诊断肝纤维化的方法与流程

肝脏是通过门静脉与来自小肠和大肠的静脉血相遇的第一个肠外器官。在健康的生物体中，只有少量的易位细菌产物到达肝脏。一般来说，肝免疫系统耐受这些细菌产物，从而避免有害反应，这种现象称为“肝耐受”。在这方面，肝脏不仅由实质肝细胞组成，而且还含有非实质细胞，包括免疫和非免疫细胞。肝免疫系统的成员是驻留的肝组织巨噬细胞(枯否细胞)，天然杀伤(NK)细胞，NKT细胞，T细胞和B细胞。这些细胞类型严格调节肝免疫系统，包括肝耐受性。

数条线的证据表明细菌易位在酒精性肝病中发挥重要作用。已经观察到，由酒精和/或其代谢物(例如乙醛)诱导的肠道中的细菌增殖和肠紧密连接的功能的损伤增强细菌易位到肝脏。这进而导致免疫细胞(包括枯否细胞)的活化，以及各种促炎细胞因子和趋化因子的释放。此外，已经观察到，在长期摄取乙醇的动物和患者中，抗微生物蛋白Reg3b和Reg3g的肠表达减少，这表明乙醇诱导的肠生态失调由抗微生物分子表达的失调介导。

在非酒精性脂肪性肝炎(NASH)中，也存在细菌易位进入肝脏的作用的证据。首先，肠道菌群在肥胖症中的作用已被证明。当喂食标准食物饮食的野生型无菌小鼠用从ob/ob或瘦供体收获的微生物群定植时，“肥胖”微生物群的接受者中的肥胖比“瘦”微生物群的接受者中的肥胖增加得更多，表明微生物群在肥胖症和因而脂肪肝疾病中的关键作用。然而，根据本发明人的知识，在受试者的细菌易位进入肝脏或甚至进入血液循环中与所述受试者中肝纤维化的存在之间未曾建立相关性。

肝纤维化是一个重要的健康问题，每年约150万例死亡的世界范围内死亡率可归因于肝硬化和原发性肝癌。肝硬化是纤维化的最后阶段，其主要响应于病毒和毒性代谢损伤发生。纤维化进展的最常见原因是慢性丙型肝炎、慢性乙型肝炎、酒精性肝病和非酒精性脂肪性肝病。即使在肝硬化阶段，肝纤维化也是可治疗的，主要使用针对丙型肝炎和乙型肝炎的抗病毒治疗，而且还通过减少饮酒和改善超重、糖尿病及非酒精性脂肪性肝病的代谢因素来治疗。

因此，需要筛查肝纤维化。肝活检是诊断肝纤维化和诊断引起纤维化的潜在肝病的标准。然而，肝活检是侵入性的，导致10％至20％风险的轻微并发症(例如术后疼痛)和0.5％至1％风险的严重并发症(例如显著出血)。此外，肝活检受限于采样误差和在组织学发现的解释上不完全的观察者间一致性。因此，可能不总是进行肝活检，并且非常需要用于诊断肝纤维化的替代的非侵入性方法。

本发明首先源自本发明人的意想不到的发现，即细菌16S rDNA的血液浓度与患有肥胖症的患者中肝纤维化的存在特异相关，而其与其它类型的脂肪肝疾病(例如肝脂肪变性)不相关。因此，细菌16SrDNA的血液浓度可用于诊断患有肥胖症的患者的肝纤维化。

