双特异性异二聚化双抗体及其用途的制作方法

本申请要求享有于2014年7月1日提交的美国临时申请号62/019,762和于2015年4月17日提交的美国临时申请62/148,920的权益，所述申请以其整体通过引用并入本文。序列表本申请经EFS-Web电子提交并且包括以.txt格式的电子提交的序列表。.txt文件包含创建于2015年6月12日标题为"PC72054A_Sequence_Listing.txt"且大小为248KB的序列表。该.txt文件中包含的序列表为说明书的一部分且以其整体通过引用并入本文。发明领域本发明涉及双特异性异二聚化双抗体及其在治疗癌症中的用途。发明背景已经开发了各种策略来生成能够募集T细胞以介导肿瘤细胞杀伤的双特异性分子。然而，产生此类分子的大部分努力受限于无效产生和不良稳定性特性。为了解决这些问题，已经开发了基于共价连接的双特异性异二聚化双抗体结构（也称为双亲和力再靶向(DART®)蛋白）的Fv衍生化策略(美国专利申请公开号2007/0004909、2009/0060910和2010/0174053)。存在对于这样的双特异性异二聚化双抗体的需求，所述双抗体克服与生成双特异性抗体相关的挑战并提供高度特异性且有效的试剂，所述试剂能够结合表达靶抗原的肿瘤细胞并且募集T细胞和经CD3活化来使之活化，得到针对癌症的新型且有效的治疗。发明概述本发明提供双特异性异二聚化双抗体，其中所述双特异性异二聚化双抗体能够特异性结合P-钙黏着蛋白的表位和CD3的表位。本发明提供双特异性异二聚化双抗体，其中所述双特异性异二聚化双抗体能够特异性结合P-钙黏着蛋白的表位和CD3的表位，其中所述双特异性异二聚化双抗体包含第一多肽链和第二多肽链，其中：a.所述第一多肽链在N末端至C末端方向包含：i.结构域1，其包含亚结构域1A和亚结构域1B，和ii.第一促异二聚体结构域；和b.所述第二多肽链在N末端至C末端方向包含：i.结构域2，其包含亚结构域2A和亚结构域2B，和ii.第二促异二聚体结构域，并且其中亚结构域1A和亚结构域2A形成包含抗P-钙黏着蛋白抗体的可变重（VH）结构域（P-CADVH）和抗P-钙黏着蛋白抗体的可变轻（VL）结构域（P-CADVL）的P-钙黏着蛋白VL/VH结合域，并且亚结构域1B和亚结构域2B形成包含抗CD3抗体的VL结构域（CD3VL）和抗CD3抗体的VH结合域（CD3VH）的CD3VL/VH结合域；或者其中亚结构域1A和亚结构域2A形成包含CD3VL和CD3VH的CD3VL/VH结合域，而亚结构域1B和亚结构域2B形成包含P-CADVH和P-CADVL的P-钙黏着蛋白VL/VH结合域。在本发明的另一方面，亚结构域1A包含P-CADVL或CD3VL，且如果亚结构域1A包含CD3VL，则亚结构域1B包含P-CADVH，或如果亚结构域1A包含P-CADVL，则亚结构域1B包含CD3VH；且其中亚结构域2B包含P-CADVL或CD3VL（取决于亚结构域1A所选的VL结构域），且如果亚结构域2B包含CD3VL，则亚结构域2A包含P-CADVH，或如果亚结构域2B包含P-CADVL，则亚结构域2A包含CD3VH。在本发明的具体方面，亚结构域1A包含P-CADVL且亚结构域1B包含CD3VH，而亚结构域2B包含CD3VL且亚结构域2A包含P-CADVH；且其中亚结构域1A的P-CADVL和亚结构域2A的P-CADVH形成能够特异性结合P-钙黏着蛋白的表位的VL/VH结合域，而亚结构域1B的CD3VH和亚结构域2B的CD3VL形成能够特异性结合CD3的表位的VL/VH结合域。在一个具体方面，亚结构域1A包含CD3VL且亚结构域1B包含P-CADVH，而亚结构域2B包含P-CADVL且亚结构域2A包含CD3VH；且其中亚结构域1A的CD3VL和亚结构域2A的CD3VH形成能够特异性结合CD3的表位的VL/VH结合域，且亚结构域1B的P-CADVH和亚结构域2B的P-CADVL形成能够特异性结合P-钙黏着蛋白的表位的VL/VH结合域。在另一方面，亚结构域1A包含抗P-钙黏着蛋白抗体的VH结合域（P-CADVH）或抗CD3抗体的VH结合域（CD3VH），且如果亚结构域1A包含CD3VH，则亚结构域1B包含抗P-钙黏着蛋白抗体的VL结合域（P-CADVL），或如果亚结构域1A包含P-CADVH，则亚结构域1B包含抗CD3抗体（CD3VL）；且其中亚结构域2B包含P-CADVH或CD3VH（取决于亚结构域1A所选的VH结构域），且如果亚结构域2B包含CD3VH，则亚结构域2A包含P-CADVL，或如果亚结构域2B包含P-CADVH，则亚结构域2A包含CD3VL。在一个具体方面，亚结构域1A包含P-CADVH且亚结构域1B包含CD3VL，而亚结构域2B包含CD3VH且亚结构域2A包含P-CADVL；且其中亚结构域1A的P-CADVH和亚结构域2A的P-CADVL形成能够特异性结合P-钙黏着蛋白的表位的VL/VH结合域，且亚结构域1B的CD3VL和亚结构域2B的CD3VH形成能够特异性结合CD3的表位的VL/VH结合域。在一个具体方面，亚结构域1A包含CD3VH且亚结构域1B包含P-CADVL，而亚结构域2B包含P-CADVH且亚结构域2A包含CD3VL；且其中亚结构域1A的CD3VH和亚结构域2A的CD3VL形成能够特异性结合CD3的表位的VL/VH结合域，且亚结构域1B的P-CADVL和亚结构域2B的P-CADVH形成能够特异性结合P-钙黏着蛋白的表位的VL/VH结合域。本发明还提供双特异性异二聚化双抗体，其中所述第一促异二聚体结构域和所述第二促异二聚体结构域包含含有CH2和CH3结构域的IgGFc区，其中CH2结构域和/或CH3结构域的氨基酸序列相比于野生型IgGFc区包含至少一个氨基酸修饰，以形成钮（knob）或扣（hole）。在一方面，所述第一促异二聚体结构域和所述第二促异二聚体结构域不同时为钮或同时为扣；和/或其中所述第一促异二聚体结构域和所述第二促异二聚体结构域形成IgG免疫球蛋白Fc区。在另一方面，形成钮的IgGFc区包含SEQIDNO:63的序列，而形成扣的IgGFc区包含SEQIDNO:64的序列。本发明还提供双特异性异二聚化双抗体，其中所述第一促异二聚体结构域和所述第二促异二聚体结构域包含含有谷氨酸和带负电荷的α螺旋卷曲的E卷曲（E-coil）区或含有赖氨酸和带正电荷的螺旋卷曲的K卷曲（K-coil）区；且其中所述第一促异二聚体结构域和所述第二促异二聚体结构域不同时为E卷曲区或同时为K卷曲区。在一方面，E卷曲区包含SEQIDNO:61的序列，和/或K卷曲区包含SEQIDNO:62的序列。本发明还提供双特异性异二聚化双抗体，其中亚结构域1A和亚结构域1B可以通过甘氨酸-丝氨酸接头（接头1）连接且不缔合形成VL/VH表位结合域，且亚结构域2B和亚结构域2A可以通过甘氨酸-丝氨酸接头（接头1）连接且不缔合形成VL/VH表位结合域。在本发明的一个方面，甘氨酸-丝氨酸接头（接头1）包含SEQIDNO:68或SEQIDNO:69的序列。本发明还提供双特异性异二聚化双抗体，其中所述第一促异二聚体结构域包含亚结构域1B上的半胱氨酸接头（接头2）和/或所述第二促异二聚体结构域包含亚结构域2A上的半胱氨酸接头（接头2）。在一方面，第一促异二聚体结构域和/或第二促异二聚体结构域的接头2还包含至少一个甘氨酸残基。在另一方面，第一促异二聚体结构域和/或第二促异二聚体结构域的接头2包含以下的序列：GFNRGEC(SEQIDNO:70)、GVEPKSC(SEQIDNO:71)、GGCGGG(SEQIDNO:72)、GCPPCP(SEQIDNO:73)、GGTGGCPPCP(SEQIDNO:74)、GEPKSSDKTHTCPPCP(SEQIDNO:75)或GGTGGGEPKSSDKTHTCPPCP(SEQIDNO:76)。在另一方面，第一促异二聚体结构域的接头2包含以下的序列：GCPPCP(SEQIDNO:73)、GGTGGCPPCP(SEQIDNO:74)、GEPKSSDKTHTCPPCP(SEQIDNO:75)或GGTGGGEPKSSDKTHTCPPCP(SEQIDNO:76)，且第二促异二聚体结构域的接头2包含以下的序列：GCPPCP(SEQIDNO:73)、GGTGGCPPCP(SEQIDNO:74)、GEPKSSDKTHTCPPCP(SEQIDNO:75)或GGTGGGEPKSSDKTHTCPPCP(SEQIDNO:76)。在另一方面，第一促异二聚体结构域的接头2包含GGCGGG(SEQIDNO:72)的序列，且第二促异二聚体结构域的接头2包含GGCGGG(SEQIDNO:72)的序列。在另一方面，第一促异二聚体结构域的接头2包含GFNRGEC(SEQIDNO:70)的序列，且第二促异二聚体结构域的接头2包含GVEPKSC(SEQIDNO:71)的序列，或第一促异二聚体结构域的接头2包含GVEPKSC(SEQIDNO:71)的序列且第二促异二聚体结构域的接头2包含GFNRGEC(SEQIDNO:70)的序列。本发明提供双特异性异二聚化双抗体，其中所述双特异性异二聚化双抗体特异性结合人P-钙黏着蛋白的胞外结构域3（ECD3）。本发明还提供双特异性异二聚化双抗体，其中所述双特异性异二聚化双抗体特异性结合P-钙黏着蛋白上的表位但不结合E-钙黏着蛋白或VE-钙黏着蛋白上的表位。本发明还提供双特异性异二聚化双抗体，其中所述双特异性异二聚化双抗体特异性结合人P-钙黏着蛋白上的表位但不结合小鼠P-钙黏着蛋白上的表位。本发明提供双特异性异二聚化双抗体，其中所述双特异性异二聚化双抗体表现出延长的血清和肿瘤半衰期。药代动力学分析可以通过各种测定诸如ELISA来进行。本发明还提供双特异性异二聚化双抗体，其中所述双特异性异二聚化双抗体在存在P-钙黏着蛋白表达水平增加或受体密度水平增加的情况下表现出更低的EC50。EC50可以通过各种体外和体内细胞毒性测定来测定。本发明提供双特异性异二聚化双抗体，其包含含有SEQIDNO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21或23的序列的P-CADVL的P-CADVLCDR1、P-CADVLCDR2和P-CADVLCDR3；含有SEQIDNO:45或46的序列的CD3VH的CD3VHCDR1、CD3VHCDR2和CD3VHCDR3；含有SEQIDNO:47的序列的CD3VL的CD3VLCDR1、CD3VLCDR2和CD3VLCDR3；和/或含有SEQIDNO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22或24的序列的P-CADVH的P-CADVHCDR1、P-CADVHCDR2和P-CADVHCDR3。本发明提供双特异性异二聚化双抗体，其包含：含有SEQIDNO:35或36的序列的P-CADVLCDR1，含有SEQIDNO:37或38的序列的P-CADVLCDR2和含有SEQIDNO:39、40、41、42、43或44的序列的P-CADVLCDR3；含有SEQIDNO:48的序列的CD3VHCDR1，含有SEQIDNO:49或50的序列的CD3VHCDR2，和含有SEQIDNO:51的序列的CD3VHCDR3；含有SEQIDNO:55的序列的CD3VLCDR1，含有SEQIDNO:56的序列的CD3VLCDR2，和含有SEQIDNO:57的序列的CD3VLCDR3；和/或含有SEQIDNO:25或33的序列的P-CADVHCDR1，含有SEQIDNO:26或34的序列的P-CADVHCDR2，和含有SEQIDNO:27、28、29、30、31或32的序列的P-CADVHCDR3。在本发明的一个方面，P-CADVLCDR1包含SEQIDNO:35的序列，P-CADVLCDR2包含SEQIDNO:37的序列，P-CADVLCDR3包含SEQIDNO:41的序列，P-CADVHCDR1包含SEQIDNO:25的序列，P-CADVHCDR2包含SEQIDNO:26的序列，P-CADVHCDR3包含SEQIDNO:28的序列。在另一个方面，P-CADVLCDR1包含SEQIDNO:35的序列；P-CADVLCDR2包含SEQIDNO:37的序列；和P-CADVLCDR3包含SEQIDNO:42的序列，P-CADVHCDR1包含SEQIDNO:25的序列，P-CADVHCDR2包含SEQIDNO:26的序列，P-CADVHCDR3包含SEQIDNO:29的序列。在另一个方面，P-CADVLCDR1包含SEQIDNO:35的序列；P-CADVLCDR2包含SEQIDNO:37的序列；P-CADVLCDR3包含SEQIDNO:43的序列，P-CADVHCDR1包含SEQIDNO:25的序列，P-CADVHCDR2包含SEQIDNO:26的序列，P-CADVHCDR3包含SEQIDNO:30的序列。在另一个方面，P-CADVLCDR1包含SEQIDNO:35的序列；P-CADVLCDR2包含SEQIDNO:37的序列；P-CADVLCDR3包含SEQIDNO:39的序列，P-CADVHCDR1包含SEQIDNO:25的序列，P-CADVHCDR2包含SEQIDNO:26的序列，P-CADVHCDR3包含SEQIDNO:31的序列。本发明还提供双特异性异二聚化双抗体，其包含：含有SEQIDNO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21或23的序列的P-CADVL；含有SEQIDNO:45或46的序列的CD3VH；含有SEQIDNO:47的序列的CD3VL；和含有SEQIDNO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22或24的序列的P-CADVH。在一方面，P-CADVL包含SEQIDNO:5的序列，和P-CADVH包含SEQIDNO:6的序列。在另一方面，P-CADVL包含SEQIDNO:7的序列，和P-CADVH包含SEQIDNO:8的序列。在另一方面，P-CADVL包含SEQIDNO:9的序列和P-CADVH包含SEQIDNO:10的序列。在另一方面，P-CADVL包含SEQIDNO:15的序列和P-CADVH包含SEQIDNO:16的序列。本发明还提供双特异性异二聚化双抗体，其能够特异性结合P-钙黏着蛋白的表位和CD3的表位且包含第一多肽链和第二多肽链，其中所述第一多肽链包含SEQIDNO:90的序列且所述第二多肽链包含SEQIDNO:91的序列。本发明还提供双特异性异二聚化双抗体，其能够特异性结合P-钙黏着蛋白的表位和CD3的表位且包含第一多肽链和第二多肽链，其中所述第一多肽链包含SEQIDNO:92的序列且所述第二多肽链包含SEQIDNO:93的序列。本发明还提供双特异性异二聚化双抗体，其能够特异性结合P-钙黏着蛋白的表位和CD3的表位且包含第一多肽链和第二多肽链，其中所述第一多肽链包含SEQIDNO:88的序列且所述第二多肽链包含SEQIDNO:89的序列。本发明还提供双特异性异二聚化双抗体，其中所述第一和第二多肽链可以通过至少一个二硫键彼此共价键合。本发明还提供双特异性异二聚化双抗体，其能够特异性结合P-钙黏着蛋白的表位和CD3的表位且包含第一多肽链和第二多肽链，其中所述第一多肽链和第二多肽链包含如图30A、30B、31A、31B、32A或32B中所示的序列。在本发明的另一方面，所述双特异性异二聚化双抗体包含如表5中所示的第一多肽链、第二多肽链和第三多肽链。本发明提供双特异性异二聚化双抗体，其中所述双特异性异二聚化双抗体可以缀合至可检测标签，包括但不限于荧光团或放射性核素。本发明提供结合P-钙黏着蛋白且竞争结合本文公开的双特异性异二聚化双抗体的双特异性异二聚化双抗体。本发明还提供包含治疗有效量的本文公开的双特异性异二聚化双抗体和药学上可接受的载体的药物组合物。本发明还提供在有需要的患者中治疗P-钙黏着蛋白相关病症的方法，其包括向所述患者施用本文公开的双特异性异二聚化双抗体或包含本文公开的双特异性异二聚化双抗体的药物组合物。本发明还提供在有需要的患者中治疗P-钙黏着蛋白相关病症的方法，其包括向所述患者施用本文公开的双特异性异二聚化双抗体或包含本文公开的双特异性异二聚化双抗体的药物组合物，其中细胞溶解性T细胞应答被激活或诱导。本发明还提供本文公开的用于治疗的双特异性异二聚化双抗体。本发明还提供本文公开的双特异性异二聚化双抗体在制备用于治疗的药物中的用途。在另一方面，所述治疗为治疗P-钙黏着蛋白相关病症。本发明还提供本文公开的用于治疗的双特异性异二聚化双抗体，其中所述治疗激活或诱导细胞溶解性T细胞应答。在一方面，所述P-钙黏着蛋白相关病症是癌症。在另一方面，癌症是表达P-钙黏着蛋白或P-钙黏着蛋白阳性癌症。癌症包括但不限于乳腺癌、结肠直肠癌、卵巢癌、胃癌、甲状腺癌、前列腺癌、宫颈癌、胰腺癌、肺癌、膀胱癌、肝癌、子宫内膜癌、头颈癌、睾丸癌和成胶质细胞瘤癌。本发明还提供重组生产本文公开的双特异性异二聚化双抗体的分离的宿主细胞、包含编码本文公开的双特异性异二聚化双抗体的核苷酸序列的分离的多核苷酸和包含所述多核苷酸的载体。本发明还提供生产本文公开的双特异性异二聚化双抗体的方法，其包括在导致产生双特异性异二聚化双抗体的条件下培养本文公开的宿主细胞并从培养上清液中纯化双特异性异二聚化双抗体。本发明还提供本文公开的双特异性异二聚化双抗体，其中晶体结构装配入被一对半胱氨酸残基之间的二硫键稳定的紧凑球形结构中，所述一对半胱氨酸残基由亚结构域1B的位置239的半胱氨酸残基(Cys239)和亚结构域2A的位置246的半胱氨酸残基(Cys246)组成；并且，其中晶体衍射X射线用于确定原子坐标以提供优于约2.0埃的分辨率。本发明还提供双特异性异二聚化双抗体，其能够特异性结合P-钙黏着蛋白的表位和CD3的表位且包含第一多肽链和第二多肽链，其中所述第一多肽链在N末端至C末端方向包含：结构域1，其包含亚结构域1A和亚结构域1B，所述亚结构域1A包含含有SEQIDNO:47的序列的抗CD3抗体的VL结合域（CD3VL），所述亚结构域1B包含含有SEQIDNO:6的序列的抗P-钙黏着蛋白抗体的VH结合域（P-CADVH），其中所述亚结构域1A和亚结构域1B可以通过甘氨酸-丝氨酸接头（接头1）共价连接且不缔合以形成VL/VH表位结合域；所述第二多肽链在N末端至C末端方向包含：结构域2，其包含亚结构域2B和亚结构域2A，所述亚结构域2B包含含有SEQIDNO:5的序列的P-CADVL，而所述亚结构域2A包含含有SEQIDNO:45的序列的CD3VH，其中所述亚结构域2B和亚结构域2A可以通过甘氨酸-丝氨酸接头（接头1）共价连接且不缔合以形成VL/VH表位结合域；并且其中晶体结构装配入被一对半胱氨酸残基之间的二硫键稳定的紧凑球形结构中，所述一对半胱氨酸残基包含亚结构域1B的位置239的半胱氨酸残基(Cys239)和亚结构域2A的位置246的半胱氨酸残基(Cys246)；并且，其中晶体衍射X射线用于确定原子坐标以提供优于约2.0埃的分辨率。在另一方面，本文所述的双特异性异二聚化双抗体含有彼此分开约40埃的两个抗原结合位点并且所述结合位点可以位于双特异性异二聚化双抗体的正交相对面上。本发明还提供基于本文公开的晶体结构鉴定形成双特异性异二聚化双抗体内的二硫键的半胱氨酸残基的额外位置的方法，其中用一对形成二硫键的半胱氨酸残基取代一对氨基酸残基位置并分析其晶体结构。在本发明的一个具体方面，所述由一对形成二硫键的半胱氨酸残基取代的氨基酸残基对可以选自氨基酸位置Gln121(VH1B)Gly160(VL1A)、Val129(VH1B)Gly244(VL1A)、Val123(VH1B)Gly160(VL1A)、Gly126(VH1B)Ser242(VL1A)和Ala127(VH1B)Ser242(VL1A)。二硫键可以降低溶剂可及性并缩短接头长度。本发明还提供工程化双特异性异二聚化双抗体变体以尝试形成更稳定的结构域间缔合的方法，其中所述工程化是通过在结构域间界面内的氨基酸定点诱变（基于本文公开的晶体结构），其中氨基酸定点诱变填补大的内部空隙/扣。在本发明的一个具体方面，定点诱变可以通过将小氨基酸替换为具有庞大的芳族侧链的氨基酸来增加氨基酸侧链体积。在本发明的另一方面，所述小氨基酸可以选自以下位置的氨基酸Ala44(VL1A)、Val213(VH2A)、Leu238(VH2A)或Met231(VL2B)。在本发明的另一方面，所述具有庞大的芳族侧链的氨基酸可以选自苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸。本发明还提供结合P-钙黏着蛋白的抗体，其包含含有SEQIDNO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21或23的序列的轻链可变区（VL）的CDR1、CDR2和CDR3和/或含有SEQIDNO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22或24的序列的重链可变区（VH）的CDR1、CDR2和CDR3。在本发明的另一方面，本文公开的抗体包含含有SEQIDNO:35或36的序列的VLCDR1、含有SEQIDNO:37或38的序列的VLCDR2、含有SEQIDNO:39、40、41、42、43或44的序列的VLCDR3、含有SEQIDNO:25或33的序列的VHCDR1、含有SEQIDNO:26或34的序列的VHCDR2和含有SEQIDNO:27、28、29、30、31或32的序列的VHCDR3。在本发明的另一方面，本文公开的抗体包含含有SEQIDNO:35或36的序列的VLCDR1、含有SEQIDNO:37或38的序列的VLCDR2、含有SEQIDNO:39、40、41、42、43或44的序列的VLCDR3、含有SEQIDNO:25的序列的VHCDR1、含有SEQIDNO:26的序列的VHCDR2和含有SEQIDNO:27、28、29、30、31或32的序列的VHCDR3。在本发明的另一方面，本文公开的抗体包含含有SEQIDNO:35的序列的VLCDR1、含有SEQIDNO:37的序列的VLCDR2、含有SEQIDNO:42的序列的VLCDR3、含有SEQIDNO:25的序列的VHCDR1、含有SEQIDNO:26的序列的VHCDR2和含有SEQIDNO:29的序列的VHCDR3。本发明还提供结合P-钙黏着蛋白的抗体，其包含含有SEQIDNO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21和23的序列的轻链可变区和/或含有SEQIDNO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22或24的序列的重链可变区。在本发明的另一方面，本文公开的抗体包含含有SEQIDNO:5的序列的轻链可变区氨基酸和/或含有SEQIDNO:6的序列的重链可变区。在本发明的另一方面，本文公开的抗体包含含有SEQIDNO:7的序列的轻链可变区和/或含有SEQIDNO:8的序列的重链可变区。在本发明的另一方面，本文公开的抗体包含含有SEQIDNO:9的序列的轻链可变区和/或含有SEQIDNO:10的序列的重链可变区。在本发明的另一方面，本文公开的抗体包含含有SEQIDNO:15的序列的轻链可变区和/或含有SEQIDNO:16的序列的重链可变区。本发明还提供结合P-钙黏着蛋白且与本文公开的抗体竞争结合P-钙黏着蛋白的抗体。本发明还提供包含治疗有效量的本文公开的抗体和药学上可接受的载体的药物组合物。本发明还提供在有需要的患者中治疗P-钙黏着蛋白相关病症的方法，其包括向所述患者施用本文公开的抗体或包含本文公开的抗体的药物组合物。本发明还提供本文公开的用于治疗的抗体。本发明还提供本文公开的抗体在制备用于治疗的药物中的用途。在一方面，所述P-钙黏着蛋白相关病症是癌症。在另一方面，癌症是表达P-钙黏着蛋白或P-钙黏着蛋白阳性癌症。癌症包括但不限于乳腺癌、结肠直肠癌、卵巢癌、胃癌、甲状腺癌、前列腺癌、宫颈癌、胰腺癌、肺癌、膀胱癌、肝癌、子宫内膜癌、头颈癌、睾丸癌和成胶质细胞瘤癌。本发明还提供编码本文公开的抗体的核酸。在本发明的另一方面，所述核酸可以包含选自SEQIDNO:98、100、102、104、106、108、110、112、114和116的序列。在本发明的另一方面，所述核酸可以包含选自SEQIDNO:97、99、101、103、105、107、109、111、113和115的序列。本发明还提供包含本文公开的核酸的载体和包含本文公开的载体的宿主细胞。本发明还提供本文公开的双特异性异二聚化双抗体或抗体，其中P-CADVL包含：含有XL1.1-XL1.2-XL1.3-XL1.4-XL1.5-XL1.6-XL1.7-XL1.8-XL1.9-XL1.10-XL1.11-XL1.2-XL1.13的P-CADVLCDR1序列，其中XL1.1至XL1.13各自独立地为根据表57、表58或表59的第3列的氨基酸残基；含有XL2.1-XL2.2-XL2.3-XL2.4-XL2.5-XL2.6-XL2.7的P-CADVLCDR2序列，其中XL2.1至XL2.7各自独立地为根据表60、表61或表62的第3列的氨基酸残基；和含有XL3.1-XL3.2-XL3.3-XL3.4-XL3.5-XL3.6-XL3.7-XL3.8-XL3.9-XL3.10-XL3.11的P-CADVLCDR3序列，其中XL3.1至XL3.11各自独立地为根据表63、表64或表65的第3列的氨基酸残基；且P-CADVH包含：含有XH1.1-XH1.2-XH1.3-XH1.4-XH1.5-XH1.6-XH1.7-XH1.8-XH1.9-XH1.10或XH1.5、XH1.6-XH1.7-XH1.8-XH1.9-XH1.10的P-CADVHCDR1序列，其中XH1.1至XH1.10各自独立地为根据表48、表49或表50的第3列的氨基酸残基；包含XH2.1-XH2.2-XH2.3-XH2.4-XH2.5-XH2.6-XH2.7-XH2.8-XH2.9-XH2.10-XH2.11-XH2.12-XH2.13-XH2.14-XH2.15-XH2.16-XH2.17或XH2.1-XH2.2-XH2.3-XH2.4-XH2.5-XH2.6-XH2.7-XH2.8-XH2.9-XH2.10的P-CADVHCDR2序列，其中XH2.1至XH2.17各自独立地为根据表51、表52或表53的第3列的氨基酸残基；和含有XH3.1-XH3.2-XH3.3-XH3.4-XH3.5-XH3.6-XH3.7-XH3.8-XH3.9的P-CADVHCDR3序列，其中XH3.1至XH3.9各自独立地为根据表54、表55或表56的第3列的氨基酸残基。在一方面，XL1.1至XL1.13各自独立地为根据表57的第3列的氨基酸残基。在另一方面，XL1.1至XL1.13各自独立地为根据表58的第3列的氨基酸残基。在另一方面，XL1.1至XL1.13各自独立地为根据表59的第3列的氨基酸残基。在另一方面，XL2.1至XL2.7各自独立地为根据表60的第3列的氨基酸残基。在另一方面，XL2.1至XL2.7各自独立地为根据表61的第3列的氨基酸残基。在另一方面，XL2.1至XL2.7各自独立地为根据表62的第3列或表62的氨基酸残基。在另一方面，XL3.1至XL3.11各自独立地为根据表63的第3列的氨基酸残基。在另一方面，XL3.1至XL3.11各自独立地为根据表64的第3列的氨基酸残基。在另一方面，XL3.1至XL3.11各自独立地为根据或表65的第3列或表65的氨基酸残基。在另一方面，XH1.1至XH1.10各自独立地为根据表48的第3列的氨基酸残基。在另一方面，XH1.1至XH1.10各自独立地为根据表49的第3列的氨基酸残基。在另一方面，XH1.1至XH1.10各自独立地为根据表50的第3列的氨基酸残基。在另一方面，XH2.1至XH2.17各自独立地为根据表51的第3列的氨基酸残基。在另一方面，XH2.1至XH2.17各自独立地为根据表52的第3列的氨基酸残基。在另一方面，XH2.1至XH2.17各自独立地为根据表53的第3列的氨基酸残基。