蛋白)的水平增加与癌症的存在或出现相关。因此，本申请提供了评估癌症的存在或出现的方法、用于评估癌症的存在或出现的生物标记物和试剂盒、以及此类生物标记物和试剂盒的用途。本申请还提供了治疗癌症的方法。

在一个方面，本申请提供了在对象中评估癌症的存在或出现的方法，所述方法包括获取对象的生物样品，检测所述生物样品中膜突蛋白C-末端区段的水平，其中在所述对象的生物样品中检测到的膜突蛋白C-末端区段的水平提示所述对象出现癌症或出现癌症的可能性增加。

在一些实施方式中，在评估癌症的存在或出现的方法中使用的C-末端区段由膜突蛋白的第471-577位氨基酸残基组成。在某些实施方式中，膜突蛋白是具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的人膜突蛋白。在一些实施方式中，C-末端区段包含来自人膜突蛋白的第471-577位氨基酸残基之间区域的至少20个连续的氨基酸。在一些实施方式中，C-末端区段包含来自人膜突蛋白的第471-577位氨基酸残基之间区域的至少50个连续的氨基酸。在一些实施方式中，C-末端区段包含人膜突蛋白的第471-487位、第488-501位或第502-577位氨基酸残基。

在一些实施方式中，通过将样品与同膜突蛋白C-末端区段特异性结合的试剂接触来检测在生物样品中的膜突蛋白C-末端区段的水平。在一些优选的实施方式中，试剂是与膜突蛋白C-末端区段特异性结合的抗体或其抗体片段。在一些实施方式中，抗体是单克隆抗体。

在一些实施方式中，将在对象生物样品中检测到的膜突蛋白C-末端区段的水平与从参照样品中检测到的膜突蛋白C-末端区段的参照水平进行比较。在一些实施方式中，与膜突蛋白C-末端区段的参照水平相比，在所述生物样品中检测到的膜突蛋白C-末端区段具有更高水平提示所述对象出现癌症或出现癌症的可能性增加。在生物样品中检测到的膜突蛋白C-末端区段的水平是膜突蛋白C-末端区段参照水平的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20倍。在一些实施方式中，在生物样品中检测到的膜突蛋白C-末端区段的水平优选是膜突蛋白C-末端区段参照水平的至少2倍。在一些实施方式中，在生物样品中检测到的膜突蛋白C-末端区段的水平是膜突蛋白C-末端区段参照水平的至少5倍。在一些实施方式中，参照样品来自无肿瘤对象，其是不具有临床可检测肿瘤的对象。

在一些实施方式中，生物样品选自下组：全血、血清和血浆。在一些实施方式中，生物样品是尿液或唾液。

在一些实施方式中，癌症选自下组：急性淋巴细胞白血病、急性骨髓性白血病、肾上腺皮质癌、肛门癌、阑尾癌、星形细胞瘤、基底细胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨肉瘤、脑干胶质瘤、脑癌、小脑星形细胞瘤、室管膜瘤、成神经管细胞瘤、乳腺癌、支气管腺瘤、伯基特氏淋巴瘤、类癌瘤、胃肠类癌瘤、宫颈癌、慢性支气管炎、慢性淋巴细胞白血病、慢性骨髓性白血病、慢性骨髓增生性疾病、慢性阻塞性肺病、结肠癌、皮肤T-细胞淋巴瘤、肺气肿、子宫内膜癌、室管膜瘤、尤因氏肉瘤、颅外生殖细胞肿瘤、性腺外生殖细胞肿瘤、肝外胆管癌、视网膜母细胞瘤、胆囊癌、胃癌、神经胶质瘤、毛细胞白血病、头颈癌、心脏癌、肝癌、霍奇金氏淋巴瘤、下咽癌、眼内黑色素瘤、胰岛细胞癌、卡波西氏肉瘤、肾癌、喉癌、白血病、肺癌、黑色素瘤、神经母细胞瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、卵巢癌、胰腺癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、浆细胞瘤、胸膜肺母细胞瘤、前列腺癌、直肠癌、肾细胞癌、视网膜母细胞瘤、软组织肉瘤、子宫肉瘤、皮肤癌、鳞状细胞癌、胃癌、咽喉癌、甲状腺癌、子宫癌、阴道癌、外阴癌。

在另一个方面，本申请提供了用于评估癌症的存在或出现的生物标记物，所述生物标记物基本上由膜突蛋白C-末端区段组成。在一些实施方式中，膜突蛋白C-末端区段由人膜突蛋白第471-577位的氨基酸残基组成。在一些实施方式中，生物标记物包含人膜突蛋白的第471-577位氨基酸残基的至少20个连续的氨基酸残基。在一些实施方式中，生物标记物包含人膜突蛋白的第471-577位氨基酸残基的至少50个连续的氨基酸残基。在一些实施方式中，生物标记物包含人膜突蛋白的第471-577位氨基酸残基的至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100个连续的氨基酸残基。本申请还提供了膜突蛋白C-末端区段作为用于在对象中评估癌症的存在或出现的生物标记物的用途以及膜突蛋白C-末端区段在制备用于在对象中评估癌症的检测剂中的用途。在一些实施方式中，C-末端区段包含人膜突蛋白的第471-487位、第488-501位或第502-577位氨基酸残基。在一些实施方式中，人膜突蛋白具有SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列。

在另一个方面，本申请提供了用于在对象中评估癌症的存在或出现的试剂盒，所述试剂盒包含与膜突蛋白C-末端区段特异性结合的试剂。在一些实施方式中，所述试剂是抗体。在一些实施方式中，所述试剂是单克隆抗体或其片段。