因此，本发明涉及用于诊断患有肥胖症的受试者中的肝纤维化的方法，特别是体外方法，所述方法包括以下步骤：

a1)测量受试者的生物样品中细菌16S rDNA的浓度或细菌16SrDNA的量与总DNA量的比率；和

b)基于步骤a1)中的测量结果，诊断患有肥胖症的受试者中的肝纤维化。

本发明还涉及用于选择患有肥胖症的受试者用于肝活检的方法，特别是体外方法，所述方法包括以下步骤：

a1)测量受试者的生物样品中细菌16S rDNA的浓度或细菌16S rDNA的量与总DNA量的比率；和

b)基于步骤a1)中的测量结果，选择患有肥胖症的受试者进行肝活检。

根据另一方面，本发明涉及用于选择患有肥胖症的受试者用于靶向肝纤维化和/或其并发症的治疗方案的体外方法，所述方法包括以下步骤：

a1)测量受试者的生物样品中细菌16S rDNA的浓度或细菌16S rDNA的量与总DNA量的比率；和

b)基于步骤a1)中的测量结果，选择患有肥胖症的受试者进行靶向肝纤维化和/或其并发症的治疗方案。

本发明的另一方面是用于治疗患有肝纤维化的肥胖受试者的方法，所述方法包括以下步骤：

a1)测量受试者的生物样品中细菌16S rDNA的浓度或细菌16S rDNA的量与总DNA量的比率；

b)基于步骤a1)中的测量结果，诊断患有肥胖症的受试者中的肝纤维化；和

c)如果在步骤b)中已经诊断出肝纤维化，则向受试者施用靶向肝纤维化的治疗。

本发明还涉及治疗患有肥胖症和肝纤维化和/或其并发症的受试者的方法，所述方法包括以下步骤：

a1)测量受试者的生物样品中细菌16S rDNA的浓度或细菌16S rDNA的量与总DNA量的比率；

b)基于步骤a1)中的测量结果，选择患有肥胖症的受试者进行靶向肝纤维化和/或其并发症的药物治疗；和

c)向步骤b)中选择的受试者施用靶向肝纤维化和/或其并发症的药物治疗。

本发明还涉及用于监测患有肥胖症和肝纤维化和/或其并发症的患者对靶向肝纤维化和/或其并发症的药物治疗的反应性的体外方法，所述方法包括以下步骤：

a1)测量受试者的生物样品中细菌16S rDNA的浓度或细菌16S rDNA的量与总DNA量的比率；和

b)基于步骤a1)中的测量结果，监测患者对所述药物治疗的反应性。

细菌16S rDNA的血液浓度反映了疾病的原因而不是其结果，并因此可以用作靶向肠微生物群的治疗策略(例如前和益生菌)的伴随生物标志物。

因此，本发明最后涉及用于筛选适用于预防和/或治疗肝纤维化的益生菌、益生元、化学化合物或生物化合物的方法，其包括以下步骤：

-测量患有肝纤维化的肥胖受试者的生物样品中的细菌16S rDNA的浓度或细菌16S rDNA的量与总DNA量的比率，所述肥胖受试者已经用候选益生菌、益生元、化学化合物或生物化合物进行治疗；和

-比较所述浓度或所述比率与未用所述候选益生菌、益生元、化学化合物或生物化合物治疗的患有肝纤维化的对照肥胖受试者的浓度或比率；

其中在所述对照受试者的生物样品中测量的比在用所述候选益生菌、益生元、化学化合物或生物化合物治疗的受试者的生物样品中测量的更高的浓度或更高的比率表明所述候选益生菌、益生元、化学化合物或生物化合物适用于预防和/或治疗肝纤维化。

发明详述

纤维化

如本文所用，术语“纤维化”、“肝纤维化”或“肝脏纤维化”是指其中过量的结缔组织在肝脏中积累的医学病症；该组织代表响应于慢性、反复的肝细胞损伤的瘢痕形成。通常，随着再生肝细胞试图替换和修复受损组织，纤维化进展，从而破坏肝结构和最终破坏肝功能。

受试者

在本发明的上下文中，“受试者”表示人或非人哺乳动物，例如啮齿动物(大鼠，小鼠，兔)，灵长类动物(黑猩猩)，猫科动物(猫)或犬科动物(狗)。优选地，受试者是人。根据本发明的受试者可以特别是男性或女性。

根据本发明，受试者患有肥胖症。

如本文所用，术语“肥胖症”、“一般性肥胖症”或“总体肥胖症”是指这样的医学病症，其中过量的体脂肪已累积到可能对健康有不利影响的程度，从而导致减少的预期寿命和/或增加的健康问题。一般性肥胖通常通过评估体重指数(BMI)来确定，体重指数(BMI)是关联体重和身高的测量。特别地，如果人们的BMI在25kg/m²和30kg/m²之间，则他们被定义为超重，并且当BMI大于30kg/m²时，则他们被定义为肥胖。

在本发明的上下文中，受试者优选具有高于30kg/m²，更优选高于37.5kg/m²，或甚至更优选高于40kg/m²的体重指数(BMI)。

在本发明的上下文中，术语“腹部肥胖症”、“向心性肥胖症”或“腹部脂肪”是指其中存在导致腰部尺寸增加的腹部脂肪的特定积累的肥胖症。通常，在腹部肥胖症中，内脏脂肪(也称为器官脂肪或腹内脂肪)位于腹膜腔内部，装填在内部器官和躯干之间，而在一般性肥胖症中，皮下脂肪被发现在皮肤下面，并且发现肌肉内脂肪散布在骨骼肌中。

