用于增强RNA产生的方法和工具与流程

疗法性核糖核酸(RNA)分子代表新兴的药物种类。基于RNA的疗法包括作为疫苗使用的编码抗原的mRNA分子(Fotin-Mleczek等2012.J.GeneMed.14(6)：428-439)。此外，设想使用RNA分子进行补充疗法，例如向患者提供缺少的蛋白质比如生长因子或酶(Karikó等，2012.Mol.Ther.20(5)：948-953；Kormann等，2012.Nat.Biotechnol.29(2)：154-157)。另外，考虑非编码的免疫刺激RNA分子(WO2009/095226)和其它非编码RNA比如微小RNA和长非编码RNA(Esteller，2011.Nat.Rev.Genet.12(12)：861-74)的治疗用途。自转染的RNA的成功蛋白质表达取决于转染效率、RNA稳定性和翻译效率。5′帽结构和3′poly(A)尾是在真核细胞中mRNA有效翻译和蛋白质合成的重要特征。当转录物达到20至30个核苷酸的长度时，新合成的mRNA用帽结构修饰。首先，5′末端核苷酸pppN通过包含RNA5′-三磷酸酶和鸟苷酸转移酶活性二者的双功能加帽酶转换为5′GpppN。然后，GpppN部分通过具有(鸟嘌呤-7)-甲基转移酶活性的第二种酶甲基化以形成单甲基化的m7GpppNO型帽结构。然后，0型帽通过2′-O-甲基化在细胞核中被转换为m7GpppN1型结构(Tcherepanova等，2008.BMCMol.Biol.9：90)。短RNA分子可以通过化学方法合成，而长RNA通常通过体外转录反应产生，所述体外转录反应包含具有噬菌体源启动子的合适的DNA模板，RNA聚合酶例如噬菌体SP6、T3或T7RNA聚合酶，和核糖核苷三磷酸(NTP)。主要地，5′帽结构可以通过两种方案引入体外转录的RNA。在第一种方案中，加帽与转录的起始同时发生(共转录加帽)。在此途径中，二核苷酸帽类似物比如m7G(5′)ppp(5′)G(m7G)被添加至反应混合物。通常以这样的方式设计DNA模板：转录的第一个核苷酸是鸟苷。帽类似物与GTP直接竞争作为起始核苷酸(initialnucleotide)(开始核苷酸)并入，并且与任何其它核苷酸一样容易并入(WO2006/004648)。为了有利于并入帽类似物，通常使用相对于GTP摩尔过量的帽类似物(例如以4∶1的比率)并且GTP浓度与其它核糖核苷三磷酸ATP、CTP和UTP相比减少。在这些条件下，GTP通常成为合成RNA分子的限制因素。结果，高比例的其它NTP(通常在40至70％之间)没有被用于RNA合成而被浪费。利用此途径，RNA产量通常限制于大约1mg/ml(WO2006/004648)。在第二种方案中，加帽在体外转录后单独的酶促反应中完成(转录后加帽或酶促加帽)。牛痘病毒加帽酶(VCE)具备对合成m7G帽结构必需的所有三种酶促活性(RNA5′-三磷酸酶、鸟苷酸转移酶和鸟嘌呤-7-甲基转移酶)。使用GTP作为底物，VCE反应在正确的方位中生成RNA帽。此外，可以通过添加第二种牛痘酶——2′O甲基转移酶——至加帽反应产生1型帽(Tcherepanova等，2008.BMCMol.Biol.9：90)。已经报道，通过噬菌体聚合酶体外转录的RNA可包含多种污染物，其包括通过自身互补的(self-complementary)3′延伸生成的双链RNA分子和由无效转录起始事件产生的短RNA分子。在线性化DNA模板的失控转录期间由T7RNA聚合酶合成的RNA分子可以比编码的RNA长(Triana-Alonso等，1995，JBC；270(11)：6298-6307)。在离开DNA模板后，如果3′-端不是稳定的二级结构的一部分(自身互补的3′延伸)，则RNA聚合酶可以将转录物结合至模板位点，且将转录物的3′-端结合至产物位点并且使其延伸。该效应似乎对UTP浓度尤其敏感并且仅仅减小UTP浓度导致如实的(faithful)转录。然而，降低UTP浓度还可以影响RNA产量。尤其是如果RNA包含poly(A)尾——如在RNA比如mRNA中常见的，转录反应中过量的未并入的UTP可以导致与poly-A-序列相反的尿苷核苷酸的RNA-模板依赖性并入，其导致可以激活先天免疫应答并且减少蛋白质合成的双链RNA分子(Kariko等，2011，NucleicAcidsRes.；39(21)：e142)。除期望的全长RNA分子之外，体外转录反应还可以生成较小的寡核糖核苷酸，这是无效转录起始事件的结果(Milligan等，1987.NucleicAcidRes.15(21)：8783-8798)。这些无效(过早)转录物是从由RNA聚合酶、DNA模板和新生RNA链组成的三元复合物过早释放的短RNA分子。通常地，大多数无效转录物的长度是二至八个核苷酸并且由于起始期间的无效循环形成。有趣地，当NTP浓度低于大约2mM时，观察到无效转录的增加(Kern等，1999.Biotechnol.Prog.15，174-184)。无效转录物是不期望的，因为它们的合成消耗有价值的NTP并且减少全长产物的产量。对于成功的RNA疗法的开发，作为活性药物成分的RNA分子的生产在产量、质量、安全和成本方面必须是高效的，尤其是当RNA以大规模生产并且需要全长RNA分子或全长加帽的RNA分子时。描述了通过体外转录增加RNA分子的生产的数种途径。高NTP浓度的使用预期增加RNA分子的产量。可选地，对于加帽的RNA分子的高效合成，已经建议调节帽类似物与GTP的比率。用于体外转录反应的标准核苷酸浓度通常在1.5至16mM的范围内(Milligan等，1987.NucleicAcidRes.15(21)：8783-8798；Sampson&Uhlenbeck，1988.Proc.Natl.Acad.Sci.USA85(4)：1033-7；Cunningham&Ofengand1990.Biotechniques9(6)：713-4；Weitzmann等1990，NucleicAcidsRes.18(12)：3515-20；Gurevich等，1991.Anal.Biochem.195(2)：207-13)。高至40mM的NTP浓度已经被报道是可能的——如果Mg++浓度被相应地调节，其导致增加的RNA产量(US5256555)。数种高产量转录试剂盒是商业上可获得的，例如T7高产量RNA合成试剂盒(NewEnglandBiolabs，Ipswich，MA，USA)、TranscriptAidTMT7高产量转录试剂盒(ThermoScientific，Waltham，MA，USA)、高产量转录试剂盒(LifeTechnologies，Carlsbad，CA，USA)或AmpliCap-MaxTMT7高信使制造者(HighMessageMaker)试剂盒(Epicentre，Madison，WI，USA)。对于所有试剂盒，建议30至40mM的高的总NTP工作浓度用于标准转录反应。对于加帽mRNA的合成，GTP浓度在1.5mM和2mMGTP之间的范围内。虽然为了最大化体外转录反应的RNA产量，一般地推荐高核苷酸浓度，但是使用高NTP浓度还可能具有劣势。例如，利用高初始NTP浓度和足够高的Mg++浓度(例如Mg(OAc)2)，可以获得高RNA产量。然而，在这些高浓度下，较高分数的NTP可以被并入短的无效转录物(Kern等，1997.Biotechnol.Prog.13，747-756)。为了在存在帽类似物的情况下共转录地产生加帽的mRNA，经济原因需要较低的NTP工作浓度，因为必须相对于GTP过量地使用帽类似物并且帽类似物是主要的成本因素。更高的帽类似物与GTP的比率将导致更高比例的加帽的RNA，但是出于产量和经济原因，通常建议4∶1的比率(NewEnglandBiolabs，CappedRNAsynthesis(E2040)，https：//www.neb.com/protocols/1/01/01/capped-rna-synthesis-e2040)。例如，对于加帽的RNA的转录，T7高产量RNA合成试剂盒的制造商的说明书建议使用2mMGTP与相对于GTP4∶1过量的帽类似物。每20μl反应的产量指示为40-50μgRNA，对应于2-2.5mg/ml，具有大约80％加帽的RNA转录物(NewEnglandBiolabs，CappedRNAsynthesis(E2040)，https：//www.neb.com/protocols/1/01/01/capped-rna-synthesis-e2040)。为了补偿由低GTP浓度造成的受限的产量，已经通过用竞争核苷酸(GTP或ATP——假如A-帽被使用)补充反应以这样的方式——维持1∶1和1∶50之间的GTP与帽类似物的比率——增加加帽的RNA的产量。利用此途径，每个反应产生的加帽的RNA的量可以加倍(WO2006/004648)。体外转录反应通常作为分批反应进行，其中所有组分被结合并且然后培育以允许合成RNA分子，直到反应终止。此外，开发补料分批反应以增加体外转录反应的效率(Kern等，1997.Biotechnol.Prog.13.747-756；Kern等，1999.Biotechnol.Prog.15，174-184)。在补料分批系统中，所有组分被结合，但是然后随时间添加额外量的一些试剂(例如NTP和镁)以维持恒定的反应条件。补料分批策略生成每单位的RNA聚合酶或DNA模板——对于非常短的38个碱基对的DNA模板——的100％的RNA提高。此方法仅用于合成在5′末端处具有三磷酸的非加帽的RNA分子。已经报道了通过体外转录合成RNA分子的生物反应器(转录反应器)的使用(WO1995/08626)。配置生物反应器，以便反应物经由进料管线被递送至反应器核心并且RNA产物通过穿过超滤膜被移出(具有标称分子量截留，例如，100,000道尔顿)至出口流。总之，来自体外转录反应的加帽的RNA分子的产量主要地取决于两个因素，可用于并入RNA分子的总NTP浓度和帽类似物：GTP比率。对于共转录加帽，GTP浓度与其它NTP相比通常减少。此事实限制可能的转录产量，尤其是对于具有高GC含量的模板。鉴于上述，对RNA生产尤其是可以翻译为蛋白质的全长加帽RNA分子生产的改进的和经济的工具和方法存在持续的需要。技术实现要素：本发明尤其涉及用于合成给定序列的RNA分子的方法，其包括下列步骤：a)测定四种核苷酸G、A、C和U中的每种在所述RNA分子中的分数(1)，和b)通过体外转录在序列优化的反应混合物中合成所述RNA分子，其中所述序列优化的反应混合物包括四种核糖核苷酸GTP、ATP、CTP和UTP，缓冲液，DNA模板和RNA聚合酶，其中四种核糖核苷酸中的每种在序列优化的反应混合物中的分数(2)对应于各种核苷酸在所述RNA分子中的分数(1)。本发明还涉及用于合成给定序列的RNA分子的生物反应器，该生物反应器具有反应模块——用于在序列优化的反应混合物中实施体外RNA转录反应、捕捉模块——用于暂时地捕捉转录的RNA分子、和控制模块——用于控制序列优化的反应混合物的组分横向进给(infeed)进入反应模块，其中反应模块包括用于从序列优化的反应混合物分离核苷酸的滤膜，并且控制模块对序列优化的反应混合物的组分横向进给的控制基于分离的核苷酸的测量浓度。定义为了清楚和易读性的目的，提供了下列定义。针对这些定义提及的任何技术特征可以在本发明的每一个实施方式上读出。可以在如在下面进一步讨论和说明的这些实施方式的背景下具体地提供额外的定义和说明。5′-帽结构：5′帽通常是被添加至RNA分子的5′端的修饰的核苷酸，具体地鸟嘌呤核苷酸。优选地，使用5′-5′-三磷酸键添加5′帽。5′帽可以是甲基化的，例如m7GpppN，其中N是携带5′帽的核酸的末端5′核苷酸，通常是RNA的5′-端。天然存在的5′帽是m7GpppN。5′帽结构的进一步的实例包括甘油基、反向脱氧脱碱基残基(inverteddeoxyabasicresidue)(部分)、4′，5′亚甲基核苷酸、1-(β-D-赤呋喃糖基(erythrofuranosyl))核苷酸、4′-硫代核苷酸、碳环核苷酸、1，5-失水己糖醇核苷酸、L-核苷酸、α-核苷酸、修饰碱基核苷酸、苏-呋喃戊糖基(pentofuranosyl)核苷酸、无环3′，4′-断裂核苷酸(seconucleotide)、无环3，4-二羟丁基核苷酸、无环3，5二羟戊基核苷酸、3′-3′-反向核苷酸部分、3′-3′-反向脱碱基部分、3′-2′-反向核苷酸部分、3′-2′-反向脱碱基部分、1，4-丁二醇磷酸、3′-氨基磷酸、己基磷酸、氨基己基磷酸、3′-磷酸、3′硫代磷酸、二硫代磷酸、或桥接或非桥接甲基膦酸部分。特别优选的5′帽结构是CAP1(m7G的相邻核苷酸的核糖的甲基化产物)、CAP2(m7G下游的第二个核苷酸的核糖的甲基化产物)、CAP3(m7G下游的第三个核苷酸的核糖的甲基化产物)、CAP4(m7G下游的第四个核苷酸的核糖的甲基化产物)。5′帽结构可以由帽类似物形成。帽类似物：帽类似物指的是具有帽功能的不可延长的二核苷酸，所述帽功能的意思是它促进翻译或定位，和/或当在RNA分子的5′端处并入时阻止RNA分子的降解。不可延长的意思是帽类似物将只在5′末端处并入，因为它不具有5′三磷酸并且因此不能通过模板-依赖性RNA聚合酶在3′方向中延伸。帽类似物包括但不限于选自m7GpppG、m7GpppA、m7GpppC；未甲基化的帽类似物(例如，GpppG)；二甲基化的帽类似物(例如，m2，7GpppG)、三甲基化的帽类似物(例如，m2，2，7GpppG)、二甲基化的对称帽类似物(例如，m7Gpppm7G)、或抗反向(antireverse)帽类似物(例如，ARCA；m7，2′OmeGpppG、m7，2′dGpppG、m7，3′OmeGpppG、m7，3′dGpppG和它们的四磷酸衍生物)的化学结构(Stepinski等，2001.RNA7(10)：1486-95)。帽类似物的实例显示在表1中。