包含突变的RAS肽和化疗剂的肽疫苗的制作方法

本发明提供RAS蛋白的至少一种肽，其用于治疗癌症。本发明还涉及用于所述用途的所述至少一种肽的药物制剂。

发明背景

癌症发作的遗传背景是原癌基因、癌基因和肿瘤抑制基因的改变。原癌基因是细胞具有变成癌基因的潜能的正常基因。所有癌基因都编码蛋白并且通过蛋白来行使功能。在大部分情况中，其被证明是信号转导通路的组分。在自然中癌基因通过点突变或易位而由原癌基因产生，由此导致载有所述突变的细胞的转变状态。癌症通过涉及癌基因和肿瘤抑制细胞中的若干突变事件的多步过程而发展。

在其最简单的形式中，原癌基因中的单碱基置换可能导致编码的蛋白有一个氨基酸不同。

在涉及鼠肿瘤的实验模型中，已经证明细胞内“自我”-蛋白的点突变可能产生由与正常的肽具有单个氨基酸差异的肽组成的肿瘤排斥抗原。在肿瘤细胞表面上的主要组织相容性(MHC)分子的背景中识别这些肽的T细胞能够杀死肿瘤细胞并因此将肿瘤排出宿主。(Boon，T.等人，Cell 1989，Vol.58，p.293-303)

在近三十年，专门的努力致力于分析人肿瘤抗原的抗体。已经表明此种抗体可以用于诊断和治疗目的两者，例如连同抗癌剂一起。一个问题是抗体仅能够结合暴露在肿瘤细胞的表面上的肿瘤抗原。因为这一原因，产生基于身体免疫系统的癌症治疗的努力不如预期的成功。

抗体典型地识别天然构象的游离抗原并且可以有效地识别暴露在抗原表面上几乎任何位点。相对于由B细胞产生的抗体，T细胞仅识别在MHC分子背景中的抗原，所述抗原在人中被称为HLA(人白细胞抗原)，并且所述识别仅在适当的抗原加工之后，所述抗原加工通常由蛋白的蛋白水解片段化组成，其产生适配到MHC分子的沟中的肽。这使得T细胞能够识别来源于胞内蛋白的肽。T细胞可以因此识别来源于肿瘤细胞中的任何地方的异常肽(当其被MHC分子展示在肿瘤细胞表面上时)。随后T细胞可以被激活以消除带有异常肽的肿瘤细胞。

T细胞可以通过多种机制控制癌症的发展和生长。细胞毒性T细胞(HLA I类限制性CD8+和HLA II类限制性CD4+两种)可以直接杀死带有适当的肿瘤抗原的肿瘤细胞。需要CD4+辅助T细胞来诱导和保持细胞毒性T细胞反应以及抗体反应，并且诱导巨噬细胞和淋巴因子活化的杀伤细胞(LAK细胞)杀伤。

已经鉴定了很多癌基因及其蛋白产物。此外，已经证明健康人的T细胞库(repertoire)包括对被递呈在适当的HLA分子上时的来源于一种p21RAS癌基因产物的合成的肽片段具有特异性的T细胞。此外，预期全部癌症中有大约20％与RAS癌基因的突变相关。

WO 92/14756公开了引起T细胞免疫性的癌基因蛋白产物的合成的肽和片段，其用于针对与RAS相关的癌症的疫苗和用于治疗癌症的组合物。所述肽对应于由癌细胞递呈的癌基因的活性片段，并且在对应于癌基因突变的一个或多个位置处包括突变。该文献公开了在RAS蛋白的位置12、13和61处的突变，并且具体公开了G12A、G12V、G12C、G12S、G12K、G12D、G12R、Q61R、Q61K、Q61L、Q61H、G13V和G13D突变。虽然该文献提及疫苗可以包含具有在癌基因蛋白中发现的最常见的突变的肽的选择，但是其没有提示肽的任何具体组合。

WO 00/66153讨论了用于癌症疫苗的引起T细胞免疫性的合成的肽混合物。所述肽混合物由RAS p21突变体肽组成，并且该文献具体公开了G12A、G12C、G12D、G12R、G12S、G12V、Q61H、Q61K、Q61L、Q61R和G13D突变。该文献还公开了由肽混合物引起的免疫应答显著高于由单个肽引起的免疫应答。然而，其未提示将肽疫苗与任何其他形式的治疗一起用于癌症的联合治疗。

Gjertsen等人(Int.J.Cancer 2001，92，p.441-450)公开了涉及用合成的突变体RAS肽与粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子联合给患有胰腺的腺癌的患者进行疫苗接种的I/II期试验。该试验使用单肽疫苗或四种突变体肽的混合物。组合疫苗由四种在胰腺癌中发现的最常见的K-RAS突变组成，即具有G12V、G12D、G12C或G12R突变的肽。该文献未提示与抗代谢物化疗剂联合治疗可能有效。

Wedén等人(Int.J.Cancer 2010，128(5)，p.1120-1128)报道了用合成的突变体RAS肽进行疫苗接种的患有胰腺癌的患者的长期随访。所述疫苗由单个的RAS肽或七种RAS肽的混合物组成。具体地，用于该试验的七种RAS肽具有G12A、G12C、G12D、G12R、G12S、G12V或G13D突变。没有提到与抗代谢物化疗剂的联合治疗。

Prior等人(Cancer Res.2012，72(10)，p.2457-2467)公开了不同类型的癌症与特定RAS同种型的突变相关，并且各同种型具有与众不同的密码子突变特征。此外，Prior等人公开了在RAS蛋白的位置12、13和61中出现总计18种突变，每个位置出现六种突变。该综述还讨论了这些突变对RAS功能的影响以及导致RAS同种型突变的差异模式的潜在机制。

之前的不相关的癌症患者治疗是系统性施用化疗剂吉西他滨(gemcitabine)。吉西他滨是目前常见的用于患有各种癌症的患者的化疗疗法，所述癌症如非小细胞肺癌、胰腺癌、膀胱癌和乳腺癌。尤其是，吉西他滨常用于治疗晚期胰腺癌。

吉西他滨是抗代谢物化疗剂，特别是嘧啶类似物。吉西他滨的三磷酸盐类似物在DNA复制过程中替代胞苷，并且插入延长的DNA链，在加入再一个核苷酸后中止进一步的DNA合成，原因在于DNA聚合酶不能前进。作用的进一步机制被认为是包括抑制核糖核苷还原酶，导致DNA合成所需的脱氧核糖核苷酸池消耗，并且与三磷酸脱氧胞苷竞争作为DNA聚合酶的抑制剂。这些作用造成坏死，导致肿瘤生长停滞。该作用还意为，抗代谢物化疗剂对其他活跃分裂的细胞如T细胞有毒性。优选的方案包括首先使用化疗，接着疫苗接种以增强之后对来自杀伤的癌细胞的免疫应答的诱导。