腹部肥胖症通常仅通过观察裸体，或更具体地通过进行腰部和臀部测量来确定。绝对腰围(男性>102厘米(40英寸)，女性>88厘米(35英寸))和腰臀比(男性>0.9，女性>0.85)都用作腹部肥胖症的测量。优选地，根据本发明的表述“腹部肥胖症”是指男性的腰围大于102cm，或女性的腰围大于88cm。

优选地，根据本发明的受试者在取样时患有非酒精性脂肪性肝病(NAFL疾病)。更优选地，根据本发明的受试者在取样时患有非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。

“非酒精性脂肪性肝病”或“NAFL疾病”是本文用于描述饮酒很少或不饮酒的人的肝脏中的脂肪积累的术语。在许多情况下，NAFL疾病与肥胖症有关。NAFL疾病是常见的，并且对于大多数人，不引起任何体征和症状，也没有并发症。但在一些患有NAFL疾病的人中，累积的脂肪可在肝脏中引起炎症和瘢痕形成。这种更严重的NAFL疾病形式被称为非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。

在本发明的上下文中，表述“非酒精性脂肪性肝炎”或“NASH”是指以脂肪累积(脂肪变性)和炎症为特征的疾病。脂肪变性由肝甘油三酯累积引起。NASH可引起肝脏损伤，其导致纤维化。

在具体实施方案中，受试者具有高于37.5kg/m²的体重指数(BMI)，并且患有选自2型糖尿病、高血压和血脂异常的至少两种代谢并存病。

如本文所用，“糖尿病(diabetes)”或“糖尿病(diabetes mellitus)”表示其中胰腺产生不足量的胰岛素或其中身体细胞不能适当地对胰岛素作出反应阻止防止细胞吸收葡萄糖的代谢病症。结果，葡萄糖在血液中积累。这种高血糖水平产生多尿(频繁排尿)、烦渴(增加的口渴)和多食(增加的饥饿)的典型症状。术语“糖尿病”包括1型糖尿病，2型糖尿病，妊娠糖尿病(在怀孕期间)和引起高血糖症的其它状态。

2型糖尿病(也称为非胰岛素依赖型糖尿病(NIDDM)和成人发病型糖尿病)与主要的胰岛素抵抗和因此相对的胰岛素缺乏和/或具有胰岛素抵抗的主要的胰岛素分泌缺陷(或胰岛素减少)相关。更具体地，2型糖尿病可以与(i)具有中度胰岛素减少的主要胰岛素抵抗或(ii)具有主要胰岛素减少的中度胰岛素抵抗相关。

如本文所用，术语“血压升高”也称为“高血压”、“HTN”或“HPN”，其表示其中血压长期升高的医学病症。在本发明的上下文中，高血压优选地通过至少140/90mmHg的收缩/舒张血压或正在进行抗高血压药物疗法来定义。

如本文所用，术语“血脂异常”表示血浆胆固醇、甘油三酯或两者的升高，或可能促成动脉粥样硬化发展的低高密度脂蛋白水平。

在一个具体的实施方案中，受试者没有已知的全身性疾病，例如类风湿性关节炎、高血压或系统性红斑狼疮，严重的慢性疾病例如心血管疾病或癌症，和/或乙醇摄入量高于每天20克。

在另一个具体实施方案中，根据本发明的受试者在取样之前的一个月期间没有显示感染症状。因此，根据本发明的受试者优选显示低于10mg/l的血浆基线C反应蛋白浓度和/或不呈现大量的白细胞尿和/或未进行抗病毒治疗。

如本文所用，术语“C反应蛋白”或“CRP”是指作为急性期反应物类别的成员的蛋白质，因为其水平在体内发生的炎症过程中急剧上升。如本领域技术人员已知的，CRP通常是由CRP基因编码的单体摩尔质量为25kDa的224个残基的蛋白质。

如本文所用，术语“白细胞尿”是指受试者尿中白细胞的存在。特别地，大量的白细胞尿通常对应于尿中存在超过10个白细胞/mm³。

细菌16S rDNA

在本发明的上下文中，表述“16S rDNA”和“16S核糖体DNA”无差异地使用，并且是指编码由约1500个核苷酸构成的16S核糖体RNA的基因，其是小原核核糖体亚基(30S)的主要组分。16S rDNA在细菌中高度保守。参考大肠杆菌(Escherichia coli)16S rDNA基因序列对应于SEQ ID NO：1(称为rrs)。在本发明的上下文中，16S rDNA指其它细菌菌株中对应于SEQ ID NO：1的任何序列。