表1：帽类似物(D1和D2表示对应物非对映异构体)三磷酸帽类似物四磷酸帽类似物m7Gp3Gm7Gp4Gm27，3′-OGp3Gb7Gp4Gb7Gp3Gb7m3′-OGp4Ge7Gp3Gm22，7Gp4Gm22，7Gp3Gm32，2，7Gp4Gm32，2，7Gp3Gb7m2Gp4Gm7Gp32′dGm7Gp4m7Gm7Gp3m2′-OGm7Gp3m7Gm27，2′-OGp3Gm27，2′-OGpppsG(D1)m27，2′-OGpppsG(D2)m27，2′-OGppspG(D1)m27，2′-OGppspG(D2)m27，2′-OGpsppG(D1)m27，2′-OGpsppG(D2)先前已经描述了进一步的帽类似物(US7074596、WO2008/016473、WO2008/157688、WO2009/149253、WO2011/015347和WO2013/059475)。近来已经描述了N7-(4-氯苯氧乙基)取代的二核苷酸帽类似物的合成(Kore等，2013.Bioorg.Med.Chem.21(15)：4570-4)。特别优选的帽类似物是G[5′]PPP[5′]G、m7G[5′]PPP[5′]G、m32，2，7G[5′]ppp[5′]G、m27，3′-OG[5′]ppp[5′]G(3’-ARCA)、m27，2′-OGpppG(2′-ARCA)、m27，2′-OGppspGD1(β-S-ARCAD1)和m27，2′-OGppspGD2(β-S-ARCAD2)。核酸：术语核酸的意思是任何DNA或RNA分子并且与多核苷酸同义使用。另外，如本文限定的核酸的修饰或衍生物明确地包括在一般术语“核酸”中。例如，肽核酸(PNA)也包括在术语“核酸”中。单顺反子RNA：单顺反子RNA通常可以是包括仅一个开放阅读框的RNA，优选地mRNA。此背景下的开放阅读框是可以被翻译为肽或蛋白质的数个核苷酸三联体(密码子)的序列。双/多顺反子RNA：通常可以具有两个(双顺反子)或更多个(多顺反子)开放阅读框(ORF)的RNA，优选地mRNA。此背景下的开放阅读框是可以被翻译为肽或蛋白质的数个核苷酸三联体(密码子)的序列。免疫刺激RNA：本发明背景下的免疫刺激RNA(isRNA)通常可以是能够诱导先天免疫应答的RNA。isRNA通常不具有开放阅读框并且因而不提供肽-抗原但是引起先天免疫应答，例如通过结合至病原-相关分子模式(PAMP)受体(例如Toll样受体(TLR)或其它细胞内RNA传感器(例如RIG-I、MDA-5或PKR)。核苷酸类似物：核苷酸类似物是与天然存在的核苷酸在结构上相似(类似)的核苷酸，其包括磷酸主链修饰、糖修饰或核碱基(nucleobase)的修饰。核酸合成：可以使用本领域中已知的任何方法制备如本文限定的根据本发明使用的核酸分子，所述方法包括合成方法比如例如固相合成、体内增殖(例如病毒的体内增殖)，以及体外方法，比如体外转录反应。根据本发明，RNA分子通过体外转录对应的DNA分子制备。此DNA模板优选地包括合适的启动子——例如T7或SP6启动子——用于体外转录，其后是编码待制备的RNA分子的期望的核苷酸序列和用于体外转录的终止信号。DNA分子——其形成感兴趣的至少一种RNA的模板——可以通过发酵增殖制备并且随后分离为可以在细菌中复制的质粒的一部分。可能被提到作为适于本发明的质粒例是例如质粒pUC18、pUC19、pBR322、pT7T(GenBank登录号U26404；Lai等，Development1995，121：2349至2360)、系列，例如(GenBank登录号X65300；来自Promega)和pSP64(GenBank登录号X65327)；还参阅Griffin和Griffin(ed.)，PCRTechnology：CurrentInnovation，CRCPress，BocaRaton，FL，2001中的MezeiandStorts，PurificationofPCRProducts。RNA：RNA是核糖核酸的常用缩写。它是核酸分子，即由核苷酸组成的聚合物。这些核苷酸通常是沿着所谓的主链彼此连接的腺苷-一磷酸、尿苷-一磷酸、鸟苷-一磷酸和胞苷-一磷酸单体。主链由第一单体的糖即核糖和第二相邻单体的磷酸部分之间的磷酸二酯键形成。具体连续的单体被称为RNA-序列。信使RNA(mRNA)：在真核细胞中，转录通常在细胞核或线粒体内进行。在体内，DNA的转录通常导致所谓的未成熟RNA，其必须被加工为所谓的信使RNA，通常简写为mRNA。未成熟RNA的加工——例如在真核生物体中——包括各种不同的转录后修饰比如剪接、5′-加帽、多腺苷酸化、从细胞核或线粒体输出等。这些加工的总和也称为mRNA的成熟。成熟信使RNA通常提供可以被翻译为特定的肽或蛋白质的氨基酸序列的核苷酸序列。通常地，成熟mRNA包括5′帽、5′UTR、开放阅读框、3′UTR和poly(A)序列。在本发明的背景下，mRNA还可以是人工分子，即在自然界中不存在的分子。这意味着本发明背景下的mRNA可以例如包括5′UTR、开放阅读框、3′UTR和poly(A)序列的组合，其在自然界中不以此组合存在。自我复制RNA(复制子)：自我复制RNA是基于α病毒的递送载体，其已经从塞姆利基森林病毒(SemlikiForestVirus)(SFV)、辛德比斯(SIN)病毒和委内瑞拉马脑炎(VEE)病毒研发出。α病毒是单链RNA病毒，其中感兴趣的异源基因可以替换α病毒的结构基因。通过提供反式(intrans)结构基因，复制子RNA被包装入复制子颗粒(RP)，其可以用于基因治疗目的或基因疫苗接种(参见例如VanderVeen等，2012.Alphavirusrepliconvaccines.AnimalHealthResearchReviews，p.1-9)。在进入宿主细胞后，基因组病毒RNA最初充当用于翻译病毒RNA扩增的起始所需的病毒非结构蛋白(nsP)的mRNA。RNA复制经由全长负链中间体的合成从内部启动子发生，所述全长负链中间体被用作用于合成额外的基因组-长度RNA和用于转录正链次基因组RNA的模板。这样的RNA然后可以被认为是自我复制RNA，这是因为负责复制(和异源基因的转录)的非结构蛋白仍存在于这样的复制子中。这样的α病毒载体被称为“复制子”。核酸分子的序列：核酸分子的序列通常理解为特定和单独的顺序，即连续的其核苷酸。开放阅读框：本发明背景下的开放阅读框(ORF)通常可以是可以被翻译为肽或蛋白质的数个核苷酸三联体的序列。开放阅读框优选地包含在其5′-端的起始密码子——即通常用于编码氨基酸甲硫氨酸的三个后继核苷酸的组合(ATG或AUG)，和后继区域，其通常展示3个核苷酸倍数的长度。ORF优选地被终止密码子(例如，TAA、TAG、TGA)终止。通常地，这是开放阅读框的唯一终止密码子。因而，本发明背景下的开放阅读框优选地是由可以被三整除的许多核苷酸组成的核苷酸序列，其开始于起始密码子(例如ATG或AUG)并且其优选地终止于终止密码子(例如，分别地TAA、TGA、或TAG或UAA、UAG、UGA)。开放阅读框可以被分离或其可以被并入更长的核酸序列，例如载体或mRNA中。开放阅读框也被叫做“蛋白质编码区”或“编码区”。序列优化的反应混合物：用于给定序列的RNA分子的体外转录反应的反应混合物包括四种核苷三磷酸(NTP)GTP、ATP、CTP和UTP，缓冲液，DNA模板和RNA聚合酶，其中四种核苷三磷酸(NTP)中的每种在序列优化的反应混合物中的分数(2)对应于各种核苷酸在所述RNA分子中的分数(1)。如果核糖核苷酸不存在于所述RNA分子中，则对应的核苷三磷酸也不存在于序列优化的反应混合物中。序列优化的核苷三磷酸(NTP)混合物：用于给定序列的RNA分子的体外转录反应的核苷三磷酸(NTP)的混合物包括四种核苷三磷酸(NTP)GTP、ATP、CTP和UTP，其中四种核苷三磷酸(NTP)中的每种在序列优化的核苷三磷酸(NTP)混合物中的分数(2)对应于各种核苷酸在所述RNA分子中的分数(1)。如果核糖核苷酸不存在于RNA分子中，则对应的核苷三磷酸也不存在于序列优化的核苷三磷酸(NTP)混合物中。修饰的核苷三磷酸：如本文使用的术语“修饰的核苷三磷酸”指的是包括主链修饰以及糖修饰或碱基修饰的化学修饰。这些修饰的核苷三磷酸在本文也称为(核苷酸)类似物。在此背景下，如本文限定的修饰的核苷三磷酸是核苷酸类似物/修饰，例如主链修饰、糖修饰或碱基修饰。与本发明相关的主链修饰是其中核苷酸的主链的磷酸被化学地修饰的修饰。与本发明相关的糖修饰是核苷酸的糖的化学修饰。另外，与本发明相关的碱基修饰是核苷酸的碱基部分的化学修饰。在此背景下，核苷酸类似物或修饰优选地选自适用于转录和/或翻译的核苷酸类似物。糖修饰可以在被发明的背景下使用的修饰的核苷和核苷酸可以在糖部分中被修饰。例如，2′羟基(OH)可以被修饰或被许多不同的“含氧(oxy)”或“脱氧”取代基取代。“含氧”-2′羟基修饰的实例包括但不限于烷氧基或芳氧基(-OR，例如，R＝H、烷基、环烷基、芳基、芳烷基、杂芳基或糖)；聚乙二醇(PEG)、-O(CH2CH2O)nCH2CH2OR；“锁定”核酸(LNA)，其中2′羟基——例如通过亚甲基桥接——被连接至相同核糖的4′碳；和氨基(-O-氨基，其中氨基，例如，NRR，可以是烷基氨基、二烷基氨基、杂环基、芳基氨基、二芳基氨基、杂芳基氨基、或二杂芳基氨基、乙二胺、聚氨基)或氨基烷氧基。“脱氧”修饰包括氢、氨基(例如NH2；烷基氨基、二烷基氨基、杂环基、芳基氨基、二芳基氨基、杂芳基氨基、二杂芳基氨基或氨基酸)；或氨基可以通过连接体附连至糖，其中连接体包括原子C、N和O中的一种或多种。糖基团还可以包含一个或多个碳，其具备与核糖中相应的碳相反的立体化学构型。因而，修饰的核苷酸可以包括包含例如阿拉伯糖作为糖的核苷酸。主链修饰磷酸主链在修饰的核苷和核苷酸中可以被进一步修饰。可以通过利用不同的取代基取代一个或多个氧原子来修饰主链的磷酸基团。进一步，修饰的核苷和核苷酸可以包括利用如本文描述的修饰的磷酸完全取代未修饰的磷酸部分。修饰的磷酸基团的实例包括但不限于硫代磷酸、硒酸磷酸(phosphoroselenate)、硼烷磷酸(boranophosphate)、硼烷磷酸酯、氢膦酸(hydrogenphosphonate)、氨基磷酸、烷基或芳基膦酸和磷酸三酯。二硫代磷酸具有均被硫取代的两个非连接的氧。磷酸连接体还可以通过利用氮(桥接的氨基磷酸)、硫(桥接的硫代磷酸)和碳(桥接的亚甲基-膦酸)取代连接的氧而进行修饰。碱基修饰可以用于本发明的修饰的核苷和核苷酸在核碱基部分中可以被进一步修饰。在RNA中发现的核碱基的实例包括但不限于腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶。例如，本文描述的核苷和核苷酸可以在大沟面上被化学修饰。在一些实施方式中，大沟化学修饰可以包括氨基、硫醇基、烷基或卤素基团。在本发明的特别优选的实施方式中，核苷酸类似物/修饰选自碱基修饰，其优选地选自2-氨基-6-氯嘌呤核糖核苷-5′-三磷酸、2-氨基嘌呤-核糖核苷-5′-三磷酸；2-氨基腺苷-5′-三磷酸、2′-氨基-2′-脱氧胞苷-三磷酸、2-硫代胞苷-5′-三磷酸、2-硫代尿苷-5′-三磷酸、2′-氟胸苷-5′-三磷酸、2′-O-甲基肌苷-5′-三磷酸、4-硫代尿苷-5′-三磷酸、5-氨基烯丙基胞苷-5′-三磷酸、5-氨基烯丙基尿苷-5′-三磷酸、5-溴胞苷-5′-三磷酸、5-溴尿苷-5′-三磷酸、5-溴-2′-脱氧胞苷-5′-三磷酸、5-溴-2′-脱氧尿苷-5′-三磷酸、5-碘胞苷-5′-三磷酸、5-碘-2′-脱氧胞苷-5′-三磷酸、5-碘尿苷-5′-三磷酸、5-碘-2′-脱氧尿苷-5′-三磷酸、5-甲基胞苷-5′-三磷酸、5-甲基尿苷-5′-三磷酸、5-丙炔基-2′-脱氧胞苷-5′-三磷酸、5-丙炔基-2′-脱氧尿苷-5′-三磷酸、6-氮杂胞苷-5′-三磷酸、6-氮杂尿苷-5′-三磷酸、6-氯嘌呤核糖核苷-5′-三磷酸、7-去氮杂腺苷(deazaadenosine)-5′-三磷酸、7-去氮杂鸟苷-5′-三磷酸、8-氮杂腺苷-5′-三磷酸、8-叠氮基腺苷-5′-三磷酸、苯并咪唑-核糖核苷-5′-三磷酸、N1-甲基腺苷-5′-三磷酸、N1-甲基鸟苷-5′-三磷酸、N6-甲基腺苷-5′-三磷酸、O6-甲基鸟苷-5′-三磷酸、假尿苷-5′-三磷酸、或嘌呤霉素-5′-三磷酸、黄苷-5′-三磷酸。给予核苷酸选自由5-甲基胞苷-5′-三磷酸、7-去氮杂鸟苷-5′-三磷酸、5-溴胞苷-5′-三磷酸和假尿苷-5′-三磷酸组成的碱基-修饰的核苷酸的碱基修饰的特别的偏好。在一些实施方式中，修饰的核苷包括吡啶-4-酮核糖核苷、5-氮杂-尿苷、2-硫代-5-氮杂-尿苷、2-硫代尿苷、4-硫代-假尿苷、2-硫代-假尿苷、5-羟基尿苷、3-甲基尿苷、5-羧甲基-尿苷、1-羧甲基-假尿苷、5-丙炔基-尿苷、1-丙炔基-假尿苷、5-牛磺酸甲基尿苷(taurinomethyluridine)、1-牛磺酸甲基-假尿苷、5-牛磺酸甲基-2-硫代-尿苷、1-牛磺酸甲基-4-硫代-尿苷、5-甲基-尿苷、1-甲基-假尿苷、4-硫代-1-甲基-假尿苷、2-硫代-1-甲基-假尿苷、1-甲基-1-去氮杂-假尿苷、2-硫代-1-甲基-1-去氮杂-假尿苷、二氢尿苷、二氢假尿苷、2-硫代-二氢尿苷、2-硫代-二氢假尿苷、2-甲氧基尿苷、2-甲氧基-4-硫代-尿苷、4-甲氧基-假尿苷和4-甲氧基-2-硫代-假尿苷。在一些实施方式中，修饰的核苷包括5-氮杂-胞苷、假异胞苷、3-甲基-胞苷、N4-乙酰胞苷、5-甲酰胞苷、N4-甲基胞苷、5-羟甲基胞苷、1-甲基-假异胞苷、吡咯并-胞苷、吡咯并-假异胞苷、2-硫代-胞苷、2-硫代-5-甲基-胞苷、4-硫代-假异胞苷、4-硫代-1-甲基-假异胞苷、4-硫代-1-甲基-1-去氮杂-假异胞苷、1-甲基-1-去氮杂-假异胞苷、zebularine、5-氮杂-zebularine、5-甲基-zebularine、5-氮杂-2-硫代-zebularine、2-硫代-zebularine、2-甲氧基-胞苷、2-甲氧基-5-甲基-胞苷、4-甲氧基-假异胞苷和4-甲氧基-1-甲基-假异胞苷。在其它实施方式中，修饰的核苷包括2-氨基嘌呤、2，6-二氨基嘌呤、7-去氮杂-腺嘌呤、7-去氮杂-8-氮杂-腺嘌呤、7-去氮杂-2-氨基嘌呤、7-去氮杂-8-氮杂-2-氨基嘌呤、7-去氮杂-2，6-二氨基嘌呤、7-去氮杂-8-氮杂-2，6-二氨基嘌呤、1-甲基腺苷、N6-甲基腺苷、N6-异戊烯基腺苷、N6-(顺-羟基异戊烯基)腺苷、2-甲基硫代-N6-(顺-羟基异戊烯基)腺苷、N6-甘氨酰氨基甲酰基腺苷(glycinylcarbamoyladenosine)、N6-苏氨酰氨基甲酰基腺苷(threonylcarbamoyladenosine)、2-甲基硫代-N6-苏氨酰氨基甲酰基腺苷、N6，N6-二甲基腺苷、7-甲基腺嘌呤、2-甲基硫代-腺嘌呤和2-甲氧基-腺嘌呤。