在另一方面，XH3.1至XH3.9各自独立地为根据表54的第3列的氨基酸残基。在另一方面，XH3.1至XH3.9各自独立地为根据表55的第3列的氨基酸残基。在另一方面，XH3.1至XH3.9各自独立地为根据表56的第3列的氨基酸残基。本发明还提供本文公开的双特异性异二聚化双抗体或抗体，其中P-CADVL包含：含有XL1.1-XL1.2-XL1.3-XL1.4-XL1.5-XL1.6-XL1.7-XL1.8-XL1.9-XL1.10-XL1.11-XL1.2-XL1.13的P-CADVLCDR1序列，其中XL1.1至XL1.13各自独立地为根据表69的第3列或第4列的氨基酸残基；含有XL2.1-XL2.2-XL2.3-XL2.4-XL2.5-XL2.6-XL2.7的P-CADVLCDR2序列，其中XL2.1至XL2.7各自独立地为根据表70的第3列或第4列的氨基酸残基；和含有XL3.1-XL3.2-XL3.3-XL3.4-XL3.5-XL3.6-XL3.7-XL3.8-XL3.9-XL3.10-XL3.11的P-CADVLCDR3序列，其中XL3.1至XL3.11各自独立地为根据表71的第3列或第4列的氨基酸残基；且P-CADVH包含：含有XH1.1-XH1.2-XH1.3-XH1.4-XH1.5-XH1.6-XH1.7-XH1.8-XH1.9-XH1.10或XH1.5、XH1.6-XH1.7-XH1.8-XH1.9-XH1.10的P-CADVHCDR1序列，其中XH1.1至XH1.10各自独立地为根据表66的第3列或第4列的氨基酸残基；包含XH2.1-XH2.2-XH2.3-XH2.4-XH2.5-XH2.6-XH2.7-XH2.8-XH2.9-XH2.10-XH2.11-XH2.12-XH2.13-XH2.14-XH2.15-XH2.16-XH2.17或XH2.1-XH2.2-XH2.3-XH2.4-XH2.5-XH2.6-XH2.7-XH2.8-XH2.9-XH2.10的P-CADVHCDR2序列，其中XH2.1至XH2.17各自独立地为根据表67的第3列或第4列的氨基酸残基；和含有XH3.1-XH3.2-XH3.3-XH3.4-XH3.5-XH3.6-XH3.7-XH3.8-XH3.9的P-CADVHCDR3序列，其中XH3.1至XH3.9各自独立地为根据表68的第3列或第4列的氨基酸残基。在一方面，XL1.1至XL1.13各自独立地为根据表69的第3列的氨基酸残基。在另一方面，XL1.1至XL1.13各自独立地为根据表69的第4列的氨基酸残基。在另一方面，XL2.1至XL2.7各自独立地为根据表70的第3列的氨基酸残基。在另一方面，XL2.1至XL2.7各自独立地为根据表70的第4列的氨基酸残基。在另一方面，XL3.1至XL3.11各自独立地为根据表71的第3列的氨基酸残基。在另一方面，XL3.1至XL3.11各自独立地为根据表71的第4列的氨基酸残基。在另一方面，XH1.1至XH1.10各自独立地为根据表66的第3列的氨基酸残基。在另一方面，XH1.1至XH1.10各自独立地为根据表66的第4列的氨基酸残基。在另一方面，XH2.1至XH2.17各自独立地为根据表67的第3列的氨基酸残基。在另一方面，XH2.1至XH2.17各自独立地为根据表67的第4列的氨基酸残基。在另一方面，XH3.1至XH3.9各自独立地为根据表68的第3列的氨基酸残基。在另一方面，XH3.1至XH3.9各自独立地为根据表68的第4列的氨基酸残基。另外，本发明提供XH1.8为G、XH2.5为Y、XH3.1为I、XH3.7为F、XL3.3为W、XH2.6为N、XH2.16为Q、XH3.5为N、XH3.9为I、XL1.8为G、XL2.2为N、XL2.3为N、XL3.2为T、和/或XL3.4为D。本发明还提供本文所述的方面的任何组合。附图简述图1A和1B提供具有第一促异二聚体结构域和第二促异二聚体结构域（包含经优化以经“钮扣(knob-in-hole)”缔合而缔合的Fc区）的LP-DARTP-钙黏着蛋白/CD3双特异性异二聚化双抗体的四种可选表示的示意图。图2提供同时靶向并活化T细胞（经CD3抗原）和肿瘤细胞（经P-钙黏着蛋白抗原）的VF-DART双特异性异二聚化双抗体的示意图，所述双抗体具有第一多肽链（1），其中第一促异二聚体结构域包含C末端肽，其与第二多肽链（2）的第二促异二聚体结构域的C末端肽形成用于稳定性的二硫键。图3提供装配的VF-DART双特异性异二聚化双抗体的示意图，所述双抗体具有第一多肽链（1）和第二多肽链（2），其中第一促异二聚体结构域（诸如SEQIDNO:70或SEQIDNO:71，详述于下文）和第二促异二聚体结构域（诸如SEQIDNO:71或SEQIDNO:70，取决于第一促异二聚体结构域的选择）包含半胱氨酸残基。图4提供具有第一多肽链（1）（其中第一促异二聚体结构域包含形成带负电荷的α螺旋卷曲（E卷曲）的谷氨酸富集区域）和第二多肽链（2）（其中第二促异二聚体结构域包含形成带正电荷的螺旋卷曲（K卷曲）的赖氨酸富集区域）的装配的EK-DART双特异性异二聚化双抗体的示意图。图5提供具有第一促异二聚化结构域和第二促异二聚化结构域（包含经优化以经“钮扣(knob-in-hole)”缔合而缔合的Fc区）的装配的LP-DART双特异性异二聚化双抗体的示意图。图6提供具有称为MP3-DART的Fc结构域的可选双特异性异二聚化双抗体的结构。双特异性异二聚化双抗体连接至Fc结构域的N末端侧并且因此称为“N末端MP3-DART”。N末端MP3-DART包含图示表示的第一、第二和第三多肽链。表示了N末端MP3-DART的最终结构。图7提供具有称为MP3-DART的Fc结构域的可选双特异性异二聚化双抗体的结构。双特异性异二聚化双抗体连接至Fc结构域的C末端侧并且因此称为“C末端MP3-DART”。C末端MP3-DART包含图示表示的第一、第二和第三多肽链。表示了C末端MP3-DART的最终结构。图8提供比较细胞毒性T淋巴细胞（CTL）活性与相应细胞表面P-钙黏着蛋白表达的线性回归分析。图9证实177EK-DART降低小鼠HCT116结肠直肠癌模型中肿瘤体积的体内能力。图10证实153EK-DART降低小鼠HCT116结肠直肠癌模型中肿瘤体积的体内能力。图11证实154EK-DART降低小鼠HCT116结肠直肠癌模型中肿瘤体积的体内能力。图12证实35EK-DART降低小鼠HCT116结肠直肠癌模型中肿瘤体积的体内能力。图13证实153LP-DART降低小鼠HCT116结肠直肠癌模型中肿瘤体积的体内能力。图14证实153LP-DART降低小鼠HCT116结肠直肠癌模型中肿瘤体积的体内能力。图15证实153LP-DART降低小鼠Du145前列腺癌模型中肿瘤体积的体内能力。图16证实153LP-DART降低小鼠H1650肺癌模型中肿瘤体积的体内能力。图17A-17D证实153LP-DART降低成熟的肿瘤+移植的人T细胞模型中的肿瘤体积的体内能力，17E证实肿瘤体积的单因素ANOVA分析。图18A和18B证实153LP-DART降低成熟的肿瘤采用人T细胞过继转移模型中的肿瘤体积的体内能力。图19证实153LP-DART降低P-钙黏着蛋白阳性患者来源的结肠直肠癌肿瘤异种移植物中的肿瘤体积的体内能力。图20显示在肿瘤浸润性淋巴细胞（TIL）中153LP-DART介导的剂量依赖性增加。图21A-21D提供评价荧光团标记的153LP-DART和T细胞的特性的体外测定。图22A-22D提供使用纵向FMT成像的HCT116异种移植物模型中153LP-DART的生物分布和靶向。图23A-23C显示来自FMT成像研究的药代动力学数据（ELISA）。图24A显示荧光团标记和未标记的T细胞的T细胞活性的评价和图24B显示使用FMT成像（体内）在HCT116肿瘤模型中荧光团标记的T细胞的细胞追踪动力学。图25提供设计用于晶体学分析的DART构建体的示意图，所述DART构建体具有与P-CADVH结构域共价连接的称为“6XHIS”的C末端His标签和与CD3VH结构域共价连接的称为“FLAG”的C末端FLAG。图26提供晶体35DART蛋白的晶体结构的图示描绘。图27提供显示对于抗CD3CDR区和抗P-CADCDR区的抗原结合位点晶体35DART蛋白的图示描绘。图28提供经结构域间界面中的定点诱变具有更稳定的结构域间缔合的晶体35DART蛋白的示意图，所述结构域间界面包含可以被多种氨基酸用渐增的侧链体积填满的大的内部空隙/扣。图29提供具有各种二硫键位置（Cys-Cys位点）以降低二硫键的溶剂可及性以及缩短接头长度的晶体35DART蛋白的晶体结构的图示描绘。图30A和30B提供本发明的VF-DART双特异性异二聚化双抗体的第一和第二多肽链的氨基酸序列。图31A和31B提供本发明的EK-DART双特异性异二聚化双抗体的第一和第二多肽链的氨基酸序列。图32A和32B提供本发明的LP-DART双特异性异二聚化双抗体的第一和第二多肽链的氨基酸序列。图33提供本发明的DART双特异性异二聚化双抗体的第一和第二多肽链的氨基酸序列。图34提供用于P-钙黏着蛋白153LP-DART的表位作图的P-钙黏着蛋白胞外结构域（ECD）-FC融合蛋白构建体。图35提供全长P-钙黏着蛋白表位序列(UniProtP22223,CADH3,人钙黏着蛋白-3)。发明详述本发明描述包含特异性结合P-钙黏着蛋白的抗原结合域和特异性结合CD3的抗原结合域的新颖的双特异性异二聚化双抗体，用于募集并活化细胞溶解性T细胞。所述双特异性异二聚化双抗体还可以包含Fc结构域。此外，本文证实，所述双特异性异二聚化双抗体成功地将T细胞细胞毒性导向至表达P-钙黏着蛋白的肿瘤细胞并将T细胞细胞毒性活化。此外，本发明的双特异性异二聚化双抗体已增强药代动力学特性以延长体内半衰期，并经设计以在表达P-钙黏着蛋白的肿瘤存在的情况下经CD3复合体接合并活化多克隆T细胞群。本发明描述了衍生自人噬菌体展示文库的针对P-钙黏着蛋白的全长人单链抗体结合域的分离和表征。本发明还提供将这些P-钙黏着蛋白结合域与之前描述的DART形式中的抗CD3抗体的抗原结合域共价连接(Moore等人,Blood,117(17):4542-4551,2011)以产生能够同时结合P-钙黏着蛋白和CD3的双特异性异二聚化双抗体。另外，在本发明的一个方面，抗P-钙黏着蛋白/抗CD3DART蛋白（也称为双特异性异二聚化双抗体）成功地引导并活化表达P-钙黏着蛋白的细胞的T细胞细胞毒性。除非另有定义，本文所用的所有专用术语、符号和其他科学术语或术语学旨在具有由本发明所属领域中的技术人员通常理解的含义。在一些情况下，具有通常理解的含义的术语在本文为了清楚和/或为了易于参考而进行定义，且包括本文此类定义不应必须解释为代表与本领域一般理解的实质性差异。除非另有说明，本发明的实践采用分子生物学（包括重组技术）、微生物学、细胞生物学、生物化学、核酸化学和免疫学的常规技术，其均在本领域技术范围之内。此类技术在以下文献中完整记载，诸如CurrentProtocolsinImmunology(J.E.Coligan等人,编辑.,1999,包括2001年的增刊);CurrentProtocolsinMolecularBiology(F.M.Ausubel等人,编辑.,1987,包括2001年的增刊);MolecularCloning:ALaboratoryManual,第3版(Sambrook和Russel,2001)。P-钙黏着蛋白（钙黏着蛋白-3，CDH3）属于在发育和组织体内稳态过程中调节钙依赖性细胞-细胞粘附的跨膜糖蛋白的经典钙黏着蛋白超家族(Gumbiner等人,J.CellBiol.,148:399-403,(2000))。钙黏着蛋白胞内结构域与连接肌动蛋白细胞骨架网络的胞质连环蛋白直接相互作用，提供稳定的细胞相互作用的分子基础。钙黏着蛋白/连环蛋白复合体以及由该结构控制的信号传导途径，通过其对细胞生长、分化、运动性和存活的影响而代表了指导细胞命运决定的主要调节机制(Cavallaro等人,2011)。经典钙黏着蛋白包括E-钙黏着蛋白（CDH1）、N钙黏着蛋白（CDH2）和P-钙黏着蛋白（CDH3）。正常组织中P-钙黏着蛋白的表达低并且主要限于肌上皮细胞和复层上皮的基层。已报道P-钙黏着蛋白在多种肿瘤中的表达增加，包括乳腺癌、胃癌、子宫内膜癌、胰腺癌和结肠直肠癌并且是疾病晚期患者差的存活的良好预测物(Hardy等人,2002;Imai等人,2008;Parades等人,2005;Stefansson等人,2004;Taniuchi等人,2005)。基因表达概况和免疫组织化学分析还暗示肺癌（包括但不限于非小细胞肺癌和小细胞肺癌）、卵巢癌、头颈癌、甲状腺癌和膀胱癌。CD3（分化抗原簇3）是T细胞共受体蛋白复合体，其包含四种不同链ε、δ、γ和ζ（其形成εδ、εγ和ζζ二聚体）。这些二聚体与称为T细胞受体（TCR）的分子缔合并产生T淋巴细胞中的活化信号。TCR和CD3分子一同构成TCR复合体。众所周知，抗CD3抗体通过活化内源淋巴因子生产而引发产生细胞毒性T细胞并且能够选择性杀死肿瘤靶标(Yun等人,CancerResearch,49:4770-4774(1989))。更具体而言，T细胞表达TCR复合体，其能够诱导抗原特异性免疫应答(Smith-Garvin等人,2009)。抗原是由肿瘤细胞和被病毒感染细胞所表达的肽，其能够刺激免疫应答。胞内表达的抗原结合主要组织相容类I（MHCI类）分子并且被转运至它们暴露于T细胞的表面。如果TCR对具有抗原的复合体中的MHCI类的结合亲和力是足够的，则将启动免疫突触的形成。经免疫突触的信号传递由形成εδ、εγ和ζζ二聚体的CD3共受体来介导。这些二聚体与TCR缔合并产生T淋巴细胞中的活化信号。该信号传递级联指导T细胞介导的对表达抗原的细胞的杀伤。通过粒酶B和穿孔蛋白从T细胞被释放并转移至靶细胞来介导细胞毒性。不受理论的束缚，据信本发明的双特异性异二聚化双抗体可以允许T细胞绕过复合体中TCR和MHCI类与抗原相互作用的需要，而相应地通过表达于T细胞上的CD3（诸如CD3ε）和表达于肿瘤上的P-钙黏着蛋白的直接共接合(co-engagement)来将T细胞重新指向靶细胞。如本文所用的“效应子功能”意指支持生物化学事件的能力，其源自双特异性异二聚化双抗体的抗CD3结合域与细胞毒性T细胞的相互作用。如本文所用，术语“抗体（antibody）”和“抗体（antibodies）”指单克隆抗体、多特异性抗体、人抗体、人源化抗体、合成抗体、嵌合抗体、多克隆抗体、骆驼化抗体、单链Fv（scFv）、单链抗体、Fab片段、F(ab')片段、二硫键连接的双特异性Fv（sdFv）、内体、和抗独特型（抗Id）抗体（包括例如针对本发明的抗体的抗Id和抗抗Id抗体）、和任何上述的表位结合片段或结合域。具体而言，抗体包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性片段，即包含抗原结合位点的分子。免疫球蛋白分子可以为任何类型（例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY）、类别(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类。如本文所用，术语“双特异性异二聚化双抗体”指两种或多种多肽链或蛋白的复合体，其各自包含至少一个抗体VL或一个抗体VH结构域或其片段，其中两个抗体结合域均包含于单一多肽链内且其中各多肽链中的VL和VH结构域来自不同抗体。如本文所用，术语“免疫特异性结合”、“免疫特异性识别”、“特异性结合”、“特异性识别”及类似术语指特异性结合抗原（例如表位或免疫复合体）且不特异性结合另一分子的分子例如结合域。特异性结合抗原的分子可以以较低亲和力结合其他肽或多肽，如通过本领域已知的测定法所测定的，例如免疫测定、BIACORE®、或其他测定。优选地，特异性结合抗原的分子不与其他蛋白交叉反应。如本文所用，术语“重链”、“轻链”、“可变区”、“可变域”、“框架区”、“恒定域”等具有它们在免疫学领域中的普通含义并且指天然存在的免疫球蛋白中的结构域和重组结合蛋白（例如人源化抗体、单链抗体、嵌合抗体等）的相应结构域。天然存在的免疫球蛋白的基础结构单元为具有两条轻链和两条重链的四聚体，通常表达为约150,000Da的糖蛋白。每一链的氨基末端（N末端）包括主要负责抗原识别的约100-110或更多个氨基酸的可变区。每一链的羧基末端（C末端）定义恒定区。每一轻链包含轻链可变域（VL）和轻链恒定域（CL）。每一重链包含重链可变区（VH）和重链恒定区，具有CH1、铰链、CH2和CH3结构域。IgG分子的可变区包含：超变区，称为互补性决定区域（CDR），其包含与抗原接触的残基；和非CDR区段，称为框架区（FR），其通常维持结构并决定CDR环的定位（尽管某些框架区也可以接触抗原）。每一VH和VL包含三个CDR和四个FR，从氨基末端向羧基末端按以下结构排列：n-FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3CDR3、FR4-c。免疫球蛋白分子可以为任何类型（例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY）、类别（例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2）或亚类。“铰链区”或“铰链结构域”通常定义为人IgG-1从Glu216指Pro230的延伸片段。其他IgG同种型的铰链区可以通过将形成重链间S--S键的第一和最后一个半胱氨酸残基置于相同位置来与IgG1序列比对。如本文所用，术语“Fc区”或类似术语用于定义IgG重链的C末端区域。IgG的Fc区包括两个恒定域，CH2和CH3。人IgGFc区的CH2结构域通常根据Kabat编号系统从氨基酸231延伸至氨基酸341。人IgGFc区的CH3结构域通常根据Kabat编号系统从氨基酸342延伸至447。人IgGFc区的CH2结构域（也称为"Cγ2"结构域）独特之处在于其不与另一结构域紧密配对。相反，两个N连接的分支碳水化合物链插入完整天然IgG的两个CH2结构域之间。当指代结合蛋白、结合域或抗体（如本文广泛定义的）时，对各结构域的氨基酸指定与以下一致：Kabat、Chothia的定义、Kabat和Chothia两者的累积、AbM、接触、和/或构象定义或本领域中熟知的CDR确定的任何方法。抗体CDR可以鉴定为由Kabat等人最初定义的超变区。参见例如Kabat等人,1992,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第5版,PublicHealthService,NIH,WashingtonD.C。CDR的位置也可以如由Chothia及其他人最初描述的结构环结构所鉴定。参见例如Chothia等人,1989,Nature342:877-883。对CDR鉴定的其他方法包括“AbM定义”，其是Kabat和Chothia之间的折衷方法且使用OxfordMolecular的AbM抗体建模软件(Accelrys,SanDiego,CA)衍生，或者基于观察到的抗原接触的CDR的“接触定义”，如MacCallum等人,1996,J.Mol.Biol.,262:732-745中所述。在另一方法中，本文称为CDR的“构象定义”，CDR的位置可以鉴定为对抗原结合焓贡献的残基。参见例如Makabe等人,2008,JournalofBiologicalChemistry,283:1156-1166。还有其他CDR边界定义可以不用严格遵循上述方法之一，但尽管如此可以与KabatCDR的至少一个位置重叠，尽管它们在预测或实验发现（特定残基或残基的组或甚至整个CDR不显著影响抗原结合）的教导下可以被缩短或延长。如本文所用，CDR可以指由本领域已知的任何方法（包括方法的组合）定义的CDR。本文所用的方法可以利用根据这些方法中的任何方法定义的CDR。对于含有超过一个CDR的任何给定的方面，CDR可以根据Kabat、Chothia、扩展的、AbM、接触、和/或构象定义的任一者来进行定义。人源化抗体指非人（例如小鼠）抗体的形式，其为含有衍生于非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段（诸如Fv、Fab、Fab'、F(ab')2或抗体的其他抗原结合子序列或结合域）。优选地，人源化抗体是人免疫球蛋白（受体抗体），其中来自受体的互补性决定区域的残基被来自非人物种（供体抗体）诸如小鼠、大鼠或兔的具有所需的特异性、亲和力和能力的CDR的残基所替换。术语“单克隆抗体”指衍生自单一克隆包括任何真核生物的、原核生物的或噬菌体克隆的抗体，而不指其产生的方法。本发明的双特异性异二聚化双抗体的结合域可以来自于的单克隆抗体可以使用本领域已知的很多种技术包括使用杂交瘤、重组和噬菌体展示技术或其组合来制备。例如，单克隆抗体可以使用杂交瘤技术包括本领域已知的那些技术来产生。抗体还可以使用本领域已知的各种噬菌体展示方法来产生。在噬菌体展示方法中，功能抗体结构域展示在携带编码所述结构域的多核苷酸序列的噬菌体颗粒的表面。在一个具体的方面，此类噬菌体可以用于展示抗原结合域，诸如Fab和Fv或二硫键稳定的Fv，其表达自完整(repertoire)或组合抗体文库（例如人或小鼠的）。表达结合目标抗原的抗原结合域的噬菌体可以用抗原例如施用经标记的抗原或结合至或捕获至固体表面或珠粒上的抗原来选择或鉴定。用于这些方法中的噬菌体通常为丝状噬菌体，包括fd和M13。将抗原结合域表达为与噬菌体基因III或基因VIII蛋白的重组融合蛋白。可用于产生本发明的免疫球蛋白或其片段的噬菌体展示方法的实例包括以下中公开的那些：Brinkmann等人(1995)"PhageDisplayOfDisulfide-StabilizedFvFragments,"J.Immunol.Methods,182:41-50。多种IgG同种型及其结构域的功能特性是本领域众所周知的。IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的氨基酸序列是本领域已知的。从用于本发明的方法的特定IgG同种型选择和/或组合两个或多个结构域可以基于亲代同种型的任何已知参数包括对FcγR的亲和力。例如，使用来自对FcγRIIB展示出有限的或无结合的IgG同种型例如IgG2或IgG4的区域或结合域可以发现特定用途，其中期望双特异性异二聚化双抗体被工程化以将对活化受体的结合最大化并对抑制受体的结合最小化。类似地，使用来自已知优先结合C1q或FcγRIIIA的IgG同种型例如IgG3的Fc区域或结构域可以与本领域已知的Fc氨基酸修饰组合以增强抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）和/或补体依赖性细胞毒性（CDC），以工程化双特异性异二聚化双抗体分子，从而将效应子功能活性例如补体活化或ADCC最大化。以类似的方式，可以在IgG同种型的Fc区域或结构域中进行突变，其最小化或消除Fc区域的效应子功能。术语“表位”指能够被抗体所识别或者由抗体在抗体的抗原结合区的一个或多个处结合的分子的部分。表位通常由化学活性表面分组的分子（诸如氨基酸或糖侧链）组成并具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。如本文所用的术语“抗原表位”定义为多肽的部分，如本领域熟知的任何方法例如通过常规免疫测定所测定的，抗体可以特异性结合所述多肽的部分。“非线性表位”或“构象表位”包括抗原蛋白内特异性针对该表位的抗体所结合的非连续多肽（或氨基酸）。一旦确定抗原上的期望表位，就可以生成针对该表位的抗体，例如本文描述的技术。在开发方法过程中，抗体的生成和表征可以说明关于期望表位的信息。从该信息中，随后可以竞争性筛选结合相同表位的抗体。实现这一点的方法是进行竞争性和交叉竞争研究以发现彼此竞争或交叉竞争的抗体，例如竞争结合抗原的抗体。一种方法是鉴定抗体结合的表位，或“表位作图”。存在许多本领域中已知用于作图并表征蛋白上的表位的位置的方法，包括解析抗体-抗原复合体的晶体结构、竞争测定、基因片段表达测定和基于合成肽的测定，如例如描述于Harlow和Lane,UsingAntibodies,aLaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.,1999的第11章。在另外的实例中，可以使用表位作图来确定抗体结合的序列。表位作图可以从许多来源商业获得，例如PepscanSystems(Edelhertweg15,8219PHLelystad,TheNetherlands)。在另外的实例中，抗原结合域的诱变、结构域交换实验和丙氨酸扫描诱变可以进行来鉴定对于表位结合所需的、足够的和/或必需的残基。抗原结合域相互作用的结合亲和力和解离速率可以通过竞争性结合测定来进行测定。竞争性结合测定的一个实例为放射性免疫测定，其包括孵育经标记的抗原和检测结合至经标记的抗原的分子。本发明的分子对抗原的亲和力和结合解离速率可以从通过Scatchard分析的饱和度数据来确定。本发明的分子对抗原的亲和力和结合特性可以使用本领域已知的用于抗原结合域的体外测定（基于生物化学或免疫学的测定）来初步测定，所述体外测定包括但不限于酶联免疫吸附测定（ELISA）测定、表面等离子共振（SPR）测定、生物层干涉法或免疫沉淀测定。本发明的分子可以在体内模型（诸如本文描述和公开的那些）中具有与基于体外的模型中的那些相似的结合特性。然而，本发明不排除这样的本发明的分子，其在基于体外的测定中没有展示出期望的表型，但在体内展示出期望表型。如本文所用，术语“结合亲和力（KD）”旨在指具体抗体-抗原相互作用的解离速率。KD是解离速率（也称为“解离速率(off-rate(koff))”）与结合速率或“结合速率(on-rate(kon))”的比率。因此，KD等于koff/kon并表示为摩尔浓度（M）。其遵循KD越小，结合的亲和力越强。因此，1μM的KD相比于1nM的KD表示弱的结合亲和力。抗体的KD值可以使用本领域充分建立的方法来确定。用于确定抗体的KD的一种方法是通过使用表面等离子共振（SPR），其通常使用生物传感器系统诸如BIACORE®系统。BIAcore动力学分析包括分析抗原从其表面上具有固定的分子（例如，包含表位结合域的分子）的芯片上的结合和解离。用于测定抗体的KD的另一种方法通过使用生物层干涉法(Bio-LayerInterferometry)，通常使用OCTET®技术(OctetQKesystem,ForteBio)。如本文所用，术语“核酸”和“核苷酸序列”包括DNA分子（例如cDNA或基因组DNA）、RNA分子（例如mRNA）、DNA和RNA分子的组合或杂合DNA/RNA分子，和DNA或RNA分子的类似物。此类类似物可以使用例如核苷酸类似物来生成，其包括但不限于肌苷或三苯甲基化（tritylated）的碱基。此类类似物还可以包括含有经修饰的骨架的DNA或RNA分子，所述经修饰的骨架对分子提供有益属性诸如例如核酸酶抗性或穿过细胞膜的能力增加。核酸或核苷酸序列可以是单链的、双链的，可以包含单链和双链部分，且可以含有三链部分，但优选是双链DNA。本发明还包括编码本发明的双特异性异二聚化双抗体（包括多肽和抗体的结合区）的多核苷酸。编码本发明的分子的多核苷酸可以通过本领域已知的任何方法来获得，且多核苷酸的核苷酸序列可以通过本领域已知的任何方法来确定。编码本发明的双特异性异二聚化双抗体的多核苷酸可以包括以下：仅变体的编码序列、变体的编码序列和额外的编码序列诸如功能多肽、或信号或分泌序列或原蛋白序列；抗体的编码序列和非编码序列，诸如抗体编码序列的内含子或5'和/或3'的非编码序列。术语“编码双特异性异二聚化双抗体的多核苷酸”涵盖这样的多核苷酸，其包括变体的额外编码序列也包括含有额外编码和/或非编码序列的多核苷酸。本领域已知对于特定宿主细胞/表达系统优化的多核苷酸序列可以从期望蛋白的氨基酸序列容易地获得(参见GENEART®AG,Regensburg,Germany)。