生物样品

如本文所用，术语“生物样品”是指生物来源的物质。生物样品的实例包括血液及其组分如血清，血浆，血小板，血沉棕黄层(白细胞)，红细胞，尿，唾液，粪便水，以及组织如脂肪组织，肝组织，胰腺组织等。优选地，根据本发明的生物样品是血液，血清，血浆，血沉棕黄层，尿，脂肪组织或肝组织样品。更优选地，生物样品选自血液，血沉棕黄层，血清和血浆样品。根据本发明的生物样品可以通过本领域技术人员已知的任何适当的取样方式从受试者获得。

诊断肝纤维化的体外方法

本发明涉及用于诊断患有肥胖症的受试者中的肝纤维化的体外方法，所述方法包括以下步骤：

a1)测量受试者的生物样品中细菌16S rDNA的浓度或细菌16S rDNA的量与总DNA量的比率；和

b)基于步骤a1)中的测量结果，诊断患有肥胖症的受试者中的肝纤维化。

肝活检是用于诊断肝纤维化和诊断引起纤维化的潜在肝病的标准。然而，肝活检是侵入性的。因此，肝活检不应该系统地进行，而是用于确认受试者中肝纤维化的存在。

因此，本发明还涉及用于选择患有肥胖症的受试者用于肝活检的体外方法，所述方法包括以下步骤：

a1)测量受试者的生物样品中细菌16S rDNA的浓度或细菌16S rDNA的量与总DNA量的比率；和

b)基于步骤a1)中的测量结果，选择患有肥胖症的受试者进行肝活检。

优选地，通过聚合酶链式反应(PCR)，更优选通过定量PCR(qPCR)，最优选通过实时或实时定量PCR(RT-PCR或RT-qPCR)测量细菌16S rDNA的浓度或细菌16S rDNA的量与总DNA量的比率(称为“16S rDNA/总DNA比率”)。

如本文所用，“实时PCR”、“实时定量PCR”、“实时聚合酶链式反应”或“动力学聚合酶链式反应”是指基于聚合酶链式反应的实验室技术，其用于扩增并同时定量靶向的DNA分子。其使得能够实现样品中特定序列的检测和定量(作为当标准化至DNA输入或另外的标准化基因时的相对量或绝对拷贝数)。两种常用的定量方法是使用插入双链DNA的荧光染料，以及当与互补DNA杂交时发射荧光的修饰的DNA寡核苷酸探针。

在本发明的上下文中，优选使用通用正向和反向引物eubac-F(5’-TCCTACGGGAGGCAGCAGT-3’SEQ ID NO:2)和eubac-R(5’-GGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTT-3’SEQ ID NO:3)进行实时PCR。通常，使用例如Sybr Green RT-qPCR技术，使用12.5μl总反应体积中的2μl DNA进行扩增，通常使用以下循环：在95℃10分钟的保持阶段，然后在95℃15秒、63℃1分钟和72℃1分钟的40个循环。通常，qPCR反应的特异性通过例如在60℃至95℃之间的PCR后解链曲线的分析来评估。

具体地，本发明人证明细菌16S rDNA的浓度(例如每ml血液的拷贝数)或16S rDNA/总DNA比率(例如每μg总DNA的拷贝数)在患有肝纤维化的受试者的生物样品中显著更高。

16S rDNA浓度优选通过实时PCR测量，优选使用通用正向和反向引物eubac-F(5’-TCCTACGGGAGGCAGCAGT-3’SEQ ID NO:2)和eubac-R(5’-GGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTT-3’SEQ ID NO:3)。通常，使用例如Sybr Green RT-qPCR技术，使用12.5μl总反应体积中的2μl DNA进行扩增，通常使用以下循环：在95℃10分钟的保持阶段，然后在95℃15秒、63℃1分钟和72℃1分钟的40个循环。通常，qPCR反应的特异性通过例如在60℃至95℃之间的PCR后解链曲线的分析来评估。

在一个具体的实施方案中，如上所述的诊断肥胖受试者中的肝纤维化的方法还包括将测量的细菌16S rDNA浓度或16S rDNA/总DNA比率与阈值进行比较的步骤a2)。

优选地，当在步骤a2)中测量细菌16S rDNA浓度时，阈值对应于细菌16S rDNA的正常浓度。还优选地，当在步骤a2)测量16S rDNA/总DNA比率时，阈值对应于16S rDNA/总DNA的正常比率。