在其它实施方式中，修饰的核苷包括肌苷、1-甲基-肌苷、怀俄苷、怀丁苷、7-去氮杂-鸟苷、7-去氮杂-8-氮杂-鸟苷、6-硫代-鸟苷、6-硫代-7-去氮杂-鸟苷、6-硫代-7-去氮杂-8-氮杂-鸟苷、7-甲基-鸟苷、6-硫代-7-甲基-鸟苷、7-甲基肌苷、6-甲氧基-鸟苷、1-甲基鸟苷、N2-甲基鸟苷、N2，N2-二甲基鸟苷、8-氧代-鸟苷、7-甲基-8-氧代-鸟苷、1-甲基-6-硫代-鸟苷、N2-甲基-6-硫代-鸟苷和N2，N2-二甲基-6-硫代-鸟苷。在一些实施方式中，核苷酸在大沟面上可以被修饰并且可以包括利用甲基或卤素基团取代尿嘧啶的C-5上的氢。在具体的实施方式中，修饰的核苷是5′-O-(1-硫代磷酸)-腺苷、5′-O-(1-硫代磷酸)-胞苷、5′-O-(1-硫代磷酸)-鸟苷、5′-O-(1-硫代磷酸)-尿苷或5′-O-(1-硫代磷酸)-假尿苷。在进一步具体的实施方式中，修饰的核苷酸包括选自6-氮杂-胞苷、2-硫代-胞苷、α-硫代-胞苷、假-异-胞苷、5-氨基烯丙基-尿苷、5-碘-尿苷、N1-甲基-假尿苷、5，6-二氢尿苷、α-硫代-尿苷、4-硫代-尿苷、6-氮杂-尿苷、5-羟基-尿苷、脱氧-胸苷、5-甲基-尿苷、吡咯并-胞苷、肌苷、α-硫代-鸟苷、6-甲基-鸟苷、5-甲基-胞苷、8-氧代-鸟苷、7-去氮杂-鸟苷、N1-甲基-腺苷、2-氨基-6-氯-嘌呤、N6-甲基-2-氨基-嘌呤、假-异-胞苷、6-氯-嘌呤、N6-甲基-腺苷、α-硫代-腺苷、8-叠氮基-腺苷、7-去氮杂-腺苷的核苷修饰。先前已经描述了进一步修饰的核苷酸(WO2013052523)。产量：产量，也称为反应产量，是在化学或酶促反应中获得的产物量。绝对产量可以作为以克或以摩尔(摩尔产量)为单位的重量给出。相对产量、分数产量(fractionalyield)或产量百分数——其用来测量合成过程的效力——通过使获得的产物的量除以理论产量来计算(二者的计量单位必须是相同的)。相对产量＝(实际产量)/(理论产量)实际产量：实际产量指的是在化学反应中获得的产物的量。理论产量：理论产量是可以在完美高效的化学或酶促反应中产生的产物的最大量。现实中，大多数反应不是极其高效的——反应的实际产量通常小于理论产量。考虑反应的化学计量学，基于限制反应物的摩尔量计算理论产量。对于计算，通常假设仅涉及一个反应。RNA产量：RNA产量是在体外转录反应中获得的RNA产物的量。RNA产量可以表达为RNA浓度(g/ml或mol/1)。RNA浓度乘以反应体积得出RNA的绝对量(以克或摩尔为单位)。实际RNA产量：实际RNA产量是在限定的时间点在体外转录反应中RNA产物的实验测定的量，例如反应完成后的产量。例如，可以使用分光光度计经由260nm下的吸光度测量测定RNA浓度(Kolitz等，2013.MethodsEnzymol.530：331-6)。260nm下的一个吸光度单位对应于40ng/μl的RNA(1A260＝40ng/μlRNA)。理论RNA产量：理论RNA产量是基于体外转录反应中可用的NTP的最大可能的RNA产量。在具有相等浓度的四种NTP(ATP、GTP、CTP、UTP)的标准转录反应中，对应于RNA序列中最常见的核苷酸的核苷酸通常成为限制因素。在使用感兴趣的RNA序列的序列优化的NTP混合物的序列优化的转录反应中，单独核苷酸均不成为限制因素。为了计算转录反应的理论RNA产量，在转录反应开始时存在的每种NTP的量(以mol为单位)除以在RNA分子的序列中存在的各种核苷酸的数目(以mol为单位)，产生可以合成的可能数目的RNA分子。乘以RNA的分子量生成以质量单位(克)的理论RNA产量。在使用相等浓度的每种NTP的标准转录反应中，对应于RNA序列中最常见的核苷酸的NTP通常成为限制因素。相比之下，在序列优化的转录反应中，没有NTP将称为限制因素，因为所有类型的NTP以与RNA分子的序列中对应的核苷酸相同的比率存在。相对RNA产量：相对RNA产量、分数RNA产量或RNA产量百分数——其用来测量体外转录反应的效率——通过使获得的RNA产物的量(实际RNA产量)除以理论RNA产量进行计算(二者的计量单位必须是相同的)：相对RNA产量＝(实际RNA产量)/(理论RNA产量)为了表达体外转录反应的效率，可以计算RNA产量百分数：％RNA产量＝(实际RNA产量)/(理论RNA产量)×100具体实施方式在第一方面，本发明涉及用于合成给定序列的RNA分子的方法，其包括下列步骤：a)测定四种核苷酸G、A、C和U中的每种在所述RNA分子中的分数(1)，和b)通过体外转录在序列优化的反应混合物中合成所述RNA分子，其中所述序列优化的反应混合物包括四种核糖核苷三磷酸(NTP)GTP、ATP、CTP和UTP，缓冲液，DNA模板和RNA聚合酶，其中四种核糖核苷三磷酸(NTP)中的每种在反应混合物中的分数(2)对应于各种核苷酸在所述RNA分子中的分数(1)。在本发明的背景下并且如实施例1和图5与6中显示的，已经发现使用包含四种核糖核苷三磷酸(NTP)GTP、ATP、CTP和UTP的序列优化的反应混合物用于通过体外转录产生具有给定序列的RNA分子与具有等摩尔的初始浓度的所有四种NTP的非优化的反应混合物相比导致更高的RNA产物产量和更少的未并入的并因此更少浪费的NTP。当难以合成并且因此使用昂贵的修饰的核苷酸时，此方面是尤其有价值的。在序列优化的NTP混合物中，GTP、ATP、CTP和UTP以以下分数出现：该分数对应于在所述RNA序列中出现的所述核苷酸G、A、C和U的分数。在序列优化的体外转录反应中，设想四种NTP消耗至相同的程度并且转录继续直到NTP被用尽，因而浪费更少的材料。另外，预期当使用序列优化的NTP混合物时，避免上述的合成比编码的RNA长的RNA分子——例如由于自身互补的3′延伸(Triana-Alonso等，1995，JBC；270(11)：6298-6307)——的可能性，这是因为在反应结束时不保留过量的UTP。尤其是如果RNA包含poly(A)尾——如在RNA比如mRNA中常见的，转录反应中过量的未并入的UTP可以导致与poly-A-序列相反的尿苷核苷酸的RNA-模板依赖性并入，其导致可以激活先天免疫应答并且减少蛋白质合成的双链RNA分子(Kariko等，2011，NucleicAcidsRes.；39(21)：e142)。如下面将详细说明的，使用体外转录生产RNA分子的方法是本领域中已知的。使用核苷酸类似物提高例如RNA分子的稳定性也是已知的。本发明关注核糖核苷三磷酸(NTP)在体外转录反应的反应混合物中的浓度。结果，在本发明的方法的第一步骤中，测定四种核苷酸G、A、C和U中的每种在所述RNA分子中的分数(1)。这可以通过本领域中已知的任何方法进行，例如通过对核苷酸的数目进行简单计数或通过使用基于计算机的方法。每种核苷酸的分数(1)然后可以由任何合适的术语——包括数目、百分比、摩尔分数或摩尔百分数——表达。摩尔分数(molefraction)或克分子分数(molarfraction)(xi)被定义为组分的量(以摩尔为单位表达)ni除以混合物中所有组分的总量ntot。所有摩尔分数的和等于1。以100的分母表达的相同的概念是摩尔百分数或摩尔百分比(mol％)。基于核苷酸中的每种在所述RNA分子中的分数的测量，在本发明方法的进一步步骤中，所述RNA分子通过体外转录在序列优化的反应混合物中合成，其中所述序列优化的反应混合物包括四种核糖核苷三磷酸(NTP)GTP、ATP、CTP和UTP或其类似物，并且其中四种核糖核苷三磷酸(NTP)中的每种在序列优化的反应混合物中的分数(2)对应于各种核苷酸在所述RNA分子中的分数(1)。在优选的实施方式中，本发明的方法的步骤b)包括以下步骤b1)制备包括四种核糖核苷三磷酸(NTP)GTP、ATP、CTP和UTP的序列优化的核糖核苷三磷酸(NTP)混合物，其中四种核糖核苷三磷酸(NTP)中的每种在序列优化的核糖核苷三磷酸(NTP)混合物中的分数(2)对应于各种核苷酸在所述RNA分子中的分数(1)，和b2)通过体外转录在序列优化的反应混合物中合成所述RNA分子，所述序列优化的反应混合物包括步骤(b1)的序列优化的核糖核苷三磷酸(NTP)混合物、缓冲液、DNA模板和RNA聚合酶。结果，在此优选的实施方式中，基于分数(1)的测定制备序列优化的核糖核苷三磷酸(NTP)混合物，其然后被添加至反应混合物。上面关于序列优化的反应混合物指示的所有定义，并且尤其是关于问题“分数(1)对应于分数(2)”做出的那些定义也适用于序列优化的核糖核苷三磷酸(NTP)混合物。在此背景下，本领域技术人员将理解如果所述RNA分子不分别包含所有核苷酸G、A、C和U，其也将适用于序列优化的核糖核苷三磷酸(NTP)混合物和序列优化的反应混合物。根据本发明，“分数(1)对应于分数(2)”的意思是核糖核苷三磷酸(NTP)在序列优化的NTP混合物或在序列优化的反应混合物中的分数已经适应于核苷酸在RNA分子中的分数。技术员人将理解没有必要使分数(2)精确反映分数(1)，但是需要各种核糖核苷三磷酸在序列优化的NTP混合物或在序列优化的反应混合物中的单独分数(2)反映对应的核苷酸在所述RNA分子中的分数(1)。为了更详细地评价分数(1)和分数(2)之间的关系，针对术语“分数(1)对应于分数(2)”的定义，可以考虑下列内容：a)关于核糖核苷三磷酸在序列优化的NTP混合物或在序列优化的反应混合物中的分数，其对应于待合成的RNA分子第一个核苷酸，根据本发明的一个实施方式，可能分数(2)在分数(1)的范围中，例如分数(1)和分数(2)相差不超过25％、20％、15％、10％、7％、5％或相差0.1％和5％之间的值。b)关于在序列优化的NTP混合物或在序列优化的反应混合物中存在的其它核糖核苷三磷酸，其不对应于所述RNA分子的第一个核苷酸，分数(2)优选地在分数(1)的范围中，例如分数(1)和分数(2)相差不超过25％、20％、15％、10％、7％、5％或相差0.1％和5％之间的值。在本发明的优选的实施方式中，在体外转录开始前起始核苷酸被添加至序列优化的NTP混合物或序列优化的反应混合物。起始核苷酸是对应于所述RNA分子的第一个核苷酸(+1位置)的核苷酸。可以尤其添加起始核苷酸以增加RNA聚合酶的起始速率。所述起始核苷酸也是本领域中已知的并且包括核苷一磷酸、核苷二磷酸、核苷三磷酸。起始核苷酸可以是单核苷酸、二核苷酸或三核苷酸。在所述RNA分子的第一个核苷酸是G的情况下，起始核苷酸优选地是GTP或GMP。在本发明的优选的实施方式中，所述起始核苷酸是二核苷酸。在甚至更优选的实施方式中，起始核苷酸是帽类似物。在优选的实施方式中，帽类似物选自G[5′]PPP[5′]G、m7G[5′]ppp[5′]G、m32，2，7G[5′]ppp[5′]G、m27，3′-OG[5′]ppp[5′]G(3′-ARCA)、m27，2′-OGpppG(2′-ARCA)、m27，2′-OGppspGD1(β-S-ARCAD1)和m27，2′-OGppspGD2(β-S-ARCAD2)。然而，根据另一个优选的实施方式，在序列优化的NTP混合物或在序列优化的反应混合物中，对应于所述RNA分子的第一个核苷酸的起始核苷酸与在所述RNA分子的第一个位置处发现的所述RNA分子中该核苷酸的分数相比过量地添加。优选地，以大约1至20mM、1至17.5mM、1至15mM、1至12.5mM、1至10mM、1至7.5mM、1至5mM或1至2.5mM的范围内的初始浓度添加起始核苷酸。甚至更优选地，以大约5至20mM或7.5至17.5mM的初始浓度添加起始核苷酸。在上面的优选的示例性实施方式中，RNA分子的第一个核苷酸是G，起始核苷酸是G的帽类似物并且对应的核糖核苷三磷酸是GTP。在此实施方式中，帽类似物与GTP相比过量地存在于反应混合物中。优选地，以大约1至20mM、1至17.5mM、1至15mM、1至12.5mM、1至10mM、1至7.5mM、1至5mM或1至2.5mM的范围内的初始浓度添加帽类似物。甚至更优选地，以大约5至20mM、7.5至20mM、10至20mM或12.5至20mM的初始浓度添加帽类似物。用于体外转录的方法是本领域中已知的(Geall等，2013.Semin.Immunol.25(2)：152-159；Brunelle等，2013.MethodsEnzymol.530：101-14)。在所述方法中使用的试剂通常包括：1)具有启动子序列的线性化DNA模板，其对其各自的RNA聚合酶比如噬菌体-编码的RNA聚合酶具有高的结合亲和力，2)四种碱基(腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤和尿嘧啶)的核糖核苷三磷酸(NTP)；3)如上面限定的帽类似物(例如m7G(5′)ppp(5′)G(m7G))；4)DNA-依赖性RNA聚合酶(例如T7、T3或SP6RNA聚合酶)；5)核糖核酸酶(RNase)抑制剂，以使任何污染RNase失活；6)焦磷酸酶，以降解焦磷酸盐，其可以抑制转录；7)MgCl2，其供应Mg2+作为聚合酶的辅助因子；8)缓冲液，以维持合适的pH值，其还可以包含最佳浓度下的抗氧化剂和聚胺比如亚精胺。根据优选的实施方式，用于本发明的方法的合成给定序列的RNA分子的序列优化的反应混合物包括缓冲液，其选自4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)和三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)。优选地，缓冲液在10至100mM、10至75mM、10至50mM、10至40mM、10至30mM或10至20mM的浓度下使用。可以利用例如NaOH、KOH或HCl调节缓冲液的pH值。优选地，缓冲液具有6至8.5、6.5至8.0、7.0至7.5、甚至更优选的7.5的pH值。最优选的是选自80mMHEPES/KOH，pH7.5和40mMTris/HCl，pH7.5的缓冲液。根据本发明的优选的实施方式，包括在序列优化的反应混合物中的RNA聚合酶选自T3、T7和SP6RNA聚合酶。