在另一个方面，本申请提供了在对象中治疗癌症的方法，所述方法包括向该对象施用药物组合物，所述药物组合物包含特异性调节膜突蛋白C-末端区段功能的试剂和药学上可接受的赋形剂。在一些实施方式中，所述试剂与膜突蛋白C-末端区段特异性结合。在一些实施方式中，所述试剂是抗体。在一些实施方式中，所述试剂是单克隆抗体或其片段。在另一个方面，本申请提供了膜突蛋白C-末端区段在制备用于在对象中治疗癌症的药物中的用途。

附图简述

图1：编码全长人膜突蛋白的cDNA序列(SEQ ID NO:1)。

图2：全长人膜突蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)。

图3：人膜突蛋白的第471-577位氨基酸残基的氨基酸序列(SEQ ID No:3)。

图4：癌症患者和健康个体(正常)的样品中C-末端膜突蛋白区段的浓度。

发明详述

在对本申请进行更加详细的描述之前，应理解本申请不限于所描述的特定实施方式，并且其当然是可以改变的。还应理解本申请中使用的术语仅用于描述特定实施方式的目的，并不旨在限制，因为本申请的范围仅由所附的权利要求限定。在提供数值范围时，应理解在该范围的上限和下限之间每个居中值和任何其他表述或该表述范围内的居中值，到下限的单位的十分之一，都被包括在本申请的范围内，除非上下文另有明示。这些更小范围的上限和下限可以独立地包括在更小的范围中，并且也被包括在本申请的范围内，服从所述范围中任何特定排除的极限值。在所述的范围包括一个或两个极限值时，排除一个或两个在内的极限值的范围也被包括在本申请的范围内。

除非另有定义，否则本申请中使用的所有科技术语具有的含义与本申请所属领域技术人员通常理解的含义相同。Singleton等，Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2nd ed.,J.Wiley&Sons(New York,N.Y.1994)和March,Advanced Organic Chemistry Reactions,Mechanisms and Structure 4th ed.,John Wiley&Sons(New York,N.Y.1992)向本领域技术人员提供本申请中使用的多数术语的一般性指导。虽然与本申请中所述的方法和材料类似或等价的任何方法和材料也可用于本申请的实践或试验，但是以下描述优选的方法和材料。

在本说明书中引用的所有出版物和专利都通过引用并入本申请，相当于每篇出版物或专利都特别地和单独地被指出通过引用并入，并且其通过引用并入本申请以披露和描述与所引用的出版物有关的方法和/或材料。所引用的任何出版物均在本申请提交日之前公开，不应将所述公开中的任何事项看作是承认本申请由于在先公开而没有资格早于这些公开。而且，所提供的公开日可能不同于实际的公开日，其可能需要单独确认。

本领域技术人员在阅读本申请后将理解，本申请中所描述和解释的各个实施方式均具有离散的组成和特性，在不脱离本申请范围或主旨的前提下，可以容易地将其分离或者与任意其他若干实施方式的特性组合。任何所述的方法均可以所叙述的事件顺序或者逻辑上可能的任何其他顺序进行。

除非另有明示，否则本申请的实施方式将采用化学、固态化学、无机化学、有机化学、物理化学、分析化学、材料化学、生物化学、生物学、分子生物学、重组DNA技术、药理学、成像等技术，其均在本领域技术的范围内。文献对这些技术进行了充分阐述，如"Molecular Cloning:A Laboratory Manual"，第二版，(Sambrook等，1989)；"Oligonucleotide Synthesis"(M.J.Gait编著，1984)；"Animal Cell Culture"(R.I.Freshney编著，1987)；"Methods in Enzymology"丛书(Academic Press,Inc.)；"Current Protocols in Molecular Biology"(F.M.Ausubel等编著，1987，并且定期更新)；"PCR:The Polymerase Chain Reaction"(Mullis等编著，1994)。可以使用本领域公知的标准技术制备本申请中使用的引物、多核苷酸和多肽。

在对本申请的实施方式进行详细描述之前，除非另有明示，否则应理解本申请不仅限于特定材料、试剂、反应原料、生产工艺等，其是可以改变的。还应理解在本申请中使用的术语仅用于说明特定实施方式的目的，并不旨在限制。本申请中也可能以逻辑上可能的不同顺序执行步骤。

给出下述实施方式以便向本领域的普通技术人员完整地披露和描述本申请所公开和主张的方法是如何进行的以及生物标记物和试剂盒是如何使用的。已努力确保数字的准确度(例如量、温度等)，但是应考虑一些误差和偏差。

需要指出的是，如本说明书和所附权利要求中所使用的，单数形式“一(a)”、“一个(an)”和“所述(the)”包括复数对象，除非上下文另有明示。因此，例如“化合物”包括多个化合物。在本说明书和下文中的权利要求中，将给出多个术语以供参考，将对其进行定义以使其具有下述含义，除非具有明显相反的意图。

本申请提供了评估癌症的存在或出现的方法、用于评估癌症的存在或出现的生物标记物和试剂盒以及此类生物标记物和试剂盒的用途。本申请还提供了治疗癌症的方法。

评估癌症的存在或出现的方法

本申请的第一个方面提供了一种在对象中评估癌症的存在或出现的方法。所述方法包括获取对象的生物样品并且在所述生物样品中检测膜突蛋白C-末端区段的水平。在对象的生物样品中检测到的膜突蛋白C-末端区段的水平提示对象出现癌症或出现癌症的可能性增加。

如在本申请中使用的，术语“评估”(assess或assessment)指将来自受到或未受到癌症影响对象的样品之间相区分的能力或者将来自处于进入转移之前的不同癌症发展分期对象的样品之间相区分的能力。在某些实施方式中，评估涉及确定对象患有肿瘤或未患肿瘤。在某些实施方式中，评估涉及确定对象的肿瘤是否已减轻或变得更加严重。在某些实施方式中，评估能辅助评价从治疗中获得临床益处的可能性。在某些实施方式中，评估可以涉及患者是否将在治疗(例如使用特定治疗剂的治疗)后得到改善和/或得到改善的可能性。可以将本申请的评估方法用于临床以便针对任意特定患者通过选择最适宜的治疗方案做出治疗决定。本申请的评估方法是在评估患者在进行治疗方案后是否可能长期存活的有价值的工具，如给定的治疗方案，包括例如施用给定的治疗剂或其组合、手术干预、类固醇疗法等。