如本文所述，细菌16S rDNA的“正常浓度”、分别地16S rDNA/总DNA的“正常比率”意指生物样品中16S rDNA的浓度、分别地16S rDNA/总DNA比率在该基因的标准截断值内。该标准取决于生物样品类型和用于测量生物样品中16S rDNA的浓度、分别地16S rDNA/总DNA比率的方法。特别地，阈值可以是靶向群体中给出高于80％、优选高于85％、更优选高于90％、甚至更优选高于95％的阳性预测值和阴性预测值的细菌16S rDNA的浓度、分别地16S rDNA/总DNA比率。

如本文所用，术语“靶向群体”是指由共有某些生物学参数(例如，性别，年龄组)或某些环境参数(例如地理区域)的受试者构成的群体。

优选地，在根据本发明的方法中，16S rDNA拷贝/μl血沉棕黄层的阈值在460至760之间，更优选在550至720之间，最优选为675，所述阈值优选在细菌16S rDNA的浓度通过实时PCR(优选使用通用正向和反向引物eubac-F(5’-TCCTACGGGAGGCAGCAGT-3’,SEQ ID NO:2)和eubac-R(5’-GGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTT-3’,SEQ ID NO:3))测量时使用。通常，使用例如Sybr Green RT-qPCR技术，使用12.5μl总反应体积中的2μl DNA进行扩增，通常使用以下循环：在95℃10分钟的保持阶段，然后在95℃15秒、63℃1分钟和72℃1分钟的40个循环。通常，qPCR反应的特异性通过例如在60℃至95℃之间的PCR后解链曲线的分析来评估。

优选地，在本发明的方法中，进一步确定所测量的细菌16S rDNA的浓度或测量的16S rDNA/总DNA比率是否与根据本发明的阈值相比增加或降低。还优选地，在本发明的方法中，进一步确定测量的细菌16S rDNA浓度或测量的16S rDNA/总DNA比率与根据本发明的阈值相比增加或降低的水平。

如本文所用，表述“增加的水平”是指与根据本发明的阈值相比，测量的细菌16S rDNA的浓度或测量的16S rDNA/总DNA比率所增加的百分比，或与根据本发明的阈值相比，测量的细菌16S rDNA的浓度或测量的16S rDNA/总DNA比率所增加的倍数。

优选地，当测量的浓度或比率与阈值相比增加时，其值显著高于阈值。

还优选地，当测量的浓度或比率与阈值相比降低时，其值显著低于阈值。

本发明人特别证明，与阈值相比，受试者的生物样品中16S rDNA浓度(例如每ml血沉棕黄层的拷贝数)的增加使得能够以非常高的显著性诊断肝纤维化，通常灵敏度为91％，特异性为73％，或阳性预测值为88％，阴性预测值为86％。

因此，在根据本发明的用于诊断肝纤维化的方法中，步骤a1)中测量的高于阈值的浓度或比率优选地指示受试者中肝纤维化的存在。

在根据本发明的用于诊断肝纤维化的方法中，在步骤a1)中测量的低于阈值的浓度或比率优选地指示受试者中没有肝纤维化。

优选地，在根据本发明的用于选择患有肥胖症的受试者用于肝活检的方法中，如果步骤a1)中测量的浓度或比率高于阈值，则选择受试者进行肝活检。

根据另一方面，本发明涉及用于选择患有肥胖症的受试者用于靶向肝纤维化和/或其并发症的治疗方案的体外方法，所述方法包括以下步骤：

a1)测量受试者的生物样品中细菌16S rDNA的浓度或细菌16S rDNA的量与总DNA量的比率；和

b)基于步骤a1)中的测量结果，选择患有肥胖症的受试者进行靶向肝纤维化和/或其并发症的治疗方案。

“靶向肝纤维化和/或其并发症的治疗方案”例如可以是增加对肝癌的监视、增加对食管静脉曲张的监视或药物治疗。

如本文所用，“药物治疗”或“靶向肝纤维化和/或其并发症的药物治疗”可以例如指用胰脂肪酶抑制剂、PPARγ激动剂、瘦素类似物、益生菌或益生元治疗。

在一个具体实施方案中，如上所定义的诊断肥胖受试者中的肝纤维化的方法或如上定义的选择患有肥胖症的受试者用于靶向肝纤维化和/或其并发症的治疗方案的方法还包括步骤c)：如果在步骤b)中已经诊断出肝纤维化，则将所述受试者提交至靶向肝纤维化和/或其并发症的治疗方案。