优选地，RNA聚合酶的浓度是大约1至100nM、1至90nM、1至80nM、1至70nM、1至60nM、1至50nM、1至40nM、1至30nM、1至20nM或大约1至10nM。甚至更优选地，RNA聚合酶的浓度是大约10至50nM、20至50nM或30至50nM。最优选的是大约40nM的RNA聚合酶浓度。在此背景下，500至10000U/ml的浓度的RNA聚合酶是优选的。更优选的是1000至7500U/ml的浓度并且最优选的是2500至5000单位/ml的浓度的RNA聚合酶。本领域技术人员将理解RNA聚合酶浓度的选择受DNA模板浓度影响。根据本发明的优选的实施方式，包括在序列优化的反应混合物中的DNA模板的浓度在大约1至50nM、1至40nM、1至30nM、1至20nM或大约1至10nM的范围内。甚至更优选地，DNA模板的浓度是大约10至30nM。最优选地，DNA模板的浓度是大约20nM。在此背景下，具有大约1至200μg/ml的DNA模板的浓度是特别优选的，并且更优选地大约10至100μg/ml，并且最优选地大约20至50μg/ml(例如25或50μg/ml)。根据本发明的优选的实施方式，序列优化的反应混合物包括焦磷酸酶。优选地，焦磷酸酶的浓度是大约1至20单位/ml、1至15单位/ml、1至10单位/ml、1至5单位/ml或1至2.5单位/ml。甚至更优选地，焦磷酸酶的浓度是大约1单位/ml或是大约5单位/ml。根据本发明的优选的实施方式，序列优化的反应混合物包括Mg++离子。优选地，Mg++离子以MgCl2或Mg(OAc)2的形式提供。优选地，初始的游离Mg++浓度是大约1至100mM、1至75mM、1至50mM、1至25mM或1至10mM。甚至更优选地，初始的游离Mg++浓度是大约10至30mM或大约15至25mM。最优选的是大约24mM的初始的游离Mg++浓度。本领域技术人员将理解Mg++浓度的选择受初始的总NTP浓度影响。根据本发明的优选的实施方式，序列优化的反应混合物包括还原剂以保持RNA聚合酶处于其活化状态。优选地，还原剂选自二硫苏糖醇(DTT)、二硫赤藓糖醇(DTE)、三(2-羧基乙基)膦(TCEP)和β-巯基乙醇。优选地，还原试剂的浓度是大约1至50mM、1至40mM、1至30mM、或1至20mM、或1至10mM。甚至更优选地，还原试剂的浓度是10至50mM或20至40mM。最优选的是包括40mM的DTF的序列优化的反应混合物。根据本发明的优选的实施方式，序列优化的反应混合物包括聚胺。优选地，聚胺选自精胺和亚精胺。优选地，聚胺的浓度是大约1至25mM、1至20mM、1至15mM、1至10mM、1至5mM或大约1至2.5mM。甚至更优选地，聚胺的浓度是大约2mM。最优选的是包括2mM的亚精胺的序列优化的反应混合物。根据本发明的优选的实施方式，序列优化的反应混合物包括核糖核酸酶抑制剂。优选地，核糖核酸酶抑制剂的浓度是大约1至500单位/ml、1至400单位/ml、1至300单位/ml、1至200单位/ml或1至100单位/ml。甚至更优选地，核糖核酸酶抑制剂的浓度是大约200单位/ml。根据本发明的优选的实施方式，在序列优化的NTP混合物或序列优化的反应混合物中的初始的总NTP浓度小于20mM、小于15mM、小于10mM、小于7.5mM、小于5.0mM或小于2.5mM。根据本发明，术语初始的总核苷酸浓度的意思是当序列优化的反应混合物的各种组分已经以最终体积集合用于进行体外转录反应时，在序列优化的NTP混合物或序列优化的反应混合物中初始地存在的NTP的总浓度，例如ATP、GTP、CTP和/或UTP的浓度的和。自然地，随着反应进行，核苷酸将并入RNA分子，并且结果，总核苷酸的浓度将从其初始值渐进地减小。本发明的一个重要的方面是使用序列优化的NTP混合物或序列优化的反应混合物导致甚至在低的初始的总核苷酸浓度(例如2mM)下RNA合成的效率增加。相比之下，先前已经建议对于增加的RNA产量，高浓度的总核苷酸——大约12mM至40mM——是必要的(US6586218)。另外，当使用序列优化的NTP混合物或序列优化的反应混合物中低的初始的总核苷酸浓度(例如2.5mM)时，预期短的无效RNA分子的合成降低。相比之下，当标准的等摩尔NTP混合物的NTP浓度降低低于大约2mM时，观察到无效转录的增加(Kern等，1999.Biotechnol.Prog.15，174-184)。本发明的另一个优选的实施方式涉及NTP被添加至序列优化的NTP混合物或序列优化的反应混合物的形式。核糖核苷三磷酸(NTP)GTP、ATP、CTP和UTP或其类似物可以被提供有一价或二价阳离子作为平衡离子。优选地，一价阳离子选自Li+、Na+、K+、NH4+或三(羟甲基)-氨基甲烷(Tris)。优选地，二价阳离子选自Mg++、Ba++和Mn++。根据本发明的最优选的实施方式，NTP平衡离子是三(羟甲基)-氨基甲烷(Tris)。噬菌体RNA聚合酶已知对盐抑制敏感。已经描述了高NaCl浓度对RNA产量的负面影响(例如Kern&Davis，1997.Biotechnol.Prog.，13，747-756；US6,586,218B2)。高浓度的Na-NTP——尤其是作为当遵循NTP补料策略时的结果——可能因此导致减少的RNA产量。可以通过使用Tris-核苷酸规避此限制，这是因为与高Na浓度相比，RNA聚合酶活性更少受高Tris浓度影响。如实施例5和图12中显示的，与Tris相比，RNA产量对添加Na更敏感。本领域中已知分别地取代核糖核苷三磷酸GTP、ATP、GTP和UTP，修饰的核苷三磷酸(类似物)也可以用于体外转录反应，例如以增强RNA的稳定性。如实施例3和图8中显示的，序列优化的NTP混合物或序列优化的反应混合物中的部分或全部UTP可以被假-UTP替换。结果，根据本发明的优选的实施方式，序列优化的NTP混合物或序列优化的反应混合物中的至少一种核糖核苷三磷酸的部分或全部可以被修饰的核苷三磷酸替换。在本发明的优选的实施方式中，所述修饰的核苷三磷酸选自假尿苷-5′-三磷酸、1-甲基假尿苷-5′-三磷酸、2-硫代尿苷-5′-三磷酸、4-硫代尿苷-5′-三磷酸和5-甲基胞苷-5′-三磷酸。本领域技术人员将理解只可能在体外转录开始前精确地建立序列优化的NTP混合物或序列优化的反应混合物的单个组分的浓度。结果，在本发明的优选的实施方式中，如上面限定的数目或分数反映转录开始前在序列优化的反应混合物或在序列优化的NTP混合物中存在的初始条件。根据本发明的另一个优选的实施方式，在体外转录的过程中，序列优化的反应混合物补充有如本文限定的序列优化的核糖核苷三磷酸(NTP)混合物。在本发明的背景下，已经发现可以通过供给额外量的序列优化的NTP混合物进入体外转录反应(NTP补料)进一步增加RNA产量。如实施例1和图6中显示的，添加额外的序列优化的NTP混合物显著地增加RNA产量。新鲜的序列优化的NTP混合物以这样的方式添加：维持帽类似物与对应的核苷酸例如GTP的期望的比率(例如4∶1)。优选地，新鲜的序列优化的NTP混合物在体外转录反应结束时添加，此时序列优化的反应混合物中所有的核苷酸被消耗。保留的帽类似物与新添加的对应的核苷酸例如GTP的比率(例如4∶1)可以被近似地维持，因为接近100％的帽类似物转录反应结束时保留，这是因为每个RNA分子仅可以并入一个帽类似物。此策略导致相同的加帽效率，增加的产量(＞4.5-倍，取决于RNA序列)和显著降低的成本。此外，增加的NTP含量防止RNA分子在转录期间沉淀，如对于标准的NTP浓度常见的(在标准的反应和序列优化的反应二者中)。NTP的序列-依赖性并入还允许监测体外转录反应的进展。如实施例6和图13中显示的，可以通过从体外转录反应分离未并入的核苷酸和测量260m下的吸光度监测体外转录反应的进展。原因是所有四种NTP的总浓度的减少与合成的RNA的量直接相关联。如果使用具有相同比率的核苷三磷酸的标准的NTP混合物，此途径将不可能如此直接。260nm下的吸光度的降低可以直接地翻译为产生的RNA分子，如果从RNA和DNA分离NTP以避免干扰的话——例如通过具有低分子量截留的膜过滤。用于定量核酸和核苷酸的方法是本领域中已知的。用于核酸定量的光谱法包括传统的吸光度测量(Kolitz等，2013.MethodsEnzymol.530：331-6)以及使用荧光染料比如溴化乙锭和具有合适的激发波长(例如302或546nm)的荧光计的更敏感的荧光技术(Gallagher，2011.CurrentProtocolsinMolecularBiology.93：A.3D.1-A.3D.14)。结果，在本发明的优选的实施方式中，通过体外转录合成所述RNA分子之后分离和定量未并入的NTP。根据本发明的优选的实施方式，所述RNA分子选自非编码和编码RNA分子。非编码RNA(ncRNA)分子是不被翻译为肽或蛋白质的功能性RNA分子。非编码RNA分子包括高丰度和功能重要的RNA比如转移RNA(tRNA)和核糖体RNA(rRNA)，以及RNA比如snoRNA、微小RNA、siRNA、snRNA、exRNA和piRNA，和包括实例比如Xist和HOTAIR的长ncRNA(Esteller，2011.Nat.Rev.Genet.12(12)：861-74)。另外，非编码RNA分子包括免疫刺激RNA(isRNA)分子。优选地，免疫刺激RNA可以是线性单链RNA。甚至更优选地，免疫刺激RNA可以是长的线性单链非编码RNA。在此背景下，isRNA在其5′-端处携带三磷酸是特别优选的。免疫刺激RNA(isRNA)可以包括已知为具有免疫刺激性的任何RNA序列，其包括但不限于代表和/或编码TLR的配体、RNA的细胞内受体的配体(比如RIG-I、MDA-5或PKR)(Meylan和Tschopp，2006.Mol.Cell22，561-569)的RNA序列、或任何其它免疫刺激RNA序列，所述TLR优选地选自人家族成员TLR1至TLR10或鼠家族成员TLR1至TLR13，更优选地选自人家族成员TLR1至TLR10，甚至更优选地选自TLR7和TLR8。另外，免疫刺激RNA分子可以包括能够引起先天免疫应答的任何其它RNA。不限制于此，这样的免疫刺激RNA可以包括核糖体RNA(rRNA)、转移RNA(tRNA)、信使RNA(mRNA)和病毒RNA(vRNA)。优选地，免疫刺激RNA是非编码RNA。这样的免疫刺激RNA可以包括1000至5000、500至5000、5至5000、或5至1000、5至500、5至250、5至100、5至50或5至30个核苷酸的长度。根据进一步特别优选的实施方式，这样的免疫刺激RNA分子由式(I)的RNA组成或包括式(I)的RNA：(NuGlXmGnNv)a，(式(I))其中：G是鸟苷(鸟嘌呤)、尿苷(尿嘧啶)或鸟苷(鸟嘌呤)或尿苷(尿嘧啶)的类似物，优选地鸟苷(鸟嘌呤)或其类似物；X是鸟苷(鸟嘌呤)、尿苷(尿嘧啶)、腺苷(腺嘌呤)、胸苷(胸腺嘧啶)、胞苷(胞嘧啶)或这些核苷酸(核苷)的类似物，优选地尿苷(尿嘧啶)或其类似物；N是具有大约4至50，优选地大约4至40，更优选地大约4至30或4至20个核酸的长度的核酸序列，每个N独立地选自鸟苷(鸟嘌呤)、尿苷(尿嘧啶)、腺苷(腺嘌呤)、胸苷(胸腺嘧啶)、胞苷(胞嘧啶)或这些核苷酸(核苷)的类似物；a是1至20，优选地1至15，最优选地1至10的整数；l是1至40的整数，其中当1＝1时，G是鸟苷(鸟嘌呤)或其类似物，当1＞1时，这些核苷酸(核苷)的至少50％是鸟苷(鸟嘌呤)或其类似物；m是整数并且至少是3；其中当m＝3时，X是尿苷(尿嘧啶)或其类似物，并且当m＞3时，出现至少3个连续的尿苷(尿嘧啶)或尿苷(尿嘧啶)的类似物；n是1至40的整数，其中当n＝1时，G是鸟苷(鸟嘌呤)或其类似物，当n＞1时，这些核苷酸(核苷)的至少50％是鸟苷(鸟嘌呤)或其类似物；u、v可以相互独立地是0至50的整数，优选地，其中当u＝0时，v≥1，或当v＝0时，u≥1；其中式(I)的核酸分子的长度为至少50个核苷酸，优选地至少100个核苷酸，更优选地至少150个核苷酸，甚至更优选地至少200个核苷酸和最优选地至少250个核苷酸。根据最优选的实施方式，根据式(I)的RNA分子可以选自例如下列序列：GGGAGAAAGCUCAAGCUUAUCCAAGUAGGCUGGUCACCUGUACAACGUAGCCGGUAUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUGACCGUCUCAAGGUCCAAGUUAGUCUGCCUAUAAAGGUGCGGAUCCACAGCUGAUGAAAGACUUGUGCGGUACGGUUAAUCUCCCCUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUAGUAAAUGCGUCUACUGAAUCCAGCGAUGAUGCUGGCCCAGAUCUUCGACCACAAGUGCAUAUAGUAGUCAUCGAGGGUCGCCUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUGGCCCAGUUCUGAGACUUCGCUAGAGACUACAGUUACAGCUGCAGUAGUAACCACUGCGGCUAUUGCAGGAAAUCCCGUUCAGGUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUCCGCUCACUAUGAUUAAGAACCAGGUGGAGUGUCACUGCUCUCGAGGUCUCACGAGAGCGCUCGAUACAGUCCUUGGAAGAAUCUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUGUGCGACGAUCACAGAGAACUUCUAUUCAUGCAGGUCUGCUCUAG(R2025；SEQIDNO：4)编码RNA是可以被翻译为肽或蛋白质的功能性RNA分子。优选地，编码RNA分子包括编码至少一个肽或蛋白质的至少一个开放阅读框。在此背景下，编码RNA分子可以包括一个(单顺反子的)、两个(双顺反子的)或更多个(多顺反子的)开放阅读框(ORF)。编码RNA分子可以是信使RNA(mRNA)分子、病毒RNA分子或自我复制RNA分子(复制子)。优选地，RNA分子是mRNA。