本领域技术人员所理解的差异不能达到在100％分析的样品中均是正确的。然而，要求分析的样品具有统计学意义的量是正确分类的。可以由本领域技术人员使用不同的统计学工具确定具有统计学意义的量，例如但不限于通过确定置信区间、确定p值、Student检验或Fisher判别函数。详细情况参见Dowdy和Wearden,Statistics for Research,John Wiley&Sons,New York 1983。在某些实施方式中，置信区间为至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％。在某些实施方式中，p值小于0.1、0.05、0.01、0.005或0.0001。在某些实施方式中，本申请在分析人群某些组的至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的对象中能够正确检测癌症。

如在本申请中使用的，“生物样品”指从目标对象获取或来源于目标对象的生物组分，其含有例如基于物理学、生物化学、化学和/或生理学特征表征和/或鉴定的细胞和/或其他分子实体。生物样品包括但不限于由本领域技术人员采用任意公知的方法获得的对象的细胞、组织、器官和/或生物液体。在某些实施方式中，所述生物样品是液体样品。在某些实施方式中，所述液体样品是全血、血浆或血清。优选地，所述液体样品是血清。

如在本申请中使用的，术语“对象”指动物，优选哺乳动物，更优选人。术语“对象”的目标并不是在任何方面进行限制，并且可以是任何年龄、性别和身体状况。

术语“膜突蛋白”代表膜组织延伸棘突蛋白(membrane-organizing extension spike protein)，如在Lankes和Furthmayr(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.,88:8297-8301中所描述的。膜突蛋白多肽的氨基酸序列可以在公共数据库中找到，如国家生物技术信息中心。术语多肽和蛋白可以在本申请中互换使用。在某些实施方式中，膜突蛋白是人膜突蛋白。全长人膜突蛋白是577个氨基酸的多肽，其具有SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列。人膜突蛋白与其他物种的膜突蛋白(如小鼠和牛的膜突蛋白)具有高度的序列同源性(Sato等，Cell Sci.J.103:131-143(1992))。

“膜突蛋白C-末端区段”指膜突蛋白C-末端尾结构域或C-末端尾结构域的一部分。膜突蛋白C-末端尾结构域是野生型膜突蛋白的一部分，其在结构上与所述蛋白的羧基末端接近，在功能上负责与肌动蛋白丝结合和相互作用。膜突蛋白的C-末端尾结构域带正电荷，并且采用了扩展的曲折结构。特别地，该术语指人膜突蛋白的最后约107个氨基酸残基。在某些文献中，将相同的结构域也称为C-ERM相关结构域(C-ERMAD)，其包括在本申请的定义中(Bretscher等(1995))。C-末端结构域的最后34个氨基酸残基在ERM蛋白之间是高度保守的，并且形成与F-肌动蛋白结合的区域。特别地，术语“膜突蛋白C-末端区段”含有具有人膜突蛋白最后约107个氨基酸残基中的氨基酸序列的至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100个连续的氨基酸残基的多肽。在某些实施方式中，膜突蛋白C-末端区段由SEQ ID NO:3所示的人膜突蛋白的第471-577位氨基酸残基组成。优选地，膜突蛋白C-末端区段包含来自人膜突蛋白的第471-577位氨基酸残基之间区域的至少20个连续的氨基酸残基。更优选地，C-末端区段包含来自人膜突蛋白的第471-577位氨基酸残基之间区域的至少50个连续的氨基酸残基。

如在本申请中使用的，术语“膜突蛋白C-末端区段的水平”指在样品中检测到的膜突蛋白C-末端区段的量或浓度。如在本申请中使用的，术语“检测”指测定膜突蛋白C-末端区段的量或浓度的任意方法。测定方法可以是半定量的或定量的。测定可以直接或间接地进行。直接测定指根据来自肽自身的信号检测肽的量或浓度，并且信号的强度与样品中存在的肽分子数直接相关。此类信号(在本申请中有时称为强度信号)可以例如通过检测肽的特定物理或化学性质的强度值获得。间接测定包括测定来自间接成分(即，不是肽或多肽本身的成分)或生物读取系统(例如，可测定的细胞应答、配体、标记或酶促反应产物)的信号。

根据本申请，可以采用用于确定样品中肽量的任意适宜的方法实现对膜突蛋白C-末端区段水平的检测。在某些实施方式中，检测方法包括可以在各种夹心、竞争或其他测定形式中利用标记的分子的免疫测定设备和方法。所述测定将产生提示存在或不存在目标肽的信号。而且，信号强度可以优选地与样品中存在的目标肽的量直接或间接地(例如成反比)相关。而且适宜的方法包括测定目标肽特有的物理或化学性质，例如，目标肽精确的分子量或NMR波谱。适宜的检测方法还包括生物传感器、与免疫测定偶联的光学设备、生物芯片、分析设备如质谱仪、NMR分析仪或色谱设备。而且，适宜的检测方法可以包括基于微板的ELISA法、全自动或机器人免疫测定(例如在ELECSYS分析仪上进行)、CBA(酶促Cobalt结合测定，例如在Roche-Hitachi分析仪上进行)和乳胶凝集测定(例如在Roche-Hitachi分析仪上进行)。在某些实施方式中，通过测定从样品中获得的肽的特异性强度信号检测目标肽的水平。如上文所述，此类信号可以是在特异性针对目标肽的质谱或NMR波谱中观察到的以m/z(质荷比)变量观察的特异性针对目标肽的信号强度。