监测方法

本发明人证明，患有纤维化的受试者的生物样品中的细菌16S rDNA的浓度或细菌16S rDNA/总DNA比率可用于诊断肝纤维化。已经诊断为患有肝纤维化的受试者可以进一步受益于肝纤维化或其并发症的适当监测。

因此，本发明的另一方面是用于监测患有肝纤维化和/或其并发症的肥胖受试者的方法，所述方法包括以下步骤：

a1)如上述“诊断肝纤维化的体外方法”部分中所定义的，测量受试者的生物样品中细菌16S rDNA的浓度或细菌16S rDNA的量与总DNA量的比率；

b)如上述“诊断肝纤维化的体外方法”部分中所定义的，基于步骤a1)中的测量结果，诊断患有肥胖症的受试者中的肝纤维化；和

c)如果在步骤b)中诊断出肝纤维化，则针对肝纤维化的并发症监测受试者。

在本发明的上下文中，表述“针对肝纤维化的并发症监测受试者”是指将所述受试者提交至临床护理，包括例如用于检测肝癌的超声或用于检测食管静脉曲张的胃纤维镜检查。这样的临床护理对于本领域技术人员是公知的。

治疗方法

根据另一方面，本发明涉及用于治疗患有肥胖症和肝纤维化和/或其并发症的受试者的方法，所述方法包括以下步骤：

a1)测量受试者的生物样品中细菌16S rDNA的浓度或细菌16S rDNA的量与总DNA量的比率；

b)基于步骤a1)中的测量结果，诊断患有肥胖症的受试者中的肝纤维化；和

c)将在步骤b)中选择的受试者提交至靶向肝纤维化和/或其并发症的治疗方案。

本发明还涉及治疗患有肥胖症和肝纤维化和/或其并发症的受试者的方法，所述方法包括以下步骤：

a1)测量受试者的生物样品中细菌16S rDNA的浓度或细菌16S rDNA的量与总DNA量的比率；

b)基于步骤a1)中的测量结果，选择患有肥胖症的受试者进行靶向肝纤维化和/或其并发症的药物治疗；和

c)向步骤b)中选择的受试者施用靶向肝纤维化和/或其并发症的药物治疗。

特别地，靶向肝纤维化和/或其并发症的药物治疗如“诊断肝纤维化的体外方法”部分中所定义。

本发明还涉及用于监测患有肥胖症和肝纤维化和/或其并发症的患者对靶向肝纤维化和/或其并发症的药物治疗的反应性的体外方法，所述方法包括以下步骤：

a1)测量受试者的生物样品中细菌16S rDNA的浓度或细菌16S rDNA的量与总DNA量的比率；和

b)基于步骤a1)中的测量结果，监测患者对所述药物治疗的反应性。

表述“监测患者对靶向肝纤维化和/或其并发症的药物治疗的反应性”可以例如意指调整药物治疗。优选地，“监测患者对靶向肝纤维化和/或其并发症的药物治疗的反应性”意指改变用于治疗患者的药物，或增加或减少剂量、施用频率或改变药物治疗的施用途径。

筛选方法

本发明还涉及用于筛选适用于预防和/或治疗肝纤维化的益生菌、益生元、化学化合物或生物化合物的方法，其包括以下步骤：

-测量患有肝纤维化的肥胖受试者的生物样品中的细菌16S rDNA的浓度或细菌16S rDNA的量与总DNA量的比率，所述肥胖受试者已经用候选益生菌、益生元、化学化合物或生物化合物治疗；和

-比较所述浓度或所述比率与未用所述候选益生菌、益生元、化学化合物或生物化合物治疗的患有肝纤维化的对照肥胖受试者的浓度或比率；

其中在所述对照受试者的生物样品中测量的比在用所述候选益生菌、益生元、化学化合物或生物化合物治疗的受试者的生物样品中测量的更高的浓度或更高的比率表明所述候选益生菌、益生元、化学化合物或生物化合物适用于预防和/或治疗肝纤维化。

如本文所用，术语“益生菌”表示含有潜在有益的细菌或酵母的膳食补充剂和活微生物。根据FAO/WHO目前采用的定义，益生菌对应于活的微生物，当以足够的量施用时其赋予宿主健康益处。根据本发明的益生菌的实例包括双歧杆菌属(bifidobacterium)、乳杆菌属(lactobacillus)、拟杆菌属(bacteroides)或梭杆菌(fusobacteria)纲的细菌菌株。