根据本发明的优选的实施方式，所述RNA分子长于100个核苷酸。具有100和15.000个核苷酸、100和12.500个核苷酸、100和10.000个核苷酸、100和7.500个核苷酸、100和5.000个核苷酸、100和2.500个核苷酸、100和1.500个核苷酸或100和1.000个核苷酸之间的长度的RNA是同等优选的。在本发明的优选的实施方式中，给定序列的RNA分子的所述合成作为大规模合成进行。根据本发明，术语“大规模”指的是大约毫克数量，优选地至少一克的所述RNA分子的反应产量。根据本发明的优选的实施方式，体外转录反应在用于大规模合成RNA的生物反应器中实施，所述生物反应器也称为转录反应器或RNA反应器。因此，生物反应器可以适于进行上面描述的本发明的方法。根据本发明，用于合成给定序列的RNA分子的这类生物反应器——优选地以大规模——是模块化设计的体外转录反应器系统，其包括反应模块——用于在序列优化的反应混合物中实施体外RNA转录反应、捕捉模块——用于暂时地捕捉转录的RNA分子、和控制模块——用于控制序列优化的反应混合物的组分横向进给进入反应模块。在此，反应模块包括用于从反应混合物分离核苷酸的滤膜，并且控制模块对序列优化的反应混合物的组分横向进给的控制基于分离的核苷酸的测量浓度。如本文使用的术语生物反应器或转录反应器指的是室或试管或柱，其中体外转录反应在规定条件下实施。生物反应器可以被热调节以精确地维持特定的温度，通常在4和40℃之间。生物反应器可以配置有流入或进料管线和出口。生物反应器可以是具备可变的搅拌速率的搅拌杯。根据本发明，生物反应器包括用于从反应混合物分离核苷酸的滤膜，特别地用于从序列优化的反应混合物分离核苷酸和其它低分子量组分。在这样的流动系统中引入滤膜，例如超滤膜，用于将高分子量组分比如例如蛋白质和/或多核苷酸与低分子量组分比如核苷酸分离。滤膜用于在反应模块的反应器核心中选择性地保留固定化的DNA模板、RNA聚合酶和合成的RNA分子，而较小的分子比如核苷酸(NTP)可以穿过滤膜进入反应模块的单独的较小的隔室，即过滤隔室。然后例如通过包含低分子量组分的分离流体中的光谱分析，可以测量核苷酸浓度。可选地，核苷酸浓度可以通过在线HPLC系统测量。在该反应器系统中应用序列优化的NTP混合物允许在体外转录反应期间实时测量核苷酸浓度以监测体外转录反应的进展。合适的滤膜可以由本领域技术人员已知的多种材料组成(vandeMerbel，1999.J.Chromatogr.A856(1-2)：55-82)。例如，膜可以由再生的或改性的纤维素或由合成材料组成。后者包括聚砜(PSU)、聚丙烯腈(PAN)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚芳醚-砜的混合物、聚乙烯吡咯烷酮和聚酰胺(Polyamix.RTM.)。例如，聚砜包括聚醚砜[聚(氧代-1，4-苯磺酰基-1，4-苯基)，缩写PES]。在一些示例性实施方式中，针对根据本公开内容的用途，聚醚砜可以被利用为半透膜。在一些情况下，PES膜包括与PSU膜相比增加的亲水性(和/或提高的膜利用水的湿润性)。在一些实施方式中，例如，PES膜的湿润性可以通过包含水溶性聚合物聚乙烯吡咯烷酮进一步增加。影响分子穿过滤膜的通量的重要参数是孔径或孔径分布。滤膜通常表征为其分子量截留(MWCO)值，即保留大于90％的特定的大小限制，其定义为最小复合物的分子质量。对于每个应用，需要选择适当的MWCO值，以便充分地保留高分子量复合物，但是同时确保分析物的快速输送。本发明的生物反应器的滤膜可以具有10至100kDa、10至75kDa、10至50kDa、10至25kDA或10至15kDa的范围内的MWCO。甚至更优选地，滤膜具有大约10至50kDa的范围内的MWCO。优选地，滤膜选自再生的纤维素、改性的纤维素、聚砜(PSU)、聚丙烯腈(PAN)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚乙烯醇(PVA)和聚芳醚砜(PAES)。根据本发明的优选的实施方式，生物反应器包括固定在固相支持体上作为RNA转录反应的基础的DNA模板。DNA模板的固定允许重复使用模板并且减少残留DNA对RNA产物的污染。此外，固定使得使用DNAse对从最终RNA产物去除DNA模板非必要。DNA模板——其优选地固定在反应模块的反应核心中的固相支持体上——可以代表化学合成的DNA分子、分离的DNA限制片段、质粒或扩增的DNA分子，例如通过扩增过程比如聚合酶链反应(PCR)。DNA模板可以是双链体或包括单链RNA编码区上游的双链启动子区的单元。DNA模板可以用配体修饰，以便在DNA链的5′端、3′端或内部核苷酸处固定至固相支持体。根据本发明，术语“固相支持体”涉及能够将DNA分子固定在其表面上的每一种不溶解的支持体。固相支持体可以选自琼脂糖、改性的琼脂糖、琼脂糖凝胶、聚苯乙烯、乳胶、纤维素、和铁磁颗粒或亚铁磁颗粒。用于选择合适的固相支持体和用于将DNA分子连接至所述固相支持体的方法和策略是本领域中已知的(参见例如Arndt-Jovin等，1975.Eur.J.Biochem.54(2)：411-8；Kerrigan等，2001.CurrentProtocolsinMolecularBiology.24：12.10.1-12.10.18；WO1995/08626)。DNA模板在固相支持体上的固定可以经由共价键或非共价键。优选地，DNA模板的固定通过非共价键发生。例如，DNA模板至固相支持体的固定可以通过非共价生物素-链亲和素相互作用发生。DNA模板的非编码链可以修饰有5′-末端生物素基团，其用于将DNA链固定至包括链亲和素蛋白的固相支持体基体。DNA模板的互补的RNA-编码链可以保持非固定的。通过其它类型的非共价键——例如，poly(A)-poly(T)和poly(G)-poly(C)相互作用——将DNA模板固定至固相支持体也是可能的。同等优选地，DNA模板的固定通过共价键发生，例如，酯键或其衍生物。一般而言，在连接前，固相支持体可以包含活性基团比如NHS、碳二亚胺等以使得与DNA分子的连接反应能够实现。DNA分子可以通过直接连接(例如使用官能团比如氨基-、巯基-、羧基-、羟基-、醛-、和酮基团)被连接至固相支持体。与固相支持体材料的键可以包含间隔区以优化DNA模板与支持体的空间分离。可以通过在DNA模板的5′端处插入额外的核苷酸提供间隔区。根据本发明的优选的实施方式，生物反应器的捕捉模块包括树脂/固相以捕捉转录的RNA分子和将转录的RNA分子与序列优化的转录反应混合物的其它可溶性组分分离。优选地，捕捉模块包括用于纯化捕捉的转录的RNA分子——例如通过洗涤过程等——的工具。进一步优选地，捕捉模块包括用于洗脱捕捉的转录的RNA分子——优选地借助洗脱缓冲液——的工具。根据进一步优选的实施方式，生物反应器进一步包括回流模块，用于在捕捉转录的RNA分子后将残留的过滤的序列优化的反应混合物——即除转录的RNA分子之外的序列优化的转录反应混合物的其它可溶性组分——从捕捉模块返回至反应模块，优选地，其中用于返回残留的过滤的序列优化的反应混合物的工具是泵。在此，回流模块优选地包括固定化酶比如焦磷酸酶或树脂以捕捉破坏性(disruptive)组分，比如磷酸盐。在优选的实施方式中，生物反应器包括至少一个离子选择性电极。在本发明的背景下，术语‘离子选择性电极’涉及将溶解于溶液的特定离子的活性转换为电势的换能器(例如传感器)，其中例如通过使用电压计或pH计可以测量电势。具体而言，如本文使用的术语‘离子选择性电极’包括系统，其包括具有选择通透性的膜或由具有选择通透性的膜组成，其中膜通常分隔两种电解质。如本文使用的离子选择性电极通常包括感测部分，其优选地包括具有选择通透性的膜和参比电极。膜通常是离子选择性膜，其表征为对不同类型离子的不同通透性。优选地，生物反应器的至少一个离子选择性电极包括选自玻璃膜、固态膜、基于液体的膜和复合膜的膜。在优选的实施方式中，如本文描述的生物反应器包括至少一个离子选择性电极，其中至少一个离子选择性电极包括含有膜的系统或由含有膜的系统组成，优选地如本文描述的膜，更优选地电化学膜，其对不同类型的离子具有不同的通透性，其中膜，优选地如本文描述的膜，更优选地电化学膜，优选地分隔两种电解质。在一个实施方式中，膜包括固体电解质层或不与水混溶的溶剂中的电解质溶液或由固体电解质层或不与水混溶的溶剂中的电解质溶液组成。膜优选地在一侧或两侧与电解质溶液接触。在优选的实施方式中，离子选择性电极包括内部参比电极。在一些实施方式中，例如，这样的内部参比电极可以被替换为金属接触物或被替换为绝缘体和半导体层。离子选择性电极允许不同介质中离子活性或离子浓度的高灵敏度的、快速的、准确的和非破坏性的测量。除直接测量离子活性或离子浓度之外，其还可以用来——具体地通过使用校正曲线——连续地监测浓度变化，作为控制试剂的剂量的元件或作为电位滴定中非常准确的指示电极。在优选的实施方式中，生物反应器包括至少一个离子选择性电极，优选地如本文描述的，用于测量生物反应器的至少一个隔室中一种或多种类型的离子的浓度。例如，至少一个离子选择性电极可以用于测量生物反应器的反应模块、控制模块或回流模块中一种或多种类型的离子的浓度。优选地，至少一个离子选择性电极被用于测量反应模块，更优选地反应核心或过滤隔室中一种或多种类型的离子的浓度。另外，至少一个离子选择性电极可以包括在生物反应器的传感器单元中，优选地如本文描述的。离子选择性电极可以位于生物反应器自身中、生物反应器上或生物反应器外(例如通过旁路连接至生物反应器)。在本发明的背景下，短语‘生物反应器包括至少一个离子选择性电极’因而可以指的是一种情况，其中至少一个离子选择性电极是生物反应器的一部分，或另一种情况，其中至少一个离子选择性电极是关于生物反应器独立的物理实体，但是其与生物反应器关联使用。根据一些实施方式，生物反应器包括至少一个离子选择性电极，优选地如本文描述的，用于测量包含在生物反应器的至少一个隔室中的液体中的一种或多种类型的离子的浓度，其中离子优选地选自H+、Na+、K+、Mg2+、Ca2+、Cl-和PO43-。根据一些实施方式，生物反应器包括至少一个离子选择性电极，优选地如本文描述的，其被连接至电势计，优选地多通道电势计(例如，6通道、高分辨率CITSensIon电势计；C-CITSensorsAG，瑞士)。在优选的实施方式中，生物反应器包括至少一个离子选择性电极，其中至少一个离子选择性电极优选地是管形电极(tubeelectrode)，更优选地选自Mg2+选择性管形电极、Na+选择性管形电极、Cl-选择性管形电极、PO43-选择性管形电极、pH-选择性管形电极和Ca2+选择性管形电极，其优选地与电势计关联使用。甚至更优选地，生物反应器包括至少一个离子选择性电极，其中至少一个离子选择性电极优选地选自CITSensIonMg2+选择性微管形电极、CITSensIonNa+选择性微管形电极、CITSensIonCl-选择性微管形电极、CITSensIonPO43-选择性微管形电极、CITSensIonpH-选择性微管形电极和CITSensIonCa2+选择性微管形电极(均来自C-CITSensorsAG，瑞士)，优选地与电势计关联使用，更优选地与多通道电势计，比如6通道、高分辨率CITSensIon电势计(C-CITSensorsAG，瑞士)关联使用。离子选择性电极具有用于实际用途的众多优势。例如，它们不影响测试溶液，因而允许非破坏性测量。另外，离子选择性电极是可移动的，适于直接测定以及滴定传感器，并且是成本有效的。在生物反应器(例如转录反应器)中使用离子选择性电极的主要优势是原位测量——不需要样品收集——和以非破坏性方式测量的可能性。根据本发明的优选的实施方式，生物反应器或更准确地生物反应器的控制模块包括用于分析序列优化的反应混合物中的关键工艺参数——比如pH值、传导性和核苷酸浓度——的传感器单元。优选地，生物反应器的传感器单元包括传感器，比如UV260/280nm的UV流动池，用于在体外转录反应期间实时测量核苷酸浓度。优选地，传感器单元的传感器通过光度分析测量作为工艺参数的核苷酸浓度。根据本发明的优选的实施方式，生物反应器包括控制模块。通过控制模块的数据收集和分析允许控制集成的泵系统(致动器)，用于反复供给序列优化的NTP混合物的组分或序列优化的反应混合物的组分，例如缓冲液组分、RNA聚合酶或核苷酸。严格控制和调节允许在导致高产物产量的最佳稳态条件下进行体外转录反应。优选地，控制模块控制序列优化的核糖核苷三磷酸(NTP)混合物至序列优化的反应混合物的添加，优选地，其中所述生物反应器包括用于将序列优化的核糖核苷三磷酸(NTP)混合物添加至序列优化的反应混合物的致动器。进一步，致动器还可以添加序列优化的反应混合物的其它反应组分——比如缓冲液组分或Mg++——至体外转录反应混合物。根据本发明的进一步优选的实施方式，生物反应器以半分批(semi-batch)模式或以连续模式操作。如本文使用的术语半分批指的是体外转录反应操作为重复的转录反应系列。例如，反应允许进行有限的时间，在该时间点处移出产物，添加新反应物，并且重复整个反应。如本文使用的术语连续流动指的是在生物反应器核心中连续地实施的反应，其中补充的反应物通过输入进料管线恒定地添加并且产物通过出口恒定地移出。连续流动反应器通过受控的装置流速控制试剂递送和产物移出，这对具有试剂限制和抑制产物的反应是有利的。在另一个方面，本发明涉及通过如本文公开的本发明的方法可获得的RNA分子。优选地，通过本发明的方法获得的RNA表征为与通过现有技术方法获得的RNA相比，具体地如与通过体外转录方法——其中NTP混合物未关于转录序列优化——比如使用标准的等摩尔NTP混合物的方法获得的RNA相比减小的免疫刺激活性。在进一步的方面，本发明还涉及针对给定序列的RNA分子优化的序列优化的核糖核苷三磷酸(NTP)混合物用于合成所述RNA分子的用途。在上面关于本发明的方法做出的与序列优化的核糖核苷三磷酸(NTP)混合物相关的所有定义和具体实施方式也适用于本发明的所述用途。尤其地，根据本发明的优选的实施方式，序列优化的NTP混合物已经通过包括以下步骤的方法优化：a)测定四种核苷酸G、A、C和U中的每种在所述RNA分子中的分数(1)，和b)制备包括四种核糖核苷三磷酸(NTP)GTP、ATP、CTP和UTP的序列优化的核糖核苷三磷酸(NTP)混合物，其中四种核糖核苷三磷酸中的每种在序列优化的核糖核苷三磷酸(NTP)混合物中的分数(2)对应于各种核苷酸在所述RNA分子中的分数(1)。