如本文所用，术语“癌症”指从异常的不受控生长的细胞产生的赘生物或肿瘤。在一些方面，癌症指良性肿瘤，其已经保持局部化。在另一方面，癌症指恶性肿瘤，其已经侵入并破坏邻近的身体结构且传播至远处部位。在一些方面，癌症与特异性癌抗原相关。如本文所用，“治疗有效量”指足以治疗或控制疾病或病症的治疗剂的量。治疗有效量可以指足以延迟疾病的发生或将其降至最低（例如延迟癌症的传播或将其降至最低）的治疗剂的量。治疗有效量还可以指在疾病的治疗或控制中提供治疗性益处的治疗剂的量。另外，关于本发明的治疗剂的治疗有效量意指单独的治疗剂的量、或与其他疗法组合的治疗剂的量，所述量在疾病的治疗或控制中提供治疗性益处。如本文所用，术语“（一种/多种）预防剂”指任何试剂，其可用于预防病症或预防病症的复发或传播。预防有效量可以指足以预防增生过多性疾病(hyperproliferativedisease)特别是癌症的复发或传播或者其在患者中的发生的量，所述患者包括但不限于对增生过多性疾病有倾向的患者，例如对癌症由遗传倾向或者之前暴露于致癌物质的患者。预防有效量还可以指在疾病的预防中提供预防性益处的预防剂的量。还，关于本发明的预防剂的预防有效量意指单独的预防剂的量、或与其他疗法组合的预防剂的量，所述量在疾病的预防中提供预防性益处。如本文所用，术语“预防（prevent、preventing和prevention）”指作为施用预防剂或治疗剂的结果，在个体中预防病症的一种或多种症状的复发或开始。如本文所用，术语“组合”指使用超过一种预防剂和/或治疗剂。使用术语“组合”不限制预防剂和/或治疗剂向患有病症的个体施用的次序。换言之，组合疗法可以通过分开地、顺序地或同时用治疗剂治疗来完成。本发明分子的重组表达一旦已经获得编码本发明的分子（即结合域）的核酸序列，则用于产生分子的载体可以通过重组DNA技术施用本领域熟知的技术来产生。编码本发明的双特异性异二聚化双抗体结合域的多核苷酸可以包括可操作连接至抗体编码序列的表达控制多核苷酸序列，包括本领域中已知的天然相关的启动子区或异源启动子区。表达控制序列可以是转化或转染真核宿主细胞的载体中的真核启动子系统，但也可以使用用于原核宿主的控制序列。一旦载体已经整合入合适的宿主细胞系中，则宿主细胞在适合于表达核苷酸序列且如期望地适合于收集和纯化抗体的条件下进行增殖。真核细胞系包括CHO细胞系、各种COS细胞系、HeLa细胞、骨髓瘤细胞系、转化的B细胞或人胚肾细胞系。双特异性异二聚化双抗体如之前所述，双特异性异二聚化双抗体指两种或多种多肽链或蛋白的复合体，其各自包含至少一个抗体VL或一个抗体VH结构域或其片段，其中两个抗体结合域均包含于单一多肽链内且其中各多肽链中的VL和VH结构域来自不同抗体。在具体方面中，双特异性异二聚化双抗体包括含有VL和VH结构域的多肽链的二聚体或四聚体。包含多聚化蛋白的各个多肽链可以通过链间二硫键共价连接至多聚体的至少一个其他肽上。本发明的双特异性异二聚化双抗体包含抗P-钙黏着蛋白（P-CAD）结合域，其利用双亲和力再靶向（Dual-AffinityRe-Targeting(DART®)）平台技术（美国专利申请公开号2007/0004909、2009/0060910和2010/0174053）共价连接至抗CD3（CD3）结合域。DART技术提供产生这样的分子的共价键，所述分子具有优异的稳定性、最优的重链和轻链配对和抗原识别。此外，最小的接头大小和容量（content）可以降低免疫原性的潜力。本发明的DART蛋白同时靶向T细胞（CD3）和肿瘤细胞（P-CAD）且成功地引导并活化T细胞细胞毒性至表达P-钙黏着蛋白的肿瘤细胞。双特异性异二聚化双抗体的每一多肽链包含VL和VH结构域，其可以共价连接（接头1）从而使得抗体结合域免于自装配。此外，每一多肽链包含异二聚化结构域，其促进多个多肽链的异二聚化并且降低不同多肽链的同二聚化的可能性。异二聚化结构域可以位于多肽链的N末端或C末端。异二聚化结构域可以包含半胱氨酸接头（接头2），其长度为1、2、3、4、5、6或更多个氨基酸残基。多肽链中的两个的相互作用可以产生两个VL/VH配对，形成两个表位结合域，即二价分子。VH或VL结构域均不限于多肽链内的任何位置，即限于氨基或羧基末端，并且结构域也不限于它们彼此的相对位置，即VL结构域可以在VH结构域的N末端，且反之亦然。唯一的限制是互补（complimentary）多肽链是可获得的以形成功能双抗体。当VL和VH结构域衍生自对不同抗原特异性的抗体时，功能性双特异性异二聚化双抗体的形成需要两种不同多肽链的相互作用，即形成异二聚体。相反，当两种不同多肽链自由相互作用，例如在重组表达细胞中，一个包含VLA和VHB（A为第一表位且B为第二表位）且另一个包含VLB和VHA时，两种不同的结合位点可以形成：VLA-VHA和VLB-VHB。对于所有双特异性异二聚化双抗体多肽链对，两条链的错误比对或错误结合是可能的，例如VL-VL或VH-VH结构域的相互作用。然而，基于正确二聚化的结合位点的免疫特异性使用本领域中已知或本文示例的基于任何亲和力的方法（例如亲和色谱）可以容易地进行功能性双特异性异二聚化双抗体的纯化。本发明的双特异性异二聚化双抗体可以同时结合两个分开且不同的表位。在某些方面，至少一个表位结合位点特异于在免疫效应细胞上表达的（例如在T淋巴细胞上表达的）CD3决定簇。在一方面，双特异性异二聚化双抗体分子结合效应细胞决定簇并还活化效应细胞。在一方面，表位结合域能够结合P-钙黏着蛋白相关抗原，所述抗原与乳腺癌、结肠直肠癌、卵巢癌、胃癌、甲状腺癌、前列腺癌、宫颈癌、胰腺癌、肺癌（包括但不限于非小细胞肺癌和小细胞肺癌）、膀胱癌、肝癌、子宫内膜癌、头颈癌、睾丸癌和成胶质细胞瘤相关。本发明的双特异性异二聚化双抗体包含通常衍生自免疫球蛋白或抗体的抗原结合域。用于本发明的方法的结合域衍生自的抗体可以来自任何动物来源，包括鸟类和哺乳动物（例如人、非人灵长类动物、鼠、驴、绵羊、兔、山羊、豚鼠、骆驼、马或鸡）。优选地，抗体是人或人源化单克隆抗体。如本文所用，“人”抗体包括具有人免疫球蛋白氨基酸序列的抗体并包括分离自人免疫球蛋白文库的或合成人免疫球蛋白编码序列的文库的或者分离自从人基因表达抗体的小鼠的抗体。本发明的双特异性异二聚化双抗体可以多种方式表征。具体而言，可以测定本发明的分子的免疫特异性结合抗原的能力。可以随后测定已经鉴定为免疫特异性结合抗原的分子它们对抗原的特异性和亲和力。本发明的双特异性异二聚化双抗体可以使用本领域中熟知的各种方法来产生，包括重新蛋白合成和编码结合蛋白的核酸的重组表达。所需的核酸序列可以通过重组方法（例如所需多核苷酸的早先制备的变体的PCR诱变）或通过固相DNA合成来产生。通常使用重组表达方法。在一方面，本发明提供包含编码抗CD3VH和/或VL的序列的多核苷酸；在另一方面，本发明提供包含编码抗P-钙黏着蛋白VH和/或VL的序列的多核苷酸。由于遗传密码的简并性，许多核酸序列编码每一免疫球蛋白氨基酸序列，且本发明包括编码本文所述的结合蛋白的所有核酸序列。接头/肽双特异性异二聚化双抗体的多肽链可以包含各种接头和肽。接头和肽可以是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或更多个氨基酸。在某些方面，双特异性异二聚化双抗体的多肽链可以包含甘氨酸-丝氨酸接头（接头1）。在另一方面，接头1可以包含但不限于序列GGGSGGGG(SEQIDNO:68)和GGGGSGGGG(SEQIDNO69)。在某些方面，双特异性异二聚化双抗体的多肽链可以包含半胱氨酸接头（接头2）。在另一方面，接头2还可以包含至少一个甘氨酸残基。在一方面，接头2可以包含但不限于选自以下的序列：GFNRGEC(SEQIDNO:70)、GVEPKSC(SEQIDNO:71)和GGCGGG(SEQIDNO:72)。在某些方面，接头2可以包含具有序列CPPCP(SEQIDNO60)和至少一个甘氨酸残基的截短的IgG1铰链区。在另一方面，接头2可以包含但不限于以下的序列：GCPPCP(SEQIDNO:73)、GGTGGCPPCP(SEQIDNO:74)、GEPKSSDKTHTCPPCP(SEQIDNO:75)和GGTGGGEPKSSDKTHTCPPCP(SEQIDNO:76)。在某些方面，双特异性异二聚化双抗体的多肽链可以包含接头3。在一方面，接头3可以包含但不限于序列KAPSSSPME(SEQIDNO77)。在某些方面，双特异性异二聚化双抗体的多肽链可以包含肽1。在某些方面，肽1可以包含具有序列CPPCP(SEQIDNO60)的截短的IgG1铰链区。在一方面，肽1可以包含但不限于序列DKTHTCPPCP(SEQIDNO96)。VF-DART在本发明的一个方面，如图2和3中所示的称为VF-DART的双特异性异二聚化双抗体包含第一多肽链（1）和第二多肽链（2）。在一方面，第一多肽链（1）可以包含：结构域1，其包含（i）包含抗P-钙黏着蛋白抗体的VL结合域（P-CADVL）或抗CD3抗体的VL结合域（CD3VL）的亚结构域1A，（ii）包含抗P-钙黏着蛋白抗体的VH结合域（P-CADVH）的亚结构域1B，如果此类亚结构域1A包含CD3VL，或包含抗CD3抗体的VH结合域（CD3VH）的亚结构域1B，如果亚结构域1A包含P-CADVL，并且亚结构域1A和亚结构域1B可以通过甘氨酸-丝氨酸接头（接头1）共价连接使得亚结构域1B和亚结构域1A不缔合以形成表位结合位点；并且可以包含含有在亚结构域1B上的半胱氨酸接头（接头2）的第一促异二聚体结构域。在另一方面，第一多肽链（1）可以包含：结构域1，其包含（i）包含P-CADVH或CD3VH的亚结构域1A，（ii）包含P-CADVL的亚结构域1B，如果亚结构域1A包含CD3VH，或包含CD3VL的亚结构域1B，如果亚结构域1A包含P-CADVH，亚结构域1A和亚结构域1B可以通过甘氨酸-丝氨酸接头（接头1）共价连接使得亚结构域1B和亚结构域1A不缔合以形成表位结合位点；并且可以包含含有在亚结构域1B上的半胱氨酸接头（接头2）的第一促异二聚体结构域。在一方面，第一多肽链（1）可以包含：结构域1，其包含（i）含有P-CADVL的亚结构域1A和（ii）含有CD3VH的亚结构域1B。在另一方面，第一多肽链（1）可以包含：结构域1，其包含（i）含有CD3VL的亚结构域1A和（ii）含有P-CADVH的亚结构域1B。在另外的方面，第一多肽链（1）可以包含：结构域1，其包含（i）含有P-CADVH的亚结构域1A和（ii）含有CD3VL的亚结构域1B。在另一方面，第一多肽链（1）可以包含：结构域1，其包含（i）含有CD3VH的亚结构域1A和（ii）含有P-CADVL的亚结构域1B。在一方面，第二多肽链（2）可以包含：结构域2，其包含（i）包含抗P-钙黏着蛋白抗体的VL结合域（P-CADVL）或抗CD3抗体的VL结合域（CD3VL）的亚结构域2B，这取决于对于亚结构域1A所选的VL结构域，（ii）包含抗P-钙黏着蛋白抗体的VH结合域（P-CADVH）的亚结构域2A，如果此类亚结构域2B包含CD3VL，或包含抗CD3抗体的VH结合域（CD3VH）的亚结构域2A，如果亚结构域2B包含P-CADVL，并且亚结构域2B和亚结构域2A可以通过甘氨酸-丝氨酸接头（接头1）共价连接使得亚结构域2B和亚结构域2A不缔合以形成表位结合位点；并且可以包含含有在亚结构域2A上的半胱氨酸接头（接头2）的第二促异二聚体结构域。在另一方面，第一多肽链（2）可以包含：结构域2，其包含（i）包含P-CADVH或CD3VH的亚结构域2B，（ii）包含P-CADVL的亚结构域2A，如果此类亚结构域2B包含CD3VH，或包含CD3VL的亚结构域2A，如果此类亚结构域2B包含P-CADVH，并且亚结构域2B和亚结构域2A可以通过甘氨酸-丝氨酸接头（接头1）共价连接使得亚结构域2B和亚结构域2A不缔合以形成表位结合位点；并且可以包含含有在亚结构域2A上的半胱氨酸接头（接头2）的第二促异二聚体结构域。在一方面，第二多肽链（2）可以包含：结构域2，其包含（i）含有P-CADVL的亚结构域2B和（ii）含有CD3VH的亚结构域2A。在另一方面，第二多肽链（2）可以包含：结构域2，其包含（i）含有CD3VL的亚结构域2B和（ii）含有P-CADVH的亚结构域2A。在还的方面，第二多肽链（2）可以包含：结构域2，其包含（i）含有P-CADVH的亚结构域2B和（ii）含有CD3VL的亚结构域2A。在另一方面，第二多肽链（2）可以包含：结构域2，其包含（i）含有CD3VH的亚结构域2B和（ii）含有P-CADVL的亚结构域2A。在VF-DART的另一方面，亚结构域1A和亚结构域2A可以缔合以形成第一结合位点，其具有VL/VH结合域并结合CD3或P-钙黏着蛋白上的表位，且亚结构域1B和亚结构域2B可以缔合以形成第二结合位点，其具有VL/VH结合域并结合P-钙黏着蛋白或CD3上的表位。第一多肽链（1）和第二多肽链（2）可以彼此共价键合，例如在位于第一和第二促异二聚体结构域内的半胱氨酸残基处。在一方面，第一促异二聚化结构域的接头2中的半胱氨酸残基和第二促异二聚体结构域的接头2中的半胱氨酸残基可以通过至少一个二硫键连接。在本发明的一个方面，CD3VL可以包含SEQIDNO:48的序列且CD3VH可以为选自SEQIDNO:47和89的序列。在另一方面，P-CADVL可以为选自SEQIDNO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21和23的序列且P-CADVH可以为选自SEQIDNO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22和24的序列。在一个方面，甘氨酸-丝氨酸接头（接头1）可以包含选自GGGSGGGG(SEQIDNO:68)和GGGGSGGGG(SEQIDNO69)的序列。在本发明的一个方面，第一促异二聚体结构域的半胱氨酸接头（接头1）可以包含GFNRGEC(SEQIDNO:70)的序列且第二促异二聚体结构域的半胱氨酸接头（接头2）可以包含GVEPKSC(SEQIDNO:71)的序列。在本发明的另一个方面，第一促异二聚体结构域的半胱氨酸接头（接头1）可以包含GVEPKSC(SEQIDNO:71)的序列且第二促异二聚体结构域的半胱氨酸接头（接头2）可以包含GFNRGEC(SEQIDNO:70)的序列。图30A和30B中提供了具有本文所述的各种P-钙黏着蛋白和CD3抗体的VF-DART蛋白的第一和第二多肽链的序列。含有E/K卷曲区的EK-DART双特异性异二聚化双抗体的两个不同的多肽链的异二聚体形成也可以通过使用对相对成员具有亲和力且对自身排斥的结构域来促成。此类结构域的一个实例是卷曲螺旋结构域。例如，第一多肽链（1）可以包含具有谷氨酸富集区（其形成带负电荷的α螺旋卷曲（E卷曲））的第一促异二聚体结构域，而第二多肽链（2）可以包含具有赖氨酸富集区（其形成带正电荷的螺旋卷曲（K卷曲））的第二促异二聚体结构域，这使得静电相互作用能够促进异二聚体形成。同二聚体的形成可能减少，因为E卷曲将对另一含有E卷曲的多肽具有排斥力且对于K卷曲而言反之亦然。在本发明的一个方面，如图4中所示的称为EK-DART的双特异性异二聚化双抗体包含第一多肽链（1）和第二多肽链（2）。在一方面，第一多肽链（1）可以包含：结构域1，其包含（i）包含抗P-钙黏着蛋白抗体的VL结合域（P-CADVL）或抗CD3抗体的VL结合域（CD3VL）的亚结构域1A，（ii）包含抗P-钙黏着蛋白抗体的VH结合域（P-CADVH）的亚结构域1B，如果亚结构域1A包含CD3VL，或包含抗CD3抗体的VH结合域（CD3VH）的亚结构域1B，如果亚结构域1A包含P-CADVL，并且亚结构域1A和亚结构域1B可以通过甘氨酸-丝氨酸接头（接头1）共价连接使得亚结构域1A和亚结构域1B不缔合以形成表位结合位点；并且可以包含含有（i）在亚结构域1B上的半胱氨酸接头（接头2）和（ii）共价连接至接头2的E卷曲区的第一促异二聚体结构域。在另一方面，第一多肽链（1）可以包含：结构域1，其包含（i）包含P-CADVH或CD3VH的亚结构域1A，（ii）包含P-CADVL的亚结构域1B，如果亚结构域1A包含CD3VH，或包含CD3VL的亚结构域1B，如果亚结构域1A包含P-CADVH，并且亚结构域1A和亚结构域1B可以通过甘氨酸-丝氨酸接头（接头1）共价连接使得亚结构域1A和亚结构域1B不缔合以形成表位结合位点；并且可以包含含有（i）在亚结构域1B上的半胱氨酸接头（接头2）和共价连接至接头2的E卷曲区的第一促异二聚体结构域。在一方面，第一多肽链（1）可以包含：结构域1，其包含（i）含有P-CADVL的亚结构域1A和（ii）含有CD3VH的亚结构域1B。在另一方面，第一多肽链（1）可以包含：结构域1，其包含（i）含有CD3VL的亚结构域1A和（ii）含有P-CADVH的亚结构域1B。在还的方面，第一多肽链（1）可以包含：结构域1，其包含（i）含有P-CADVH的亚结构域1A和（ii）含有CD3VL的亚结构域1B。在另一方面，第一多肽链（1）可以包含：结构域1，其包含（i）含有CD3VH的亚结构域1A和（ii）含有P-CADVL的亚结构域1B。在一方面，第二多肽链（2）可以包含：结构域2，其包含（i）包含抗P-钙黏着蛋白抗体的VL结合域（P-CADVL）或抗CD3抗体的VL结合域（CD3VL）的亚结构域2B，这取决于对于亚结构域1A所选的VL结构域，（ii）包含抗P-钙黏着蛋白抗体的VH结合域（P-CADVH）的亚结构域2A，如果亚结构域2B包含CD3VL，或包含抗CD3抗体的VH结合域（CD3VH）的亚结构域2B，如果亚结构域2B包含P-CADVL，并且亚结构域2B和亚结构域2A可以通过甘氨酸-丝氨酸接头（接头1）共价连接使得亚结构域2B和亚结构域2A不缔合以形成表位结合位点；并且可以包含含有（i）在亚结构域2A上的半胱氨酸接头（接头2）和（ii）共价连接至接头2的K卷曲区的第二促异二聚体结构域。在另一方面，第二多肽链（2）可以包含：结构域2，其包含（i）包含P-CADVH或CD3VH的亚结构域2B，（ii）包含P-CADVL的亚结构域2A，如果亚结构域2B包含CD3VH，或包含CD3VL的亚结构域2B，如果亚结构域2B包含P-CADVH，并且亚结构域2B和亚结构域2A可以通过甘氨酸-丝氨酸接头（接头1）共价连接使得亚结构域2B和亚结构域2A不缔合以形成表位结合位点；并且可以包含含有（i）在亚结构域2A上的半胱氨酸接头（接头2）和共价连接至接头2的K卷曲区的第二促异二聚体结构域。在一方面，第二多肽链（2）可以包含：结构域2，其包含（i）含有P-CADVL的亚结构域2B和（ii）含有CD3VH的亚结构域2A。在另一方面，第二多肽链（2）可以包含：结构域2，其包含（i）含有CD3VL的亚结构域2B和（ii）含有P-CADVH的亚结构域2A。在还的方面，第二多肽链（2）可以包含：结构域2，其包含（i）含有P-CADVH的亚结构域2B和（ii）含有CD3VL的亚结构域2A。在另一方面，第二多肽链（2）可以包含：结构域2，其包含（i）含有CD3VH的亚结构域2B和（ii）含有P-CADVL的亚结构域2A。在EK-DART的另一方面，亚结构域1A和亚结构域2A可以缔合以形成第一结合位点，其具有VL/VH结合域区并结合CD3或P-钙黏着蛋白上的表位，且亚结构域1B和亚结构域2B可以缔合以形成第二结合位点，其具有VL/VH结合域区并结合P-钙黏着蛋白或CD3上的表位。第一多肽链（1）和第二多肽链（2）可以彼此共价键合，例如在位于第一和第二促异二聚体结构域内的半胱氨酸残基处。在一方面，第一促异二聚化结构域的接头2中的半胱氨酸残基和第二促异二聚体结构域的接头2中的半胱氨酸残基可以通过至少一个二硫键连接。在本发明的一个方面，CD3VL可以包含SEQIDNO:48的序列且CD3VH可以为选自SEQIDNO:47和89的序列。在另一方面，P-CADVL可以为选自SEQIDNO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21和23的序列且P-CADVH可以为选自SEQIDNO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22和24的序列。在一个方面，甘氨酸-丝氨酸接头（接头1）可以包含选自GGGSGGGG(SEQIDNO:68)和GGGGSGGGG(SEQIDNO69)的序列。在本发明的一个方面，第一促异二聚体结构域和第二促异二聚体结构域的半胱氨酸接头（接头2）可以包含GGCGGG(SEQIDNO:72)的序列。在一方面，第一促异二聚体结构域还包含含有序列EVAALEKEVAALEKEVAALEKEVAALEK(SEQIDNO:61)的谷氨酸富集区域（E卷曲）。在另一方面，第二促异二聚体结构域还包含含有序列KVAALKEKVAALKEKVAALKEKVAALKE(SEQIDNO:62)的赖氨酸富集区域（K卷曲）。表1以及图31A和31B提供具有本文所述的各种P-钙黏着蛋白和CD3抗体的EK-DART蛋白的第一和第二多肽链的序列。表1.EK-DART蛋白的第一和第二多肽链的序列。包含Fc区或其部分的双特异性异二聚化双抗体本发明涵盖包含Fc区或结构域或其部分的双特异性异二聚化双抗体。在某些方面，Fc区或其部分包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的Fc区的一个或多个恒定域（例如CH2或CH3结构域）。在其它方面，本发明涵盖包含Fc区或其部分的分子，其中Fc区或其部分包含相对于相当的野生型Fc区或其部分的至少一个氨基酸修饰（例如取代）。变体Fc区是本领域中熟知的，且主要用于改变包含变体Fc区的抗体的表型，如在本领域中熟知的任何结合活性或效应子功能测定（例如ELISA、SPR分析或ADCC）中所测定的。此类变体Fc区或其部分可以延长由包含Fc区或其部分的本发明的双抗体分子所展示出的血浆半衰期和稳定性。在其他方面，本发明涵盖使用本领域中已知的任何Fc变体。在某些方面，对于Fc区的氨基酸的一个或多个修饰降低Fc区的亲和力和抗体亲抗原性，并因此，降低本发明的双抗体分子对于一种或多种FcγR受体的亲和力和抗体亲抗原性。在一个特定方面，本发明涵盖包含变体Fc区或其部分的双抗体，其中所述变体Fc区包含相对于野生型Fc区的至少一个氨基酸修饰，所述变体Fc区仅结合一个FcγR，其中所述FcγR是FcγRIIIA。在另一个特定方面，本发明涵盖包含变体Fc区或其部分的双抗体，其中所述变体Fc区包含相对于野生型Fc区的至少一个氨基酸修饰，所述变体Fc区仅结合一个FcγR，其中所述FcγR是FcγRIIA。在另一个特定方面，本发明涵盖包含变体Fc区或其部分的双抗体，其中所述变体Fc区包含相对于野生型Fc区的至少一个氨基酸修饰，所述变体Fc区仅结合一个FcγR，其中所述FcγR是FcγRIIB。在某些方面，本发明涵盖包含变体Fc区的分子，其中相对于不包含Fc区或包含野生型Fc区的分子，变体赋予或介导降低的ADCC活性（或其他效应子功能）和/或增加的对FcγRIIB(CD32B)的结合，如使用本领域技术人员已知和本文所述的方法所测量的。本发明还涵盖使用包含来自两种或更多种IgG同种型的结构域或区域的Fc区。如本领域中已知，Fc区的氨基酸修饰可以很大程度影响Fc介导的效应子功能和/或结合活性。然而，当在所选的IgG同种型范围内实施时，功能特征中的这些改变可以进一步改善和/或操纵。类似地，同种型Fc的天然特征可以通过一个或多个氨基酸修饰来操纵。由于其铰链区和/或Fc区的氨基酸序列中的差异，多种IgG同种型（即IgG1、IgG2、IgG3和IgG4）展示出不同的物理和功能特性，包括血清半衰期、补体结合、FcγR结合亲和力和效应子功能活性（例如ADCC、CDC）。在某些方面，氨基酸修饰和IgGFc区基于其单独的结合和/或效应子功能活性而独立地选择以将双抗体工程化而具有期望的特征。在大多数方面，氨基酸修饰和IgG铰链区/Fc区已分别测定在IgG1的上下文中如本文所述的或本领域已知的结合和/或效应子功能活性。在某些方面，氨基酸修饰和IgG铰链/Fc区在双抗体分子或其他含Fc分子（例如和免疫球蛋白）的上下文中展示出相似的功能性，例如降低的ADCC活性（或其他效应子功能）和/或增加的对FcγRIIB的结合。在其他方面，本发明涵盖具有新特性的变体Fc区，其包含本领域中已知的氨基酸修饰与所选IgG区的组合，当如本文所述独立测定所述修饰和/或区域时，所述特性是不可检测到的。LP-DART在本发明的一个方面，具有Fc区的双特异性异二聚化双抗体，称为LP-DART，显示于图1和5中。LP-DART可以由结合靶抗原和CD3的两个scFv结构域构成，其融合至IgG的Fc结构域。在本发明的一个方面，双特异性异二聚化双抗体可以由结合P-钙黏着蛋白和CD3ε的两个scFv结构域构成，其融合至IgG1的Fc结构域。具体而言，图1A和1B显示抗P-钙黏着蛋白/抗人CD3LP-DART的四个可选代表，且图5显示装配的LP-DART的一般图示。LP-DART类似于上文所述VF-DART或EK-DART的结构，不同之处在于第一和第二促异二聚体结构域包含具有免疫球蛋白Fc区的CH2和/或CH3结构域的免疫球蛋白Fc区，其中所述CH2和/或CH3结构域已进行改变以包含钮（凸起）或扣（腔）。对于LP-DART的Fc部分的修饰描述于下文。在本发明的一个方面，如图1A、1B和5中所示，LP-DART双特异性异二聚化双抗体包含第一多肽链（1）和第二多肽链（2）。在一方面，第一多肽链（1）可以包含：结构域1，其包含（i）包含抗P-钙黏着蛋白抗体的VL结合域（P-CADVL）或抗CD3抗体的VL结合域（CD3VL）的亚结构域1A，（ii）包含抗P-钙黏着蛋白抗体的VH结合域（P-CADVH）的亚结构域1B，如果此类亚结构域1A包含CD3VL，或包含抗CD3抗体的VH结合域（CD3VH）的亚结构域1B，如果此类亚结构域1A包含P-CADVL，并且亚结构域1A和亚结构域1B可以通过甘氨酸-丝氨酸接头（接头1）共价连接使得亚结构域1A和亚结构域1B不缔合以形成表位结合位点；并且可以包含含有（i）在亚结构域1B上的半胱氨酸接头（接头2）和（ii）具有经改变以包含钮Fc链（凸起）或扣Fc链（腔）的CH2和/或CH3结构域且共价连接至接头2的Fc区的第一促异二聚体结构域。在另一方面，第一多肽链（1）可以包含：结构域1，其包含（i）包含P-CADVH或CD3VH的亚结构域1A，（ii）包含P-CADVL的亚结构域1B，如果此类亚结构域1A包含CD3VH，或包含CD3VL的亚结构域1B，如果此类亚结构域1A包含P-CADVH，并且亚结构域1A和亚结构域1B可以通过甘氨酸-丝氨酸接头（接头1）共价连接使得亚结构域1A和亚结构域1B不缔合以形成表位结合位点；并且可以包含含有（i）在亚结构域1B上的半胱氨酸接头（接头2）和（ii）具有经改变以包含钮Fc链（凸起）或扣Fc链（腔）的CH2和/或CH3结构域且共价连接至接头2的Fc区的第一促异二聚体结构域。在一方面，第一多肽链（1）可以包含：结构域1，其包含（i）含有P-CADVL的亚结构域1A和（ii）含有CD3VH的亚结构域1B。在另一方面，第一多肽链（1）可以包含：结构域1，其包含（i）含有CD3VL的亚结构域1A和（ii）含有P-CADVH的亚结构域1B。在另外的方面，第一多肽链（1）可以包含：结构域1，其包含（i）含有P-CADVH的亚结构域1A和（ii）含有CD3VL的亚结构域1B。在另一方面，第一多肽链（1）可以包含：结构域1，其包含（i）含有CD3VH的亚结构域1A和（ii）含有P-CADVL的亚结构域1B。在一方面，第二多肽链（2）可以包含：结构域2，其包含（i）包含抗P-钙黏着蛋白抗体的VL结合域（P-CADVL）或抗CD3抗体的VL结合域（CD3VL）的亚结构域2B，这取决于对于亚结构域1A所选的VL结构域，（ii）包含抗P-钙黏着蛋白抗体的VH结合域（P-CADVH）的亚结构域2A，如果此类亚结构域2B包含CD3VL，或包含抗CD3抗体的VH结合域（CD3VH）的亚结构域2A，如果此类亚结构域2B包含P-CADVL，并且亚结构域2B和亚结构域2A可以通过甘氨酸-丝氨酸接头（接头1）共价连接使得亚结构域2B和亚结构域2A不缔合以形成表位结合位点；并且可以包含含有（i）在亚结构域2A上的半胱氨酸接头（接头2）和（ii）具有经改变以包含钮Fc链（凸起）（如果此类第一异二聚体区包含扣Fc链（腔））或扣Fc链（腔）（如果此类第一异二聚体区包含钮Fc链（凸起））的CH2和/或CH3结构域且共价连接至接头2的Fc区的第二促异二聚体结构域。