在某些实施方式中，通过将样品与同膜突蛋白C-末端区段特异性结合的试剂接触来检测膜突蛋白C-末端区段的水平。结合的试剂将产生强度信号。根据本申请的结合包括共价结合和非共价结合。与根据本申请的膜突蛋白C-末端区段结合的试剂可以是与本申请所述的膜突蛋白C-末端区段结合的任意化合物，例如肽、多肽、核酸或小分子。在某些实施方式中，结合试剂包括抗体、核酸、肽或多肽(如针对肽或其含有肽的结合结构域的片段的受体或结合伴侣)和适体(例如核酸或肽适体)。制备此类试剂的方法是本领域熟知的。例如，商业供应商也提供适宜抗体或适体的鉴定和生产。本领域技术人员熟知开发具有更高亲和性或特异性的此类试剂的衍生物的方法。例如，可以将随机突变引入核酸、肽或多肽中。然后可以根据本领域公知的筛选方法(例如噬菌体展示)测定这些衍生物的结合情况。

根据本申请的特异性结合指试剂基本上不与在待分析的样品中存在的另一种肽、多肽或底物结合(“交叉反应”)。优选地，特异性结合的肽或多肽的结合亲和性应比任意其他相关的肽或多肽的结合亲和性高至少3倍、更优选地至少10倍和甚至更优选地至少50倍。如果非特异性结合仍是显著的、可以明确检测的(例如根据其在Western印迹上的尺寸，或者在样品中具有相对较高的丰度)，那么也是可以接受的。可以采用本领域公知的任意方法检测试剂的结合。优选地，所述方法是半定量的或定量的。适宜的方法包括：(1)例如通过NMR或表面等离子体共振直接测定试剂的结合。(2)如果试剂还作为目标肽酶促活性的底物，则可以测定酶促反应产物(例如，可以通过例如使用Western印迹法测定裂解底物的量来测定蛋白酶的量)。或者，可以将其自身可以显示出酶促性质的试剂和与肽结合的试剂与能够通过产生强度信号检测的适宜底物接触。对于酶促反应产物的测定而言，优选底物的量是饱和的。在反应前还可以使用可检测的标记对底物进行标记。优选地，将样品与底物接触一段适宜的时间。一段适宜的时间指产生可检测的(优选可测量的)量的产物所需要的时间。除了测定产物的量以外，还可以测定出现给定量(例如可检测的量)的产物所需要的时间。(3)可以将试剂与使得试剂能够被检测和测量的标记共价或非共价偶联。可以利用直接或间接的方法进行标记。直接标记包括将标记与试剂直接(共价或非共价)偶联。间接标记包括将第二试剂与第一试剂(共价或非共价)结合。第二试剂应与第一试剂特异性结合。所述第二试剂可以与适宜的标记偶联和/或是与第二试剂结合的第三试剂的靶点(受体)。使用第二、第三或者甚至更高阶试剂通常是为了增加信号强度。适宜的第二级和更高阶的试剂可以包括抗体、二抗和熟知的抗生物素蛋白链菌素-生物素系统(Vector Laboratories,Inc.)。还可以使用一种或多种本领域公知的标签对试剂或底物进行“加标”。然后可以将此类标签作为更高阶试剂的靶点。适宜的标签包括生物素、地高辛、His-标签、谷胱甘肽-S-转移酶、FLAG、GFP、myc-标签、甲型流感病毒血凝素(HA)、麦芽糖结合蛋白等。在肽或多肽的情况下，所述标签优选在N-末端和/或C-末端。

适宜的标记是可以通过适宜的检测方法检测的任意标记。典型的标记包括金颗粒、乳胶小珠、吖啶酯、鲁米诺、钌、酶促活性标记、放射性标记、磁性标记(“例如磁性小珠”，包括顺磁性和超顺磁性标记)和荧光标记。酶促活性标记包括例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶及其衍生物。用于检测的适宜底物包括二氨基联苯胺(DAB)、3,3′-5,5′-四甲基联苯胺、NBT-BCIP(4-硝基蓝四唑氯化物和5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸盐，来自Roche Diagnostics的即用型储备液)、CDP-Star(Amersham Biosciences)、ECF(Amersham Biosciences)。适宜的酶-底物结合可以产生有色的反应产物、荧光或化学发光，可以根据本领域公知的方法对其进行检测(例如使用光敏薄膜或适宜的照相系统)。至于测定酶促反应，可以类似地应用上面给出的标准。

典型的荧光标记包括荧光蛋白(如GFP及其衍生物)、Cy3、Cy5、德克萨斯红(Texas Red)、荧光素和Alexa染料(例如Alexa 568)。其他的荧光标记可以来自例如Molecular Probes(Oregon)。使用量子点作为荧光标记也是可以预期的。典型的放射性标记包括35S、125I、32P、33P等。可以采用任意公知的和适宜的方法对放射性标记进行检测，例如光敏薄膜或磷光体成像仪。根据本申请的适宜的检测方法还包括沉淀(特别是免疫沉淀)、电化学发光(电致化学发光)、RIA(放射性免疫测定)、ELISA(酶联免疫吸附测定)、夹心酶免疫测试、电化学发光夹心免疫测定(ECLIA)、解离增强的镧系荧光免疫测定(DELFIA)、闪烁法、亲近测定(SPA)、比浊法、比浊测定法、乳胶增强的比浊法或比浊测定法或者固相免疫测试。可以单独使用本领域公知的其他方法(如凝胶电泳、2D凝胶电泳、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、Western印迹和质谱)或者将其与上文所述的标记或其他检测方法联用。

在某些优选的实施方式中，与膜突蛋白C-末端区段特异性结合的试剂是抗体或抗体片段。本申请所述的抗体包括多克隆和单克隆抗体、多价抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)及其片段，例如，能够结合抗原或半抗原的单链抗体、Fv、Fab和F(ab)₂片段。