尽管一些药物组合，如FOLFIRINOX，已经显示比吉西他滨在患有转移性胰腺癌的患者中更有效，但是利用该组合的治疗与高的副作用发生率相关(Conroy等人，N Engl J Med 2011，vol.364(19)，P.1817-1825)。因此，希望找到用于治疗癌症的新策略。

Oettle等人(JAMA 2007，297(3)，p.267-277)报道了在可切除胰腺癌中使用吉西他滨作为辅助化疗的研究，并且公开了吉西他滨对不患病存活的作用在具有R0或R1切除的患者中显著。尤其是，该研究公开了，与在切除后未施用吉西他滨的患者相比，在完全切除胰腺癌后，手术后的吉西他滨显著延迟复发疾病的发展。然而，该研究未提示吉西他滨能够与其他癌症药物疗法联合使用。

Bauer等人(Cancer Immunol.Immunother.2014，63，p.321-333)公开了吉西他滨对树突细胞(DC)疫苗诱导的T-细胞增殖具有消极影响。尤其是，该研究表明，与DC疫苗相比，延迟施用吉西他滨不改善患者的免疫应答，而共同施用吉西他滨和DC疫苗显著损害疫苗诱导的免疫应答。

因此，需要提供进一步的并且更有效的癌症疗法。

发明概述

本发明产生是因为现在已经出人意料地发现，与单独施用RAS肽疫苗相比，与抗代谢物化疗剂(吉西他滨)联合施用RAS肽疫苗显著改善患者的免疫应答。这是预料之外的，因为之前据信，向患者施用抗代谢物化疗剂，如吉西他滨，引起增殖的免疫细胞(包括增殖的T细胞)的细胞死亡，由此将会降低患者的免疫系统的活性，并且由此降低患者对同时或顺序施用的肽疫苗的免疫应答。不希望受理论限制，据信，事实上，抗代谢物化疗剂造成的细胞死亡可以导致产生系统性免疫原性环境的信号传导分子的释放，由此促进已经诱导的免疫应答和促进进一步诱导的免疫应答。因此，抗代谢物化疗剂实际上增强，而不是降低针对肽疫苗的免疫应答。

在本发明的第一方面，提供至少一种适于诱导免疫应答的肽，其中所述肽或每种肽对应于RAS蛋白的片段但具有RAS蛋白的一至三个点突变，其用于通过与抗代谢物化疗剂同时或顺序施用来治疗癌症。

有利地，所述肽或每种肽包含包括RAS蛋白的位置12或13的至少8个氨基酸的区域，其中所述区域除了位置12或13外分别具有与RAS蛋白的相应区域相同的至少6个氨基酸残基，并且其中所述肽或每种肽分别在对应于所述位置12或13的氨基酸残基处具有点突变。

方便地，所述点突变中的一个选自G13A，G13C，G13D，G13R，G13S，G13V，G12A，G12C，G12D，G12R，G12S或G12V突变。

优选，所述至少一种肽包括两种以上的肽，每个肽具有不同的点突变。

有利地，所述至少一种肽包括：

具有G13D突变的肽

具有G12A突变的肽

具有G12C突变的肽

具有G12D突变的肽

具有G12R突变的肽

具有G12S突变的肽，和

具有G12V突变的肽，

优选其中所述至少一种肽包括由SEQ ID NO：13表示的序列组成的肽，由SEQ ID NO：14表示的序列组成的肽，由SEQ ID NO：15表示的序列组成的肽，由SEQ ID NO：16表示的序列组成的肽，由SEQ ID NO：17表示的序列组成的肽，由SEQ ID NO：18表示的序列组成的肽和由SEQ ID NO：19表示的序列组成的肽。

方便地，所述至少一种肽包括：

具有G13D突变的肽

具有G13C突变的肽

具有G12A突变的肽

具有G12C突变的肽

具有G12D突变的肽

具有G12R突变的肽

具有G12S突变的肽，和

具有G12V突变的肽，

优选其中所述至少一种肽包括由SEQ ID NO：13表示的序列组成的肽，由SEQ ID NO：14表示的序列组成的肽，由SEQ ID NO：15表示的序列组成的肽，由SEQ ID NO：16表示的序列组成的肽，由SEQ ID NO：17表示的序列组成的肽，由SEQ ID NO：18表示的序列组成的肽，由SEQ ID NO：19表示的序列组成的肽和由SEQ ID NO：20表示的序列组成的肽。

优选地，所述抗代谢物化疗剂是嘧啶类似物，或其药用盐。

有利地，所述嘧啶类似物是吉西他滨，或其药用盐。

方便地，所述癌症包含表达突变的RAS蛋白的细胞。

优选地，所述癌症是胰腺癌。

方便地，所述胰腺癌是切除的胰腺癌。

有利地，所述抗代谢物化疗剂在首次剂量的至少一种肽之后至少三周首次施用。

方便地，所述抗代谢物化疗剂在手术切除胰腺癌之后12周以内首次施用。

优选地，所述抗代谢物化疗剂在至少一种肽的24小时内施用。

有利地，所述抗代谢物化疗剂在已经施用至少一种肽之后施用。

方便地，所述至少一种肽以每剂量0.01-10mg，优选0.1-2mg，并且更优选0.7mg的剂量施用。

优选地，所述抗代谢物化疗剂以100-10,000mg/m²，优选500-2000mg/m²，并且更优选1000mg/m²的剂量施用。

有利地，所述至少一种肽和抗代谢物化疗剂以至少两个阶段(instance)，并且更优选以至少三个阶段同时或顺序施用，其中每个施用阶段间隔至少一周，并且更优选至少2周。

在本发明的第二方面，提供至少一种对根据上述第一方面的至少一种肽特异的T-细胞，或包含对呈递到MHC分子上时的根据上述第一方面的至少一种肽特异的T-细胞的T-细胞制剂，其用于通过与抗代谢物化疗剂同时或顺序施用来治疗癌症。

在本发明的第三方面，提供药物组合物，其包含根据上述第一方面的至少一种肽，或根据上述第二方面的至少一种T-细胞或T-细胞制剂，其用于通过与抗代谢物化疗剂组合或顺序施用治疗癌症。

在本发明的第四方面，提供试剂盒，其包含分别含有根据上述第一、第二或第三方面的所述的至少一种肽、T细胞或药物组合物的第一产品，和包含上述方面中所述的抗代谢物化疗剂的供给的第二产品。

在本发明的第五方面，提供治疗癌症的方法，其包括向有此需要的患者施用分别如上述第一、第二或第三方面的所述的至少一种肽、T细胞或药物组合物，和如上述方面中所述的抗代谢物化疗剂。

术语“肽”，当在本文中使用时，是指作为较长的蛋白的片段(或具有对应于较长的蛋白的片段的序列)的氨基酸残基的聚合物。该术语还适用于这样的氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸残基是修饰的残基，或非天然存在的残基，如相应的天然存在的氨基酸的人工化学拟似物，以及天然存在的氨基酸聚合物。