在进一步的方面，本发明还涉及用于合成给定序列的RNA分子的序列优化的核糖核苷三磷酸(NTP)混合物，其包括四种核苷三磷酸GTP、ATP、CTP和UTP，其中四种核苷三磷酸中的每种在序列优化的核糖核苷三磷酸(NTP)混合物中的分数(2)对应于各种核苷酸在所述RNA分子中的分数(1)。在进一步的方面，本发明还涉及试剂盒，其包括如上面限定的针对给定序列的RNA分子优化的序列优化的核糖核苷三磷酸(NTP)混合物。序列优化的NTP混合物可以提供在包含四种类型的NTP(GTP、ATP、CTP和UTP)的一个管中或每种NTP在单独的管中。在上面关于本发明的方法做出的所有定义或具体实施方式也适用于本发明的所述试剂盒。附图说明下列显示的图仅是说明性的并且应当以进一步的方式描述本发明。这些图不应当解释为将本发明限制于此。图1：编码智人(Homosapiens)前列腺干细胞抗原(HsPSCA)的R1871的G/C优化的mRNA序列，其对应于SEQIDNO：1。图2：编码萤火虫(Photinuspyralis)荧光素酶(PpLuc)的R2988的G/C优化的mRNA序列，其对应于SEQIDNO：2。图3：编码智人Mucin-1(黏蛋白-1)信号肽/表皮生长因子受体/Mucin-1融合蛋白(EGFR/Mucin-1)的R1626的G/C优化的mRNA序列，其对应于SEQIDNO：3。图4：R2025的非编码免疫刺激RNA序列，其对应于SEQIDNO：4。图5：编码HsPSCA(R1871)和EGFR/Mucin-1(R1626)的mRNA随时间的RNA产量。mRNA通过如实施例1中显示的体外转录合成。(A)标准转录反应的RNA产量在大约30分钟后达到大约1.4mg/mlRNA(对于编码EGFR/Mucin-1(R1626)的5337个核苷酸长的RNA)和大约1.8mg/mlRNA(对于编码HsPSCA(R1871)的589个核苷酸长的RNA)的平台。(B)序列优化的转录反应的RNA产量与标准转录反应相比显著地更高。在60分钟(R1626)和120分钟(R1871)后，两种RNA均达到大约3.9mg/mlRNA的类似的平台。显示一式三份的平均值和标准偏差。图6：对于编码HsPSCA(R1871)、荧光素酶(PpLuc，R2988)和EGFR/Mucin-1(R1626)的mRNA，使用标准的和序列优化的核苷酸(CapNTP)混合物获得的RNA产量的比较。实验如实施例1中描述的进行(反应时间5小时)。不同长度的三种不同的RNA分子的RNA产量对于每种类型的转录反应是粗略地相同的。然而，取决于用于体外转录的核苷酸混合物获得不同的产量。标准转录(每种NTP相等的NTP浓度)产生大约1.5mg/mlRNA，利用两倍浓缩的Cap-NTP混合物(2×CapNTP)的转录产生大约3.0mg/mlRNA，序列优化的(seq-opt)转录产生大约3.9mg/mlRNA并且具有NTP进料的序列优化的转录产生大约6.75mg/mlRNA。显示一式三份的平均值和标准偏差。图7：通过萤火虫荧光素酶(PpLuc)mRNA的标准的和序列优化的体外转录取得的加帽效率的分析。利用如实施例2中描述的锤头核酶HHNUH2d裂解RNA并且通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(dPAGE)分离得到的RNA片段。非加帽的(没有帽)和酶促加帽的(E-cap)RNA充当对照。当使用标准的和序列优化的NTP混合物用于合成编码萤火虫荧光素酶(PpLuc)的mRNA时，取得可比较的加帽效率。图8：对于Mucin-1信号肽/表皮生长因子受体/Mucin-1融合蛋白(EGFR/Mucin-1)mRNA(R1626)和前列腺干细胞抗原(HsPSCA)mRNA(R1871)在序列优化的CapNTP混合物中使用UTP和假-UTP的RNA产量的比较。实验如实施例3中描述的进行。在混合物中，UTP替换为如指示的0％、10％或100％假-UTP(psU)。显示一式三份的平均值和标准偏差。图9：在存在额外的核苷酸(13.45mM总NTP浓度；对于相等的混合物(相对于GTP4倍过量)13.45mM帽或GTP；对于序列优化的NTP混合物(相对于GTP4倍过量)11.2mM帽或GTP)的情况下使用标准的(相等的)和序列优化的(seqopt)NTP混合物的非编码的免疫刺激RNAR2025的理论和实际RNA产量的比较。白条：实际产量。黑条：理论产量。实验如实施例4中描述的进行。显示一式三份的平均值和标准偏差。图10：在存在额外的核苷酸(13.45mM总NTP浓度；对于相等的混合物(相对于GTP4倍过量)13.45mM帽或GTP；对于序列优化的NTP混合物(相对于GTP4倍过量)13.7mM帽或GTP)的情况下使用标准的(相等的)和序列优化的NTP比率的编码智人前列腺干细胞抗原(HsPSCA)(R1871)的mRNA的理论和实际RNA产量的比较。白条：实际产量。黑条：理论产量。实验如实施例4中描述的进行。图11：在存在各自添加的盐(NaCl；Tris/HCl，pH7.5)的情况下使用Na-NTP或Tris-NTP的序列优化的NTP混合物的转录效率。实验如实施例5中描述的进行。图12：通过测量产生的RNA的量和核苷酸混合物的消耗监测序列优化的转录反应的进展。实验如实施例6中描述的进行。图13：取决于帽浓度的编码萤火虫荧光素酶(PpLuc)(R2988)的mRNA的RNA产量。在存在不同浓度的帽类似物的情况下，通过使用4mM和13.45mM的总NTP浓度的PpLuc序列优化的NTP混合物的体外转录合成mRNA。实验如实施例7中描述的进行。(A)实际RNA[mg/ml]。(B)相对RNA产量[％]。图14：取决于帽浓度的编码智人前列腺干细胞抗原(HsPSCA)(R1871)的mRNA的RNA产量。在存在不同浓度的帽类似物的情况下，通过使用2mM、4mM和13.45mM的总NTP浓度的HsPSCA序列优化的NTP混合物的体外转录合成mRNA。实验如实施例7中描述的进行。(A)实际RNA产量[mg/ml]。(B)相对RNA产量[％]。图15：取决于GTP起始核苷酸浓度的编码智人前列腺干细胞抗原(HsPSCA)(R1871)的mRNA的RNA产量。通过使用13.45mM的总NTP浓度的HsPSCA序列优化的NTP混合物——向其添加高至20mM浓度的GTP起始核苷酸——体外转录合成mRNA。实验如实施例8中描述的进行。(A)实际RNA产量[mg/ml]。(B)相对RNA产量[％]。图16：取决于GTP起始核苷酸浓度的编码萤火虫荧光素酶(PpLuc)(R2988)的mRNA的RNA产量。通过使用13.45mM的总NTP浓度的PpLuc序列优化的NTP混合物——向其添加高至20mM浓度的GTP起始核苷酸——体外转录合成mRNA。实验如实施例8中描述的进行。(A)实际RNA产量[mg/ml]。(B)相对RNA产量[％]。图17：取决于GTP起始核苷酸浓度的编码EGFR/Mucin-1(R1626)的mRNA的RNA产量。通过使用13.45mM的总NTP浓度的EGFR/Mucin-1序列优化的NTP混合物——向其添加高至20mM浓度的GTP起始核苷酸——体外转录合成mRNA。实验如实施例8中描述的进行。(A)实际RNA产量[mg/ml]。(B)相对RNA产量[％]。图18：示意图示的生物反应器，其包括用于连续或半分批工艺的模块，具有树脂-固定化的线性DNA作为转录反应的模板。图19：与标准的等摩尔NTP混合物相比，利用序列优化的NTP混合物合成的RNA的减小的免疫刺激。如实施例10中描述的测量细胞上清液中的细胞因子和趋化因子水平。图20：编码来自甲型H1N1流感(荷兰2009)的HA的G/C优化的mRNA序列，其对应于SEQIDNO：6(实施例11)。图21：编码HA的mRNA随时间的RNA产量(实施例11)。对于分别通过在生物反应器中使用标准NTP混合物的体外转录(TS(1))、通过在生物反应器中没有进料的序列优化的转录(TS(2))、通过在生物反应器中具有进料的序列优化的转录(TS(3))、或通过在生物反应器中具有减小的T7RNA聚合酶浓度和减小的模板浓度的序列优化的转录(TS(4))获得的RNA，显示不同时间点处的RNA产量。图22：如通过使用流式细胞分析测定的HA蛋白的表面表达(实施例11)。对于转染有分别通过在生物反应器中使用标准NTP混合物的体外转录(TS(1))、通过在生物反应器中没有进料的序列优化的转录(TS(2))、通过在生物反应器中具有进料的序列优化的转录(TS(3))、或通过在生物反应器中具有减小的T7RNA聚合酶浓度和减小的模板浓度的序列优化的转录(TS(4))获得的RNA的细胞，测定荧光强度的几何平均值(GMFI)。图23：分别通过在生物反应器中使用标准NTP混合物的体外转录(TS(1))、通过在生物反应器中没有进料的序列优化的转录(TS(2))、通过在生物反应器中具有进料的序列优化的转录(TS(3))、或通过在生物反应器中具有减小的T7RNA聚合酶浓度和减小的模板浓度的序列优化的转录(TS(4))合成的RNA的免疫刺激。如实施例11中描述的测量细胞上清液中的细胞因子和趋化因子水平。实施例下列显示的实施例仅是说明性的并且应当以进一步的方式描述本发明。这些实施例不应当解释为将本发明限制于此。实施例1：mRNA的制备1.DNA和mRNA构建体的制备对于本实施例，制备编码智人前列腺干细胞抗原(HsPSCA)mRNA(R1871)、萤火虫荧光素酶(PpLuc)mRNA(R2988)和Mucin-1信号肽/表皮生长因子受体/Mucin-1融合蛋白(EGFR/Mucin-1)(R1626)的DNA序列并且用于随后的体外转录反应。根据第一制备，构建用于体外转录的载体，其包含T7启动子，接着是编码上述蛋白质的序列。该构建体通过修饰野生型编码基因制备，所述修饰通过引入用于稳定的GC-优化的序列，接着源自α-珠蛋白-3’-UTR(muag(突变的α-珠蛋白-3’-UTR))的稳定序列、64个腺苷的一段序列(聚-A-序列)、30个胞嘧啶的一段序列(聚-C-序列)和组蛋白茎环。此外，构建用于体外转录的载体，其包含T7启动子，接着是编码免疫刺激RNA(R2025)的序列，其不编码蛋白质。RNA构建体和其核苷酸组成分别列在表1和表2中。表1：RNA描述标识符(R数字)序列SEQIDNo.HsPSCAmRNAR1871图11PpLucmRNAR2988图22EGFR/Mucin-1mRNAR1626图33非编码RNAR2025图44表2：RNA的核苷酸组成2.体外转录使用T7聚合酶体外转录根据第1段制备的各自的DNA质粒。随后使用(CureVac，Tübingen，德国；WO2008/077592A1)纯化mRNA。标准的转录反应体积是20ul。对于随后的mRNA的HPLC纯化，例如用于帽分析，建立1ml的反应。线性化DNA质粒模板(50μg/ml)在80mMHEPES/KOH，pH7.5、24mMMgCl2、2mM亚精胺、40mMDTT、5U/ml焦磷酸酶(ThermoFisherScientific)、200U/mlRibolockRNase抑制剂(ThermoFisherScientific)、5000U/mlT7RNA聚合酶(ThermoFisherScientific)中在37℃下转录三小时(或根据指示的)。分别根据下面的部分3至7添加核糖核苷三磷酸(NTP)。在转录之后，通过DNaseI消化(Roche)(100U/ml，1mMCaCl2，37℃下30分钟)去除DNA模板。RNA在-20℃下在3.45倍反应体积中的2.86MLiCl中沉淀16小时，接着离心(30分钟，16.000g，4℃)。沉淀物在五个转录反应体积的75％乙醇中洗涤(颠倒管，离心5分钟，16.000g，4℃)，干燥并且在2.5个转录反应体积的H2O中再溶解。使用分光光度计经由260nm下的吸光度测量测定RNA产量。260nm下的一个吸光度单位对应于40ng/μl的RNA(1A260＝40ng/μlRNA)。为了测定并入的核苷酸的数目，产生的RNA的总量被转换为通过除以分子质量产生的分子数目。乘以序列中存在的各种核苷酸的数目得到并入的核苷酸。为了测定转录反应结束时保留的核苷酸(in％)，根据以下方程式，将该数目除以可获得的核苷酸的数目：方程式(1)：RNA产量指示每个反应产生的分子的数目(nmol)。NTP起始浓度[NTP(起始)]以mM指示，反应体积以μl指示。为了计算各种核苷酸的保留浓度，根据以下方程式，将反应开始时可获得的NTP乘以转录反应结束时保留的NTP的百分比(参见上面)：方程式(2)：3.帽类似物存在的情况下的标准体外转录对于使用帽类似物生产5′-加帽的RNA，利用5.8mMm7G(5′)ppp(5′)G帽类似物、4mMATP、4mMCTP、4mMUTP和1.45mMGTP(均是ThermoFisherScientific的)(参见表3)实施标准转录。帽类似物和GTP以4∶1的比率使用。表3：标准体外转录反应的核苷酸浓度(mM)RNACAPGCAUHsPSCA5.81.45444PpLuc5.81.45444EGFR/Mucin-15.81.45444表4：标准转录反应结束时保留的核苷酸的量(2.5小时后，以反应开始时核苷酸的百分数计)表5：标准体外转录反应结束时(2.5小时后)保留的核苷酸浓度(mM)RNACAPGCAUHsPSCA5，790，252，362，773，36PpLuc5，800，242，723，093，43EGFR/Mucin-15，800，242，543，193，51标准转录中RNA转录物的典型产量是大约1.5mg/ml反应。4.使用双倍浓度的帽类似物和NTP(2×CapNTP)的帽类似物存在的情况下的体外转录帽类似物和NTP浓度与标准的转录条件相比加倍，使得反应在11.6mMm7G(5′)PPP(5′)G帽类似物、8mMATP、8mMCTP、8mMUTP和2.9mMGTP(均是ThermoFisherScientific的)(参见表3)中实施。帽类似物和GTP以4∶1的比率使用。