在某些实施方式中，抗体优选是单克隆抗体。单克隆抗体是高度特异性地直接针对单一抗原的。在某些实施方式中，单克隆抗体通常包括包含与靶点结合的多肽序列的抗体，其中与靶点结合的多肽序列来自某一过程，该过程包括从多个多肽序列中选择与单一靶点结合的多肽序列。例如，所述选择过程可以是从多个克隆(例如，杂交瘤克隆、噬菌体克隆或重组DNA克隆的库)中选择独特的克隆。应理解，还可以进一步改变所选择的靶点结合序列，例如，从而改善对靶点的亲和性、将靶点结合序列人源化、改善其在细胞培养中的生产、降低其在体内的免疫源性、制备多特异性抗体等，并且包含改变的靶点结合序列的抗体也是本发明的单克隆抗体。为了筛选与同目标抗体结合的抗原上的表位结合的抗体，可以进行常规的交叉阻断测定，如在Antibodies,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Ed Harlow and David Lane(1988)中所描述的。

在某些实施方式中，可以按照如下所示检测膜突蛋白C-末端区段的水平：(a)将固体支持物与样品接触，所述固体支持物包含与如上所述的膜突蛋白C-末端区段特异性结合的试剂，所述样品包含膜突蛋白C-末端区段；和(b)检测与支持物结合的膜突蛋白C-末端区段的量。所述试剂优选以固化的形式存在于固体载体上，所述试剂优选选自下组：核酸、肽、多肽、抗体和适体。试剂可以与多种不同载体结合。熟知的载体的示例包括玻璃、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、聚碳酸酯、葡聚糖、尼龙、直链淀粉、天然和经修饰的纤维素、聚丙烯酰胺、琼脂糖和磁铁。用于本发明目的的载体的性质可以是可溶的或不可溶的。将所述试剂固定/固化于载体的适宜方法是熟知的并且包括但不限于离子、疏水性、共价相互作用等等。还考虑使用“悬浮阵列”作为根据本申请的阵列(Nolan 2002,Trends Biotechnol.20(1):9-12)。在这种悬浮阵列中，载体例如微珠或微球存在于悬浮液中。阵列由携带不同试剂的不同微珠或微球(可能进行了标记)组成。生产此类阵列的方法(例如基于固相化学和对光不稳定的保护基团)通常是已知的(美国专利号5,744,305)。

在某些实施方式中，检测来自根据本申请定义的对象的血液样品中膜突蛋白C-末端区段的水平。优选地，通过ELISA进行此类检测。

在某些实施方式中，将在对象的生物样品中检测到的膜突蛋白C-末端区段的水平与从参照样品检测到的膜突蛋白C-末端区段的参照水平进行了比较。

如在本申请中使用的，术语“比较”包括对由待分析的生物样品组成的膜突蛋白C-末端区段的水平与适宜参照样品的水平进行比较。应理解，如在本申请中使用的术语指相应的参数或值的比较，例如，将绝对量与绝对的参照量进行比较，将浓度与参照浓度进行比较，或者将来自测试样品的强度信号与参照样品同一类型的强度信号进行比较。比较可以人工或计算机辅助进行。对于计算机辅助比较而言，可以通过计算机程序将确定的量的值与在数据库中存储的相应适宜参照的值进行比较。可以使用计算机程序对比较结果进行进一步评估，并且以适宜的输出形式自动提供所需的评估。基于检测得到的膜突蛋白C-末端区段的水平与适宜的参照水平的比较，能够评估在所述对象中的癌症情况。

因此，在本申请中使用的术语“参照水平”指能够纳入或排除对象中癌症的存在或出现的阈值水平。例如，如果样品中的膜突蛋白C-末端区段的水平高于参照水平，则可以认为样品出现癌症或出现癌症的可能性增加。膜突蛋白C-末端区段的参照水平可以来自于一个或多个参照样品，其中参照水平来自与检测目标样品的实验平行进行的实验。或者，参照水平可以来自数据库，该数据库包括来自一个或多个参照样品或疾病参照样品的数据、标准或水平的集合。在某些实施方式中，对此类数据、标准或水平的集合进行了归一化以使得其能够用于与来自一个或多个样品的数据进行比较的目的。归一化(“normalize”或“normalization”)是一个过程，通过该过程可以将检测的原始数据转化为可以与其他已经过这样归一化的数据直接进行比较的数据。归一化用于克服由在一项测定与另一项测定之间可能改变的因素导致的测定特异性误差，例如由上样量、结合效率、检测灵敏度以及其他各种误差导致的改变。在某些实施方式中，参照数据库包括来自一个或多个参照样品的膜突蛋白C-末端区段的浓度和/或其他实验室和临床数据。在某些实施方式中，参照数据库包括膜突蛋白C-末端区段的水平，各水平均归一化为与参照样品在相同条件下测试的对照样品(例如已知量的膜突蛋白C-末端区段)的膜突蛋白C-末端区段水平的百分率。为了与此类归一化的膜突蛋白C-末端区段的水平进行比较，还测定待测样品的膜突蛋白C-末端区段的水平，并计算为在与待测样品相同条件下检测的对照样品膜突蛋白C-末端区段水平的百分率。在某些实施方式中，通过汇总来自从健康对象和/或无肿瘤对象(即已知无癌的对象)获得的参照样品的参照水平数据建立参照数据库。在某些实施方式中，通过汇总来自接受癌症治疗的个体的参照样品的参照水平数据建立参照数据库。在某些实施方式中，通过汇总来自通过例如膜突蛋白C-末端区段的不同水平证实处于不同阶段癌症的个体的参照样品的数据建立参照数据库。