两个序列之间的百分比“同一性”可以使用BLASTP算法版本2.2.2(Altschul，Stephen F.，Thomas L.Madden，Alejandro A.Jinghui Zhang，Zheng Zhang，Webb Miller和David J.Lipman(1997)，″Gapped BLAST and PSI-BLAST：a new generation of protein database search programs″，Nucleic Acids Res.25：3389-3402)使用默认参数来确定。特别地，可以在互联网上使用URL http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/来访问BLAST算法。

术语“免疫应答”，当在本文中使用时，在一些实施方案中是指在主要组织相容性(MHC)分子将肽递呈在细胞表面上后T细胞介导的免疫应答，并且特别地是指在肽的递呈后的T细胞的激活。

术语“RAS蛋白”，当在本文中使用时，是指由ras原癌基因编码的那类小GTP酶蛋白并且包括RAS蛋白的全部三种同种型：HRAS、KRAS和NRAS。在一些实施方案中，术语“RAS蛋白”是指对应于UniProtKB/Swiss-Prot登记号P01112.1并且如SEQ ID NO：23中所示的蛋白。

术语“RAS蛋白的位置13”，当在本文中使用时，是指从N端数起，形成野生型RAS蛋白的一级结构的氨基酸链中的第十三个氨基酸。

术语“RAS蛋白的位置12”，当在本文中使用时，是指从N端数起，形成野生型RAS蛋白的一级结构的氨基酸链中的第十二个氨基酸。

术语“对应于位置13的氨基酸”，当在本文中使用时，表示RAS蛋白的肽中的位于所述肽的氨基酸链中在对应于RAS蛋白的氨基酸序列的第十三个氨基酸(从N端数起)的位置处的氨基酸。术语“对应于位置12的氨基酸”具有相应的意义。

术语“RAS蛋白突变”，当在本文中使用时，是指在存在于取自受试者的样品中的RAS蛋白中存在的一个或多个点突变。

术语“点突变”，当在本文中使用时，是指蛋白产物的多肽链中的单个氨基酸残基被不同的氨基酸残基代替。

术语“一至三个点突变”，当在本文中使用时，意为一个点突变或两个点突变或三个点突变。

术语，例如，“G12V突变”，当在本文中使用时，是指使得野生型RAS蛋白的位置12处的甘氨酸(G)被缬氨酸(V)代替的点突变。类似的定义适用于类似的术语，如G13C、G13R等。

术语“药物组合物”，当在本文中使用时，表示适用于出于治疗目的而向目标人或动物受试者施用的药物制剂。

术语“抗代谢物化疗剂”，当在本文中使用时，意为具有抑制患者的细胞生长或细胞分裂的效果并且用作癌症的治疗型治疗的产品。

术语“吉西他滨”，当在本文中使用时，意为IUPAC名称为4-氨基-1-(2-脱氧-2，2-二氟-β-D-红-五呋喃糖基)嘧啶-2(1H)-酮的化合物，其具有以下结构式：

术语“其药用盐”，当在本文中使用时，意为通过允许游离形式化合物与酸或碱反应形成的盐。药用盐的实例包括氢卤酸盐，如氢氟酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐和氢碘酸盐；无机酸盐，如盐酸盐、硝酸盐、高氯酸盐、硫酸盐和磷酸盐；低级烷磺酸盐，如甲磺酸盐、三氟甲磺酸盐和乙磺酸盐；芳基磺酸盐，如苯磺酸盐和对甲苯磺酸盐；有机酸盐，如乙酸盐、苹果酸盐、延胡索酸盐、琥珀酸盐、柠檬酸盐、抗坏血酸盐、酒石酸盐、草酸盐和马来酸盐；碱金属盐，如钠盐、钾盐和锂盐；碱土金属盐，如钙盐和镁盐；金属盐，如铝盐和铁盐；无机盐，如铵盐；胺盐，包括有机盐，如叔-辛基胺盐、二苯甲基胺盐、吗啉盐、葡糖胺盐、苯基甘氨酸烷基酯盐、乙二胺盐、N-甲基葡糖胺盐、胍盐、二乙胺盐、三乙胺盐、二环己基胺盐、N，N′-二苯甲基乙二胺盐、氯普鲁卡因盐、普鲁卡因盐、二乙醇胺盐、N-苄基苯乙胺盐、哌嗪盐、四甲基铵盐、和三(羟甲基)氨基甲烷盐；和氨基酸盐，如甘氨酸盐、赖氨酸盐、精氨酸盐、鸟氨酸盐、谷氨酸盐和天冬氨酸盐。

术语“顺序施用”，当在本文中使用时，意为向患者施用两种产品，其中所述两种产品不同时施用。在一些实施方案中，顺序施用的每个阶段意为所述两种产品间隔少于5天、4天、3天、2天或1分别施用。

附图简述

图1是显示在每名患者中记录阳性DTH反应的时间点的表。¹DTH未评估；²NT：未治疗。

图2是显示在诱导免疫应答的过程中，吉西他滨对DTH反应起作用后的协同辅助效果的图表。

序列表简述

SEQ ID NO：1显示具有G13C突变的RAS肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：2显示具有G13R突变的RAS肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：3显示具有G13D突变的RAS肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：4显示具有G13V突变的RAS肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：5显示具有G13A突变的RAS肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：6显示具有G13S突变的RAS肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：7显示具有G12A突变的RAS肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：8显示具有G12C突变的RAS肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：9显示具有G12D突变的RAS肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：10显示具有G12R突变的RAS肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：11显示具有G12S突变的RAS肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：12显示具有G12V突变的RAS肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：13显示具有G13D突变的TG01和TG02的RAS肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：14显示具有G12A突变的TG01和TG02的RAS肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：15显示具有G12C突变的TG01和TG02的RAS肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：16显示具有G12D突变的TG01和TG02的RAS肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：17显示具有G12R突变的TG01和TG02的RAS肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：18显示具有G12S突变的TG01和TG02的RAS肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：19显示具有G12V突变的TG01和TG02的RAS肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：20显示具有G13C突变的TG02的RAS肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：21显示具有G13R突变的RAS肽的备选氨基酸序列。

SEQ ID NO：22显示具有G13V突变的RAS肽的备选氨基酸序列。

SEQ rD NO：23显示野生型RAS蛋白的全长氨基酸序列。

发明详述

在通常意义上，本发明涉及RAS蛋白的至少一种肽，其用于通过与抗代谢物化疗剂同时或顺序施用来治疗癌症。至少一种肽的每种肽具有RAS蛋白的一至三个点突变。

根据本发明使用的所述肽或每种肽可以是对应于HRAS、KRAS或NRAS中任一种的肽。这些RAS同种型中的所有三种共有在负责GDP/GTP结合的所有区域(即在癌症中进行突变的区域)中的序列同一性。