如本文所用，术语“益生元”表示不可消化的食物成分，其通过作为底物选择性刺激肠内，特别是结肠中的一种或有限数量的细菌的生长和/或活性来有益地影响宿主，从而改善宿主的健康。

在本发明的上下文中，“益生元”包括分离或纯化的益生元以及膳食补充剂中存在的天然益生元。

在本发明的上下文中，“益生菌”包括分离或纯化的益生菌以及膳食补充剂中存在的天然益生菌。

如本文所用，术语“化学或生物化合物”包括化学合成的化合物和生物来源的化合物，其对细菌的生长、代谢、存活和/或其穿过肠屏障具有影响。特别地，根据本发明的化学或生物化合物包括改变消化道的细菌群和/或改变细菌通过消化道的迁移和/或改变肠上皮屏障的渗透性的分子。本发明的化学或生物化合物的实例包括杀菌剂，抗生素，以及作用于上皮细胞间紧密连接、微绒毛、细胞衣和/或肠上皮细胞的化合物。

未经治疗的对照受试者可以是与接受候选益生元、益生菌或化学或生物化合物的受试者无关的受试者或在用候选益生元、益生菌或化学或生物化合物治疗前的同一受试者。

本发明将通过以下实施例进一步说明。

序列简述

SEQ ID NO：1显示了参照大肠杆菌16S rDNA基因的序列。

SEQ ID NO：2显示通用rDNA正向引物eubac-F的序列。

SEQ ID NO：3显示通用rDNA反向引物eubac-R的序列。

附图说明

图1显示了通过16S rDNA qPCR测定法测量的37名患者的血液中16S细菌DNA水平的分布。

图2显示了通过16S rDNA qPCR测定法测量的患有或不患有纤维化的患者中的血液细菌16S rDNA的浓度。

图3显示了通过16S rDNA qPCR测定法测量的不患有纤维化或患有不同阶段的纤维化的患者中的血液细菌16S rDNA的浓度。

图4显示了用于肝纤维化的诊断的ROC曲线。

实施例1

材料和方法

群体

在Florinash队列(http://www.florinash.org/)中进行横断面研究。包括的患者具有严重的肥胖症(BMI>40或BMI>37.5加上两种代谢并存病，例如2型糖尿病、高血压和血脂异常，根据ATPIII)，并且在适当的生活方式干预失败后面向胃分流术以减少体重和降低心血管风险。排除标准是全身性疾病、上月中感染、严重慢性病、每天>20g乙醇摄入。分析所有可获得血沉棕黄层级分样品的患者。

测定血液16S rDNA基因浓度

使用二氧化硅膜技术试剂盒从100μl血沉棕黄层级分中提取总DNA。使用UV光谱仪Nanodrop 2000(Thermo Scientific)测定总DNA浓度。使用光学级384孔板通过实时定量PCR(ViiA^TM 7实时PCR系统，Life technology)定量细菌DNA(16S rDNA)含量。qPCR反应使用通用rDNA正向和反向引物eubac-F(5’-TCCTACGGGAGGCAGCAGT-3’,SEQ ID NO:2)和eubac-R(5’-GGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTT-3’,SEQ ID NO:3)进行。扩增步骤之后进行解链曲线步骤以确定获得的扩增产物的特异性。扩增的DNA(16S rDNA)的量表达为原始数据2^-ct或用大肠杆菌16S rDNA的基于质粒的标准尺度标准化。使用30个重复测量来确定该方法的变异系数(可重复性)(0.24％)。

统计分析

显示了患有和不患有纤维化的参与者的特征，并且分别对定量和类别变量进行非参数Mann-Whitney检验和Fisher精确检验。此外，呈现了用于肝纤维化诊断的ROC曲线。

结果

用37名患者的血液样品进行细菌16S rDNA qPCR测定。如在图1的分布图上所示的，该测定显示，两个不同的群体在队列中共存：一个具有低的血液中与肝纤维化状态相关的16S细菌DNA水平和一个具有高的血液中与肝纤维化状态相关的16S细菌DNA水平。患者的纤维化状态与血液细菌16S rDNA浓度之间的相关性的分析显示纤维化的血液细菌16S rDNA的非常显著的增加(图2)，其与所述疾病的阶段显著相关(图3)。该结果证明肝纤维化在队列中与血液中与疾病的严重性相关的细菌16S DNA的量的明显变化相关。