在另一方面，第二多肽链（2）可以包含：结构域2，其包含（i）包含P-CADVH或CD3VH的亚结构域2B，（ii）包含P-CADVL的亚结构域2A，如果此类亚结构域2B包含CD3VH，或包含CD3VL的亚结构域2A，如果此类亚结构域2B包含P-CADVH，并且亚结构域2B和亚结构域2A可以通过甘氨酸-丝氨酸接头（接头1）共价连接使得亚结构域2B和亚结构域2A不缔合以形成表位结合位点；并且可以包含含有（i）在亚结构域2A上的半胱氨酸接头（接头2）和（ii）具有经改变以包含钮Fc链（凸起）（如果此类第一异二聚体区包含扣Fc链（腔））或扣Fc链（腔）（如果此类第一异二聚体区包含钮Fc链（凸起））的CH2和/或CH3结构域且共价连接至接头2的Fc区的第二促异二聚体结构域。在一方面，第二多肽链（2）可以包含：结构域2，其包含（i）含有P-CADVL的亚结构域2B和（ii）含有CD3VH的亚结构域2A。在另一方面，第二多肽链（2）可以包含：结构域2，其包含（i）含有CD3VL的亚结构域2B和（ii）含有P-CADVH的亚结构域2A。在另外的方面，第二多肽链（2）可以包含：结构域2，其包含（i）含有P-CADVH的亚结构域2B和（ii）含有CD3VL的亚结构域2A。在另一方面，第二多肽链（2）可以包含：结构域2，其包含（i）含有CD3VH的亚结构域2B和（ii）含有P-CADVL的亚结构域2A。在LP-DART的另一方面，亚结构域1A和亚结构域2A可以缔合以形成第一结合位点，其具有VL/VH结合域区并结合CD3或P-钙黏着蛋白上的表位，且亚结构域1B和亚结构域2B可以缔合以形成第二结合位点，其具有VL/VH结合域区并结合P-钙黏着蛋白或CD3上的表位。第一多肽链（1）和第二多肽链（2）可以彼此共价键合，例如在位于第一和第二促异二聚体结构域内的半胱氨酸残基处。在一方面，第一促异二聚化结构域的接头2中的半胱氨酸残基和第二促异二聚体结构域的接头2中的半胱氨酸残基可以通过至少一个二硫键连接。在本发明的一个方面，CD3VL可以包含SEQIDNO:48的序列且CD3VH可以为选自SEQIDNO:47和89的序列。在另一方面，P-CADVL可以为选自SEQIDNO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21和23的序列且P-CADVH可以为选自SEQIDNO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22和24的序列。在一个方面，甘氨酸-丝氨酸接头（接头1）可以包含选自GGGSGGGG(SEQIDNO:68)和GGGGSGGGG(SEQIDNO69)的序列。在本发明的另一方面，半胱氨酸接头（接头2）可以包含具有序列CPPCP(SEQIDNO60)和铰链区前的至少一个甘氨酸残基的截短的IgG1铰链区。在一方面，接头2可以包含选自以下的序列：GCPPCP(SEQIDNO:73)、GGTGGCPPCP(SEQIDNO74)、GEPKSSDKTHTCPPCP(SEQIDNO75)和GGTGGGEPKSSDKTHTCPPCP(SEQIDNO76)。在一方面，第一促异二聚体结构域可以包含具有CH2和/或CH3结构域的Fc区，所述CH2和/或CH3结构域经改变以包含含有SEQIDNO:63的序列的钮Fc链（凸起）或含有SEQIDNO:64的序列的扣Fc链（腔）。在另一方面，第二促异二聚体结构域可以包含具有CH2和/或CH3结构域的Fc区，所述CH2和/或CH3结构域经改变以包含含有SEQIDNO:63的序列的钮Fc链（凸起）（如果此类第一异二聚体区包含扣Fc区（腔））或含有SEQIDNO:64的序列的扣Fc链（腔）（如果此类第一异二聚体区包含钮Fc链（凸起））。表2和图32A和32B提供具有本文所述的各种P-钙黏着蛋白和CD3抗体的LP-DART蛋白的第一和第二多肽链的氨基酸序列。SEQIDNO117-124提供对应的核苷酸序列，在括号中引用。表2.LP-DART蛋白的第一和第二多肽链的序列。人IgG1CH2-CH3中的效应子无效突变以及去除C末端Lys将人IgG1的Fc区修饰以去除C末端赖氨酸残基（其通常在翻译后切割），以及使用标准引物指导的PCR诱变引入突变L234A、L235A和G237A，以消除(oblate)由于结合FcγRIII而引起的效应子功能（效应子无效表型）。人IgG1CH2-CH3中的钮扣突变“钮扣”是本领域中已知的用于工程化抗体重链同二聚体以异二聚化的有效设计策略。在该方法中，通过用较大的氨基酸替换IgG1的Fc区的一条链中的小的氨基酸例如Y349C和T366W来获得“钮”变体。将“钮”设计为插入到Fc区的互补链的CH3结构域中的“扣”中，所述“扣”通过用较小的氨基酸替换大的残基例如S354C、T366S、L368A和Y407V来产生。钮扣命名类似于凸起和腔命名且可以互换使用。“凸起”或“钮”指这样的至少一个氨基酸侧链，其从第一多肽的界面上伸出且因此可置于邻近界面（即第二多肽的界面）中的互补腔中，以稳定异二聚体，并从而例如相比形成同二聚体更偏向形成异二聚体。凸起可以存在于原始界面中或者可以合成引入（例如通过改变编码界面的核酸）。一般地，编码第一多肽界面的核酸经改变以编码凸起。为了实现这一点，将第一多肽的界面中编码至少一个“原始”氨基酸残基的核酸用编码至少一个“输入”氨基酸（其比原始氨基酸残基具有更大的侧链体积）的核酸替换。被替换的原始残基数目的上限是第一多肽界面中的残基总数。用于形成凸起的某些输入残基一般是天然存在的氨基酸残基且优选自精氨酸（R）、苯丙氨酸（F）、酪氨酸（Y）和色氨酸（W）。“腔”或“扣”指至少一个氨基酸侧链，其从第二多肽的界面凹进去并因此可容纳第一多肽的相邻界面上的相应凸起。腔可以存在于原始界面中或者可以合成引入（例如通过改变编码界面的核酸）。一般地，编码第二多肽界面的核酸经改变以编码腔。为了实现这一点，将第二多肽的界面中编码至少一个“原始”氨基酸残基的核酸用编码至少一个“输入”氨基酸（其比原始氨基酸残基具有更小的侧链体积）的DNA替换。被替换的原始残基数目的上限是第二多肽界面中的残基总数。用于形成腔的某些输入残基一般是天然存在的氨基酸残基且优选自丙氨酸（A）、丝氨酸（S）、苏氨酸（T）和缬氨酸（V）。“原始”氨基酸残基是由可以比原始残基具有更小或更大的侧链体积的“输入”残基所替换的氨基酸残基。输入氨基酸残基可以是天然存在的或非天然存在的氨基酸残基，但优选前者。“天然存在的”氨基酸残基是由遗传密码所编码的那些残基。“非天然存在的”氨基酸残基意指这样的残基，其不是由遗传密码所编码，但其能够共价结合多肽链中的邻近氨基酸残基。非天然存在的氨基酸残基的实例是正亮氨酸、鸟氨酸、正缬氨酸、高丝氨酸及其他氨基酸残基类似物，诸如描述于例如Ellman等人,Meth.Enzym.202:301-336(1991)中的那些。本发明的方法涉及替换至少一个原始氨基酸残基，但也可以替换不止一个原始残基。一般地，可以包含不超过第一或第二多肽的界面中的所有残基的被替换的原始氨基酸残基。凸起或钮“可置于”腔或扣中意指凸起和腔分别在第一多肽和第二多肽的界面上的空间位置以及凸起和腔的大小是这样的，使得凸起可以位于腔中而不会显著影响第一和第二多肽在界面处的正常缔合。由于凸起诸如Tyr、Phe和Trp一般不会从界面的轴垂直延伸，因此凸起与相应腔的比对依赖于基于诸如通过X射线晶体学或核磁共振（NMR）获得的三维结构对凸起/腔对进行建模。这可以使用本领域中广泛接受的技术来实现。因此，为了利于所得Fc区的异二聚化，引入互补突变使得每一Fc链将携带一组突变，对于钮（或凸起）Fc链(SEQIDNO:63)为Y349C和T366W，或者对于扣（或腔）Fc链(SEQIDNO:64)为S354C、T366S、L368A和Y407V，如表3中所提供。当共转染至合适的哺乳动物宿主中时，编码SEQIDNO:63和64的氨基酸序列的DNA生成主要为双特异性异二聚化且具有与一个扣（或腔）Fc链缔合的一个钮（或凸起）Fc链的Fc区。表3.Fc区的序列。使用重叠引物延伸PCR，引入5'BspEI限制性酶识别序列TCCGGA(SEQIDNO67)用于将钮（凸起）和扣（腔）Fc链亚克隆至含有3'BspEI位点的每一DART链中。该限制性位点编码在DART-Fc连接处框内插入氨基酸丝氨酸和甘氨酸（ser-gly）。抗P-钙黏着蛋白/抗CD3LP-DART蛋白如实施例6中所述进行构建。本发明的抗P-钙黏着蛋白/抗CD3LP-DART蛋白在热稳定性研究中针对聚集是稳定的且是靶向人CD3和P-钙黏着蛋白的有效双特异性双抗体Fc融合体。钮扣Fc结构域允许在CHO细胞中改善的表达和改善的纯化，产生高纯度的所需异二聚体。Fc结构域内工程化的突变消除了FcƴR结合因而潜在地避免ADCC介导的T细胞消耗。另外，相比于临床上批准的单克隆抗体，Fc结构域并入DART蛋白增强了分子的稳定性，如通过差示扫描量热法（DSC）和受迫聚集测定（forcedaggregationassay）所证明的。另外，Fc结构域改善了药代动力学概况。MP3DART图6和7分别是N末端MP3-DART和C末端MP3-DART双特异性异二聚化双抗体的示意图。此类MP3-DART蛋白由三条多肽链构成：第一多肽链（1）、第二多肽链（2）和第三多肽链（3）。在本发明的一方面，如图6中所示的N末端MP3-DART在N末端至C末端方向可以包含第一多肽链（1），其包含：结构域1，其包含（i）包含抗P-钙黏着蛋白抗体的VL结合域（P-CADVL）或抗CD3抗体的VL结合域（CD3VL）的亚结构域1A，（ii）包含抗P-钙黏着蛋白抗体的VH结合域（P-CADVH）的亚结构域1B，如果此类亚结构域1A包含CD3VL，或包含抗CD3抗体的VH结合域（CD3VH）的亚结构域1B，如果此类亚结构域1A包含P-CADVL，并且亚结构域1A和亚结构域1B可以通过甘氨酸-丝氨酸接头（接头1）共价连接使得亚结构域1A和亚结构域1B不缔合以形成表位结合位点；并且可以包含含有（i）在亚结构域1B上的半胱氨酸接头（接头2）、（ii）在接头2上的半胱氨酸肽1和（iii）具有共价连接至肽1的IgG1结构域的CH2和/或CH3结构域的Fc区的第一促异二聚体结构域。在本发明的另一方面，如图7中所示的C末端MP3-DART在N末端至C末端方向可以包含：第一多肽链（1），其包含：第一促异二聚体结构域，所述第一促异二聚体结构域包含（i）半胱氨酸肽1、（ii）具有IgG1Fc结构域的CH2和/或CH3结构域的Fc区和（iii）Fc区上的接头3；和结构域1，其包含：（i）包含抗P-钙黏着蛋白抗体的VL结合域（P-CADVL）或抗CD3抗体的VL结合域（CD3VL）的亚结构域1A，（ii）包含抗P-钙黏着蛋白抗体的VH结合域（P-CADVH）的亚结构域1B，如果此类亚结构域1A包含CD3VL，或包含抗CD3抗体的VH结合域（CD3VH）的亚结构域1B，如果此类亚结构域1A包含P-CADVL，并且亚结构域1A和亚结构域1B可以通过甘氨酸-丝氨酸接头（接头1）共价连接使得亚结构域1A和亚结构域1B不缔合以形成表位结合位点，和（iv）亚结构域1B上的半胱氨酸接头（接头2）。在另一方面，N末端MP3-DART或C末端MP3-DART的第一多肽链（1）可以包含：结构域1，其包含（i）包含P-CADVH或CD3VH的亚结构域1A，（ii）包含P-CADVL的亚结构域1B，如果此亚结构域1A包含CD3VH，或包含CD3VL的亚结构域1B，如果此亚结构域1A包含P-CADVH。在一方面，N末端MP3-DART或C末端MP3-DART的第一多肽链（1）可以包含：结构域1，其包含（i）含有P-CADVL的亚结构域1A和（ii）具有CD3VH的亚结构域1B。在另一方面，第一多肽链（1）可以包含：结构域1，其包含（i）含有CD3VL的亚结构域1A和（ii）含有P-CADVH的亚结构域1B。在另外的方面，第一多肽链（1）可以包含：结构域1，其包含（i）含有P-CADVH的亚结构域1A和（ii）含有CD3VL的亚结构域1B。在另一方面，第一多肽链（1）可以包含：结构域1，其包含（i）具有CD3VH的亚结构域1A和（ii）含有P-CADVL的亚结构域1B。在一方面，N末端MP3-DART或C末端MP3-DART的第二多肽链（2）可以包含：结构域2，其包含（i）包含抗P-钙黏着蛋白抗体的VL结合域（P-CADVL）或抗CD3抗体的VL结合域（CD3VL）的亚结构域2B，这取决于对于MP3-DART的第一多肽链所选的VL结构域，（ii）包含抗P-钙黏着蛋白抗体的VH结合域（P-CADVH）的亚结构域2A，如果此类亚结构域2B包含CD3VL，或包含抗CD3抗体的VH结合域（CD3VH）的亚结构域2A，如果此类亚结构域2B包含P-CADVL，并且亚结构域2B和亚结构域2A可以通过甘氨酸-丝氨酸接头（接头1）共价连接使得亚结构域2B和亚结构域2A不缔合以形成表位结合位点；并且可以包含含有在亚结构域2A上的半胱氨酸接头（接头2）的第二促异二聚体结构域。在另一方面，第二多肽链（2）可以包含：结构域2，其包含（i）包含P-CADVH或CD3VH的亚结构域2B，（ii）包含P-CADVL的亚结构域2A，如果此亚结构域2B包含CD3VH，或包含CD3VL的亚结构域2A，如果此亚结构域2B包含P-CADVH。在一方面，第二多肽链（2）可以包含：结构域2，其包含（i）含有P-CADVL的亚结构域2B和（ii）具有CD3VH的亚结构域2A。在另一方面，第二多肽链（2）可以包含：结构域2，其包含（i）含有CD3VL的亚结构域2B和（ii）含有P-CADVH的亚结构域2A。在另外的方面，第二多肽链（2）可以包含：结构域2，其包含（i）含有P-CADVH的亚结构域2B和（ii）含有CD3VL的亚结构域2A。在另一方面，第二多肽链（2）可以包含：结构域2，其包含（i）含有CD3VH的亚结构域2B和（ii）含有P-CADVL的亚结构域2A。在一方面，N末端MP3-DART或C末端MP3-DART的第三多肽链（3）在N末端至C末端方向上可以包含：第三促异二聚体结构域，其包含（i）半胱氨酸肽1和（ii）具有IgGFc结构域的CH2和/或CH3结构域的Fc区。在本发明的另一方面，亚结构域1A和亚结构域2A可以缔合以形成第一结合位点，其具有VL/VH区并结合CD3或P-钙黏着蛋白上的表位，且亚结构域1B和亚结构域2B可以缔合以形成第二结合位点，其具有VL/VH区并结合P-钙黏着蛋白或CD3上的表位。第一多肽链（1）和第二多肽链（2）可以彼此共价键合，例如在位于第一和第二促异二聚体结构域内的半胱氨酸残基处。在一方面，第一促异二聚化结构域的接头2中的半胱氨酸残基和第二促异二聚体区的接头2中的半胱氨酸残基可以通过至少一个二硫键连接。第一多肽链（1）的第一促异二聚体结构域和第三多肽链（3）的第三促异二聚体结构域可以彼此缔合以形成免疫球蛋白Fc区。第一多肽链（1）和第三多肽链（3）可以彼此共价键合，例如在位于第一和第三促异二聚体结构域内的半胱氨酸残基处。在另一方面，第一促异二聚化结构域的肽1中的半胱氨酸残基和第三促异二聚体结构域的肽1中的半胱氨酸残基可以通过至少一个二硫键连接。在本发明的一个方面，CD3VL可以包含SEQIDNO:48的序列且CD3VH可以为选自SEQIDNO:47和89的序列。在另一方面，P-CADVL可以为选自SEQIDNO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21和23的序列且P-CADVH可以为选自SEQIDNO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22和24的序列。在一个方面，甘氨酸-丝氨酸接头（接头1）可以包含选自GGGSGGGG(SEQIDNO:68)和GGGGSGGGG(SEQIDNO69)的序列。在本发明的一个方面，半胱氨酸接头（接头2）可以包含选自GFNRGEC(SEQIDNO:70)和GVEPKSC(SEQIDNO:71)的序列。在另一个方面，第一促异二聚体结构域的半胱氨酸接头（接头2）可以包含GFNRGEC(SEQIDNO:70)的序列且第二促异二聚体结构域的半胱氨酸接头（接头2）可以包含GVEPKSC(SEQIDNO:71)的序列。在某些方面，第三促异二聚体区的接头3可以包含KAPSSSPME(SEQIDNO77)的序列。在某些方面，第一和第三促异二聚体区的肽1可以包含具有序列CPPCP(SEQIDNO60)的截短的IgG1铰链区。在一方面，肽1可以包含但不限于序列DKTHTCPPCP(SEQIDNO96)。本文所述的钮和扣策略可以用在MP3-DART构建体中以确保第一和第三多肽链的正确配对。类似于本文所述的LP-DART，将人IgG1的Fc区修饰以去除C末端赖氨酸残基（其通常在翻译后切割），以及引入突变L234A、L235A和G237A突变以消除(oblate)由于结合FcγRIII而引起的效应子功能（效应子无效表型）。在一方面，通过修饰天然IgGFc区以包含修饰T366W而产生钮。在另一方面，通过修饰天然IgGFc区以包含修饰T366S、L368A和Y407V而产生扣。优选地，第一多肽链包含钮而第三多肽链包含扣。为了有助于从第三多肽链的任何同二聚体中纯化MP3-DARTTM，优选地通过在位置435的氨基酸取代（H435R）而突变第三多肽链的CH2和CH3结构域的蛋白A结合位点。因此，第三多肽链的任何同二聚体均不结合蛋白A，而MP3-DARTTM保留其经第一多肽链上的蛋白A结合位点而结合蛋白A的能力。因此，钮（或凸起）Fc链可以具有SEQIDNO:65的序列且扣（或腔）Fc链可以具有SEQIDNO:66的序列，如表4中所提供的。表4.Fc区的序列。表5描述用本文所述的各种P-钙黏着蛋白和CD3-1抗体构建的示例性N末端MP3-DART和C末端MP3-DART蛋白的第一（1）、第二（2）和第三（3）多肽链。SEQIDNO.125-158提供了表5中所述的N末端和C末端MP3-DART双特异性异二聚化双抗体的多肽链1、2和3的氨基酸和核苷酸序列（括号中引用）。表5.MP3-DART蛋白的第一、第二和第三多肽链。工程化的半胱氨酸残基在某些方面，双特异性异二聚化双抗体的每一多肽可以进行工程化以包含至少一个半胱氨酸残基，其可以与本发明的另一多肽链上的对应半胱氨酸残基相互作用以形成链间二硫键。链间二硫键可以用于稳定双抗体分子，改善重组系统中的表达和回收，得到稳定且一致的制剂，以及，改善分离和/或纯化的产物的体内稳定性。可以在多肽链的任何部分中引入一个或多个半胱氨酸残基作为单个氨基酸或更大氨基酸序列（例如铰链区）的一部分。在具体方面，将至少一个半胱氨酸残基工程化至多肽链的C末端。癌症治疗本发明涵盖在个体中治疗、预防或管理癌症的方法和组合物，其包括向所述个体施用治疗有效量的根据本发明工程化的双特异性异二聚化双抗体，所述分子还结合癌抗原。本发明的分子可以特别用于预防、抑制、减少原发性肿瘤的生长和癌细胞的转移和/或使之消退。尽管不旨在受具体作用机制的束缚，但本发明的分子可以介导效应子功能，其可以导致肿瘤清除、肿瘤减小或其组合。因此，本发明提供通过将双特异性异二聚化双抗体工程化为免疫特异性识别T细胞上的P-钙黏着蛋白癌抗原和CD3抗原二预防或治疗特征在于P-钙黏着蛋白癌抗原的癌症。根据本发明已工程化的双特异性异二聚化双抗体可用于预防或治疗癌症，因为它们具有通过抗CD3诱导的活化的杀伤性T细胞的细胞毒性活性。因此，本发明的一个方面提供在有需要的患者中治疗P-钙黏着蛋白阳性癌症的方法，其中所述癌症选自乳腺癌、结肠直肠癌、卵巢癌、胃癌、甲状腺癌、前列腺癌、宫颈癌、胰腺癌、肺癌（包括但不限于非小细胞肺癌和小细胞性肺癌）、膀胱癌、肝癌、子宫内膜癌、头颈癌、睾丸癌和胶质母细胞瘤。本发明还提供本发明的双特异性异二聚化双抗体，用于治疗本文限定的癌症的方法中。此外，本发明提供本发明的双特异性异二聚化双抗体在制备用于治疗如本文所定义的癌症的药物中的用途。在一个特定的方面，相对于在不存在本发明的双特异性异二聚化双抗体的情况下的癌细胞的生长，本发明的双特异性异二聚化双抗体抑制或降低癌细胞的生长至少99%、至少95%、至少90%、至少85%、至少80%、至少75%、至少70%、至少60%、至少50%、至少45%、至少40%、至少45%、至少35%、至少30%、至少25%、至少20%或至少10%。在一个特定的方面，就杀伤细胞或抑制或降低癌细胞的生长而言，本发明的双特异性异二聚化双抗体优于不存在本发明的双特异性异二聚化双抗体的情况至少5%、至少10%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少100%。本发明还涵盖组合施用本发明的分子与本领域技术人员已知的用于治疗或预防癌症的其他疗法，所述其他疗法包括但不限于目前标准的和实验性的化学疗法、生物疗法、免疫疗法、放射疗法或手术。在一些方面，本发明的分子可以与治疗或预防有效量的本领域技术人员已知的用于治疗和/或预防癌症的一种或多种试剂、治疗抗体或其他试剂组合施用。因此，用于治疗癌症的方法包括向有需要的患者施用有效量的本发明的双特异性异二聚化双抗体与化学治疗剂的组合。此类组合治疗可以分开、连续或同时施用。合适的化学治疗剂包括但不限于5-氟尿嘧啶、BCNU、博莱霉素、卡里奇霉素、喜树碱、卡铂、顺铂、环磷酰胺（cyclophosphamide）、阿糖胞苷、环磷酰胺（cytoxan）、达卡巴嗪、更生霉素、柔红霉素、多西他赛、多柔比星、依托泊苷、羟基脲、伊达比星、异环磷酰胺、伊立替康、L-天冬酰胺酶、巯基嘌呤、甲氨蝶呤、丝裂霉素、米托蒽醌、氮芥、亚硝基脲、紫杉醇、普卡霉素、丙卡巴肼、紫杉酚、硫鸟嘌呤、拓扑替康、长春碱、长春新碱和长春瑞滨。本文提供的施用的剂量和频率被术语治疗有效的和预防有效的所涵盖。剂量和频率还可以根据每一患者的具体因素而改变，其取决于施用的具体治疗剂或预防剂、癌症的严重程度和类型、施用途径以及患者的年龄、体重、应答和病史。合适的方案可以由本领域技术人员通过考虑此类因素并按照例如文献中报道的和Physician'sDeskReference(第56版,2002)中推荐的剂量来选择。本发明的双特异性异二聚化双抗体可以药物组合物的形式施用，所述药物组合物经配制以适合于所选的施用模式和药学上可接受的稀释剂或赋形剂，诸如缓冲剂、表面活性剂、防腐剂、溶解剂、等渗剂、稳定剂、载体等。Remington'sPharmaceuticalSciences,MackPublishingCo.,EastonPa.,第18版.,1995提供了如技术人员一般已知的配制技术的概要。这些药物组合物可以通过本领域已知的任何方法（其实现治疗癌症的一般预期目的）来施用。施用途径可以是肠胃外（如提及施用模式时本文所限定的），其包括但不限于静脉内、肌内、腹膜内、皮下和关节内注射和输注。所施用的剂量可以取决于受体的年龄、健康和体重、同期治疗的类型（如有的话）、治疗频率和期望效果的性质。在本发明范围内的组合物包括所有组合物，其中双特异性异二聚化双抗体以有效实现治疗癌症的期望疗效的量存在。尽管个体需求可能因患者而异，但所有组分的有效量的最佳范围的确定均在普通临床医生技术人员的能力范围之内。本发明提供可用于上述方法的试剂盒。在一方面，试剂盒包含本发明的双特异性异二聚化双抗体。在另一方面，试剂盒还在一个或多个容器中包含可用于治疗癌症的一种或多种其他预防剂或治疗剂。在某些方面，所述其他预防剂或治疗剂是化学治疗剂。在其他方面，所述预防剂或治疗剂是生物或激素治疗剂。本发明的药物组合物、预防剂或治疗剂的若干方面优选在用于人之前在细胞培养系统中和在动物模型生物（诸如啮齿类动物模型系统）中体外测试期望的治疗活性。本发明的预防和/或治疗方案的毒性和效力可以通过标准药物程序在细胞培养物或实验动物中来确定，例如测定LD50（群体的50%的致死剂量）和ED50（群体的50%的治疗有效剂量）。毒性作用和治疗作用之间的剂量比例为治疗指数，并且其可以表示为LD50/ED50的比例。具有大的治疗指数的预防和/或治疗剂是优选的。另外，本领域技术人员已知的任何测定均可以用于评价本文公开的疗法或组合疗法在治疗或预防癌症上的预防效用和/或治疗效用。生物保藏物本发明的代表性材料于2013年12月20日保藏于AmericanTypeCultureCollection,10801UniversityBoulevard,Manassas,Va.20110-2209,USA(ATCC)。具有ATCC登录号PTA-120809的载体153LP-DARTA包含编码P-钙黏着蛋白LP-DART（Fc融合双抗体）A链的重组人DNA插入片段，且具有ATCC登录号PTA-120810的载体153LP-DARTB包含编码P-钙黏着蛋白LP-DART（Fc融合双抗体）B链的重组人DNA插入片段。保藏物根据布达佩斯条约规定在其下（布达佩斯条约）的用于专利程序和管理目的的微生物保藏国际认可下进行。这保证保藏物的活的培养物从保藏之日起保持30年。保藏物在布达佩斯条约条款下可通过ATCC获得，并且受PfizerInc和ATCC之间的协议的约束，这确保相关美国专利发布后或任何美国或外国专利申请向公众开放后（以先到者为准），保藏物的培养物后代可以永久且不受限制地获得，并且确保根据35U.S.C.Section122待对其授予及所依据的专员细则（包括37C.F.R.Section1.14，具体参考886OG638）的由美国专利及商标专员(U.S.CommissionerofPatentsandTrademarks)确定的保藏物后代的可获得性。本申请的受让人已同意如果保藏材料的培养物在合适条件下培养时发生死亡或丢失或破坏，则该材料将及时地用另一份相同材料替换并通知。在违反任何政府根据其专利法的职权所授予的权利的情况下，保藏材料的可获得性不应解释为实施本发明的许可。提供用于进行本发明的具体方面的以下实施例仅用于说明性目的，且不应旨在以任何方式限制本发明的范围。实施例1P-钙黏着蛋白和双特异性异二聚化双抗体的生成构建双特异性异二聚化双抗体以评价每一种的重组产生、纯化和结合特征。通过本文描述的重组表达系统产生亲和力纯化的双特异性异二聚化双抗体。ELISA和SPR分析还揭示了共价双特异性异二聚化双抗体对于两种靶抗原P-钙黏着蛋白和CD-3具有亲和力，且能够同时结合两种抗原。A.噬菌体展示用由来源于非免疫的人供体的scFv构成的噬菌体展示文库使用本领域已知的技术鉴定结合P-钙黏着蛋白的胞外结构域（ECD）的单链片段可变（scFv）部分。在P-钙黏着蛋白构建体和表达P-钙黏着蛋白的细胞上通过标准ELISA技术测量在噬菌体表面上表达的scFv的结合。B.测序分析使用常规方法用引物5’GGAGATTTTCAACGTGAA3’(SEQIDNO:58)和5’CTCTTCTGAGATGAGTTTTTG3’(SEQIDNO:59)以未纯化的细菌甘油原液或纯化的质粒的形式来测序ScFv片段。C.转变为DART选择具有强的重组P-钙黏着蛋白或细胞表面结合（>3x背景或阴性细胞结合）的scFv片段用于亚克隆入DART蛋白。DART设计和克隆方法在之前有述(Johnson等人,JMolBiol,399:436-449,2010;Moore等人,Blood,117(17):4542-51,2011)。用于从噬菌体展示文库改变新的抗P-钙黏着蛋白scFv的方法如下：通过用整合了BamHI/BspEI（对于VH）和BssHII/BamHI（对于VL）的引物通过标准聚合酶链式反应（PCR）扩增片段。将片段用对应的限制酶根据制造商说明书(NewEnglandBiolabs)进行切割。