在优选的实施方案中，所述一至三个点突变中的至少一个是对应于由RAS癌基因编码的突变的点突变，例如在RAS蛋白的位置12，13或61处的点突变。

在一些实施方案中，所述肽或每种肽包含至少8个、至少9个、至少10个、至少12个、至少16个、至少17个、至少18个、至少20个、至少24个或至少30个氨基酸。在优选的实施方案中，所述至少一种肽或每种肽包含至少8个氨基酸。在其他优选的实施方案中，所述至少一种肽或每种肽包含至少17个氨基酸。

在一些实施方案中，所述肽或每种肽包含包括RAS蛋白的位置12或13的至少8个氨基酸残基的区域。在优选的实施方案中，所述肽或每种肽的点突变在所述位置12或13的氨基酸残基处。

在一些实施方案中，所述肽或每种肽在包含位置13的区域之外的位置与RAS蛋白具有至少20％、至少25％、至少30％、至少37％、至少50％、至少60％、至少66％、至少75％、至少85％、至少95％、至少99％或100％的序列同一性。在一些实施方案中，所述肽或每种肽在包含位置13的区域之外的位置与SEQ ID NOs 1-6中的一个具有至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少66％、至少75％、至少85％、至少95％、至少99％或100％的序列同一性。在优选的实施方案中，所述肽或每种肽在包含位置13的区域之外的位置与SEQ ID NOs：1-6中的一个具有至少95％的序列同一性。在其他实施方案中，所述肽或每种肽在包含位置13的区域之外的位置与SEQ ID NOs：1-6中的一个具有100％的序列同一性。

在一些实施方案中，所述至少一种肽包含在包含位置13的区域之外的位置与SEQ ID NOs：1-6中的一个具有百分比序列同一性的第一肽和在包含位置13的区域之外的位置与SEQ ID NOs：1-6的另一个具有不同百分比序列同一性的第二肽。在其他实施方案中，第一肽在包含位置13的区域之外的位置与SEQ ID NOs：1-6中的一个具有百分比序列同一性，并且第二肽在包含位置13的区域之外的位置与SEQ ID NOs：1-6中的另一个具有相同的百分比序列同一性。在所有实施方案中，所述肽或每种肽能够引发免疫应答。

上述实施方案中的至少一种肽的第一肽和第二肽中的每一个在RAS蛋白的位置13具有点突变，其中第一肽中的点突变不同于第二肽中的点突变。野生型RAS蛋白在位置13包含甘氨酸(G)。因此，位置13的突变可以是从甘氨酸到任何其他氨基酸的点突变。然而，已经发现G13A、G13C、G13D、G13R、G13S和G13V突变与癌症特别相关。因此，在优选的实施方案中，所述肽或每种肽的点突变独立地是G13A、G13C、G13D、G13R、G13S或G13V突变之一。在更优选的实施方案中，第一肽和第二肽之一在位置13处的点突变独立地是G13C或G13D突变。在特别优选的实施方案中，第一肽或第二肽之一在位置13处的点突变是G13C突变。在其他特别优选的实施方案中，第一肽或第二肽之一在位置13处的点突变是G13D突变。

在一些实施方案中，第一肽或第二肽在位置13处的点突变是G13C突变，并且另一种肽在位置13处的点突变是G13D突变。

在其他实施方案中，第一肽或第二肽在位置13处的点突变是G13R突变，并且另一种肽在位置13处的点突变是G13V突变。

在一些实施方案中，存在两种以上RAS蛋白的肽，其具有RAS蛋白的一至三个点突变，其用在通过与抗代谢物化疗剂同时或顺序施用治疗癌症的方法中。第二肽或更多的肽中的每个独立地包含至少8个、至少9个、至少10个、至少12个、至少16个、至少17个、至少18个、至少20个、至少24个或至少30个氨基酸。在优选的实施方案中，每种肽包含至少8个氨基酸。在其他优选的实施方案中，每种肽包含至少17个氨基酸。在进一步的实施方案中，每种肽包含至少18个氨基酸。通常，肽混合物中的每种肽可以包含与一种或多种其他肽不同数量的氨基酸。每种肽具有至少一个不同于其他一种或多种肽的点突变。

在本发明的备选实施方案中，所述至少一种肽可以包括RAS蛋白的至少第三肽，其包含包括RAS蛋白的位置13的至少8个氨基酸的区域。所述至少第三肽可以在对应于RAS蛋白的位置13的氨基酸处具有点突变，该点突变不于第一和第二肽的位置13的突变。所述点突变可以是G13A、G13C、G13D、G13R、G13S或G13V突变中的一个，独立于第一和第二肽的点突变。

本发明的至少一种肽可以另外包括RAS蛋白的至少一种其他肽，其包含至少8个氨基酸的区域。在一些实施方案中，所述至少一种其他肽的所述区域包括RAS蛋白的位置12。

在至少一种肽包括至少第三肽的实施方案中，每种肽独立地包含至少8个、至少9个、至少10个、至少12个、至少16个、至少17个、至少18个、至少20个、至少24个或至少30个氨基酸。在优选的实施方案中，每种肽包含至少8个氨基酸。在其他优选的实施方案中，每种肽包含至少17个氨基酸。在进一步的实施方案中，每种肽包含至少18个氨基酸。通常，所述至少一种肽中的每种肽可以包含与所述至少肽中的一种以上其他肽不同数量的氨基酸。

在至少一种肽包括至少一种包含包括RAS蛋白的位置12的区域的肽的实施方案中，对应于RAS蛋白的位置12的氨基酸具有点突变。在野生型RAS蛋白中，位置12的氨基酸是甘氨酸(G)。因此，在一些实施方案中，位置12处的点突变可以是除甘氨酸之外的氨基酸。在一些实施方案中，每个突变独立地是G12A、G12C、G12D、G12R、G12S或G12V突变。在其他实施方案中，所述至少一种其他肽在包含位置12的区域之外的位置处与RAS蛋白具有至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少66％、至少75％、至少85％、至少95％、至少99％或100％的序列同一性。在一些实施方案中，所述至少一种肽在包含位置12的区域之外的位置处与SEQ ID NO：7-12之一具有至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少66％、至少75％、至少85％、至少95％、至少99％或100％的序列同一性。在一些实施方案中，存在多于一种RAS蛋白的肽，其包含包括RAS蛋白的位置12的至少8个氨基酸的区域，并且在对应于RAS蛋白的位置12的氨基酸处具有点突变。在所述实施方案中，每种具有位置12非突变的肽具有不同的点突变。

在一些实施方案中，所述至少一种肽包括至少两种RAS蛋白的肽，每种包含包括RAS蛋白的位置12的至少8个氨基酸的区域。位置12处的点突变可以是G12A、G12C、G12D、G12R、G12S或G12V突变之一。包括RAS蛋白的位置12的至少两种肽可以在包含位置12的区域之外的位置与RAS蛋白具有至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少66％、至少75％、至少85％、至少95％、至少99％或100％的序列同一性。在一些实施方案中，包含包括位置12的至少8个氨基酸的区域的至少两种肽在包含位置12的区域之外的位置处与SEQ ID NOs：7-12和14-19之一具有至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少66％、至少75％、至少85％、至少95％、至少99％或100％的序列同一性。在所述至少一种肽中设想上述突变和SEQ ID Nos的任意组合，用于本发明所述的应用。