可以由本领域技术人员根据所需的灵敏度和特异性选择参照水平。用于确定适宜参照水平的方法是本领域技术人员公知的，例如可以根据临床研究从受试者工作特征曲线(ROC)确定参照水平。

在一些实施方式中，在生物样品中检测的膜突蛋白C-末端区段的水平高于膜突蛋白C-末端区段的参照水平提示该对象出现癌症或出现癌症的可能性增加。优选地，在生物样品中检测的膜突蛋白C-末端区段的水平是膜突蛋白C-末端区段参照水平的至少2倍。更优选地，在生物样品中检测的膜突蛋白C-末端区段的水平是膜突蛋白C-末端区段参照水平的至少5倍。

在本申请中使用的“可能性增加”指与从其中获得参照样品的对象相比，对象出现癌症的可能性水平总体增加5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高。

在本申请中使用的术语“癌症”指涉及细胞失控生长的一大类疾病。癌症的示例包括但不限于急性淋巴细胞白血病、急性骨髓性白血病、肾上腺皮质癌、肛门癌、阑尾癌、星形细胞瘤、基底细胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨肉瘤、脑干胶质瘤、脑癌、小脑星形细胞瘤、室管膜瘤、成神经管细胞瘤、乳腺癌、支气管腺瘤、伯基特氏淋巴瘤、类癌瘤、胃肠类癌瘤、宫颈癌、慢性支气管炎、慢性淋巴细胞白血病、慢性骨髓性白血病、慢性骨髓增生性疾病、慢性阻塞性肺病、结肠癌、皮肤T-细胞淋巴瘤、肺气肿、子宫内膜癌、室管膜瘤、尤因氏肉瘤、颅外生殖细胞肿瘤、性腺外生殖细胞肿瘤、肝外胆管癌、视网膜母细胞瘤、胆囊癌、胃癌、神经胶质瘤、毛细胞白血病、头颈癌、心脏癌、肝癌、霍奇金氏淋巴瘤、下咽癌、眼内黑色素瘤、胰岛细胞癌、卡波西氏肉瘤、肾癌、喉癌、白血病、肺癌、黑色素瘤、神经母细胞瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、卵巢癌、胰腺癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、浆细胞瘤、胸膜肺母细胞瘤、前列腺癌、直肠癌、肾细胞癌、视网膜母细胞瘤、软组织肉瘤、子宫肉瘤、皮肤癌、鳞状细胞癌、胃癌、咽喉癌、甲状腺癌、子宫癌、阴道癌、外阴癌。

生物标记物和试剂盒

本申请的另一个方面提供了一种用于评估癌症的生物标记物，所述生物标记物基本上由膜突蛋白C-末端区段或C-末端区段的一部分组成。

如在本申请中使用的，“生物标记物”指指示对象中的正常或异常过程或者对象中的疾病或其他状况的靶分子或指征。生物标记物通常是可以通过多种方法检测和测量的，所述方法包括实验室测定和医学成像。

在某些实施方式中，本申请的生物标记物包含膜突蛋白C-末端区段的至少20个连续的氨基酸残基。在某些实施方式中，本申请的生物标记物包含膜突蛋白C-末端区段的至少50个连续的氨基酸残基。在某些实施方式中，膜突蛋白C-末端区段由人膜突蛋白第471-577位的氨基酸残基组成。

在另一个方面，本申请提供了膜突蛋白C-末端区段作为用于在对象中评估癌症的存在或出现的生物标记物的用途。

在另一个方面，本申请涉及膜突蛋白C-末端区段在制备用于在对象中评估癌症的存在或出现的检测剂中的用途。

在另一个方面，本申请提供了一种用于在对象中评估癌症的试剂盒，其中所述试剂盒包含用于检测样品中存在的膜突蛋白C-末端区段水平的方法。该试剂盒可以使用适于检测样品中存在的膜突蛋白C-末端区段水平的任意方法。在某些实施方式中，该试剂盒含有与膜突蛋白C-末端区段特异性结合的试剂。已在本申请的上文中公开了术语“试剂”和“特异性结合”。在优选的实施方式中，所述试剂是抗体。

在某些实施方式中，试剂盒还可以包含用户手册，其用于解释关于根据本申请中定义的在对象中评估癌症的任何检测的结果。特别地，此类手册可以包括关于哪种测定水平对应于哪种评估的信息。此外，此类用户手册可以提供关于正确使用用于检测膜突蛋白C-末端区段水平的试剂盒的组分的说明。在某些实施方式中，在单一容器中提供用于检测的工具和试剂盒的说明书。

治疗癌症的方法

本申请的另一个方面涉及一种在对象中治疗癌症的方法。该方法包括向对象施用药物组合物，所述药物组合物包含特异性调节膜突蛋白C-末端区段功能的试剂和药学上可接受的赋形剂。

如在本申请中使用的，术语“治疗”指试图改变被治疗对象中的疾病或状况的自然过程的临床干预，并且其能够用于预防或在临床病理过程中进行。治疗的理想效果包括预防疾病或状况的发生或复发、缓解症状、减轻疾病或状况任何直接或间接的病理后果、减慢疾病或状况的进展速率、改善或减轻疾病状态以及缓和或改善预后。

如在本申请中使用的，术语“调节”指控制以及调控膜突蛋白C-末端区段的功能。例如，所述试剂可以与膜突蛋白C-末端区段特异性结合并且隔绝C-末端区段与其他分子之间的相互作用。再例如，所述试剂可以与C-末端区段竞争结合其相互作用伴侣，如膜突蛋白C-末端尾部结构域通常结合的粘附分子。再例如，所述试剂可以修饰C-末端区段(例如磷酸化)从而改变C-末端区段的性质。又例如，所述试剂可以降解膜突蛋白C-末端区段并将其从对象中除去。