为了生成DART表达载体，将抗P-钙黏着蛋白VH(P-CADVH)或VL(P-CADVL)scFv进行凝胶纯化(QIAGEN®GelPurificationKit)并分别连接入含有抗CD3VL(CD3VL)或VH(CD3VH)scFv的哺乳动物表达载体中。为了产生VF-DART，如图2和3中所示，DART表达载体还包含各自具有半胱氨酸接头（接头2）诸如GFNRGEC(SEQIDNO:70)或GVEPKSC(SEQIDNO:77)的第一和第二促异二聚体结构域。为了产生EK-DART，如图4中所示，DART表达载体还包含各自具有半胱氨酸接头（接头2）诸如GGCGGG(SEQIDNO:72)和E卷曲结构域(SEQIDNO:61)或K卷曲结构域(SEQIDNO:62)的第一和第二促异二聚体结构域。为了产生LP-DART，如图1和5中所示，DART表达载体还包含各自具有半胱氨酸接头（接头2）诸如GCPPCP(SEQIDNO:73)、GGTGGCPPCP(SEQIDNO74)、GEPKSSDKTHTCPPCP(SEQIDNO75)或GGTGGGEPKSSDKTHTCPPCP(SEQIDNO76)和“钮”Fc链(SEQIDNO:63)或“扣”Fc链(SEQIDNO:64)的第一和第二促异二聚体结构域。除了来自噬菌体展示文库的新的抗P-钙黏着蛋白scFv外，将来自抗P-钙黏着蛋白临床mAbPF-03732010(Zhang等人,ClinCancerRes.16(21),5177-5188,2010)的VH和VL结构域也亚克隆入如上所述的各种DART表达载体中以用作阳性对照。随后通过将表达载体共转染入HEK293细胞中在哺乳动物细胞中瞬时表达DART蛋白。使用偶联至CNBr-活化的琼脂糖4B(GEHealthcare,Piscataway,NJ)的抗卷曲螺旋mAb15F1亲和纯化保留P-钙黏着蛋白亲和力的DART蛋白。通过SDS-PAGE和SEC评价经纯化的DART蛋白的生物化学特性。表6提供通过本文所述技术生成的抗P-钙黏着蛋白scFv克隆的VL和VH氨基酸序列。克隆20和30的CDR根据Kabat用下划线标出。SEQIDNO97-116提供对应的核苷酸序列（在括号中标识出）。表6.P-CADVL和VH序列。表7a和7b提供所产生的抗P-钙黏着蛋白VHscFv克隆的CDR序列，其分别使用Kabat和AbM编号命名。表7a.使用Kabat编号的P-CADVHCDR序列。表7b.使用AbM编号的P-CADVHCDR序列。表7c提供生成的抗P-钙黏着蛋白VLscFv克隆的CDR序列。表7c.使用Kabat/AbM编号的P-CADVLCDR序列。表8示出了在亲和力成熟的P-钙黏着蛋白克隆中发现的氨基酸突变。数据表明基于解析的晶体结构的对VL/VH折叠和配体相互作用的潜在影响。CDR结合口袋内的突变显示出对于改进的配体相互作用的潜力。CDR结合口袋外发现的突变表明改进的VL/VH折叠的作用。表8.亲和力成熟的P-钙黏着蛋白克隆的氨基酸突变。表9提供通过本文所述技术生成的抗CD3scFv克隆的VL和VH氨基酸序列。表9.CD3VL和VH氨基酸序列。表10a和10b提供生成的抗CD3VHscFv克隆的CDR序列，其分别使用Kabat和AbM编号命名。表10a.使用Kabat编号的CD3VHCDR序列。表10b.使用AbM编号的CD3VHCDR序列。表10c提供生成的抗CD3VLscFv克隆的CDR序列。表10c.使用Kabat/AbM编号的CD3-1和CD3-2VLCDR序列。实施例2抗P-钙黏着蛋白/抗人CD3LP-DART的构建通过PCR扩增抗P-钙黏着蛋白/抗人CD3DART蛋白使得每一DART蛋白在每一末端包含限制酶克隆位点用于克隆入哺乳动物表达载体，参见表11以及图33A和33B。表11.抗P-钙黏着蛋白/抗人CD3DART蛋白。随后，将编码DART蛋白序列的核酸融合至编码经修饰的Fc构建体的每一核酸例如“钮”Fc链(SEQIDNO:63)和“扣”Fc链(SEQIDNO:64)，其各自连接至具有半胱氨酸接头诸如GCPPCP(SEQIDNO:73)、GGTGGCPPCP(SEQIDNO74)、GEPKSSDKTHTCPPCP(SEQIDNO75)和GGTGGGEPKSSDKTHTCPPCP(SEQIDNO76)的DART的C末端。PCR扩增后，将DART和Fc链核酸用BspEI和HindIII(5’DART克隆位点)或EcoRI(3’Fc克隆位点)消化。将经消化的DNA通过如下分离：从琼脂糖凝胶中切出并随后纯化，随后在室温下连接入HindIII-EcoRI消化的表达载体30分钟。随后将连接物转化入感受态大肠杆菌DH5α中并在37℃下在含有100µg/mL羧苄青霉素的琼脂糖平板上生长过夜。将克隆计数，挑取并在YT-培养基+100µg/mL羧苄青霉素中生长过夜，并使用标准方法分离DNA。随后，在进行哺乳动物细胞表达之前，对所有DNA构建体的两条链均进行测序。随后将互补构建体对共转化入含有一百万个细胞/mlHEK293细胞的1L对数期培养物中。转染后24小时，添加胰蛋白胨至0.75%的终浓度并允许细胞在收获前再生长5天。随后收集培养后的培养物(Spentcultures)，离心以去除细胞碎片随后通过20µm过滤器。然后利用本领域已知的技术来进行蛋白纯化。抗P-钙黏着蛋白/抗人CD3LP-DART的图示实例显示于图1A和1B中。实施例3P-钙黏着蛋白scFv-Fc和DART蛋白的结合特性使用标准ELISA技术分析了P-钙黏着蛋白scFv-Fc构建体（融合至人IgGFc区的P-钙黏着蛋白VH和VL）和DART蛋白与P-钙黏着蛋白构建体和与表达P-钙黏着蛋白细胞的结合特性。表12中的数据表示噬菌体衍生的P-钙黏着蛋白scFv-Fc构建体强力结合重组人P-钙黏着蛋白且对于小鼠P-钙黏着蛋白不具有可检测的结合。表12.P-钙黏着蛋白scFv-Fc与P-钙黏着蛋白蛋白构建体的结合特性。P-CAD克隆#huP-cad-ECDEC50(nM)huP-cad-ECD生物素化的EC50(nM)muP-cad-ECDEC50(nM)33scFv-Fc3.4640.1012NB34scFv-Fc11.160.1943NB35scFv-Fc2.50.01762NBPF037320101.9360.01882.333阴性对照NBNBNBNB=无可检测的结合。P-钙黏着蛋白scFv-Fc与各种表达P-钙黏着蛋白的细胞类型在基于细胞的ELISA中的结合特性显示于表13中。噬菌体衍生的P-钙黏着蛋白scFv-Fc构建体显示出与H1650细胞和与SW480-huPcad和CHO-huPcad细胞类型的强力结合。表13.P-钙黏着蛋白scFv-Fc与P-钙黏着蛋白表达细胞的结合特性。P-CAD克隆#SW480-huPcadEC50(nM)H1650EC50(nM)CHO-huPcadEC50(nM)CHO亲代EC50(nM)33scFv-Fc0.42430.56690.4931NB34scFv-Fc0.44220.4940.3938NB35scFv-Fc0.17340.16310.2761NBPF-037320100.16650.20920.3293NB阴性对照NBNBNBNBNB=无可检测的结合。如表14中所示，在ELISA格式中，本发明的抗P-钙黏着蛋白EK-DART蛋白表现出对H1650细胞上细胞表面表达的P-钙黏着蛋白以及对重组人P-钙黏着蛋白-Fc的强力结合，但不结合其他钙黏着蛋白家族成员，E-钙黏着蛋白和VE-钙黏着蛋白。EK-DART是E/K卷曲结构域构建体。PFEK-DART是采用如实施例1中所述的来自抗P-钙黏着蛋白临床mAbPF-03732010的VH和VL的阳性对照。表14中的所有EK-DART蛋白均包含CD3-2。表14.P-钙黏着蛋白EK-DART蛋白的结合特性。DARTHuP-钙黏着蛋白–FcEC50(nM)E-钙黏着蛋白-FcEC50(nM)VE-钙黏着蛋白-FcEC50(nM)H1650EC50(nM)CHO亲代EC50(nM)33EK-DART1.8NBNB60.1NB34EK-DART2.85NBNB67.95NB35EK-DART1.92NBNB24.87NBPFEK-DART2.1NBNB19.69NB20EK-DART12.3NBNB~114.7NB30EK-DART3.68NBNB141.9NB阴性对照EK-DARTNBNBNBNBNBNB=无可检测的结合。实施例4DART蛋白的表面等离子共振（SPR）分析使用BIACORE®3000生物传感器(GEHealthcare)通过SPR分析EK-DART蛋白与P-钙黏着蛋白和CD3的结合亲和力。将抗原huCD3εδ和人P-钙黏着蛋白-Fc或人/食蟹猴/小鼠P-钙黏着蛋白-ECD通过如制造商推荐的胺偶联试剂盒固定在CM-5传感器芯片上。表15显示噬菌体衍生的EK-DART蛋白针对食蟹猴（“cyno”）P-钙黏着蛋白ECD的结合亲和力，而表16显示噬菌体衍生的EK-DART蛋白针对人可溶性CD3蛋白的结合亲和力。表15和16中的所有EK-DART蛋白均包含CD3-2。表15.EK-DART蛋白针对食蟹猴P-钙黏着蛋白ECD的结合亲和力DARTka(1/Ms)kd(1/s)KD(nM)33EK-DART1.15E+065.78E-0246.434EK-DART7.05E+058.33E-02129.335EK-DART3.18E+051.38E-0243.4PFEK-DART2.11E+052.51E-0311.9020EK-DART3.46E+067.04E-032.0330EK-DART4.72E+066.48E-031.37表16.EK-DART蛋白针对人可溶性CD3的结合亲和力DARTka(1/Ms)kd(1/s)KD(nM)33EK-DART2.28E+054.03E-0317.734EK-DART1.95E+054.45E-0322.835EK-DART1.89E+054.47E-0323.6PFEK-DART4.11E+053.95E-039.6120EK-DART9.79E+056.09E-035.1930EK-DART3.53E+054.57E-0313.6在表17中，Biacore数据显示了相比具有CD3-2的亲代35EK-DART，具有CD3-2的优化的EK-DART蛋白与食蟹猴P-钙黏着蛋白ECD的结合亲和力。表17中的所有EK-DART蛋白均包含CD3-2。表17.EK-DART蛋白针对食蟹猴P-钙黏着蛋白ECD的结合亲和力DARTka(1/Ms)kd(1/s)KD(pM)35EK-DART6.14E+052.15E-0235050±2950153EK-DART7.32E+051.72E-05231.5±17.5154EK-DART1.04E+063.90E-033930.0±910165EK-DART8.34E+053.09E-04370.0±87177EK-DART8.02E+053.83E-04483.0±82178EK-DART1.67E+052.16E-041310.0±140179EK-DART1.11E+064.58E-034165.0±255180EK-DART7.71E+057.44E-04965.5±19.5在表18中，Biacore数据显示了亲代35EK-DART和经优化的EK-DART蛋白与可溶性CD3δε的结合亲和力。表18中的所有EK-DART蛋白均包含CD3-2。表18.EK-DART蛋白针对人可溶性CD3的结合亲和力DARTka(1/Ms)kd(1/s)KD(nM)35EK-DART1.89E+054.47E-0323.6153EK-DART4.03E+056.31E-0315.65±1.75154EK-DART4.56E+057.68E-0317.10±0.90165EK-DART2.78E+054.17E-0314.90±2.80177EK-DART2.53E+054.43E-0319.95±6.55178EK-DART2.30E+055.26E-0323.10±1.10179EK-DART3.06E+056.41E-0325.75±9.25180EK-DART7.06E+051.11E-0215.9±1.00各种DART形式在pH7.4下相对于P-钙黏着蛋白的结合亲和力显示在表19中。比较了具有P-钙黏着蛋白克隆153VH和VL结合域的VF、EK、LP、MP3-C末端和MP3-N末端形式的DART蛋白。153VF-DART表现出最高的结合亲和力和最快速率。KD类似于153EK-DART和153LP-DART蛋白。153MP3-DART蛋白对食蟹猴P-钙黏着蛋白的结合亲和力稍低，如较慢的速率所示。所有153DART蛋白的%活性（Rmax）均类似地低。表19中的所有DART蛋白均包含CD3-1，不同之处是153EK-DART包含CD3-2。表19，各种DART形式针对食蟹猴P-钙黏着蛋白的结合亲和力。各种DART形式在pH7.4下相对于shCD3（可溶性人CD3）的结合亲和力显示在表20中。比较了具有P-钙黏着蛋白克隆#153VH和VL结合域的VF、EK、LP、MP3C末端和MP3N末端形式的DART蛋白。153VF-DART表现出最快速率和对shCD3的最高结合亲和力。153EK、LP和MP3DART蛋白对shCD3具有类似的亲和力。针对shCD3的%活性（Rmax）好于针对食蟹猴P钙粘蛋观察到的。表20中的所有DART蛋白均包含CD3-1，不同之处是153EK-DART包含CD3-2。表20.各种DART形式针对人可溶性CD3的结合亲和力。实施例5P-钙黏着蛋白DART蛋白的表征使用差示扫描量热法（DSC）分析来表征噬菌体衍生的EK-DART蛋白的热稳定性。表21表明P-钙黏着蛋白EK-DART蛋白具有有利的热概况，具有高于65℃的Tm1转变。受迫聚集测定表明P-钙黏着蛋白EK-DART蛋白在40℃下对热应激的抗性。表21中的所有EK-DART蛋白均包含CD3-2。表21.P-钙黏着蛋白EK-DART蛋白的DSC分析。亲和力成熟的P-钙黏着蛋白EK-DART蛋白的额外生物物理学特性显示于表22a中。这些分子的理论pI约8.5。表22a中的所有EK-DART蛋白均包含CD3-2。表22a.P-钙黏着蛋白EK-DART蛋白的生物物理学特性。表22b显示亲和力成熟的P-钙黏着蛋白VF-DART蛋白的功能表征。来自两种类型的细胞毒性T淋巴细胞（CTL）测定的数据显示不具有E-K卷曲的双特异性异二聚化双抗体保留的细胞毒性。对配体更高的亲和力对应于CTL中更高的效力，如EK-DART中所见的。表22b中的所有VF-DART蛋白均包含CD3-1。表22b.P-钙黏着蛋白VF-DART蛋白的功能表征表22c包含亲和力成熟的P-钙黏着蛋白VF-DART蛋白的生物物理学表征数据。VF-DART蛋白的分析显示直至65℃没有检测到聚集的显著增加。数据表明VF-DART形式改善了在低温下的受迫聚集概况，同时不影响Tm1。LC/MS数据表明表达和纯化后形成了正确的异二聚体。表22c中的所有VF-DART蛋白均包含CD3-1。表22c.P-钙黏着蛋白VF-DART蛋白的生物物理学表征数据。实施例6P-钙黏着蛋白LP-DART蛋白的表征表23汇总了用亲代克隆P-CAD35和CD3-2生成的八种不同的P-钙黏着蛋白LP-DART构建体(#1-#8)的各种功能和生物物理学数据。例如，LP-DART#1的第一多肽链（1）具有名称：CD3VLxP-CAD35VH-钮，其中CD3VL指SEQIDNO:47的抗CD3-2抗体VL结合区，P-CAD35VH指SEQIDNO:6的抗P-钙黏着蛋白抗体克隆35VH结合区，而“钮”指SEQIDNO:63的Fc钮链。LP-DART#1的第二多肽链（2）具有名称：P-CAD35VLxCD3VH-扣，其中P-CAD35VL指SEQIDNO:5的抗P-钙黏着蛋白抗体克隆35VL结合区，CD3VH指SEQIDNO:46的抗CD3-2抗体VH结合区，而“扣”指SEQIDNO:64的Fc扣链。分析了具有含有序列CPPCP(SEQIDNO60)和至少一个甘氨酸残基的截短的IgG1铰链的各种半胱氨酸接头（接头2）。将LP-DART构建体#1-#8与亲代35EK-DART比较。数据表明DART部分和Fc结构域之间更短的接头（接头2）与针对每一配体更高的亲和力和CTL测定中更高的效力相关。这表明更短的接头（接头2）阻止Fc结构域干扰DART部分上的配体结合位点。该数据还表明取向：CD3VLxP-CAD35VH-扣和P-CAD35VLxCD3VH-钮（如LP-DART#5至LP-DART#8中所示）对于LP-DART生成是最优的。表23.P-钙黏着蛋白LP-DART蛋白的功能和生物物理学数据。表24示出了整合了高亲和力P-钙黏着蛋白VH和VL结合域以及高亲和力抗CD3VH和VL结合域的若干P-钙黏着蛋白LP-DART蛋白的体外功能表征。数据表明增加的亲和力与增加的CTL效力相关；类似于对于P-钙黏着蛋白VF-DART和EK-DART形式所观察到的关联性。表24中的所有LP-DART蛋白均包含CD3-1。如同33、34和35亲代克隆，153LP-DART不结合小鼠P-钙黏着蛋白。表24.P-钙黏着蛋白LP-DART蛋白的功能表征。DARTBiacore亲和力食蟹猴P-钙黏着蛋白单体ECD(nM)Biacore亲和力小鼠P-钙黏着蛋白ECDBiacore亲和力可溶性CD3(nM)DU145CTL(LDH)EC50(nM)HCT116CTL(Luc)EC50(nM)153LP-DART0.521NB11.50.00060.0004154LP-DART5.5NT7.180.00170.007235LP-DARTNTNTNT0.00730.107NT=未测试；NB=无结合。表25示出了若干P-钙黏着蛋白LP-DART蛋白的生物物理学表征。P-钙黏着蛋白LP-DART蛋白的DSC显示出与用P-钙黏着蛋白EK-DART和VF-DART蛋白获得的类似的Tm1值。受迫聚集分析表明在更低温度下相对于P-钙黏着蛋白EK-DART形式改善的稳定性和与临床mAb类似的总体概况。LC/MS数据表明表达和纯化后形成了正确的异二聚体。表25中的所有LP-DART蛋白均包含CD3-1。表25.P-钙黏着蛋白LP-DART蛋白的生物物理学表征。NT=未检测到。表26提供P-钙黏着蛋白LP-DART蛋白、153LP-DART和154LP-DART结合食蟹猴P-钙黏着蛋白ECD和可溶性CD3δε的BiacoreSPR数据。该数据表明，相比于对应的EK-DART的亲和力，对于每一配体的亲和力有些许降低。表26中的所有LP-DART蛋白均包含CD3-1。表26.P-钙黏着蛋白LP-DART蛋白食蟹猴P-钙黏着蛋白和可溶性CD3的结合亲和力。实施例7P-钙黏着蛋白表达的定量A.工程化以表达萤光素酶用于体外研究的癌细胞系上P-钙黏着蛋白表达的定量进行流式细胞术实验来评估抗P-钙黏着蛋白mAb（PF-03732010）结合以确定在一组10个癌细胞系中内源性细胞表面P-钙黏着蛋白表达的相对水平。用于体外测试的所有肿瘤细胞系经工程化以表达萤光素酶。如所述收集显示一定范围的P-钙黏着蛋白受体表达的肿瘤细胞系用于饱和FACS结合。将2.5x105细胞/样品转移至96孔圆底聚丙烯板。将细胞用5µg/ml和10μg/ml的以1：1mAb与PE的比率缀合的藻红蛋白(PE)标记的抗人P-钙黏着蛋白mAb(PF-03732010)(eBioscience)或用缀合至对照小鼠IgG1mAb的PE(Biolegend)室温下染色30分钟。将细胞洗涤并用FACS缓冲液加10ng/ml碘化丙啶重悬，随后使用具有FACSDiva软件的LSRII进行获取。将QuantiBRITEPE珠粒(BDPharmingen)使用0.5mLFACS缓冲液重构并使用LSRII用如肿瘤细胞样品的相同电压设定进行获取。将珠粒和肿瘤细胞的PE几何平均荧光强度用于根据QuantiBRITEPEBeadKit的制造商规定的方案来计算每细胞结合的PE标记的抗体的数目（ABC）。受体密度和细胞毒性EC50之间的线性回归曲线拟合使用GraphPadPrism5.0软件通过将对于每一肿瘤细胞系在5μg/mL和10μg/mLPE标记的抗P-钙黏着蛋白mAb时通过Quantibrite测定法测定的平均受体密度的Log10值相对于对于相同靶肿瘤细胞系的平均体外细胞毒性EC50的Log10值进行作图来确定。在整个图板上观察到宽范围的细胞表面P-钙黏着蛋白表达并且抗P-钙黏着蛋白mAb结合至来源于多种癌症类型（包括乳腺癌、肺癌和结肠直肠癌）的细胞系，如表27中所示。相反，对照mAb没有显示可评估的结合。MFI=平均荧光强度；ABC=每细胞结合的抗体。表27.表达萤光素酶的癌细胞系上的内源性细胞表面P-钙黏着蛋白表达水平B.用于体内研究的癌细胞系上P-钙黏着蛋白表达的定量进行流式细胞术实验来评估抗P-钙黏着蛋白mAb（PfizerPF-03732010）结合以确定在一组用于体内研究的个癌细胞系中内源性细胞表面P-钙黏着蛋白表达的相对水平。如所述收集显示一定范围的P-钙黏着蛋白受体表达的肿瘤细胞系用于饱和FACS结合。将2.5x105细胞/样品转移至96孔圆底聚丙烯板。将细胞用5µg/ml和10μg/ml的以1：1mAb与PE的比率缀合的藻红蛋白(PE)标记的抗人P-钙黏着蛋白mAb(eBioscience)或用7.5µg/mL缀合至对照小鼠IgG1mAb的PE(Biolegend)室温下染色30分钟。将细胞洗涤并用FACS缓冲液加10ng/mL碘化丙啶重悬，随后使用具有FACSDiva软件的LSRII进行获取。将QuantiBRITEPE珠粒(BDPharmingen)使用0.5mlFACS缓冲液重构并使用LSRII用如肿瘤细胞样品的相同电压设定进行获取。将珠粒和肿瘤细胞的平均PE几何平均荧光强度用于根据QuantiBRITEPEBeadKit的制造商规定的方案来计算每细胞结合的PE标记的抗体的数目（ABC）。在来源于结肠直肠癌和乳腺癌的细胞系上观察到宽范围的细胞表面P-钙黏着蛋白表达，并相应地排位；HCT116>SUM149>SW480>Ls174T>SW620，如表28中所示。相反，同种型对照mAb没有显示出与任何细胞系的可评估的结合。表28.癌细胞系上的内源性细胞表面P-钙黏着蛋白表达水平实施例8体外细胞毒性测定A.EK-DART细胞毒性T淋巴细胞（CTL）测定显示强的重组P-钙黏着蛋白/CD3蛋白结合以及强的细胞结合信号(>3x背景或EC50≈PF03732010-DART)的EK-DART蛋白在T细胞引导的细胞杀伤测定中如前述进行筛选(Moore等人,Blood,117(17):4542-4551,2011)。表29表明本发明的P-钙黏着蛋白EK-DART蛋白的有效T细胞引导的细胞毒性。在以E:T比率为30:1的人PBMC存在的情况下，将工程化以过表达人P-钙黏着蛋白的CHO细胞和内源性表达高水平的P-钙黏着蛋白的癌细胞系（H1650）在24小时温育后均被EK-DART蛋白有效裂解，如使用LDH释放测定所测量的。将温育时间延长至40小时进一步增加了细胞杀伤的效力，如通过用P-钙黏着蛋白EK-DART分子的再引导T细胞杀伤的作用机制所预期的。相反，如基于缺乏P-钙黏着蛋白表达所预期的，在亲代CHO细胞系上没有观察到杀伤。表29中的所有EK-DART蛋白均包含CD3-2。表29.P-钙黏着蛋白EK-DART蛋白的T细胞引导的细胞毒性。优化的P-钙黏着蛋白EK-DART蛋白针对表达人P-钙黏着蛋白和组成型表达的萤光素酶报告基因构建体的肿瘤细胞的T细胞引导的细胞毒性显示于表30中。表30中的所有EK-DART蛋白均包含CD3-2。表30.P-钙黏着蛋白EK-DART蛋白的T细胞引导的细胞毒性。B.LP-DART细胞毒性T淋巴细胞（CTL）测定通过细胞毒性T淋巴细胞（CTL）测定评估153LP-DART介导性细胞杀伤。将以10:1的效应物（T细胞）与靶标（CHO细胞）比率的CHO亲代和CHOP-钙黏着蛋白细胞与CD3+T细胞在存在渐增浓度的153LP-DART的情况下进行温育。48小时后测量细胞活力并且计算半最大有效浓度（EC50）为0.41pM。结果显示153LP-DART表现出对CHOP-钙黏着蛋白细胞的有效杀伤，而对CHO亲代细胞的阴性对照没有可检测的活性。因此，CTL活性取决于P-钙黏着蛋白表达。通过细胞毒性T淋巴细胞（CTL）测定评估153LP-DART介导性肿瘤杀伤。分析了优化的153LP-DART蛋白针对表达人P-钙黏着蛋白和组成型表达的萤光素酶报告基因构建体的肿瘤细胞的T细胞引导的细胞毒性。将CD3+T细胞与以3:1的效应物（T细胞）与靶标（癌细胞）比率的一组癌细胞在存在渐增浓度的153LP-DART的情况下进行温育。72小时后测量细胞活力并且计算每一癌细胞系的半最大有效浓度（EC50），如表31中所示。数据表明153LP-DART介导癌症模型中的有效抗肿瘤活性。EC50=半最大有效浓度;S.D.=标准偏差;pM=皮摩尔;NA=无活性。表31.表达萤光素酶的癌细胞系中的153LP-DART的细胞毒性T淋巴细胞活性。细胞系肿瘤类型EC50±S.D.(pM)H1650_Luc肺癌4.24±0.66HCT116_Luc结肠直肠癌5.6±3.61BT20v_Luc乳腺癌4.72±2.43SUM149_Luc乳腺癌0.35±0.10H1975_Luc肺癌0.96±0.31H322_Luc肺癌5.78±3.09LoVo_Luc结肠直肠癌1.65±0.91SW480_Luc结肠直肠癌53.37±30.73HT29_Luc结肠直肠癌41.19±22.17Ls174T_Luc结肠直肠癌1439.07±2462.25Colo205_Luc结肠直肠癌191.28±203.58SW620_Luc结肠直肠癌NAC.比较CTL活性与细胞表面P-钙黏着蛋白表达水平收集来自部分A的具有一定范围P-钙黏着蛋白受体表达的肿瘤细胞系并将2.5x105细胞/样品转移至96空圆底聚丙烯板。将细胞用5µg/ml和10μg/ml的以1：1mAb与PE的比率缀合的藻红蛋白(PE)标记的抗人P-钙黏着蛋白mAb(PfizerPF-03732010)(eBioscience)或用缀合至对照小鼠IgG1mAb的PE(Biolegend)室温下染色30分钟。将细胞洗涤并用FACS缓冲液加10ng/ml碘化丙啶重悬，随后使用具有FACSDiva软件的LSRII进行获取。将QuantiBRITEPE珠粒(BDPharmingen)使用0.5mLFACS缓冲液重构并使用LSRII用如肿瘤细胞样品的相同电压设定进行获取。将珠粒和肿瘤细胞的PE几何平均荧光强度用于根据QuantiBRITEPEBeadKit的制造商规定的方案来计算每细胞结合的PE标记的抗体的数目（ABC）。受体密度和细胞毒性EC50之间的线性回归曲线拟合使用GraphPadPrism5.0软件通过将对于每一肿瘤细胞系在5μg/mL和10μg/mLPE标记的抗P-钙黏着蛋白mAb时通过Quantibrite测定法测定的平均受体密度的Log10值相对于对于相同靶肿瘤细胞系的平均体外细胞毒性EC50的Log10值进行作图来确定。如图8中所示，在更低的EC50和抗P-钙黏着蛋白mAb与细胞表面的结合增加之间存在显著关联，P值=0.0127。这表明CTL活性与P-钙黏着蛋白表达水平相关。实施例9人PBMC重建异种移植研究在异种移植重建实验中体内测试具有有效的T细胞引导的细胞毒性(<10ng/mLEC50)的各种DART蛋白，如下文所述。A.从人全血中分离PBMC和T细胞从全血中使用Ficoll梯度离心分离来自健康人供体的PBMC。简言之，将全血用无菌PBS1：1稀释。将35mL经稀释的血液铺层到50-mL试管中的15mLFICOLL-PAQUETMPlus上并将试管以1400rpm离心20min，且制动器松开(brakeoff)。将两相之间的淡黄色涂层收集到50mL试管中，并用45mLPBS通过以600xg(1620rpm)将试管离心5min来洗涤。丢弃上清液并将细胞沉淀用PBS洗涤一次并通过锥虫蓝染料排除来确定活细胞计数。将PBMC在完全培养基(RPMI1640,10%FBS、2mM谷氨酰胺、10mMHEPES、100μ/100μ/mL青霉素/链霉素(P/S)中重悬至2.5x106细胞/mL的终浓度。