在一些实施方案中，所述至少一种肽由下述组成：具有G13D突变的肽，具有G12A突变的肽，具有G12C突变的肽，具有G12D突变的肽，具有G12R突变的肽，具有G12S突变的肽，和具有G12V突变的肽。在所述实施方案中，所述至少一种肽独立地在包含位置12或13的区域之外的位置分别与SEQ ID NOs：3，7，8，9，10，11和12具有至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少66％、至少75％、至少85％、至少95％、至少99％或100％的序列同一性。在一些实施方案中，所述肽混合物由独立地在包含位置12或13的区域之外的位置分别与SEQ ID NOs：13-19具有至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少66％、至少75％、至少85％、至少95％、至少99％或100％的序列同一性的肽组成。在与SEQ ID NOs：13-19具有100％的序列同一性时，本发明的该实施方案在本文中称为TG01。表3显示优选存在于TG01中的肽。

在一些实施方案中，所述至少一种肽由下述组成：具有G13C突变的肽，具有G13D突变的肽，具有G12A突变的肽，具有G12C突变的肽，具有G12D突变的肽，具有G12R突变的肽，具有G12S突变的肽，和具有G12V突变的肽。在所述实施方案中，所述至少一种肽独立地在包含位置12或13的区域之外的位置分别与SEQ ID NOs：1，3，7，8，9，10，11和12具有至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少66％、至少75％、至少85％、至少95％、至少99％或100％的序列同一性。在一些实施方案中，所述肽混合物由独立地在包含位置12或13的区域之外的位置分别与SEQ ID NOs：13-20具有至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少66％、至少75％、至少85％、至少95％、至少99％或100％的序列同一性的肽组成。在与SEQ ID NOs：13-20具有100％的序列同一性时，本发明的该实施方案在本文中称为TG02。表4显示优选存在于TG02中的肽。

通常，根据本发明使用的所述至少一种肽或每种肽，在包括位置12或13的8个氨基酸的区域内，分别在位置12或13的残基之外具有与RAS蛋白的相应区域相同的至少6个氨基酸残基。此外，通常，根据本发明使用的所述至少一种肽或每种肽，在包括RAS蛋白的位置12或13的区域之外的位置分别与SEQ ID NOs：1-20之一具有至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少66％、至少75％、至少85％、至少95％、至少99％或100％的序列同一性。

在一些实施方案中，所述至少一种肽由第一、第二、第三和第四肽组成。第一和第二肽各自在RAS蛋白的位置13处具有点突变，其中第一肽中的点突变不同于第二肽中的点突变。第一和第二肽中的每种的点突变独立地是G13A、G13C、G13D、G13R、G13S或G13V突变之一。第三和第四肽中的每种包含包括RAS蛋白的位置13的至少8个氨基酸的区域，并且第三和第四肽中的每一个独立地在包括位置13的区域之外的位置与RAS蛋白具有至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少66％、至少75％、至少85％、至少95％、至少99％或100％的序列同一性。第三和第四肽中的每种可以独立地在包括位置13的区域之外的位置与SEQ ID NOs：1-6，20，13，21或22中的一个具有至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少66％、至少75％、至少85％、至少95％、至少99％或100％的序列同一性。第三和第四肽中的每种在对应于RAS肽的位置13的氨基酸处具有点突变，并且第一、第二、第三和第四肽中的每种具有与其他肽的点突变不同的点突变。在一个实施方案中，第一肽是具有G13R突变的肽，第二肽是具有G13A突变的肽，第三肽是具有G13S突变的肽，并且第四肽是具有G13V突变的肽。

在一些实施方案中，所述至少一种肽由最多8种不同肽组成。在其他实施方案中，存在最多10、12、14或16种不同的肽。在包含多于一种肽的实施方案中，所述至少一种肽可以包含1、2、3、4、5或6种包含包括RAS蛋白的位置12的至少8个氨基酸残基的区域的肽。在包含多于一种肽的其他实施方案中，所述至少一种肽可以包含1、2、3、4、5或6种包含包括RAS蛋白的位置13的至少8个氨基酸残基的区域的肽。在进一步的实施方案中，所述至少一种肽包括1、2、3、4、5或6种独立地包含包括RAS蛋白的位置12或13的至少8个氨基酸残基的区域的肽。

在一些实施方案中，所述包含包括RAS肽的位置13的至少8个氨基酸的区域的肽或每种包含包括RAS肽的位置13的至少8个氨基酸的区域的肽包含RAS蛋白的位置1至30。在备选实施方案中，所述包含包括RAS肽的位置13的至少8个氨基酸的区域的肽或每个包含包括RAS肽的位置13的至少8个氨基酸的区域的肽包含RAS蛋白的位置5至21。在进一步的实施方案中，对应于RAS蛋白的位置13的氨基酸在每个肽的C-末端。在进一步的实施方案中，对应于RAS蛋白的位置13的氨基酸在所述肽或每种肽的N-末端。通常，具有包括RAS蛋白的位置13的至少8个氨基酸的区域可以由RAS蛋白的包括位置13的任意8个位置组成。例如，具有包括位置13的至少8个氨基酸的区域可以由RAS蛋白的位置6至位置13、位置7至位置14、位置8至位置15、位置9至位置16、位置10至位置17、位置11至位置18、位置12至位置19或位置13至位置20的氨基酸组成。

在一些实施方案中，包含包括RAS肽的位置12的至少8个氨基酸的区域的肽包含RAS蛋白的位置1至30。在其他实施方案中，包含包括RAS蛋白的位置12的至少8个氨基酸的区域的肽包含RAS蛋白的位置5至21。在备选实施方案中，对应于RAS蛋白的位置12的氨基酸在肽的C-末端。在进一步的实施方案中，对应于RAS蛋白的位置12的氨基酸在肽的N-末端。通常，具有包括RAS蛋白的位置12的至少8个氨基酸的区域可以由RAS蛋白的包括位置12的任意8个位置组成。例如，具有包括位置12的至少8个氨基酸的区域可以由RAS蛋白的位置5至位置12、位置6至位置13、位置7至位置14、位置8至位置15、位置9至位置16、位置10至位置17、位置11至位置18或位置12至位置19的氨基酸组成。