如图4所示，用于诊断肝纤维化的ROC曲线下面积为0.87。

群体的特征在表1中给出。肝纤维化患者的16S rDNA浓度(拷贝/μl)显著较高(表1)。16S rDNA浓度的分布向肝纤维化患者中的较高值偏移。在675拷贝16S rDNA/μl血沉棕黄层的阈值下，阴性预测值为86％，阳性预测值为88％，测试灵敏度为55％，特异性为96％。在281拷贝16S rDNA/μl血沉棕黄层的阈值下，阴性预测值为95％，阳性预测值为56％，测试灵敏度为91％，特异性为73％。

总之，结果表明，血液16S rDNA基因浓度的测定使得能够诊断或排除肥胖患者中的肝纤维化。

表1：研究群体的特征

GPT：谷氨酸-丙酮酸转氨酶，GGT：γ-谷氨酰转肽酶，HDL：高密度脂蛋白。

*一位患者的数据缺失。

序列表

<110> VAIOMER

UNIVERSIT?DEGLI STUDI DI ROMA TOR VERGATA

FUNDACI?INSTITUT D'INVESTIGACI?BIOM菵ICA DE GIRONA DR.

JOSEP TRUETA

<120> 诊断肝纤维化的方法

<130> BET 15P1059

<150> EP 14305597.8

<151> 2014-04-23

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1542

<212> DNA

<213> 大肠杆菌

<400> 1

aaattgaaga gtttgatcat ggctcagatt gaacgctggc ggcaggccta acacatgcaa 60

gtcgaacggt aacaggaagc agcttgctgc tttgctgacg agtggcggac gggtgagtaa 120

tgtctgggaa actgcccgat ggagggggat aactactgga aacggtagct aataccgcat 180

aacgtcgcaa gaccaaagag ggggaccttc gggcctcttg ccatcggatg tgcccagatg 240

ggattagcta gtaggtgggg taacggctca cctaggcgac gatccctagc tggtctgaga 300

ggatgaccag ccacactgga actgagacac ggtccagact cctacgggag gcagcagtgg 360

ggaatattgc acaatgggcg caagcctgat gcagccatgc cgcgtgtatg aagaaggcct 420

tcgggttgta aagtactttc agcggggagg aagggagtaa agttaatacc tttgctcatt 480

gacgttaccc gcagaagaag caccggctaa ctccgtgcca gcagccgcgg taatacggag 540

ggtgcaagcg ttaatcggaa ttactgggcg taaagcgcac gcaggcggtt tgttaagtca 600

gatgtgaaat ccccgggctc aacctgggaa ctgcatctga tactggcaag cttgagtctc 660

gtagaggggg gtagaattcc aggtgtagcg gtgaaatgcg tagagatctg gaggaatacc 720

ggtggcgaag gcggccccct ggacgaagac tgacgctcag gtgcgaaagc gtggggagca 780

aacaggatta gataccctgg tagtccacgc cgtaaacgat gtcgacttgg aggttgtgcc 840

cttgaggcgt ggcttccgga gctaacgcgt taagtcgacc gcctggggag tacggccgca 900

aggttaaaac tcaaatgaat tgacgggggc ccgcacaagc ggtggagcat gtggtttaat 960

tcgatgcaac gcgaagaacc ttacctggtc ttgacatcca cggaagtttt cagagatgag 1020

aatgtgcctt cgggagccgt gagacaggtg ctgcatggct gtcgtcagct cgtgttgtga 1080

aatgttgggt taagtcccgc aacgagcgca acccttatcc tttgttgcca gcggtccggc 1140

cgggaactca aaggagactg ccagtgataa actggaggaa ggtggggatg acgtcaagtc 1200

atcatggccc ttacgaccag ggctacacac gtgctacaat ggcgcataca aagagaagcg 1260

acctcgcgag agcaagcgga cctcataaag tgcgtcgtag tccggattgg agtctgcaac 1320

tcgactccat gaagtcggaa tcgctagtaa tcgtggatca gaatgccacg gtgaatacgt 1380

tcccgggcct tgtacacacc gcccgtcaca ccatgggagt gggttgcaaa agaagtaggt 1440

agcttaacct tcgggagggc gcttaccact ttgtgattca tgactggggt gaagtcgtaa 1500

caaggtaacc gtaggggaac ctgcggttgg atcacctcct ta 1542

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 2

tcctacggga ggcagcagt 19

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 3

ggactaccag ggtatctaat cctgtt 26