表6：2×CapNTP体外转录反应的核苷酸浓度(mM)RNACAPGCAUHsPSCA11.62.9888PpLuc11.62.9888EGFR/Mucin-111.62.9888表7：2×CapNTP转录反应结束时保留的核苷酸的量(2.5小时后，以反应开始时核苷酸的百分数计)RNACAPGCAUHsPSCA99，8723，4562，0871，5185，20PpLuc99，9617，9368，5377，7086，09EGFR/Mucin-199，9920，1565，0780，7288，39使用双倍浓度的帽类似物和NTP的转录的典型产量是大约3mg/ml反应。5.帽类似物存在的情况下的序列优化的体外转录对于序列优化的体外转录反应，根据序列的核苷酸组成(表2)计算每个单独的序列的核糖核苷三磷酸(NTP)的浓度，使得所有NTP的总浓度是13.45mM，如在标准转录反应中的。帽类似物的浓度比GTP的计算浓度高四倍，使得获得4∶1的帽/GTP比率。表8：序列优化的体外转录的核苷酸浓度(mM)RNACAPGCAUHsPSCA13.63.44.73.51.8PpLuc16.44.14.33.11.9EGFR/Mucin-116.44.15.02.71.7表9：序列优化的转录结束时保留的核苷酸的量(2.5小时后，以反应开始时核苷酸的百分数计)RNACAPGCAUHsPSCA99，8614，8314，7114，5714，83PpLuc99，9614，6214，7214，7614，85EGFR/Mucin-199，9914，6014，8214，5115，04表10：序列优化的体外转录反应结束时(2.5小时后)保留的核苷酸浓度(mM)RNACAPGCAUHsPSCA13，580，510，690，510，27PpLuc16，390，600，640，450，29EGFR/Mucin-116，400，600，740，400，25使用序列优化的帽类似物和NTP的转录的典型RNA产量是大约3.9mg/ml反应。6.具有NTP进料的帽类似物存在的情况下的序列优化的体外转录对于序列优化的体外转录反应，根据序列的核苷酸组成(表2)计算每个单独的序列的核糖核苷三磷酸(NTP)的浓度，使得所有NTP的总浓度是13.45mM，如在标准转录反应中的。帽类似物的浓度比GTP的计算浓度高四倍，使得获得4∶1的帽/GTP比率(参见表7)。对于NTP进料，不具有帽类似物的13.45mMNTP在2.5小时后添加(以2.69μl的体积)至反应混合物。因为在此时间点处，＞99％的帽类似物仍存在于转录反应中，可以保留4∶1的帽/GTP比率。表11：具有NTP进料的序列优化的转录结束时保留的核苷酸的量(5小时后，以反应开始时核苷酸的百分数计)RNACAPGCAUHsPSCA99，7526，326，226，126，3PpLuc99，9426，126，226，226，3EGFR/Mucin-199，9826，126，326，026，5使用序列优化的帽类似物和NTP接着NTP进料的转录的典型RNA产量是大约6.75mg/ml反应。7.非加帽的RNA的标准体外转录对于非加帽的5′三磷酸RNA的生产，转录在存在4mM的每种ATP、GTP、CTP和UTP(均是ThermoFisherScientific的)的情况下实施。非加帽的RNA被用作加帽分析试验中的对照(图7)。8.mRNA的酶促加帽根据制造商的说明使用ScriptCapTMm7G加帽系统(Cellscript，Madison，WI，USA)进行酶促加帽。简言之，每个反应，60μg的非加帽的RNA在68.5μl的体积中热变性(10分钟，65℃)并且在冰上立即冷却(5分钟)。在添加反应组分(1×ScriptCap加帽缓冲液、1mMGTP、0.1mMSAM、1000U/mlScripGuardRNase抑制剂、400U/mlScriptCap加帽酶)至100μl的最终体积之后，反应在37℃下培育1小时。RNA在-20℃下在3.45倍反应体积中的2.86MLiCl中沉淀16小时，接着离心(30分钟，16.000g，4℃)。沉淀物在0.5倍反应体积的75％乙醇中洗涤(颠倒，离心5分钟，16.000g，4℃)，干燥并且在H2O中再溶解。酶促加帽的RNA被用作加帽分析试验中的对照(图7)。9.结果如上面描述的，在限定的时间点处测定标准的和序列优化的体外转录反应的RNA产量持续多至两小时(第2段)。如图5A可见，标准转录反应的RNA产量在大约30分钟后达到大约1.4mg/mlRNA(对于编码EGFR/Mucin-1(R1626)的5337个核苷酸长的RNA)和大约1.8mg/mlRNA(对于编码HsPSCA(R1871)的589个核苷酸长的RNA)的平台。如图5B可见，序列优化的转录反应的RNA产量与标准转录反应相比显著地更高。分别在60分钟(R1626)和120分钟(R1626)后，两种RNA均达到大约3.9mg/mlRNA的类似的平台。如图6可见，在五小时后，不同长度的三种不同的RNA分子的RNA产量对于每种类型的转录反应是粗略地相同的。标准转录(相等的NTP浓度)产生大约1.5mg/mlRNA，利用两倍浓缩的Cap-NTP混合物(2×CapNTP)的转录产生大约3.0mg/mlRNA，序列优化的转录产生大约3.9mg/mlRNA并且具有NTP进料的序列优化的转录产生大约6.75mg/mlRNA。因而，与标准转录反应相比，序列优化的转录反应导致RNA产量的大约三倍的增加。通过为反应补充NTP(NTP进料)，此产量可以进一步增加大约两倍。实施例2：CAP分析试验1.试验的原理锤头核酶HHNUH2d(5’-GCAUGGCUGAUGAGGCCUCGACCGAUAGGUCGAGGCCGAAAAGCUUUCUCCC-3’)(SEQIDNO：5)与实施例1的体外转录的RNA一起培育并且通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(dPAGE)分离裂解产物。2.核酶裂解反应每个反应，10pmol的HHNUH2d和10pmol的各自生成4种RNA在6μl的总体积中的0.625mMEDTA中退火(95℃下2分钟，0.1℃/秒至25℃，25℃下10分钟)。在添加4μl的100mMMgCl2、125mMTris/HCl，pH7.5(最终浓度40mMMgCl2，50mMTris/HCl)后，反应在25℃下培育一小时。对于经由PAGE的分析，利用30μl95％甲酰胺、20mMEDTA终止1×反应。3.裂解产物的凝胶分离、定量和加帽程度的计算终止的反应被热变性(加热至80℃持续2分钟，立即放置在冰上持续5分钟)并且在10cm×8cm×1.0mm20％变性聚丙烯酰胺凝胶(8M脲(AppliChem)，20％丙烯酰胺：双丙烯酰胺19∶1(AppliChem)，1×TBE，1％APS(AppliChem)，0.1％TEMED(AppliChem)；180V，2小时，TetraCell(BioRad))上分离。凝胶在TBE中的1∶10,000SYBRGold(Invitrogen)中染色10分钟并且在具有312nm-UV透照仪(Peqlab)(SYBRGold的最大激发：～300nm，发射：～537nm)的E-BOXVX2凝胶成像系统上成像。为了测定mRNA制剂中加帽的比例，使用QuantityOne1-D分析软件(BioRad)定量各自的13-mer(源自非加帽的部分)或14-mer(源自加帽的部分)裂解产物的条带。根据以下方程式分别计算加帽的和非加帽的RNA的程度：方程式(4)：方程式(5)：4.结果如图7中可见，对于用于萤火虫荧光素酶(PpLuc)mRNA的标准的和序列优化的NTP混合物，取得可比较的加帽效率。实施例3：在序列优化的核苷酸混合物中使用UTP和假-UTP的RNA产量的比较可以通过将四种核苷酸ATP、GTP、CTP和UTP中的一种或多种用核苷酸类似物替换来进行体外转录反应。这样的修饰的NTP的实例是假尿苷(psU或Ψ)三磷酸和5-甲基胞苷(5mC)三磷酸。修饰的核苷酸在混合物中的百分比可以从其替换的天然核苷酸的0％至100％变化。为了测试是否可能在序列优化的核苷酸混合物中使用修饰的核苷酸比如假尿苷(psU)三磷酸，UTP被10％和100％的假尿苷三磷酸替换。在对照反应中，使用100％的UTP。帽类似物存在的情况下的序列优化的体外转录对于序列优化的体外转录反应，根据序列的核苷酸组成(表2)计算每个单独的序列的核糖核苷三磷酸(NTP)的浓度，使得所有NTP的总浓度是13.45mM，如在标准转录反应中的。帽类似物的浓度比GTP的计算浓度高四倍，使得获得4∶1的帽/GTP比率。结果如图8中可见，在具有帽类似物的序列优化的核苷酸混合物(CapNTP混合物)中使用UTP和假-UTP导致独立于序列优化的核苷酸混合物中的假-UTP百分比的可比较的RNA产量。这分别针对编码Mucin-1信号肽/表皮生长因子受体/Mucin-1融合蛋白(EGFR/Mucin-1)(R1626)和前列腺干细胞抗原(HsPSCA)mRNA(R1871)的两种不同的mRNA进行了证明。实施例4：使用标准的和序列优化的核苷酸混合物的理论和实际RNA产量的比较转录反应如实施例1部分2中描述的安排(assemble)。NTP相等地分配(等摩尔)或根据如实施例1部分5中描述的产生的RNA的序列分配。对于一些反应，以相对于GTP4∶1的比率添加额外的核苷酸(GTP或帽类似物)。结果如图9中可见，与标准NTP混合物(相等的NTP混合物)相比，对于序列优化的NTP混合物，R2025的实际RNA产量可以增加。如图10中可见，与标准NTP混合物(相等的NTP混合物)相比，对于序列优化的NTP混合物，编码智人前列腺干细胞抗原(HsPSCA；R1871)的mRNA的实际RNA产量可以增加。实施例5：NTP平衡离子对RNA产量的影响使用编码智人Mucin-1信号肽/表皮生长因子受体/Mucin-1融合蛋白(EGFR/Mucin-1，R1626)的mRNA作为实例，研究NTP平衡离子对RNA产量的影响。转录反应如实施例1部分2中描述的安排，使用序列优化的NTP比率和13.45mM的总NTP浓度。NTP包含Na+或Tris+(均是ThermoScientific的)作为平衡离子。此外，Na-NTP反应补充有不同浓度的NaCl，Tris-NTP反应补充有Tris/HCl。在2.5小时的反应时间后，RNA被纯化并且如实施例1部分2中描述的测定其浓度。结果如图11中可见，使用序列优化的NTP混合物的智人Mucin-1信号肽/表皮生长因子受体/Mucin-1融合蛋白(EGFR/Mucin-1，R1626)的RNA产量在多至150mMTris-HCl的浓度粗略地保持相同。相比之下，RNA产量在75mM以上的NaCl浓度下开始下降。已经描述了高NaCl浓度对RNA产量的负面影响(例如Kern等，1997.Biotechnol.Prog.，13，747-756；US6,586,218B2)。高浓度的Na-NTP——尤其是作为遵循NTP进料策略时的结果——可能因此导致降低的RNA产量。利用Tris-NTP应当规避此限制，这是因为聚合酶活性不受高Tris/HCl浓度影响。实施例6：监测转录反应的进展使用序列优化的NTP比率和13.45mMTris-NTP的总NTP浓度，如实施例1部分2中描述的安排智人前列腺干细胞抗原(HsPSCA；R1871)的较大规模的转录反应(350μl)。帽类似物以相对于GTP4∶1过量存在。在限定的时间点(反应开始后15/30/60/90/120分钟)处，提取20μl样品，纯化RNA并且如实施例1部分2中描述的测定其在260nm下的吸光度。在相同的时间点处提取40μl的第二样品并且通过MicroconYM10装置(MerckMillipore，Darmstadt，德国)(16000*g，5分钟，17℃)过滤。根据制造商(T009-TechnicalBulletinNanoDrop1000％8000；ThermoFisherScientific，Wilmington，Delaware，USA)的说明，使用分光光度计测定260nm下流通(flow-through)的吸光度，其对应于未并入的帽类似物和NTP。结果如图12中可见，使用序列优化的核糖核苷酸混合物允许通过测定限定的时间点处保留的总核苷酸浓度测量体外转录反应的进展。总NTP浓度的降低与合成的RNA的量直接关联。因而，转录反应的进展可以准确地确定为在给定时间点处测量的总NTP浓度的函数并且计算消耗的NTP的摩尔数。基于此信息，计算合成的RNA的量变得可能。此过程对连续地监测转录反应的进展——例如在转录反应器中——是尤其有用的。当使用标准NTP混合物时这将是不可能的，这是因为NTP的消耗将不能容易地反映合成的RNA的量。实施例7：作为帽浓度函数的序列优化的核苷酸混合物的RNA产量转录反应如实施例1部分2中描述的安排，并且在如图14和15中指示的2mM、4mM和13.45mMNTP的总NTP浓度下实施。根据如实施例1部分5中描述的产生的RNA的序列分配NTP(用于PpLuc和HsPSCA的序列优化的核糖核苷酸混合物)。反应在如图14和15中指示的帽类似物(m7G(5′)PPP(5′)G)的多种浓度(0、0.25、2.0、10、16和20mM)下进行。结果如图13A中可见，利用较高的帽类似物浓度，PpLucmRNA的实际RNA产量增加。与4mM的总NTP浓度相比，13.45mM的总NTP浓度的实际RNA产量更高。图13B显示了PpLucmRNA的相对RNA产量在多至大约16mM的帽类似物浓度下增加。低NTP浓度(4mM)的相对RNA产量的增加比高NTP浓度(13.45mM)更强。如图14A中可见，利用较高的帽类似物浓度，HsPSCAmRNA的实际RNA产量增加。与4mM和2mM的总NTP浓度相比，13.45mM的总NTP浓度的实际RNA产量更高。图14B显示了HsPSCAmRNA的相对RNA产量在多至大约16mM的帽类似物浓度下增加。对测试的最低的NTP浓度(2mM)，观察到相对RNA产量的最强的增加。这些结果证明序列优化的核糖核苷酸混合物的使用甚至在低的初始的总核苷酸浓度下(例如在2mM下)下导致加帽的RNA合成的效率增加。相比之下，先前已经建议对于增加的RNA产量，高浓度的总核苷酸——大约12mM至40mM——是必需的(US6586218)。