在包括多于一种肽的实施方案中，所述多于一种肽可以包括相同或不同比例的不同肽。例如，在由第一和第二肽组成的实施方案中，第一和第二肽以相同比例使用，即每种肽占使用的肽的50％。在其他实施方案中，第一肽的比例大于第二肽的比例。例如，第一肽可以占使用的肽的至少55％，至少60％，至少70％，至少80％或至少90％。在备选实施方案中，使用比第一肽大的第二肽的比例。例如，第二肽可以占使用的肽的至少55％，至少60％，至少70％，至少80％或至少90％。在其中使用多于两种肽的实施方案中，肽可以以彼此相同或不同的比例使用。例如，每种肽可以独立地占使用的肽的至少1％，至少5％，至少10％，至少20％至少30％，至少40％，至少50％，至少60％，至少60％，至少70％，至少80％或至少90％。

备选实施方案包括包含至少五种RAS蛋白的肽的至少一种肽，其中五种肽中的每种包含包括RAS肽的位置13的至少8个氨基酸的区域。至少五种肽中的每种独立地在包括位置13的区域之外的位置与RAS蛋白具有至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少66％、至少75％、至少85％、至少95％、至少99％或100％的序列同一性，和/或独立地在包括位置13的区域之外的位置与SEQ ID NOs：1-6，13，20，21和22中的一个具有至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少66％、至少75％、至少85％、至少95％、至少99％或100％的序列同一性。所述至少五种肽中的每种在对应于RAS蛋白的位置13的氨基酸处具有点突变，所述点突变独立地选自G13A，G13C，G13D，G13R，G13S或G13V突变，并且每种肽的点突变不同于其他肽的点突变。

在另一实施方案中，适于诱导免疫应答的至少一种肽由六种RAS蛋白的肽组成，其中每种肽包含包括RAS蛋白的位置12的至少8个氨基酸的区域。每种肽独立地在包括位置12的区域之外的位置与RAS蛋白具有至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少66％、至少75％、至少85％、至少95％、至少99％或100％的序列同一性，和/或独立地在包括位置12的区域之外的位置与SEQ ID NOs：7-12和14-19之一具有至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少66％、至少75％、至少85％、至少95％、至少99％或100％的序列同一性。每种肽在对应于RAS蛋白的位置12的氨基酸处具有点突变，所述点突变选自G12A，G12C，G12D，G12R，G12S或G12V突变，并且每种肽的点突变不同于其他肽的点突变。

在进一步的实施方案中，适于引发免疫应答的所述至少一种肽由RAS蛋白的第一、第二、第三和第四肽组成，其中第一、第二和第三肽中的每种包含包括RAS蛋白的位置12的至少8个氨基酸的区域，并且RAS蛋白的第四肽包含包括RAS蛋白的位置13的至少8个氨基酸的区域。第一、第二、第三和第四肽的每种独立地在包括位置12或13的区域之外的位置分别与RAS蛋白具有至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少66％、至少75％、至少85％、至少95％、至少99％或100％的序列同一性，和/或独立地在包括位置12或13的区域之外的位置处分别与SEQ ID NOs：7-12，14-19，1-6，13，20，21和22之一具有至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少66％、至少75％、至少85％、至少95％、至少99％或100％的序列同一性。第一、第二、第三和第四肽中的每种在对应于RAS蛋白的所述位置12或13的氨基酸处分别具有点突变。在一些实施方案中，第一肽是具有G12A突变的肽，第二肽是具有G12R突变的肽，第三肽是具有G12S突变的肽，并且第四肽是具有G13C突的肽变。

根据本发明使用的至少一种肽是对应于由MHC II分子展示在细胞表面上的RAS蛋白片段的肽。因此，根据本发明使用的至少一种肽是这样的肽：其对应于由细胞内蛋白水解RAS蛋白得到的蛋白片段，其随后可以展示在HLA分子上，并且个体通常在其T细胞库中具有对其有反应性的T细胞。

在本发明的进一步的方面，提供至少一种T-细胞，或包含所述T-细胞的T-细胞制剂，所述T-细胞对当呈递在MHC分子上时的上文所述的至少一种肽特异，其用于通过与抗代谢物化疗剂同时或顺序施用来治疗癌症。所述至少一种T-细胞可以通过用RAS蛋白的至少一种肽刺激至少一种反应性T-细胞产生。例如，在一个实施方案中，所述至少一种T-细胞包含多种T-细胞，其中第一和第二T-细胞分别对对应于RAS蛋白的片段的第一和第二肽特异，其中每种肽包含包括RAS蛋白的位置13的至少8个氨基酸的区域，其中第一和第二T-细胞中的每种对肽的对应于所述位置13的氨基酸的点突变特异，并且第一T-细胞特异针对的点突变不同于第二T-细胞特异针对的点突变。在另一个实施方案中，例如，所述至少一种T-细胞包含多种对对应于RAS蛋白的片段的肽特异的T-细胞，其中所述肽包含包括RAS肽的位置13的至少8个氨基酸的区域，其中每种T-细胞对肽的对应于所述位置13的氨基酸处的点突变特异。

上文所述至少一种肽、至少一种T-细胞和T-细胞制剂用于治疗癌症，并且与抗代谢物化疗剂同时或顺序施用。在一些实施方案中，所述抗代谢物化疗剂是嘧啶类似物，或其药用盐。在优选的实施方案中，所述抗代谢物化疗剂是吉西他滨或其药用盐。在一些实施方案中，吉西他滨的药用盐是吉西他滨盐酸盐。

根据本发明使用的至少一种肽、至少一种T-细胞或T-细胞制剂用于治疗癌症。在一些实施方案中，所述癌症是由于RAS蛋白中的突变，尤其是对应于所施用的一种或多种肽中的点突变的突变引起的癌症。在一些实施方案中，癌症是非小细胞肺癌、胰腺癌、膀胱癌、卵巢癌和乳腺癌中的一种或多种。在优选的实施方案中，所述癌症是胰腺癌。在更优选的实施方案中，所述癌症是切除的胰腺癌。在一些实施方案中，所述至少一种肽包括具有G13C点突变的肽，所述至少一种T-细胞对具有G13C突变的肽特异，或所述T-细胞制剂包含对具有G13C突变的肽特异的T-细胞，并且用于通过与抗代谢物化疗剂同时或顺序施用治疗癌症。在所述实施方案中，优选所述癌症是胰腺癌。在另一实施方案中，所述至少一种肽包括具有G13D突变的肽，所述至少一种T-细胞对具有G13D突变的肽特异，或所述T-细胞制剂包含对具有G13D突变的肽特异的T-细胞，并且用于通过与抗代谢物化疗剂同时或顺序施用治疗癌症。尤其是，已经发现，与单独施用肽疫苗相比，通过按照以下剂量方案同时或顺序施用至少一种肽治疗癌症显著改善针对至少一种肽的免疫应答：第1周：仅肽；第2周-仅肽；第3周-仅肽；第4周-肽和抗代谢物化疗剂；第5周-仅抗代谢物化疗剂；第6周-肽和抗代谢物化疗剂；第7周-无治疗；和第8周-肽和抗代谢物化疗剂。