在某些实施方式中，所述试剂与膜突蛋白C-末端区段特异性结合。在优选的实施方式中，所述试剂是抗体。更优选地，所述试剂是单克隆抗体或其片段。在某些实施方式中，所述试剂是人源化的杂合抗体，其中将显示出所需抗原特异性的非人供体抗体的氨基酸序列与人受体抗体的序列组合。供体序列通常至少包含供体与抗原结合的氨基酸残基，但是还可以包含与供体抗体的结构和/或功能相关的其他氨基酸残基。可以采用本领域熟知的一些方法制备这种杂合物。

在某些实施方式中，试剂能够与膜突蛋白C-末端区段竞争结合粘附分子或细胞质膜或膜突蛋白C-末端结构域通常结合的其他细胞或分子成分。在优选的实施方式中，所述试剂是分离的肽，所述分离的肽基本上由膜突蛋白C-末端区段或其变体组成。

如在本申请中使用的，术语“分离的”指肽或核苷酸，此类肽或核苷酸1)基本上不含通常天然与其伴随或相互作用的组分，或者2)如果在此类肽或核苷酸的天然介质中发现它们，那么它们已被人工干预改变和/或将它们引入了原来并不含有它们的细胞中。

如在本申请中使用的，术语“变体”指基本上与目标肽(或核苷酸)同源的肽(或核苷酸)，它们与目标肽(或核苷酸)具有相同的生理、代谢或免疫学作用，或者与目标肽(或核苷酸)具有相同的用途。肽变体还包括由目标肽的翻译后修饰得到的肽，例如但不限于，糖基化、磷酸化或甲基化。

如在本申请中使用的，当肽变体的氨基酸序列(或核苷酸变体的核酸序列)与目标肽(或核苷酸)的氨基酸(或核酸)序列具有至少70％的同一性时，肽(或核苷酸)变体与目标肽(或核苷酸)是“基本上同源的”。在某些实施方式中，此类序列同一性是至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或者至少99％。

肽或核苷酸序列的术语“同一性”定义为在进行序列比对且如有必要引入间隙以达到序列同一性最大百分率后，以变体序列中的氨基酸或核酸残基与在目标肽或核苷酸中相同的氨基酸或核酸残基的百分比，并且不考虑将任何保守性取代作为序列同一性的一部分。可以采用本领域中的各种方法实现用于确定序列同一性百分率目的的比对，例如使用公众能够获得的计算机软件如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员能够确定用于测定比对的适宜参数，包括在待比较序列的全长范围内实现最大比对所需的任意算法。

在某些实施方式中，所述试剂是与SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列具有至少70％氨基酸序列同一性的膜突蛋白C-末端区段的变体。在某些实施方式中，所述试剂是与SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％氨基酸序列同一性的膜突蛋白C-末端区段的变体。

如在本申请中使用的，术语“赋形剂”指化学和药学上的惰性成分，其便于制备剂型或适于活性成分释放。赋形剂包括但不限于粘合剂、崩解剂、填充剂(或稀释剂)、助流剂、润滑剂、香料、甜味剂和染料。赋形剂是药学上可接受的含义是指其与制剂中的其他成分具有相容性并且对其受体无过度危害；并且其还可以减少活性剂任何不利的副作用。参见Wang等，J.Parent.Drug Assn.,34(6):452-462(1980)，其通过引用并入本申请。适于在根据本发明的组合物中使用的示例性的药物赋形剂列于Remington:The Science&Practice of Pharmacy,21^st ed.,Lippincott Williams&Wilkins(2006)；Physician's Desk Reference,64^th ed.,Thomson PDR(2010)；和Handbook of Pharmaceutical Excipients,6^th ed.,Eds.Raymond C.Rowe et al.,Pharmaceutical Press(2009)中，其通过引用并入本申请。

“有效量”指在所需剂量和时间内能够有效获得所需治疗或预防结果的量。本申请试剂的有效量可以随着因素而改变，例如疾病状态、年龄、性别和对象的体重以及试剂在对象中激发所需应答的能力。有效量也是治疗有益效果超过试剂的任何毒性或有害作用的量。有效量以及适宜给药剂量或途径的确定方法是本领域技术人员熟知的。

在另一个方面，本申请涉及膜突蛋白C-末端区段或其变体在制备用于在对象中治疗癌症的药物中的用途。

在另一个方面，本申请涉及一种分离的核苷酸序列，所述分离的核苷酸序列编码人膜突蛋白的第471-577位氨基酸残基或其变体。

提供下述实施例以说明本申请。其并非旨在以任何方式进行限制。

实施例1：制备与膜突蛋白C-末端区段或膜突蛋白N-末端区段结合的单克隆抗体

可以使用常规的杂交瘤方法制备针对膜突蛋白C-末端区段的单克隆抗体。为了产生具有SEQ ID NO:3所示序列的膜突蛋白C-末端区段，使用PCR扩增与图3中所示的SEQ ID NO:3描述的C-末端区段对应的cDNA片段。

将经PCR扩增的膜突蛋白C-末端区段的DNA片段克隆进入选自pET32a(+)和pET28a(+)的表达载体。然后使用所构建的载体转化大肠杆菌宿主细胞系BL21(DE3)进行培养和表达。使用限制性内切酶消化对所构建表达系统的C-末端结构域进行验证，随后进行测序以确证针对C-末端区段的表达具有正确的阅读框架。

进行充分培养后，回收表达C-末端区段的宿主细胞，以便根据标准蛋白表达和纯化方案收集和纯化C-末端区段。使用SDS-PAGE对所得到的蛋白片段进行测定以确证其性质和纯度。