B.T细胞分离和活化根据RosettaSepT细胞分离试剂盒中提供的制造商方案从肝素化全血中分离人T细胞。随后通过将细胞暴露于抗CD3（OKT-3;1µg/mL）和抗CD28(66µg/mL)抗体持续48小时的时期将经纯化的T细胞活化。刺激后，使细胞在含有10%FBS和1%青霉素/链霉素的RPMI1640培养基中在IL-2(7.6ng/mL)存在的情况下生长最长至3周。C.肿瘤模型将人T细胞和肿瘤细胞(HCT116、Du145或H1650)以1:5的比率(分别1x106和5x106)组合并重悬于200µL无菌盐水中并在研究第0天（SD0）进行皮下注射。各种P-钙黏着蛋白EK-DART(CD3-2)、LP-DART(CD3-1)或对照DART(CD3-2)蛋白连同对照在SD0、1、2和3以100µL经尾静脉静脉内(IV)施用。每一治疗组包含8只动物。HCT116肿瘤模型中的P-CAD177EK-DART：将P-CAD177EK-DART以0.5、0.2、0.1或0.05mg/kg的剂量向四个治疗组施用并将媒介物对照（单独移植的HCT116细胞或移植的HCT116细胞+T细胞）施用于一个治疗组（0mg/kg）。HCT116肿瘤模型中的P-CAD153EK-DART：将P-CAD153EK-DART以0.5、0.2、0.1或0.05mg/kg的剂量向四个治疗组施用并将媒介物对照（单独移植的HCT116细胞或移植的HCT116细胞+T细胞）施用于一个治疗组（0mg/kg）。HCT116肿瘤模型中的P-CAD154EK-DART：将P-CAD154EK-DART以0.5、0.2、0.1或0.05mg/kg的剂量向四个治疗组施用并将媒介物对照（单独移植的HCT116细胞或移植的HCT116细胞+T细胞）施用于一个治疗组（0mg/kg）。HCT116肿瘤模型中的P-CAD35EK-DART：将P-CAD35EK-DART以0.5、0.2、0.1或0.05mg/kg的剂量向四个治疗组施用并将媒介物对照（单独移植的HCT116细胞或移植的HCT116细胞+T细胞）施用于一个治疗组（0mg/kg）。HCT116肿瘤模型中的P-CAD153LP-DART：向治疗组施用以0.5、0.2、0.1或0.05mg/kg剂量的P-CAD153LP-DART或媒介物对照（单独移植的HCT116细胞或移植的HCT116细胞+T细胞）。HCT116肿瘤模型中的P-CAD153LP-DART：向治疗组施用以100、10、1、0.1或0.01µg/kg剂量的P-CAD153LP-DART、或媒介物对照（单独移植的HCT116细胞）、媒介物对照（移植的HCT116细胞+T细胞）或4420-hXR32LP-DART(100µg/kg)对照。Du145肿瘤模型中的P-CAD153LP-DART：向治疗组施用以100、10、1、0.1或0.01µg/kg剂量的P-CAD153LP-DART、或媒介物对照（单独移植的Du145细胞）、媒介物对照（移植的HCT116细胞+T细胞）或4420-hXR32LP-DART(100µg/kg)对照。H1650肿瘤模型中的P-CAD153LP-DART：向治疗组施用以100、10、1、0.1或0.01µg/kg剂量的P-CAD153LP-DART、或媒介物对照（单独移植的H1650细胞）、媒介物对照（移植的H1650细胞+T细胞）或4420-hXR32LP-DART(100µg/kg)对照。C.数据采集和统计学分析动物重量：在肿瘤细胞注射时开始每周两次记录个体动物重量直至研究完成。濒死率(Moribundity)/死亡率每周两次观察动物的总体濒死率和每日观察动物的死亡率。基于包括总体观察结果和体重减轻的因素来将动物死亡评估为药物相关的或技术性的；每日记录动物死亡。肿瘤体积：在肿瘤移植一周内开始每周两次记录个体肿瘤体积并且持续直至研究完成。将经历技术性或药物相关死亡的动物从数据计算中剔除。肿瘤生长移植：对于包含经治疗的动物的每组使用以下公式来计算肿瘤生长抑制（TGI）值：将经历部分或完全应答的动物或者经历技术性或药物相关的死亡的动物从TGI计算中剔除。国家癌症研究所对于化合物活性的标准为TGI>58%(Corbett等人(2004)AnticancerDrugDevelopmentGuide;Totowa,NJ:Humana99-123)。部分/完全肿瘤应答：将在第1天具有肿瘤测量小于1mm3的个别小鼠归类为具有部分应答（PR）并使用以下公式确定百分比肿瘤消退（%TR）值。将缺乏可触知的肿瘤的个别小鼠归类为经历完全应答（CR）。肿瘤体积统计学：在经治疗组和对照组之间比较肿瘤体积来进行统计学分析。对于这些分析，采用双因素方差分析随后为Bonferroni事后检验(Bonferronipost-test)。所有分析均使用GraphPadPRISM®软件(版本5.02)来进行。将来自经历技术性或药物相关死亡的个别动物的体重和肿瘤数据从分析中剔除。然而，将来自报告为部分或完全应答的动物的肿瘤数据包括在这些计算中。D.HCT116肿瘤模型结果将细胞系HCT116与经活化的T细胞预先混合并在研究第0天皮下（SC）移植入NOD/SCIDγ敲除小鼠（N=8/组），如上所述。在将肿瘤细胞/T细胞混合物植入的同一天[(SD0)]开始用各种P-钙黏着蛋白EK-DART、LP-DART或对照DART蛋白治疗，并在随后的3天以每日总计4次注射进行每日注射。将动物用P-钙黏着蛋白EK-DART、LP-DART或对照DART蛋白以4个剂量水平（0.5、0.2、0.1和0.05mg/kg）进行治疗。结果显示于图9-14中。媒介物治疗组（单独的HCT116细胞或加上T细胞）中HCT116肿瘤显示相对快速的体内生长概况。在研究第20天（SD20），媒介物治疗组中肿瘤的平均体积为约125mm3，且到第35天（SD35），肿瘤已达到约450mm3的平均体积。在研究第45天（SD45）实验结束时，肿瘤已达到约750mm3的平均体积。在大多数测试的P-钙黏着蛋白DART蛋白的所有剂量水平下，HCT116肿瘤的生长均被明显抑制。在SD45实验结束时，对于所有治疗而言，肿瘤的平均体积范围为约100至0mm3，例外是177EK-DART，其范围为约500至100mm3。E.Du145结果将细胞系Du145与经活化的T细胞预先混合并在SD0时SC移植入NOD/SCIDγ敲除小鼠（N=8/组），如上所述。在将肿瘤细胞/T细胞混合物植入的同一天[(SD0)]开始用153LP-DART治疗，并在随后的3天以每日总计4次注射进行每日注射。将动物用153LP-DART以5个剂量水平(100、10、1、0.1和0.01μg/kg)进行治疗。结果显示于图15中。媒介物治疗组（单独的Du145细胞或加上T细胞）中Du145肿瘤显示相对快速的体内生长概况。在100、10和1μg/kg剂量水平的153LP-DART，Du145肿瘤的生长受到显著抑制并且在实验结束时（SD74），肿瘤平均体积为0mm3。在0.1μg/kg剂量水平的153LP-DART，Du145肿瘤的生长受到显著抑制，且在实验结束时（SD74），肿瘤平均体积为约500mm3。F.H1650结果将细胞系H1650与经活化的T细胞预先混合并在SD0时SC移植入NOD/SCIDγ敲除小鼠（N=8/组），如上所述。在将肿瘤细胞/T细胞混合物植入的同一天[(SD0)]开始用153LP-DART治疗，并在随后的3天以每日总计4次注射进行每日注射。将动物用153LP-DART以5个剂量水平(100、10、1、0.1和0.01μg/kg)进行治疗。结果显示于图16中。媒介物治疗组（单独的H1650细胞或加上T细胞）中H1650肿瘤显示相对快速的体内生长概况。在100、10和1μg/kg剂量水平的153LP-DART，H1650肿瘤的生长受到显著抑制并且在实验结束时（SD49），肿瘤平均体积为50mm3。在0.1μg/kg剂量水平的153LP-DART，H1650肿瘤的生长受到显著抑制，且在实验结束时（SD49），肿瘤平均体积为约400mm3。在Winn模型的背景下，当在植入当天开始给药且持续3天或连续更多天时，各种EK-DART、LP-DART和对照DART蛋白均有效抑制NOD/SCID小鼠中移植的HCT116、Du145和H1650肿瘤的生长。基于由国家癌症研究所建立的标准，以0.1mg/kg或更高剂量水平的各种DART蛋白(TGI>58)被认为在这三个模型中是有活性的。实施例10建立的肿瘤人PBMC移植模型基于定量流式细胞术分析建立了四个单独的异种移植肿瘤模型，用P-钙黏着蛋白表达归类为高（HCT116）、中等（SW480）、低（Ls174T）和阴性（SW620）。HCT116显示最高相对水平的细胞表面P-钙黏着蛋白表达（43,801ABC，表28），SW480显示相对中等水平的细胞表面P-钙黏着蛋白表达（12,665ABC，表28），且Ls174T显示相对低水平的细胞表面P-钙黏着蛋白表达（4,160ABC，表28）。NODscidγ(NSG)动物在第0天用5x106HCT116、5x106SW480、2x106Ls174T或5x106SW620肿瘤细胞皮下植入右侧。基于预期的肿瘤生长进行随机化之前7天（第5天），经腹膜内注射PBS中的0.2mL细胞悬浮液将将动物用5x106个新鲜分离的人外周血单核细胞进行接种。PBMC移植后一周（第12天），测量所有研究动物的肿瘤体积并且收集血液样品用于流式细胞术。将来自每一样品的红细胞用BDPharmlyse溶液(BDPharmingen)进行裂解并将所得的细胞沉淀对人CD3、人CD4和人CD8进行染色，并通过流式细胞术使用BDPharmingenLSRII（具有FACSDiva软件）进行分析。对于每一动物建立通过正向散射相对于侧向散射门控确定的作为总淋巴细胞的百分比的人CD3+细胞。使用数字游标卡尺(MitutoyoAmerica,Aurora,IL)收集肿瘤测量结果，并通过改变的椭圆体公式½(宽度2×长度)来计算体积。使用两参数随机化来建立每组n=10只动物的治疗组，提供肿瘤体积和人CD3+细胞移植物值之间的同量加权。将动物用0.05mg/kg或0.5mg/kg153LP-DART(CD3-1)、0.5mg/kg阴性对照双特异性（针对FITC和CD3ε的异二聚化双抗体Fc融合蛋白）或作为媒介物的DPBS向每一动物的侧面尾静脉静脉内给药。收集两周肿瘤测量结果以评估相对于对照的肿瘤生长抑制，伴随持续监测移植物抗宿主病的体征（例如，体重减轻、脱发、驼背体态）。表明相对于时间作图的肿瘤体积(mm3)的肿瘤生长图显示于图17A-17D，且相应的数据表显示于下表32-35中。数据表明每周施用153LP-DART导致在最高剂量（0.5mg/kg）下对于HCT116(高)、SW480(中等)肿瘤模型的肿瘤消退，以及在最高剂量（0.5mg/kg）下对于Ls174T（低）肿瘤模型的中等效力。施用阴性对照双特异性抗体相比于用媒介物治疗的小鼠没有显示出肿瘤抑制的增加。在HCT116肿瘤模型中，图17A显示分别在0.05和0.5mg/kg剂量的153LP-DART下61.9%和105.1%的肿瘤生长抑制（TGI）。图17A-17D进一步表明，建立的异种移植肿瘤的肿瘤生长抑制取决于P-钙黏着蛋白水平表达。表32.HCT116肿瘤模型中的肿瘤生长抑制。表33.SW480肿瘤模型中的肿瘤生长抑制。表34.Ls174T肿瘤模型中的肿瘤生长抑制。表35.SW620的使用移植的人T细胞的肿瘤生长抑制。图17E显示HCT116肿瘤模型移植后第25天收集的肿瘤体积(mm3)的单因素ANOVA分析，其具有对于媒介物对照组的Dunnet氏多项比较检验。该数据表明在用153LP-DART的0.05mg/kg和0.5mg/kg给药组中的显著肿瘤生长移植(*p<0.05)。P-钙黏着蛋白153LP-DART治疗的携带HCT116肿瘤的NSG动物的药代动力学分析结果显示于表36中。向动物施用单一IV剂量的0.05或0.5mg/kg153LP-DART，并在给药后指定的时间点在N=3组中安乐死以收集血清和肿瘤。LP-DART的测定通过夹心ELISA针对标准曲线来进行。153LP-DART具有延长的血清和肿瘤半衰期。表36.153LP-DART治疗的动物的药代动力学分析。实施例11建立的肿瘤人T细胞过继转移模型分析了用过继转移HCT116（结肠）和SUM149（乳腺）的人T细胞的肿瘤生长抑制。HCT116表明最高相对水平的细胞表面P-钙黏着蛋白表达(43,801ABC,表28)且SUM149表明相对中等水平的细胞表面P-钙黏着蛋白表达(15,426ABC,表28)。用补充有2XGlutaMax-1、1%PenStrep和20ng/ml重组人IL-2的OpTmizerCTSTCellExpansionSerum-FreeMedia(LifeTechnologies,Carlsbad,CA)重悬T细胞至0.5x106细胞/ml。随后将DynabeadsHumanT-ExpanderCD3/CD28磁珠(LifeTechnologies)以1x10e6珠粒/ml(2珠粒/细胞)加入T细胞中，并根据制造商方案将细胞培养一周。收获时，用磁铁移除珠粒，并将细胞在DPBS中以1x107细胞/ml重悬用于体内接种。对于异种移植研究，将NSG小鼠用5x106HCT116细胞在侧腹或用5x106SUM149细胞在乳腺脂肪垫中以0.2mL的总注射体积进行接种。将HCT116细胞在DPBS中悬浮，而将SUM149细胞在生长培养基中悬浮，并与MatrigelBasementMembraneMatrix(BDBiosciences,SanJose,CA)1：1混合。使用数字游标卡尺(MitutoyoAmerica,Aurora,IL)收集肿瘤测量结果，并通过改变的椭圆体公式½(宽度2×长度)来计算体积。一旦肿瘤已达到生长期，将小鼠随机化并接受初始剂量，第二天接种2x106经培养的T细胞/小鼠。将小鼠每周以0.2mL推注给药高至5次，并所有化合物和T细胞施用均为经每一动物的侧尾静脉静脉内施用。收集两周肿瘤测量结果，伴随持续监测移植物抗宿主病的体征（例如，体重减轻、脱发、驼背体态）。用过继转移HCT116（结肠）的人T细胞的肿瘤生长抑制显示于图18A（表37）中，而用过继转移SUM149（乳腺）的人T细胞的肿瘤生长抑制显示于图18A（表37）中。每周施用153LP-DART(CD3-1)导致如下的剂量应答：在最高剂量(0.5mg/kg)下肿瘤消退而在较低剂量(0.05mg/kg)下肿瘤停滞并最终复发。施用阴性对照LP-DART相比于用媒介物治疗的小鼠没有显示出肿瘤抑制的增加。相比于上文中实施例10的移植的T细胞模型，过继T细胞转移模型允许在小鼠死于GVHD之前延长153LP-DART给药（分别为2周和≥6周）。表37.用过继转移HCT116的人T细胞的肿瘤生长抑制。表38.用过继转移SUM149的人T细胞的肿瘤生长抑制。实施例12P-钙黏着蛋白阳性患者来源的异种移植物（PDX）分析了P-钙黏着蛋白阳性PDX的体内肿瘤生长抑制。通过用抗P-钙黏着蛋白抗体阳性染色FFPE肿瘤样品鉴定P-钙黏着蛋白阳性患者来源的结肠直肠肿瘤异种移植物PDX-CRX-11260。将PDX-CRX-11260肿瘤组织移植入NSG动物并生长至大约100mm3。将动物随机化入n=7的给药组中并且用媒介物、0.05mg/kg153LP-DART(CD3-1)或0.5mg/kg153LP-DART(CD3-1)每周给药。初始剂量后一天，所有动物接受2x106体外扩增的人T细胞。PDX-CRX-11260的肿瘤生长抑制显示于图19A（表39）中。0.05mg/kg153LP-DART给药组显示7只动物中的3只具有完全应答，而0.5mg/kg153LP-DART给药组中显示7只动物全部具有完全应答。该数据表明153LP-DART展示出对P-钙黏着蛋白阳性结肠肿瘤PDX的有效肿瘤生长抑制。表39.P-钙黏着蛋白阳性PDX-CRX-11260的肿瘤生长抑制。实施例13肿瘤浸润性淋巴细胞（TIL）的剂量依赖性积累将移植有人外周血单核细胞（PBMC）并用不同水平的153LP-DART(CD3-1)给药的携带HCT116肿瘤的小鼠(n=3)在给药后6天安乐死以评估肿瘤浸润性人CD3+淋巴细胞。将肿瘤样品收集到含有人肿瘤细胞离解缓冲液的gentleMACSC管(MiltenyiBiotech)中，并使用制造商推荐的软组织人类肿瘤方案使用gentleMACS组织离解器(MiltenyiBiotech)将其加工成单细胞悬浮液。将细胞悬浮液随后用含有2mMEDTA的DPBS洗涤并通过锥虫蓝排除和血细胞计数器来确定活细胞计数。将来自每一样品的1x106个活细胞收集入含有2%FBS和0.02%叠氮化钠的PBS中并用CD3FITC(BDPharmingen)在冰上染色30min。洗涤后，立即向每一样品添加碘化丙啶，随后使用FACSDiva软件(BDPharmingen)的LSRII进行分析。通过FlowJo软件(Treestar)分析数据并使用GraphPadPrism5.0软件将总活细胞事件的百分比CD3+细胞在具有经单因素ANOVA和Dunnett氏多项比较检验测定的显著性的分组图中相对于未治疗的对照样品进行作图。图20和表40中显示的结果表明肿瘤浸润性淋巴细胞（TIL）中剂量依赖性增加。另外，肿瘤组织的人CD3的免疫组织化学（IHC）染色（未显示）表明，对于具有P-钙黏着蛋白阳性肿瘤和人T细胞的动物进行153LP-DART治疗导致CD3+淋巴细胞的肿瘤内积累。表40.肿瘤浸润性淋巴细胞（TIL）的剂量依赖性积累实施例14P-钙黏着蛋白LP-DART的生物分布和肿瘤靶向使用FMT成像使用具有建立的皮下HCT116异种移植物的NSG或无胸腺裸小鼠。包括T细胞移植物的研究接受分离自健康人志愿者的T细胞。当肿瘤达到300-500mm3时开始生物分布研究。将P-钙黏着蛋白153LP-DART(CD3-1)或阴性对照-DART(非靶向结构域xCD3结合域)用近红外荧光团VivoTag680XL(VT680)缀合，且荧光团与双特异性标记的比率为1-2.75，得到：P-钙黏着蛋白153LP-DART-VivoTag680XL和对照-LP-DART-VivoTag680XL。通过分光光度计测定标记效率。将运输研究中使用的T细胞用CellVue815(CV815)进行标记。通过流式细胞术测定细胞表面P-钙黏着蛋白表达以及P-钙黏着蛋白153LP-DART结合。用细胞毒性T淋巴细胞（CTL）测定来测量T细胞活性。在注射经标记的双特异性物后纵向进行FMT成像。使用TrueQuant软件分析数据。在不同时间点收集血浆和组织用于通过ELISA的PK分析。A.经标记的生物分子的体外表征为了确定VT680标记是否影响分子特性，进行了质量控制研究：通过FACS分析的体外结合细胞和用于分子活性的细胞毒性测定。比较VT680标记和未标记的对照LP-DART和P-钙黏着蛋白153LP-DART的特性。对于用CV815标记的T细胞，评价了T细胞扩增以及对效应细胞的细胞毒性。表41显示用于生物分布研究的分子。DOL=标记程度。表41.VivoTag680XL标记的分子。分子DOL~Ab/剂量P-钙黏着蛋白153LP-DART-VivoTag680X2.620.925mg/kg对照-LP-DART-VivoTag680XL2.750.9mg/kg进行可溶性P-钙黏着蛋白ELISA以评价结合能力：图21A显示，对P-钙黏着蛋白153LP-DART的VT680标记对P-钙黏着蛋白结合具有最小的影响。该最小的降低是DOL依赖性的。对照-LP-DART（标记或未标记的）不影响结合P-钙黏着蛋白。进行可溶性CD3ELISA以评价结合能力：图21B表明，对P-钙黏着蛋白153LP-DART的VT680标记显著降低与CD3ε/δ蛋白的结合。该结合中的降低是DOL依赖性的。对照LP-DART比P-钙黏着蛋白153LP-DART具有更低的结合。VT680标记显著降低与CD3ε/δ蛋白的结合。将表达萤光素酶的HCT116细胞用作“靶”细胞用于在24小时测定中与经纯化的人T淋巴细胞“效应”细胞针对P-钙黏着蛋白153LP-DART的滴定的体外细胞毒性（以10:1的效应子与靶标的比率）。图21C显示的细胞毒性曲线表明，当用VT680以2.0DOL标记P-钙黏着蛋白153LP-DART时，细胞毒性降低。用细胞标记染料标记后细胞活力和T细胞扩增的比较：将从供体分离的人T细胞用荧光细胞追踪染料–VivoTrack680和CellVue815(CV815)标记。图21D显示，VivoTrack680和CV815均不影响T细胞的细胞活力或扩增。B.体外FMT成像和PK分析数据使用纵向FMT成像分析了P-钙黏着蛋白153LP-DART在HCT116异种移植模型中的生物分布和靶向。将在50%基质胶中的一百万个HCT116细胞注射入雌性nu/nu小鼠（8周龄）的SQ侧。使肿瘤生长直至大小~300-500mm3。将动物用等同于1nmol的VT680的探针（VT680标记的生物分子）进行注射（表41）。在注射后5min、24小时、48小时、96小时和240小时纵向进行体内FMT成像（全身）。在每一时间点收集血液（血浆）样品。在不连续的时间点和研究结束时，将动物安乐死并用PBS/盐水灌注以将血液从血管腔隙中去除。将组织（肿瘤、肝、脾、肾、肺和脑）离体(exvivo)成像。使用TrueQuant软件分析FMT数据。离体成像后，将组织快速冷冻用于将来的PK分析。血浆和组织样品的PK分析通过ELISA进行。在生物分布研究中不进行T细胞移植。FMT成像显示，P-钙黏着蛋白153LP-DART特异性靶向HCT116肿瘤。非侵入性体内FMT成像揭示，相比于对照LP-DART，在肿瘤中高水平的P-钙黏着蛋白153LP-DART积累（图像未显示）。体内动力学揭示，肿瘤中的峰积累在注射后约96小时，如图22A所示。显示从各个组织、肿瘤和血管腔隙的积累和清除的合成结果的全身分布和清除数据显示出P-钙黏着蛋白153LP-DART和对照-LP-DART之间没有总体上的显著差异，如图22B中所示。如图22C和22D中所示，在48、96和240小时肿瘤和所选的组织的离体分析显示P-钙黏着蛋白153LP-DART渗透入组织中。在所有时间点，相比于对照-LP-DART，肿瘤显示出P-钙黏着蛋白153LP-DART的20-30倍的积累。在注射后240小时，仍存在肿瘤中检测到的可测量的P-钙黏着蛋白153LP-DART。不同器官（肝（图22D）、肾、脾、肺和脑（数据未显示））中积累的离体比较显示出P-钙黏着蛋白153LP-DART或阴性对照DART之间没有差异。用药代动力学方法比较FMT数据以证实FMT成像的概况。通过常规药代动力学方法、ELISA评价来自FMT研究的样品。来自肿瘤和肝的PK数据显示如同上文所述的FMT成像数据的相似趋势。如图23A中所示，血浆概况显示出相比于对照-LP-DART的P-钙黏着蛋白153LP-DART的～2-3倍长的血浆暴露。如图23B中所示，评价离体肿瘤样品显示P-Cad-LP-DART积累中～7倍的增加。如图23C中所示，评价离体肝样品显示在48小时的积累增加，然而在96和240小时不存在显著差异。C.移植的T细胞的细胞追踪使用FMT成像进行HCT116模型中移植的T细胞的细胞追踪。将在50%基质胶中的一百万个HCT116细胞注射入雌性NSG小鼠（8周龄）的SQ侧。当肿瘤大小为~300-500mm3时，将P-钙黏着蛋白153LP-DART(用VT680标记或未标记)经SQ途径注射。注射药物24小时后，将五百万个用CV815标记的T细胞经IV途径注射。细胞移植后纵向进行FMT成像。使用680nm和800nm激光对P-钙黏着蛋白153LP-DART-VT680和TCell-CV815组进行连续成像。用CellVue标记的T细胞进行的细胞运输研究显示肿瘤中T细胞和P-钙黏着蛋白153LP-DART的共定位。如图24A中所示，CV815标记或未标记的T细胞活力的评价显示，用荧光团标记T细胞对于T细胞的细胞毒性能力没有影响（体外）。如图24B中所示，通过FMT成像的肿瘤中荧光团标记的T细胞的体内运输动力学显示在P-钙黏着蛋白153LP-DART注射组中细胞移植后第7天时T细胞运输和积累显著增加。FMT图像（未显示）表明在细胞移植后第5天和第7天时VivoTag680标记的P-钙黏着蛋白153LP-DART靶向至肿瘤和CV815标记的T细胞运输至肿瘤。该组接受CV815标记的T细胞+用VivoTag680标记的P-钙黏着蛋白153LP-DART。使用1.0DOL的P-钙黏着蛋白153LP-DART-VT680。已证明1.0的DOL对于结合P-钙黏着蛋白和CD3蛋白具有最小影响。实施例15结晶和结构测定对于结晶试验，利用图25中显示的经纯化的DART蛋白。具体而言，设计DART蛋白(具有克隆35P-CADVL/VH结合域和克隆CD3结合域)用于晶体学分析，其不具有促异二聚体结构域但具有共价连接至P-CAD35VH结构域的C末端His标签HHHHHH(SEQIDNO:78)（称为“6XHIS”）和共价连接至CD3VH结构域的C末端FLAG序列GGCGGDYKDDDDK(SEQIDNO:79)（本文中随后称为“晶体学35DART”）。将经纯化的晶体学35DART在含TBS的蛋白溶液中浓缩至9.6mg/ml。通过悬滴汽相扩散(hanging-dropvapor-diffusion)法从含有15%PEG8K和0.5M硫酸锂的条件中获得晶体。六角片样晶体具有与三方晶系空间组一致的对称性，且细胞参数a=b=142.81Å;c=62.69Å，并且在晶体不对称单元中具有一个晶体学35DART。使用含有25%乙二醇的储备溶液将晶体冷冻保护并在液氮中速冻。在ArgonneNationalLaboratory(APS)以IMCA光束17-ID从单一冷冻晶体收集为2.0Å分辨率的数据集。使用autoPROC和SCALA处理并测量数据。最终数据集为96.8%完成度，具有9.9的平均冗余和14.2%的Rsym。通过分子置换使用PHASER用制备于BrookhavenPDB入口代码1moe的单链Fv片段模型开始来测定结构。通过分别搜索晶体学35DART的四个亚基中的每一个来获得解析。几个迭代轮次的使用COOT的手动调节和模型重建以及使用autoBUSTER的晶体精修获得了最终的晶体学35DART模型，其具有176.%的晶体学Rwork和20.5%的Rfreeof20.5%，其中Rwork=||Fobs|-|Fcalc||/|Fobs|并且Rfree等同于Rwork，但针对随机选择的从精修过程中省略的反射的5%进行计算。最终的晶体学35DART模型包含两条链，重链（H）和轻链（L），具有链H的残基1-110、117-239和链L的残基2-110、116-246。模型中存在的非蛋白原子包括574个水分子和5个硫酸根离子。接头区中缺失的氨基酸（11个残基）没有建模到结构中，这是因为缺少电子密度，很可能是由于混乱造成。图26显示晶体学35DART蛋白的晶体结构的图示描绘。在晶体中，晶体学35DART装配为非常致密的球状结构，其非常不同于之前公开的双抗体结构（图27）(参见Carmichael等人,J.Mol.Biol.326:341-351(2003);Perisic,等人,Structure,2(12):1217-1226,(1994))。其具有出人意料的亚基之间的广泛界面和通过两条多肽链之间的二硫键（Cys239(VH1B)-Cys246(VL2A)）稳定结构的明显证据。四个亚基VL1A、VH1B、VL2B和VH2A均对结合界面所有贡献，且最大贡献来自于两条链的框架氨基酸残基。后一观察结果表明用其他CDR构成的其他DART蛋白（其结合不同的肿瘤相关抗原）可能具有与晶体学35DART相似的结构和相似的结构域界面。尽管相对紧密的堆积，但晶体学35DART界面没有像Fab分子中天然存在的界面（其特征在于重链和轻链结构域之间的高度链间缔合）那样高度富集和形状互补。在晶体学35DART中，一条链或结构域中的少量凹陷（其没有通过另一者中的突出而得到互补，产生小的内部堆积缺陷和大的空隙）被晶体结构中的结合水所填充（图28）。