还提供包含上文所述的至少一种肽、至少一种T-细胞或T-细胞制剂的药物组合物，其用于本发明所述的应用。所述药物组合物还可以包含至少一种药用载体、稀释剂和/或赋形剂。在一些实施方案中，所述药物组合物还包含一种以上另外的活性成分和/或佐剂。在某些实施方案中，所述药物组合物还可以包含一种以上对同一疾病适应症治疗有效的成分。在一些实施方案中，所述药物组合物还包含粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。

在一些实施方案中，抗代谢物化疗剂与所述至少一种肽、至少一种T-细胞、T-细胞制剂或药物组合物一起同时施用。因此，在所述实施方案中，抗代谢物化疗剂与所述至少一种肽、至少一种T-细胞、T-细胞制剂或药物组合物同时施用。

在其他实施方案中，抗代谢物化疗剂与所述至少一种肽、至少一种T-细胞、T-细胞制剂或药物组合物顺序施用。在一些实施方案中，施用所述至少一种肽、至少一种T-细胞、T-细胞制剂或药物组合物，并且接着施用抗代谢物化疗剂。在一些实施方案中，在顺序施用的每个阶段中，抗代谢物化疗剂在所述至少一种肽、至少一种T-细胞、T-细胞制剂或药物组合物的6小时内施用。在其他实施方案中，在顺序施用的每个阶段中，抗代谢物化疗剂在所述至少一种肽、至少一种T-细胞、T-细胞制剂或药物组合物的12小时内施用。在进一步的实施方案中，在顺序施用的每个阶段中，抗代谢物化疗剂在所述至少一种肽、至少一种T-细胞、T-细胞制剂或药物组合物的18小时内施用。在进一步的实施方案中，在顺序施用的每个阶段中，抗代谢物化疗剂在所述至少一种肽、至少一种T-细胞、T-细胞制剂或药物组合物的24小时内施用。在优选的实施方案中，在顺序施用的每个阶段中，抗代谢物化疗剂在施用所述至少一种肽、至少一种T-细胞、T-细胞制剂或药物组合物之后24小时立即施用。

在一些实施方案中，所述至少一种肽、至少一种T-细胞、T-细胞制剂或药物组合物和抗代谢物化疗剂多于一次同时或顺序施用给同一患者。在一些实施方案中，所述至少一种肽和抗代谢物化疗剂施用至少两次(即以至少两个阶段)。在其他实施方案中，所述至少一种肽和抗代谢物化疗剂施用至少三次(即以至少三个阶段)。在进一步的实施方案中，所述至少一种肽、至少一种T-细胞、T-细胞制剂或药物组合物和抗代谢物化疗剂施用多于三次(即以多于三个阶段)。在一些实施方案中，施用所述至少一种肽、至少一种T-细胞、T-细胞制剂或药物组合物和抗代谢物化疗剂的每个阶段间隔至少一周。在其他实施方案中，施用所述至少一种肽、至少一种T-细胞、T-细胞制剂或药物组合物和抗代谢物化疗剂的每个阶段间隔至少两周。在一些实施方案中，施用的每个阶段间隔多于两周。

在一些实施方案中，抗代谢物化疗剂在与本发明的至少一种肽、至少一种T-细胞、T-细胞制剂或药物组合物同时或顺序施用之前或之后，单独施用一次或多次。在其他实施方案中，所述至少一种肽、至少一种T-细胞、T-细胞制剂或药物组合物在与抗代谢物化疗剂同时或顺序施用之前或之后单独施用一次或多次。

因此，在一些实施方案中，相对于所述至少一种肽、至少一种T-细胞、T-细胞制剂或药物组合物的第一次施用，抗代谢物化疗剂的第一次施用延迟。在一些实施方案中，抗代谢物化疗剂的第一次施用是在所述至少一种肽、至少一种T-细胞、T-细胞制剂或药物组合物的第一次施用后至少一周进行。在其他实施方案中，抗代谢物化疗剂的第一次施用是在所述至少一种肽、至少一种T-细胞、T-细胞制剂或药物组合物的第一次施用之后至少两周进行。在进一步的实施方案中，抗代谢物化疗剂的第一次施用是在所述至少一种肽、至少一种T-细胞、T-细胞制剂或药物组合物的第一次施用之后至少三周进行。在特别优选的实施方案中，尽管在所述至少一种肽、至少一种T-细胞、T-细胞制剂或药物组合物中的每种和抗代谢物化疗剂的第一次施用之间有延迟，抗代谢物化疗剂在施用所述至少一种肽、至少一种T-细胞、T-细胞制剂或药物组合物的24小时内施用。尤其是，已经发现，所述至少一种肽、至少一种T-细胞、T-细胞制剂或药物组合物的第一次施用和抗代谢物化疗剂的第一次施用之间三周的延迟对记录的免疫应答有显著影响。

在一些实施方案中，其中所述癌症是切除的胰腺癌，抗代谢物化疗剂的第一次施用是在手术切除胰腺癌后12周以内。在一些实施方案中，第一次施用是在手术切除胰腺癌后10周以内。在其他实施方案中，抗代谢物化疗剂的第一次施用是在手术切除胰腺癌后8周以内。

根据本发明使用的所述至少一种肽、至少一种T-细胞、T-细胞制剂或药物组合物可以通过本领域技术人员已知的任何合适的递送技术施用给受试者。例如，其他技术中，所述至少一种肽、至少一种T-细胞、T-细胞制剂或药物组合物可以以溶液的形式、脂质体的形式或干燥形式(例如，以包衣颗粒的形式等)通过注射施用给受试者。在一些实施方案中，所述至少一种肽或药物组合物以每剂量0.01mg至10mg的至少一种肽的量施用。在其他实施方案中，所述至少一种肽或药物组合物以每剂量0.1mg至2mg的至少一种肽的量施用。在一些实施方案中，所述至少一种肽或药物组合物以每剂量0.1mg的至少一种肽的量施用。在另一个实施方案中，所述至少一种肽或药物组合物以每剂量0.7mg的至少一种肽的量施用。剂量取决于施用给患者的不同肽的数量。例如，当所述至少一种肽仅由一种类型的点突变组成，则所述至少一种肽或药物组合物优选以每剂量0.1mg的至少一种肽的量施用。在另一个实例中，当至少一种肽包括七种以上类型的点突变时，所述至少一种肽或药物组合物优选以每剂量0.7mg的至少一种肽的量施用。

在一些实施方案中，所述至少一种T-细胞或T-细胞制剂以静脉内注射和/或输注施用，并且以例如10⁶至10¹²个每种对本发明的肽特异的T-细胞的量施用。

抗代谢物化疗剂可以以本领域技术人员已知的任何递送技术施用给受试者。例如，在一些实施方案中，抗代谢物化疗剂通过套管、中线(central line)或通过外周插入的中心导管施用。在一些实施方案中，抗代谢物化疗剂以100至10,000mg/m²体表面积的量施用。在一些实施方案中，抗代谢物化疗剂以500至2000mg/m²体表面积的量施用。在其他实施方案中，抗代谢物化疗剂以1000mg/m²体表面积的量施用。