PpLucmRNA(1870个核苷酸)和HsPSCAmRNA(589个核苷酸)的比较显示了对于限定的总NTP浓度，相对RNA产量独立于RNA长度。实施例8：作为GTP起始核苷酸浓度函数的序列优化的核苷酸混合物的RNA产量转录反应如实施例1部分2中描述的安排，并且在对于P625、P1040和P532的13.45mM的序列优化的核苷酸混合物的总NTP浓度下实施。根据如实施例1部分5中描述的产生的RNA的序列分配NTP(用于PpLuc、HsPSCA和EGFR/Mucin-1的序列优化的核糖核苷酸混合物)。如图16至18指示的，通过添加限定浓度(0、0.25、2.0、10、16和20mM)的GTP起始核苷酸至序列优化的NTP混合物进行反应。结果如图15A和15B中可见，HsPSCAmRNA的实际和相对RNA产量在多至大约10mM的GTP起始核苷酸浓度下增加并且在更高的GTP浓度下下降。如图16A和16B中可见，PpLucmRNA的实际和相对RNA产量在多至大约10mM的GTP起始核苷酸浓度下轻微地增加并且然后在更高的GTP浓度下下降。如图17A和17B中可见，EGFR/Mucin-mRNA的实际和相对RNA产量在多至大约10mM的GTP起始核苷酸浓度下增加并且然后在更高的GTP浓度下下降。这些结果证明序列优化的核糖核苷酸混合物和额外量的起始核苷酸GTP的使用在多至大约10mM的GTP起始核苷酸浓度下导致RNA合成的效率增加。实施例9：生物反应器图18以示意图示显示了根据本发明的生物反应器1的优选的实施方式。由图18，生物反应器1的模块结构变得明白。在此，生物反应器1由数个生物反应器模块2、3、4、5组成。反应模块1是用于合成给定序列的RNA分子的连续或半分批过程的反应容器。反应模块2包含树脂固定化的DNA，其被用作RNA转录反应的模板。在此，DNA的固定化允许模板的重复使用并且减少任何种类的残留DNA对期望的RNA产物的污染。此外，DNA模板的固定化取代使用酶DNAse进行末端DNA消化。在转录后，产生的RNA分子可以被分批地或连续地释放入捕捉模块3。捕捉模块3包含树脂/固相以捕捉RNA分子并且将RNA与转录反应的其它可溶性组分分离。其后，RNA分子可以借助出口管线等(未显示)从生物反应器1分送至接收单元等，在其中可以实施进一步的RNA洗脱和纯化。洗涤液和/或洗脱缓冲液可以借助各自的洗涤和缓冲液罐31被提供至捕捉模块3，所述洗涤和缓冲液罐31被连接至反应模块2和捕捉模块3之间的转移区域。为了能够监测和控制反应模块2中的转录过程，在反应模块2中提供超滤膜21，用于将高分子量组分比如蛋白质和多核苷酸与低分子量组分比如核苷酸分离。该膜将在其中实施RNA转录反应的反应核心22与在其中接收过滤的反应混合物的过滤隔室23分隔。基于反应模块2的过滤隔室23中的过滤的反应混合物中的核苷酸浓度——其被用作关键的工艺参数，可以借助进料泵43控制和调节来自进料罐24的核苷酸、缓冲液组分和/或酶进料入反应模块2，其允许以产生高转录性能的最佳的稳态条件执行RNA转录反应。提供传感器单元41作为测量工具，用于测量反应混合物中的反应参数。在此，传感器单元41在包含低分子量组分的过滤的流体中至少包括用于光度分析的传感器，比如UV260/280nm的UV流动池，该过滤的流体从过滤隔室23提取，通过再循环泵25循环并且返回过滤隔室23。在循环管路中，提供传感器单元41的传感器，以便对过滤隔室23内部的过滤的流体实现实时监测。生物反应器1中序列优化的核糖核苷酸混合物的应用使得能够在反应模块2的反应核心22中的RNA转录反应期间实时测量过滤隔室23中的核苷酸浓度。传感器单元41是控制模块4的一部分，所述控制模块4进一步包括控制器42和进料泵43形式的致动器。传感器单元41和进料泵43被连接至控制器42，以便向控制器42提供测量信号并且从控制器42接收指令信号。另外，其它关键的工艺参数，比如过滤的流体的pH值或过滤的流体的传导性，可以通过传感器单元41的进一步合适的传感器分析。通过控制器42——通常是基于计算机的系统等的形式——的数据收集和分析允许控制作为致动器的进料泵43——其用于反复地进料核苷酸、缓冲液组分和/或酶进入反应模块2，以及控制生物反应器1中的进一步的泵，以便调节最佳的稳态反应条件中关键的工艺参数。为了防止浪费，优选的实施方式的生物反应器1进一步包括连接至捕捉模块3的回流模块5，该回流模块5收集未使用的原料，比如核苷酸和酶，并且借助回流泵51将其再循环返回入反应模块2。回流模块5包含固定化酶——比如焦磷酸酶——或树脂以捕捉破坏性组分，比如磷酸盐等。本发明的上述实施方式和附图仅意欲是说明性的并且不应当被认为是限制性的，因为可以在所附的权利要求的范围内对描述的发明做出修改，而不背离所附的权利要求的范围。实施例10：RNA分子的免疫刺激活性在此实施例中，比较利用序列优化的NTP混合物和标准的等摩尔NTP混合物合成的RNA分子的免疫刺激性质。通过测量转染有mRNA的细胞的上清液中的细胞因子和趋化因子水平测定免疫刺激。如实施例1中描述的进行荧光素酶mRNA(pPluc)的标准的和序列优化的体外转录反应。随后，通过LiCl沉淀纯化mRNA。免疫刺激试验海拉细胞以6孔板中4×105个细胞/孔的密度接种在2ml海拉细胞培养基中，所述海拉细胞培养基由补充有25mMHEPES、2mML-谷氨酰胺和100IU/ml青霉素/链霉素(均是Lonza，Basel，瑞士)的RPMI1640培养基和10％胎牛血清(PerbioScience，Bonn，德国)组成。第二天，使用2000(LifeTechnologies，Darmstadt，德国，目录号11668-027)对细胞转染2μg的RNA或作为阴性对照的注射用水(WFI)。简略地，试剂和RNA每个在培养基(LifeTechnologies)中稀释，以1∶1.5的RNA：的比率结合并且在室温下培育20分钟。阴性对照包含WFI取代与混合的RNA。同时，利用补充有25mMHEPES和2mML-谷氨酰胺的2mlRPMI1640培养基(无血清和无青霉素/链霉素的培养基)洗涤细胞一次，并且2ml的无血清和无青霉素/链霉素的培养基被添加至细胞，然后添加0.5mlRNA：转染混合物。在37℃和5％CO2下培育4小时后，包含转染混合物的培养基被替换为2ml的海拉细胞培养基。在24小时后，收集无细胞的上清液，并且使用下列试剂盒：HumanSolubleProteinMasterBufferKit(目录号558264)、AssayDiluent(目录号560104)、HumanIL-6FlexSet(目录号558276)、HumanCXCL10FlexSet(目录号558280)和HumanCCL5FlexSet(目录号558324)(所有试剂盒都来自BDBiosciences)，根据制造商的说明(BDBiosciences)通过流式细胞小球微阵列术(CytometricBeadArray)(CBA)测量IL-6、CXCL10和CCL5的浓度。使用FCAP阵列v3.0软件(BDBiosciences)分析数据。结果如图19中可见，与利用标准的等摩尔NTP混合物合成的相同的RNA相比，利用序列优化的NTP混合物合成的RNA的分泌的IL-6、CXCL10和CCL5的水平更低，这指示由序列优化的NTP混合物得到的RNA的免疫刺激活性更低。实施例11：生物反应器中的体外转录用于体外转录的DNA(P1140)的制备：通过将下列元件插入DNA载体(pCV32(KanR))制备用于体外转录的DNA载体(P1140)：5′UTR：32L4(Top-UTR)ORF：来自H1N1的HA(荷兰2009)(GC富集的)3′UTR：白蛋白7获得的DNA载体的体外转录导致具有2083nt的长度的RNA分子。各自的RNA序列(SEQIDNO：6)图解在图20中。RNA构建体由下列核苷酸组成表征：G＝540(25，92％)C＝676(32，45％)A＝541(25，97％)U＝326(15，65％)G/C＝58，37％DNA载体的线性化：使用下列条件使质粒P1140线性化：0.5μg质粒DNA1.5μl10×反应缓冲液1μlEcoRI添加15μlWFI(注射用水)反应在37℃下培育3h。随后进行苯酚/氯仿提取和异丙醇沉淀。体外转录：标准帽/NTP混合物标准的帽/NTP-混合物4μL最终浓度[mM]帽(100mM)1，165.8ATP(100mM)0，84CTP(100mM)0，84UTP(100mM)0，84GTP(100mM)0，291.45WFI0，15(不具有帽的最终NTP浓度是13.45mM)NTP和帽的计算：如在标准转录反应中使用的13.45mM的相同的总NTP浓度被用于序列优化的转录。四倍量的GTP被用于帽类似物。用于P1140的序列优化的帽/NTP混合物的制备：5×转录缓冲液：400mMHEPES120mMMgCl210mM亚精胺200mMDTF25U/ml无机焦磷酸酶在生物反应器中测试4种不同的转录反应：使用来自Dasgip的DasBoxBioreaktor作为生物反应器。反应在50rpm下搅拌。在指示的时间点处，移出每种20μl的样品。通过在LiCl沉淀后测定260nm下的吸收测量RNA浓度。四种不同的条件被用于体外转录：1.使用标准NTP混合物的转录试剂添加80000μL线性化质粒DNA(P1140)[0，48μg/μL](μL)83005×转录缓冲液(μL)16000标准的帽/NTP-混合物(μL)16000RNAse抑制剂[40U/μL](μL)400T7RNA聚合酶[200U/μL](μL)2000WFI(μL)37300最终体积80000转录反应在37℃下培育3h。随后，6μlDNAseI(1mg/ml)和0.2μlCaCl2溶液(0.1M)/μgDNA模板被添加至转录反应，并且在37℃下培育2h。2.序列优化的转录(1.5h而没有进料)转录反应在37℃下培育1.5h。随后，6μlDNAseI(1mg/ml)和0.2μlCaCl2溶液(0.1M)/μgDNA模板被添加至转录反应，并且在37℃下培育2h。3.具有进料的序列优化的转录试剂添加80000μl线性化质粒DNA(P1140)[0，48μg/μl](μl)83005×转录缓冲液(μl)16000序列优化的帽/NTP-混合物(μl)28000RNAse抑制剂[40U/μl](μl)400T7RNA聚合酶[200U/μl](μl)2000WFI(μl)25300最终体积80000转录反应在37℃下培育1.5h。在1.5h后添加12934.6μl序列优化的帽/NTP-混合物和5×转录缓冲液。转录反应在37℃下培育另外的1.5h。随后，6μlDNAseI(1mg/ml)和0.2μlCaCl2溶液(0.1M)/μgDNA模板被添加至转录反应，并且在37℃下培育2h。4.具有减小的T7RNA聚合酶浓度和减小的模板浓度的序列优化的转录结果：与标准条件下的转录相比(图21，TS(1))，序列优化的转录混合物中的转录导致更高浓度的转录的RNA。核苷酸和转录缓冲液的额外的进料进一步增加转录的RNA的量(图21，TS(3))。产量：样品ID[RNA](mg)P1140-TS(1)130，6P1140-TS(2)317，1P1140-TS(3)656，4P1140-TS(4)312，6表达和免疫刺激：海拉细胞以6孔板中4×105个/孔的密度接种在2ml海拉细胞培养基中，所述海拉细胞培养基由补充有25mMHEPES、2mML-谷氨酰胺和100IU/ml青霉素/链霉素(均是Lonza，Basel，瑞士)的RPMI1640培养基和10％胎牛血清(PerbioScience，Bonn，德国)组成。第二天，使用2000(LifeTechnologies，Darmstadt，德国，目录号11668-027)对细胞转染不同浓度的2μg的RNA或作为阴性对照的注射用水(WFI)。简略地，Lipofectamine试剂和RNA每个在培养基(LifeTechnologies)中稀释，以1∶1.5的RNA：Lipofectamine的比率结合并且在室温下培育20min。阴性对照包含WFI取代与Lipofectamine2000混合的RNA。同时，利用补充有25mMHEPES和2mML-谷氨酰胺的2mlRPMI1640培养基(无血清和无青霉素/链霉素的培养基)洗涤细胞一次，添加2ml的无血清和无青霉素/链霉素的培养基至细胞，然后添加0.5mlRNA：Lipofectamine转染混合物。在37℃和5％CO2下培育4小时之后，移出包含转染混合物的培养基并且添加2ml的海拉细胞培养基。在24小时后，收集上清液和细胞。蛋白质表达：使用流式细胞分析测定HA蛋白的表面表达。利用1mlPBS洗涤贴壁的海拉细胞一次并且使用无胰蛋白酶的分离缓冲液(40mMTrisHClpH7，5；150mMNaCl、1mMEDTA)收获。利用小鼠单克隆抗HA(H1N1)抗体(ImmuneTechnology，NewYork，USA)接着二次抗小鼠FITC缀合抗体(Sigma-Aldrich，Taufkirchen，德国)与细胞一起培育。细胞在BDFACSCanto上测量并且使用FlowJo软件版本10.6分析。使用GraphPadPrism软件版本5.01进行统计学分析。结果：与标准条件下转录的RNA相比(图22，TS(1))，序列优化的反应混合物(图22，TS(2)、TS(3)、TS(4))中转录的RNA导致更高的编码HA蛋白的表达。免疫刺激：使用下列试剂盒，根据制造商的说明(BDBiosciences)通过流式细胞小球微阵列术(CBA)在无细胞的上清液中测量IL-6、CXCL10和CCL5的浓度：试剂目录号HumanSolubleProteinMasterBUfferKit558264AssayDiluent560104HumanIL-6FlexSet558276HumanCXCL10FlexSet558280HumanCCL5FlexSet558324使用FCAP阵列v3.0软件(BDBiosciences)分析数据。使用GraphPadPrism软件版本5.01进行统计学分析。结果：与在序列优化的反应混合物(图23，TS2、TS3、TS4)中转录的RNA相比，在标准条件(图23，TS1)下转录的RNA诱导海拉细胞中更高水平的细胞因子IL-6、CXCL10和CCL5。当前第1页1 2 3