然后使用BALB/C小鼠，根据常规的杂交瘤方法，使用表达的C-末端区段制备针对膜突蛋白C-末端区段的单克隆抗体。

Kohler和Milstein,Nature,256:495(1975)首次描述了该杂交瘤方法，其全部内容通过引用并入本申请。在一个典型的杂交瘤方法中，使用抗原(例如，如上文所述表达的膜突蛋白C-末端区段)免疫小鼠(例如，BALB/C小鼠)，然后将来自免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞融合。在选择性允许杂交瘤生长的培养基中收集融合细胞，并且培养出存活的杂交瘤集落。经过足够的时间后，通过使用抗原(例如C-末端区段)的ELISA检测和免疫组化测定筛选上清液。选择阳性细胞用于进一步的亚克隆。通过有限稀释将选择的克隆亚克隆。进行亚克隆直至所有的克隆均为ELISA阳性。然后对阳性克隆进行选择以获得产生针对抗原的单克隆抗体的杂交瘤。

以类似方法制备针对膜突蛋白N-末端区段的抗体。用于制备抗体的膜突蛋白N-末端区段具有本申请所述的SEQ ID NO:2第1-297位氨基酸残基的氨基酸序列，并且可以使用如上文所述的基因工程方法制备。

针对膜突蛋白全长或区段的抗体也是市售的。

实施例2：在癌症患者的血清中检测膜突蛋白的特定片段

从不同癌症患者中收集血清或血浆样品，并使用化学发光酶免疫测定法检测人膜突蛋白特定区段的存在情况，包括N-末端区段(第1-297位氨基酸残基)和C-末端区段(第471-577位氨基酸残基)。简言之，使用生物素标记的N-末端或C-末端膜突蛋白区段稀释样品，用于与包被了与所述区段特异性结合抗体的板竞争性结合。然后加入酶(辣根过氧化物酶)标记的抗生物素蛋白链菌素以结合生物素。洗涤后，显示发光信号以检测与板结合的酶标记的抗生物素蛋白链菌素。发光信号与样品中N-末端或C-末端区段的浓度成反比。

材料和方法

首先，在保持抗体处于天然状态的条件下，使用针对膜突蛋白N-末端或C-末端区段的高度纯化的抗体包被聚苯乙烯微孔板的孔。特别地，ELISA板(LUMITRAC^TM 600 96孔白色免疫学板，Greiner 655074)的每个微孔与约100ng针对膜突蛋白N-末端区段或C-末端区段的抗体在2℃至8℃下孵育12-16小时。然后使用PBS洗板1次，随后使用封闭溶液封闭，并真空干燥以供保存和随后使用。

为了检测样品中N-末端膜突蛋白区段的存在情况，从临床诊断患有转移性肉瘤或非转移性肉瘤的患者中收集和制备血清或血浆样品。还收集了健康个体的样品作为对照。使用PBS-T缓冲液(0.05％(v/v)吐温-20)稀释样品，所述PBS-T缓冲液含有利用EZ-Link^TMNHS-PEG4-生物素化试剂盒(Thermo Scientific，产品编号21455)制备的20ng/ml的生物素标记的N-末端膜突蛋白片段。然后将100ul稀释的样品加入各孔中，使得样品中存在的生物素标记的N-末端膜突蛋白区段或任意N-末端膜突蛋白区段与各孔中固化的抗体结合。使用PBS-T缓冲液洗去未结合的N-末端膜突蛋白区段(生物素标记的或未标记的)。然后将抗生物素蛋白链菌素-HRP(Invitrogen Life Technologies,SA100-01)加入各孔中以结合附着于微孔上的生物素标记的N-末端膜突蛋白区段。在将全部未结合的抗生素蛋白链菌素HRP洗去后，加入化学发光底物(SuperSignal ELISA Femto最大灵敏度底物，Pierce 37074)，并使用光度计(Thermo Scientific Luminoskan Ascent)检测和测量发光信号。

使用与上述类似的方法检测C-末端膜突蛋白片段的存在情况。

我们还使用夹心ELISA法确定样品中全长膜突蛋白的存在情况。简言之，按照如上文所述制备使用针对N-末端膜突蛋白区段的抗体包被的板。将未与生物素标记的N-末端膜突蛋白区段混合的样品加入板中。在洗去未结合的蛋白之后，将针对C-末端膜突蛋白的抗体加入各微孔中以检测全长膜突蛋白的存在情况。

对于统计分析而言，使用Student’s t检验(双侧检验)评估不同组之间N-末端或C-末端膜突蛋白浓度的差异。当p<0.05时差异具有统计学意义。

结果

如图4和表1中所示，与健康个体相比，来自癌症患者的样品具有显著性更高的C-末端膜突蛋白区段浓度(p<0.01)。相比之下，在癌症患者中N-末端膜突蛋白区段的浓度未具有统计学意义的显著高于健康个体(p＝0.17)。在样品中未检测到全长膜突蛋白。

如表2所示，在70.8％来自癌症患者的样品中检测到了C-末端膜突蛋白区段，但是仅在12.5％来自健康个体的样品中检测到了C-末端膜突蛋白区段。而相反的是，在87.5％来自癌症患者的样品中和在75％来自健康个体的样品中检测到了N-末端膜突蛋白区段。

因此，可以将C-末端膜突蛋白区段的存在情况作为癌症的生物标记物。

表1：样品中N-末端或C-末端膜突蛋白区段的浓度

表2：样品中N-末端或C-末端膜突蛋白区段的存在情况

*癌症组包括骨肉瘤、尤文氏肉瘤、软骨肉瘤、巨细胞肿瘤、脂肪肉瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、胰腺癌、胶质母细胞瘤、乳腺癌、卵巢癌、多发性骨髓瘤、胃癌和前列腺癌患者。

尽管已参照特定实施方式(其中的一些是优选实施方式)特别地示出和描述了本发明，本领域技术人员应理解，在不脱离如本申请所公开的本申请的主旨和范围的前提下，可以对本申请的形式和细节做出各种改变。