在本发明的进一步实施方案中，提供包含以下各项的试剂盒：包含上文所述的至少一种肽、T细胞或药物组合物的第一产品，和提供如上文所述的抗代谢物化疗剂的供应的第二产品。以分开的小瓶和隔室提供第一和第二产品。在一些实施方案中，所述试剂盒还包含用于施用第一和第二产品的说明书。

表

表1.SEQ ID NOs：1-6的位置13突变的RAS肽

表2.SEQ ID NOs：7-12的位置12突变的RAS肽

表3.TG01中含有的SEQ ID NOs：13-19的肽

表4.TG02中含有的SEQ ID NOs：13-20的肽

实施例

实施例1

进行I/II期试验以研究对切除的胰腺癌用单独的RAS肽疫苗接种(TG01)以及随后与吉西他滨辅助化疗联合的辅助治疗的安全性和免疫学反应。

患者在手术后1-8周内接受TG01连同免疫调节剂，GM-CSF。在TG01/GM-CSF治疗开始后3-7周，患者也接受吉西他滨。在接受至少一个周期的吉西他滨后第11周对患者评估安全性和免疫应答。

最初，将六名患者用TG01和GM-CSF处理，并且在第11周，如下文列出的，利用安全性和免疫应答评估怎样继续研究。

在第11周，如果：

-6名患者中有0名显示免疫应答，和/或6名患者中有3名显示剂量限制性毒性(DLT)，将终止研究，

-6名患者中有1-3名显示免疫应答和/或6名患者中有3名显示DLT，则将招募另外6名患者进入研究中，

-6名患者中有4名以上显示免疫应答和/或6名患者中有2名以下显示DLT，则起始II期研究。

决定的是，如果I期招募扩展到12名患者，则在第11周，如果：

-12名患者中有少于4名显示免疫应答和/或12名患者中多于4名显示DLT，则将终止研究，

-12名患者中有4名以上显示免疫应答和/或12名患者中有4名以下显示DLT，将起始II期研究。

因此，如果：

a)在第11周，6名患者中有4名以上显示免疫应答并且6名患者中有2名以下显示DLT，或

b)在第11周，12名患者中有4名以上显示免疫应答并且12名患者中有4名以下显示DLT，

则将起始II期研究。

试验治疗的准备

在2R玻璃小瓶中提供TG01，包含2.1mg的TG01，并且将一个TG01小瓶中的内容物溶解在0.3mL无菌水中用于注射(7mg/mL)。在重构后6小时内使用溶液。

在小瓶中提供GM-CSF，含有0.1mg，并且将一瓶中的内容无溶解在0.33mL无菌水中用于注射(0.30mg/mL)。在重构后6小时内使用溶液。

吉西他滨以1000mg/m²的剂量施用。药物提供在200mg和1g的小瓶中，用于在要通过静脉内注射给予的盐水中重构。

对于DTH，将一个TG01小瓶中的内容物溶解在0.3mL无菌水中用于注射。在重构后6小时内使用溶液。

TG01和GM-CSF剂量和施用

在第1，3，5，8，15，22天和每2周给予TG01和GM-CSF，直到化疗结束(第1天定义为TG01治疗的第一天，其是在手术后1-8周)。化疗结束后，在未表现出复发和/或在研究治疗期间具有阳性免疫应答的患者中，每4周给予进一步的加强注射，直到第52周，然后每12周给予加强注射，持续至多2年，或直到同意终止或有毒性(取最早的那个)。

TG01剂量是0.70mg(在水中以7mg/mL重构的TG01溶液的0.10mL注射液用于注射)。GM-CSF剂量是0.03mg(-在水中以0.3mg/mL重构的GM-CSF溶液的0.10mL注射液用于注射)。

将两种研究药物通过皮内注射施用至上臂的背侧，在注射TG01之前10-15分钟施用GM-CSF。

化疗剂量和施用

患者在开始TG01和GM-CSF(起始治疗期的第22，36或50天)之后至少3周(但不晚于自手术日起12周)开始接受吉西他滨。将TG01和GM-CSF的首次剂量日视为化疗治疗期的第1天。在四周周期的第1、8和15天以1000mg/m²静脉内给予吉西他滨历时30分钟，总共六个周期。

DTH剂量和施用

在第1，8，15，22，36，50和64天在对侧臂下部区域给予TG01。

在治疗日制备DTH-测试剂量，并且是0.10mL的以7mg/mL水的TG01，用于注射溶液，制备用于以无菌注射器皮内注射。

化疗剂量标准

吉西他滨：

在施用吉西他滨之前，在每个新的治疗周期开始时，评估患者以保证他们满足产品制造商的吉西他滨的处方信息。

结果和讨论

研究从6名患者扩展到9名患者，并且从中获得的结果在下文讨论。

到第11周，在所有9名受试者中都发现TG01-特异性免疫应答，并且未报道DLT。

安全性特性如对于胰腺手术后接受化疗的患者所预期的。存在被认为与单独的TG01/GM-CSF相关的一个副作用事件，其是注射位点反应。一名患者经历三个与TG01/GM-CSF和吉西他滨相关的事件(恶心、呕吐和流感样症状)。与吉西他滨相关的不良事件如对于3/4级嗜中性白血球减少症(neutropenia)(其是主要相关的不良事件)所预期的。在这些情况下需要中断或减少吉西他滨剂量。

在两名患者中报道了四种严重的不良事件。一名患者经历肺部感染和两次发烧，都认为与吉西他滨相关。一名患者经历恶心，也被认为与利用TG01和吉西他滨的治疗无关。

根据在基线处(第1周)无DTH反应，在第3周结束时起始吉西他滨之前，四名患者(44％)产生DTH反应(图1和2)。在第一周期的吉西他滨(第6周)之后，这增加至七名患者(77％)具有DTH阳性，并且在第二周期(第8周)的首次吉西他滨剂量后，增加至所有九名患者(100％)(图1和2)。这表明，在第8周在用TG01和吉西他滨共同治疗后，在所有患者中诱导了Th1极化的针对TG01的应答。

还发现，对已建立的免疫应答没有降低或消除，从而诱导的免疫应答持续(图2)。的确，在第二周期(第8周)中施用TG01和吉西他滨二者之后显示免疫应答的患者数量显著大于单独施用TG01时的患者数量(图2)。

这些结果表明以下预料不到的研究结果：TG01和吉西他滨的组合在癌症患者中有效诱导免疫应答，并且诱导的免疫应答是强烈的。尤其是，用于使研究继续到II期的算法(即在第11周，如果6名患者中有4名以上显示免疫应答和/或6名患者中有2名以下显示DLT，则将开始II期研究)表明，预期是可能50％的患者将在第11周显示免疫应答。因此，所有在第11周显示具有免疫应答的患者对于研究的设计者是出乎意料的。