晶体学35DART上的两个抗原结合位点彼此分开约40Å，且位于分子的正交相对侧上。在本上下文中，“正交相对侧”意指晶体学35DART上的两个结合位点以~90°的角度彼此相对。抗CD3CDR区远离亚基界面，而抗P-CADCDR区在更邻近的区域内（参见图27）。此外，生成新的单链DART（scDART）变体以解决两条链双抗体错配的问题（可以基于晶体结构使用不同的VH和VL链方向性）。将额外的半胱氨酸残基工程化以引入scDART蛋白内的共价键，从而进一步改善单链双抗体的稳定性。该方法为Dani等人(Prot.Eng.16(3):187-193(2003))的变型，利用进一步分析以将每一位点的品质进行排位。还使用该方法将不同二硫键位置进行工程化以降低二硫键的溶剂可接近性并降低接头长度。例如，引入立体化学上最优的二硫化物的建模位置表明用于半胱氨酸诱变的以下氨基酸残基对(参见图29)：Gln121(VH1B)Gly160(VL1A)、Val129(VH1B)Gly244(VL1A)、Val123(VH1B)Gly160(VL1A)、Gly126(VH1B)Ser242(VL1A)和Ala127(VH1B)Ser242(VL1A)。另外，使用DiscoveryStudio(AccelrysSoftwareInc)稳定性预测方案和Rosettav2.3稳定性方案，将DART变体（包括scDART变体）经结构域间界面中的定点诱变来工程化以填满大的内部空隙/扣（图26），尝试进一步改善结构域间缔合的稳定性。例如，在位置Ala44(VL1A)、Val213(VH2A)、Leu238(VH2A)或Met231(VL2B)通过用相对小的氨基酸替换具有大的芳族侧链的氨基酸如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸来增加侧链体积。基于用于位点特异性生物缀合方法的晶体结构将探查不同位置的单一表面半胱氨酸突变体进一步工程化。实施例16P-钙黏着蛋白153LP-DART的表位作图为了鉴定P-钙黏着蛋白153LP-DART的结合表位，生成了可溶性P-钙黏着蛋白胞外结构域（ECD）-Fc融合蛋白构建体。每一P-钙黏着蛋白-Fc构建体包含信号肽、前肽和P-钙黏着蛋白ECD亚结构域区（ECD1、ECD1-2、ECD1-3、ECD1-4或ECD1-5）（其经可切割接头与人IgG1的铰链和CH2和CH3结构域基因融合），如图34中所示。用于生成ECD-Fc构建体的ECD1、ECD2、ECD3、ECD4和ECD5P-钙黏着蛋白亚结构域片段与在全长P-钙黏着蛋白表位中鉴定的序列一致(UniProtP22223,CADH3,人钙黏着蛋白-3)，其显示于图35中并在表42中进一步表征。表42.生成的P-钙黏着蛋白结构域和亚结构域。结构域残基SEQIDNO:全程P-钙黏着蛋白(UniProtP22223)1-829159P-钙黏着蛋白信号肽1-24160P-钙黏着蛋白前肽25-107161P-钙黏着蛋白胞外结构域1108-215162P-钙黏着蛋白胞外结构域2216-328163P-钙黏着蛋白胞外结构域3329-440164P-钙黏着蛋白胞外结构域4441-546165P-钙黏着蛋白胞外结构域5547-650166P-钙黏着蛋白跨膜和胞质的651-829167P-钙黏着蛋白胞外结构域1-2108-328168P-钙黏着蛋白胞外结构域1-3108-440169P-钙黏着蛋白胞外结构域1-4108-546170P-钙黏着蛋白胞外结构域1-5108-650171所有构建体通过DNA测序进行确认并根据制造商的方法瞬时转染入FreeStyle™293HEK细胞(LifeTechnologies,GrandIsland,NY)并表达5-7天。对于前肽的增强处理，将包含PACE切割酶的表达载体连同含P-钙黏着蛋白的载体共转染。使用标准蛋白A色谱技术(ProteinAFF,GEHealthcare,Piscataway,NJ)后接凝胶过滤尺寸排阻色谱(Superdex200,GEHealthcare,Piscataway,NJ)来纯化目标可溶性蛋白。通过使用可商购的抗人P-钙黏着蛋白单克隆和多克隆抗体的结合ELISA对经纯化的蛋白的纯度和活性进行表征。在蛋白ELISA中使用经纯化的P-钙黏着蛋白ECD-Fc构建体来确定153LP-DART结合P-钙黏着蛋白的哪个ECD亚结构域。表43显示153LP-DART和各种其他抗P-钙黏着蛋白DART分子以及用于证实正确表达和折叠ECD-Fc构建体的多克隆Ab(R&DSystems,Minneapolis,MN)与生成的P-钙黏着蛋白ECD-Fc构建体的结合结果。结果显示，153LP-DART不结合ECD1-Fc或ECD1-2-Fc，但结合包含ECD3的所有构建体（ECD1-3-Fc、ECD1-4-Fc和ECD1-5-Fc）。该数据表明，153LP-DART结合人P-钙黏着蛋白的ECD3。表43.P-钙黏着蛋白DART与P-钙黏着蛋白ECD-Fc构建体的结合。P-cadECD–Fc构建体35EK-DART153EK-DART153LP-DARTPFEK-DART20EK-DART30EK-DART多克隆Ab(AF-761)ECD1-Fc否否否否否是是ECD1-2-Fc否否否是是是是ECD1-3-Fc是是是是是是是ECD1-4-Fc是是是是是是是ECD1-5-Fc是是是是是是是如表24（上文）中所示，153LP-DART不结合小鼠P-钙黏着蛋白，因此153LP-DART识别人P-钙黏着蛋白的ECD3(SEQIDNO:164)上的表位，其中其与来自小鼠P-钙黏着蛋白ECD3(SEQIDNO:172)的序列不同。表44显示人和小鼠P-钙黏着蛋白ECD-3的比对，表明这些直系同源物之间的区别。(;)代表相似的,(.)代表不同的而(–)代表非常不同的残基。表44.人和小鼠P-钙黏着蛋白胞外结构域3（ECD3）的比对。为了确定结合表位和结合亲和力是否对T细胞再靶向细胞毒性测定中的效力有影响，分析了各种抗P-钙黏着蛋白EK-DART的细胞毒性T淋巴细胞（CTL）测定的结果。将细胞毒性值（参见表29）与对可溶性和细胞表面表达的P-钙黏着蛋白的结合亲和力（通过Biacore和ELISA）（参见表14-16、24）进行比较。PF-DART在ECD2内以个位数nM的结合亲和力结合P-钙黏着蛋白并且具有亚nM的CTL细胞毒性活性。35EK-DART(153EK-DART的亲代克隆)在ECD3内以约35nM的结合亲和力结合P-钙黏着蛋白，比PF-DART的小几乎35倍，但仍以相似的效力（亚nM）杀伤。该数据表明ECD3中的结合（其更接近细胞膜）导致更高的CTL效力。153LP-DART还以比35EK-DART（0.5nM）高得多的结合亲和力在ECD3中结合P-钙黏着蛋白，且具有最高的CTL活性（亚pM）。实施例17抗P-钙黏着蛋白CDR的配位作图为了进一步理解互补性决定区（CDR）中哪些氨基酸（AA）残基参与scFv153结合人P-钙黏着蛋白，通过平行定点诱变将所有非丙氨酸CDRAA单独突变为丙氨酸。定点诱变涉及六十三种寡聚物（长度33-45个碱基）（表45）。对于每一寡聚物调整寡聚物长度以具有相当的预测解链温度（Tm）值。设计每一寡聚物为克隆153scFv的有义链的反向互补序列，且在“AGC”（丙氨酸密码子GCT的反向互补序列）的每一侧侧接15-21个碱基。表45.设计的寡聚物使用公开的方案(TonikianR等人,Nat.Protoc.2007;2(6):1368-86)产生单链DNA。简言之，根据制造商方案(Lucigen,Middleton,WI)将噬菌体表达载体转化入CJ236电感受态细胞中，并将0.05%的细胞铺板至LP/Amp平板。过夜生长后，用独立菌落接种六个1-mL培养物（生长于补充100µg/mL氨苄青霉素、10ug/mL氯霉素和1e+10M13KO7的2xTY/2%葡萄糖），并在37℃下生长2小时，随后添加卡那霉素至25µg/mL。在下摇动4个多小时后，合并出现混浊的培养物并扩大至2-L带挡板的烧瓶中的120mL培养物中（补充有100µg/mL氨苄青霉素、25µg/mL卡那霉素、0.25µg/mL尿苷的2xTY/2%葡萄糖）。过夜生长后，经离心（6000rpm，10分钟）回收培养物上清液并向100mL上清液中添加20mLPEG/NaCl，并通过PEG-沉淀纯化噬菌体。将经纯化的噬菌体（重悬于1mLPBS）裂解并根据制造商方案纯化单链的尿嘧啶DNA(QiaprepspinM13试剂盒，目录号:27704)。通过Nanodrop(Thermo)将DNA定量。寡聚物以tris-EDTA缓冲液(50µM于200µL)中的标准化形式定购。接下来，将200皮摩尔的每一种寡聚物(4µL)在96孔板式中在37℃下磷酸化90分钟并65℃热失活20分钟。反应混合物包含以下：4µL寡聚物、2µL10xPNK缓冲液、2µL10mMATP、1µL100mMDTT、11µL水、2µLT4PNK(T4多核苷酸激酶)。在96孔板式中设置定点诱变反应如下：2.2µL单链尿嘧啶模板DNA(200ng)、2µLPfuTurboCx缓冲液、2µL100mMDTT、0.4µLNAD+、0.16µLdNTPs、10µL水、0.2µL(0.5单位的PfuturboCx)、1µLTaqDNA连接酶、2µL的20倍稀释的磷酸化反应物(0.9皮摩尔)。将反应物如下温育：95℃持续3min,55℃持续90sec,68℃持续15min,45℃持续15min。接下来，将1µL(1皮摩尔)5’磷酸化的OmpA寡聚物加入并将反应物进一步如下温育：95℃持续30sec,55℃持续45sec,68℃持续10min,45℃持续15min。在这些温育之后，加入2µL或2单位UDG:尿嘧啶DNA糖苷酶和5单位ExonucleaseIII酶混合物以消化模板，首先在37℃60min随后在65℃20min。最后，合并来自每一反应物的2µL(总计63个反应物)并将0.3µL电穿孔入ER2738电感受态细胞中用于测序。制备用于ELISA的噬菌体表达的scFvscFv可以表达在噬菌体颗粒的表面。为了在其表面上制备噬菌体表达的scFv，将含有1mL2XTY培养基（具有2%葡萄糖/100μg/mL氨苄青霉素）的96深孔板用来自融化的甘油储存液的0.5-1µL（每孔一个克隆）使用QpixTM2菌落挑取器(MolecularDevices,SunnyvaleCA)进行接种，并在37℃(900rpm)下生长~4小时。接下来，加入5μL的1:29稀释的辅助噬菌体(8.3x1013pfu)并将板在37℃下再温育30分钟（不摇动），随后以300rpm温育1小时。将板离心，并将培养基用含有卡那霉素/无葡萄糖的培养基(2XTY，具有50μg/mL卡那霉素和100µg/mL氨苄青霉素)进行替换。将板在25℃(900rpm)下生长过夜，并在离心后收获上清液中的噬菌体。ELIS以测量scFv蛋白与人P-钙黏着蛋白-Fc的结合将P-钙黏着蛋白-ECD1-3-Fc蛋白或阴性对照蛋白（以2μg/mL的浓度于PBS+Ca2+和Mg2+中）在4℃下涂布在96孔NuncMaxisorp®板(ThermoFisherScientific,Madison,CT)上。将板使用PBS+Ca2+和Mg2+洗涤三次，并在室温下在3%牛乳/PBS+Ca2+和Mg2+中封闭1小时。将如上制备的噬菌体样品添加入封闭的板中在室温下持续1小时。将板用PBS+Ca2+和Mg2+洗涤三次，随后加入二级抗体(抗M13-HRP1:2000,GEHealthcare,Piscataway,NJ)。将板在室温下再温育1小时并用PBS+Ca2+和Mg2+洗涤6次。使用TMB(SurModics,EdenPrairie,MN)产生信号，用H2SO4终止反应，并且在EnVision®板读数器(PerkinElmer,Waltham,MA)上在450nm处读取吸光度。评估对人P-钙黏着蛋白的结合通过ELISA测试抗P-钙黏着蛋白scFv153丙氨酸突变体的噬菌体制备物与人P-钙黏着蛋白-Fc蛋白的结合。将数据以总结合信号（OD450）和相比于亲代克隆153的结合百分比的形式作图。随后基于克隆153的结合百分比的标准偏差计算Z分数。该测定的数据呈现于表46和表47中。结果表明噬菌体上scFv表达良好并证明克隆153的预期结合活性。某些CDR残基被认为是重要的，因为突变为Ala后对人P-钙黏着蛋白结合产生负面影响，并且具有低于-1的Z得分。某些CDR残基被认为是中等程度重要的，因为突变为Ala导致-0.2至-1.0的Z得分。这些结果表明H1.8、H2.5、H3.1、H3.7和L3.3是对于人P-钙黏着蛋白结合重要的AA，而H2.6、H2.16、H3.5、H3.9、L1.8、L2.2、L2.3、L3.2和L3.2对于结合是中等程度重要的。表46.抗P-钙黏着蛋白克隆153丙氨酸突变体的结合。表47.抗P-钙黏着蛋白克隆153丙氨酸突变体的结合。本文提供的丙氨酸扫描数据和结构信息（实施例15）暗示，抗P-钙黏着蛋白scFv153中显著数量的CDR残基可以被取代而不会显著影响抗原结合。因此，进行了进一步的分析来确定哪些CDR残基可以被取代而不会显著影响P-钙黏着蛋白结合。表48-65显示使用DiscoveryStudio4.0Stability预测算法的每一位置预测的DeltaDeltaG(DDG)稳定性。稳定性得分（DDG）显示预测的突变对蛋白稳定性的影响。表48.可选的VHCDR1残基(DDG<=1.0kcal/mol)表49可选的VHCDR1残基(DDG<=0.5kcal/mol)表50.可选的VHCDR1残基(DDG<=0kcal/mol)表51.可选的VHCDR2残基(DDG<=1.0kcal/mol)表52.可选的VHCDR2残基(DDG<=0.5kcal/mol)表53.可选的VHCDR2残基(DDG<=0kcal/mol)表54.可选的VHCDR3残基(DDG<=1.0kcal/mol)表55.可选的VHCDR3残基(DDG<=0.5kcal/mol)表56.可选的VHCDR3残基(DDG<=0kcal/mol)表57.可选的VLCDR1残基(DDG<=1.0kcal/mol)表58.可选的VLCDR1残基(DDG<=0.5kcal/mol)表59.可选的VLCDR1残基(DDG<=0kcal/mol)表60.可选的VLCDR2残基(DDG<=1.0kcal/mol)表61.可选的VLCDR2残基(DDG<=0.5kcal/mol)表62.可选的VLCDR2残基(DDG<=0kcal/mol)表63.可选的VLCDR3残基(DDG<=1.0kcal/mol)表64.可选的VLCDR3残基(DDG<=0.5kcal/mol)表65.可选的VLCDR3残基(DDG<=0kcal/mol)表66-71显示在每一CDR位置的人序列的Abysis分析结果。将来自抗P-钙黏着蛋白153的每一CDR与数据库中来自人抗体序列的对应CDR进行比较。该数据库合并了来自若干数据库的所有人序列，所述数据库包括：PDB、Kabat数据库、IMGT数据库、VBASE、和Pfizer的内部数据库。该数据库中的人抗体序列用Abysis进行Kabat编号，并且仅使用与抗P-钙黏着蛋白克隆153中发现的那些长度相同的CDR来计算CDR残基的频率。表66-71显示在每一位置的可选氨基酸，其中所列的残基存在于至少5%或10%的人序列中。在第3列和第4列中还包括原始P-钙黏着蛋白153残基，尽管它们没有落入上述5%或10%的范畴内。表66.可选的VHCDR1残基（Abysis）表67.可选的VHCDR2残基（Abysis）表68.可选的VHCDR3残基（Abysis）表69.可选的VLCDR1残基（Abysis）表70.可选的VLCDR2残基（Abysis）表71.可选的VLCDR3残基（Abysis）本文引用的每一专利、专利申请和公开的公开内容由此以其整体通过引用并入本文。尽管本发明已参考具体的实施方案来进行公开，但显而易见的是，本领域技术人员可以想到本发明的其他实施方案和变化而不背离本发明的真实精神和范围。所附的权利要求包括所有此类实施方案和等同的变化。序列表<110>PfizerInc.Root,Adam<120>双特异性异二聚化双抗体及其用途<130>PC72054A<160>239<170>PatentIn版本3.5<210>1<211>110<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的肽序列<400>1GlnSerValLeuThrGlnProProSerValSerAlaAlaProGlyGln151015LysValThrIleSerCysSerGlySerSerSerAsnIleGlyAsnAsn202530TyrValSerTrpTyrGlnGlnLeuProGlyThrAlaProLysLeuLeu354045IleTyrAspAsnAsnLysArgProSerGlyIleProAspArgPheSer505560GlySerLysSerGlyThrSerAlaThrLeuGlyIleThrGlyLeuGln65707580ThrGlyAspGluAlaAspTyrTyrCysGlyThrTrpAspSerSerLeu859095SerAlaTyrValPheGlyThrGlyThrLysValThrValLeu100105110<210>2<211>118<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的肽序列<400>2GlnMetGlnLeuValGlnSerGlyAlaGluValLysLysProGlyAla151015SerValLysValSerCysLysAlaSerGlyTyrThrPheThrSerTyr202530GlyIleSerTrpValArgGlnAlaProGlyGlnGlyLeuGluTrpMet354045GlyTrpIleSerAlaTyrAsnGlyAsnThrAsnTyrAlaGlnLysLeu505560GlnGlyArgValThrMetThrThrAspThrSerThrSerThrAlaTyr65707580MetGluLeuArgSerLeuArgSerAspAspThrAlaValTyrTyrCys859095AlaLeuIleGlySerGlyValAlaPheAspIleTrpGlyGlnGlyThr100105110MetValThrValSerSer115<210>3<211>110<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的肽序列<400>3GlnSerValValThrGlnProProSerValSerAlaAlaProGlyGln151015LysValThrIleSerCysSerGlySerSerSerAsnIleGlyAsnAsn202530TyrValSerTrpTyrGlnGlnLeuProGlyThrAlaProLysLeuLeu354045IleTyrAspAsnAsnLysArgProSerGlyIleProAspArgPheSer505560GlySerLysSerGlyThrSerAlaThrLeuGlyIleThrGlyLeuGln65707580ThrGlyAspGluAlaAspTyrTyrCysGlyThrTrpAspSerSerLeu859095SerAlaTrpValPheGlyGlyGlyThrLysLeuThrValLeu100105110<210>4<211>118<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的肽序列<400>4GluValGlnLeuValGlnSerGlyAlaGluValLysLysProGlyAla151015SerValLysValSerCysLysAlaSerGlyTyrThrPheThrSerTyr202530GlyIleSerTrpValArgGlnAlaProGlyGlnGlyLeuGluTrpMet354045GlyTrpIleSerAlaTyrAsnGlyAsnThrAsnTyrAlaGlnLysLeu505560GlnGlyArgValThrMetThrThrAspThrSerThrSerThrAlaTyr65707580MetGluLeuArgSerLeuArgSerAspAspThrAlaValTyrTyrCys859095AlaThrIleAspThrAlaSerAlaPheAspIleTrpGlyGlnGlyThr100105110MetValThrValSerSer115<210>5<211>110<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的肽序列<400>5GlnSerValLeuThrGlnProProSerValSerAlaAlaProGlyGln151015LysValThrIleSerCysSerGlySerSerSerAsnIleGlyAsnAsn202530TyrValSerTrpTyrGlnGlnLeuProGlyThrAlaProLysLeuLeu354045IleTyrAspAsnAsnLysArgProSerGlyIleProAspArgPheSer505560GlySerLysSerGlyThrSerAlaThrLeuGlyIleThrGlyLeuGln65707580ThrGlyAspGluAlaAspTyrTyrCysGlyThrTrpAspSerSerLeu859095SerAlaValValPheGlyGlyGlyThrLysLeuThrValLeu100105110<210>6<211>118<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的肽序列<400>6GluValGlnLeuValGlnSerGlyAlaGluValLysLysProGlyAla151015SerValLysValSerCysLysAlaSerGlyTyrThrPheThrSerTyr202530GlyIleSerTrpValArgGlnAlaProGlyGlnGlyLeuGluTrpMet354045GlyTrpIleSerAlaTyrAsnGlyAsnThrAsnTyrAlaGlnLysLeu505560GlnGlyArgValThrMetThrThrAspThrSerThrSerThrAlaTyr65707580MetGluLeuArgSerLeuArgSerAspAspThrAlaValTyrTyrCys859095AlaThrIleAspThrAlaSerAlaPheAspIleTrpGlyGlnGlyThr100105110MetValThrValSerSer115<210>7<211>110<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的肽序列<400>7GlnSerValLeuThrGlnProProSerValSerAlaAlaProGlyGln151015LysValThrIleSerCysSerGlySerSerSerAsnIleGlyAsnAsn202530TyrValSerTrpTyrGlnGlnLeuProGlyThrAlaProLysLeuLeu354045IleTyrAspAsnAsnLysArgProSerGlyIleProAspArgPheSer505560GlySerLysSerGlyThrSerAlaThrLeuGlyIleThrGlyLeuGln65707580ThrGlyAspGluAlaAspTyrTyrCysGlyThrTrpAspSerSerLeu859095SerGlyValValPheGlyGlyGlyThrLysLeuThrValLeu100105110<210>8<211>118<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的肽序列<400>8GluValGlnLeuValGlnSerGlyAlaGluValLysLysProGlyAla151015SerValLysValSerCysLysAlaSerGlyTyrThrPheThrSerTyr202530GlyIleSerTrpValArgGlnAlaProGlyGlnGlyLeuGluTrpMet354045GlyTrpIleSerAlaTyrAsnGlyAsnThrAsnTyrAlaGlnLysLeu505560GlnGlyArgValThrMetThrThrAspThrSerThrSerThrAlaTyr65707580MetGluLeuArgSerLeuArgSerAspAspThrAlaValTyrTyrCys859095AlaThrIleAspThrAlaAsnAlaPheGlyIleTrpGlyGlnGlyThr100105110MetValThrValSerSer115<210>9<211>110<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的肽序列<400>9GlnSerValLeuThrGlnProProSerValSerAlaAlaProGlyGln151015LysValThrIleSerCysSerGlySerSerSerAsnIleGlyAsnAsn202530TyrValSerTrpTyrGlnGlnLeuProGlyThrAlaProLysLeuLeu354045IleTyrAspAsnAsnLysArgProSerGlyIleProAspArgPheSer505560GlySerLysSerGlyThrSerAlaThrLeuGlyIleThrGlyLeuGln65707580ThrGlyAspGluAlaAspTyrTyrCysGlyThrTrpAspSerSerLeu859095SerSerTyrValPheGlyThrGlyThrLysValThrValLeu100105110<210>10<211>118<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的肽序列<400>10GluValGlnLeuValGlnSerGlyAlaGluValLysLysProGlyAla151015SerValLysValSerCysLysAlaSerGlyTyrThrPheThrSerTyr202530GlyIleSerTrpValArgGlnAlaProGlyGlnGlyLeuGluTrpMet354045GlyTrpIleSerAlaTyrAsnGlyAsnThrAsnTyrAlaGlnLysLeu505560GlnGlyArgValThrMetThrThrAspThrSerThrSerThrAlaTyr65707580MetGluLeuArgSerLeuArgSerAspAspThrAlaValTyrTyrCys859095AlaThrIleAspThrAlaThrAlaPheAspIleTrpGlyGlnGlyThr100105110MetValThrValSerSer115<210>11<211>110<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的肽序列<400>11GlnSerValLeuThrGlnProProSerValSerAlaAlaProGlyGln151015LysValThrIleSerCysSerGlySerSerSerAsnIleGlyAsnAsn202530TyrValSerTrpTyrGlnGlnLeuProGlyThrAlaProLysLeuLeu354045IleTyrAspAsnAsnLysArgProSerGlyIleProAspArgPheSer505560GlySerLysSerGlyThrSerAlaThrLeuGlyIleThrGlyLeuGln65707580ThrGlyAspGluAlaAspTyrTyrCysGlyThrTrpAspSerSerLeu859095SerAlaTyrValPheGlyThrGlyThrLysValThrValLeu100105110<210>12<211>118<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的肽序列<400>12GluValGlnLeuValGlnSerGlyAlaGluValLysLysProGlyAla151015SerValLysValSerCysLysAlaSerGlyTyrThrPheThrSerTyr202530GlyPheSerTrpMetArgGlnAlaProGlyGlnGlyLeuGluTrpMet354045GlyTrpIleSerAlaTyrAsnGlyAsnThrAsnTyrAlaGlnLysLeu505560GlnGlyArgValThrMetThrThrAspThrSerThrSerThrAlaTyr65707580MetGluLeuArgSerLeuArgSerAspAspThrAlaValTyrTyrCys859095AlaThrIleAspThrAlaSerAlaPheAspIleTrpGlyGlnGlyThr100105110MetValThrValSerSer115<210>13<211>110<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的肽序列<400>13GlnSerValLeuThrGlnProProSerValSerAlaAlaProGlyGln151015LysValThrIleSerCysSerGlySerSerSerAsnIleGlyAsnAsn202530TyrValSerTrpTyrGlnGlnLeuProGlyThrAlaProLysLeuLeu354045IleTyrAspAsnAsnLysArgProSerGlyIleProAspArgPheSer505560GlySerLysSerGlyThrSerAlaThrLeuGlyIleThrGlyLeuGln65707580AlaGlyAspGluAlaAspTyrTyrCysGlyThrTrpAspSerSerLeu859095SerAlaTyrValPheGlyThrGlyThrLysValThrValLeu100105110<210>14<211>118<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的肽序列<400>14GluValGlnLeuValGlnSerGlyAlaGluValLysLysProGlyAla151015SerValLysValSerCysLysAlaSerGlyTyrThrPheThrSerTyr202530GlyIleSerTrpValArgGlnAlaProGlyGlnGlyLeuGluTrpMet354045GlyTrpIleSerAlaTyrAsnGlyAsnThrAsnTyrAlaGlnLysLeu505560GlnGlyArgValThrMetThrThrAspThrSerThrSerThrAlaTyr65707580MetGluLeuArgSerLeuArgSerAspAspThrAlaValTyrTyrCys859095AlaThrIleAspThrAlaAsnAlaPheAspIleTrpGlyGlnGlyThr100105110MetValThrValSerSer115<210>15<211>110<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的肽序列<400>15GlnSerValLeuThrGlnProProSerValSerAlaAlaProGlyGln151015LysValThrIleSerCysSerGlySerSerSerAsnIleGlyAsnAsn202530TyrValSerTrpTyrGlnGlnLeuProGlyThrAlaProLysLeuLeu354045IleTyrAspAsnAsnLysArgProSerGlyIleProAspArgPheSer505560GlySerLysSerGlyThrSerAlaThrLeuGlyIleThrGlyLeuGln65707580ThrGlyAspGluAlaAspTyrTyrCysGlyThrTrpAspSerSerLeu859095SerAlaTyrValPheGlyThrGlyThrLysValThrValLeu100105110<210>16<211>118<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的肽序列<400>16GluValGlnLeuValGlnSerGlyAlaGluValLysLysProGlyAla151015SerValLysValSerCysLysAlaSerGlyTyrThrPheThrSerTyr202530GlyIleSerTrpValArgGlnAlaProGlyGlnGlyLeuGluTrpMet354045GlyTrpIleSerAlaTyrAsnGlyAsnThrAsnTyrAlaGlnLysLeu505560GlnGlyArgValThrMetThrThrAspThrSerThrSerThrAlaTyr65707580MetGluLeuArgSerLeuArgSerAspAspThrAlaValTyrTyrCys859095AlaThrIleAspThrAlaAsnAlaPheAspIleTrpGlyGlnGlyThr100105110MetValThrValSerSer115<210>17<211>110<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的肽序列<400>17GlnSerValLeuThrGlnProProSerValSerAlaAlaProGlyGln151015LysValThrIleSerCysSerGlySerSerSerAsnIleGlyAsnAsn202530TyrValSerTrpTyrGlnGlnLeuProGlyThrAlaProLysLeuLeu354045IleTyrAspAsnAsnLysArgProSerGlyIleProAspArgPheSer505560GlySerLysSerGlyThrSerAlaThrLeuGlyIleThrGlyLeuGln65707580ThrGlyAspGluAlaAspTyrTyrCysGlyThrTrpAspSerSerLeu859095SerAlaValValPheGlyGlyGlyThrLysLeuThrValLeu100105110<210>18<211>118<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的肽序列<400>18GluValGlnLeuValGlnSerGlyAlaGluValLysLysProGlyAla151015SerValLysValSerCysLysAlaSerGlyTyrThrPheThrSerTyr202530GlyIleSerTrpValArgGlnAlaProGlyGlnGlyLeuGluTrpMet354045GlyTrpIleSerAlaTyrAsnGlyAsnThrAsnTyrAlaGlnLysLeu505560GlnGlyArgValThrMetThrThrAspThrSerThrSerThrAlaTyr65707580MetGluLeuArgSerLeuArgSerAspAspThrAlaValTyrTyrCys859095AlaThrIleAspThrAlaAsnAlaPheAspIleTrpGlyGlnGlyThr100105110MetValThrValSerSer115<210>19<211>110<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的肽序列<400>19GlnSerValLeuThrGlnProProSerValSerAlaAlaProGlyGln151015LysValThrIleSerCysSerGlySerArgSerAsnIleGlyAsnAsn202530TyrValSerTrpTyrGlnGlnLeuProGlyThrAlaProLysLeuLeu354045IleTyrAspSerAsnLysArgProSerGlyIleProAspArgPheSer505560GlySerLysSerGlyThrSerAlaThrLeuGlyIleThrGlyLeuGln65707580ThrGlyAspGluAlaAspTyrTyrCysGlyThrTrpAspSerSerLeu859095SerSerTrpValPheGlyGlyGlyThrLysLeuThrValLeu100105110<210>20<211>118<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的肽序列<400>20GluValGlnLeuValGlnSerGlyAlaGluValLysLysProGlyAla151015SerValLysValSerCysLysAlaSerGlyTyrThrPheThrSerTyr202530GlyIleSerTrpValArgGlnAlaProGlyGlnGlyLeuGluTrpMet354045GlyTrpIleSerAlaTyrAsnGlyAsnThrAsnTyrAlaGlnLysLeu505560GlnGlyArgValThrMetThrThrAspThrSerThrSerThrAlaTyr65707580MetGluLeuArgSerLeuArgSerAspAspThrAlaValTyrTyrCys859095AlaThrIleAspThrAlaAsnAlaPheAspIleTrpGlyGlnGlyThr100105110MetValThrValSerSer115<210>21<211>110<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的肽序列<400>21GlnSerValValThrGlnProProSerValSerAlaAlaProGlyGln151015LysValThrIleSerCysSerGlySerSerSerAsnIleGlyAsnAsn202530TyrValSerTrpTyrGlnGlnLeuProGlyThrAlaProLysLeuLeu354045IleTyrAspAsnAsnLysArgProSerGlyIleProAspArgPheSer505560GlySerLysSerGlyThrSerAlaThrLeuGlyIleThrGlyLeuGln65707580ThrGlyAspGluAlaAspTyrTyrCysGlyThrTrpAspSerSerLeu859095SerAlaTyrValPheGlyThrGlyThrLysValThrValLeu100105110<210>22<211>118<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的肽序列<400>22GluValGlnLeuValGlnSerGlyAlaGluValLysLysProGlyAla151015SerValLysValSerCysLysAlaSerGlyTyrThrPheThrSerTyr202530GlyIleSerTrpValArgGlnAlaProGlyGlnGlyLeuGluTrpMet354045GlyTrpIleSerAlaTyrAsnGlyAsnThrAsnTyrAlaGlnLysLeu505560GlnGlyArgValThrMetThrThrAspThrSerThrSerThrAlaTyr65707580MetGluLeuArgSerLeuArgSerAspAspThrAlaValTyrTyrCys859095AlaThrIleAspThrAlaAsnAlaPheAspIleTrpGlyGlnGlyThr100105110MetValThrValSerSer115<210>23<211>110<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的肽序列<400>23GlnSerValValThrGlnProProSerValSerAlaAlaProGlyGln151015LysValThrIleSerCysSerGlySerSerSerAsnIleGlyAsnAsn202530TyrValSerTrpTyrGlnGlnLeuProGlyThrAlaProLysLeuLeu354045IleTyrAspAsnAsnLysArgProSerGlyIleProAspArgPheSer505560GlySerLysSerGlyThrSerAlaThrLeuGlyIleThrGlyLeuGln65707580ThrGlyAspGluAlaAspTyrTyrCysGlyThrTrpAspSerSerLeu859095SerAlaTrpValPheGlyGlyGlyThrLysLeuThrValLeu100105110<210>24<211>118<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的肽序列<400>24GluValGlnLeuValGlnSerGlyAlaGluValLysLysProGlyAla151015SerValLysValSerCysLysAlaSerGlyTyrThrPheThrSerTyr202530GlyIleSerTrpValArgGlnAlaProGlyGlnGlyLeuGluTrpMet354045GlyTrpIleSerAlaTyrAsnGlyAsnThrAsnTyrAlaGlnLysLeu505560GlnGlyArgValThrMetThrThrAspThrSerThrSerThrAlaTyr65707580MetGluLeuArgSerLeuArgSerAspAspThrAlaValTyrTyrCys859095AlaThrIleAsnAlaProAsnAsnPheAspIleTrpGlyGlnGlyThr100105110MetValThrValSerSer115<210>25<211>5<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的肽序列<400>25SerTyrGlyIleSer15<210>26<211>17<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的肽序列<400>26TrpIleSerAlaTyrAsnGlyAsnThrAsnTyrAlaGlnLysLeuGln151015Gly<210>27<211>9<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的肽序列<400>27IleGlySerGlyValAlaPheAspIle15<210>28<211>9<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的肽序列<400>28IleAspThrAlaSerAlaPheAspIle15<210>29<211>9<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的肽序列<400>29IleAspThrAlaAsnAlaPheGlyIle15<210>30<211>9<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的肽序列<400>30IleAspThrAlaThrAlaPheAspIle15<210>31<211>9<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的肽序列<400>31IleAspThrAlaAsnAlaPheAspIle15<210>32<211>9<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的肽序列<400>32IleAsnAlaProAsnAsnPheAspIle15<210>33<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的肽序列<400>33GlyTyrThrPheThrSerTyrGlyIleSer1510<210>34<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的肽序列<400>34TrpIleSerAlaTyrAsnGlyAsnThrAsn1510<210>35<211>13<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的肽序列<400>35SerGlySerSerSerAsnIleGlyAsnAsnTyrValSer1510<210>36<211>13<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的肽序列<400>36SerGlySerArgSerAsnIleGlyAsnAsnTyrValSer1510<210>37<211>7<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的肽序列<400>37AspAsnAsnLysArgProSer15<210>38<211>7<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的肽序列<400>38AspSerAsnLysArgProSer15<210>39<211>11<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的肽序列<400>39GlyThrTrpAspSerSerLeuSerAlaTyrVal1510<210>40<211>11<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的肽序列<400>40GlyThrTrpAspSerSerLeuSerAlaTrpVal1510<210>41<211>11<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的肽序列<400>41GlyThrTrpAspSerSerLeuSerAlaValVal1510<210>42<211>11<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的肽序列<400>42GlyThrTrpAspSerSerLeuSerGlyValVal1510<210>43<211>11<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的肽序列<400>43GlyThrTrpAspSerSerLeuSerSerTyrVal1510<210>44<211>11<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的肽序列<400>44GlyThrTrpAspSerSerLeuSerSerTrpVal1510<210>45<211>125<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的肽序列<400>45GluValGlnLeuValGluSerGlyGlyGlyLeuValGlnProGlyGly151015SerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyPheThrPheSerThrTyr202530AlaMetAsnTrpValArgGlnAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpVal354045GlyArgIleArgSerLysTyrAsnAsnTyrAlaThrTyrTyrAlaAsp505560SerValLysGlyArgPheThrIleSerArgAspAspSerLysAsnSer65707580LeuTyrLeuGlnMetAsnSerLeuLysThrGluAspThrAlaValTyr859095TyrCysValArgHisGlyAsnPheGlyAsnSerTyrValSerTrpPhe100105110AlaTyrTrpGlyGlnGlyThrLeuValThrValSerSer115120125<210>46<211>125<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的肽序列<400>46GluValGlnLeuValGluSerGlyGlyGlyLeuValGlnProGlyGly151015SerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyPheThrPheAsnThrTyr202530AlaMetAsnTrpValArgGlnAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpVal354045AlaArgIleArgSerLysTyrAsnAsnTyrAlaThrTyrTyrAlaAsp505560SerValLysAspArgPheThrIleSerArgAspAspSerLysAsnSer65707580LeuTyrLeuGlnMetAsnSerLeuLysThrGluAspThrAlaValTyr859095TyrCysValArgHisGlyAsnPheGlyAsnSerTyrValSerTrpPhe100105110AlaTyrTrpGlyGlnGlyThrLeuValThrValSerSer115120125<210>47<211>109<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的肽序列<400>47GlnAlaValValThrGlnGluProSerLeuThrValSerProGlyGly151015ThrValThrLeuThrCysArgSerSerThrGlyAlaValThrThrSer202530AsnTyrAlaAsnTrpValGlnGlnLysProGlyGlnAlaProArgGly354045LeuIleGlyGlyThrAsnLysArgAlaProTrpThrProAlaArgPhe505560SerGlySerLeuLeuGlyGlyLysAlaAlaLeuThrIleThrGlyAla65707580GlnAlaGluAspGluAlaAspTyrTyrCysAlaLeuTrpTyrSerAsn859095LeuTrpValPheGlyGlyGlyThrLysLeuThrValLeu100105<210>48<211>5<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的肽序列<400>48ThrTyrAlaMetAsn15<210>49<211>19<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的肽序列<400>49ArgIleArgSerLysTyrAsnAsnTyrAlaThrTyrTyrAlaAspSer151015ValLysGly<210>50<211>19<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的肽序列<400>50ArgIleArgSerLysTyrAsnAsnTyrAlaThrTyrTyrAlaAspSer151015ValLysAsp<210>51<211>14<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的肽序列<400>51HisGlyAsnPheGlyAsnSerTyrValSerTrpPheAlaTyr1510<210>52<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的肽序列<400>52GlyPheThrPheSerThrTyrAlaMetAsn1510<210>53<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的肽序列<400>53GlyPheThrPheAsnThrTyrAlaMetAsn1510<210>54<211>12<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的肽序列<400>54ArgIleArgSerLysTyrAsnAsnTyrAlaThrTyr1510<210>55<211>14<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的肽序列<400>55ArgSerSerThrGlyAlaValThrThrSerAsnTyrAlaAsn1510<210>56<211>7<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的肽序列<400>56GlyThrAsnLysArgAlaPro15<210>57<211>9<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的肽序列<400>57AlaLeuTrpTyrSerAsnLeuTrpVal15<210>58<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成的核苷酸序列<400>58ggagattttcaacgtgaa18<210>59<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成的核苷酸序列<400>59ctcttctgagatgagtttttg21<210>60<211>5<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的肽序列<400>60CysProProCysPro15<210>61<211>28<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的肽序列<400>61GluValAlaAlaLeuGluLysGluValAlaAlaLeuGluLysGluVal151015AlaAlaLeuGluLysGluValAlaAlaLeuGluLys2025<210>62<211>28<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的肽序列<400>62LysValAlaAlaLeuLysGluLysValAlaAlaLeuLysGluLysVal151015AlaAlaLeuLysGluLysValAlaAlaLeuLysGlu2025<210>63<211>216<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的肽序列<400>63AlaProGluAlaAlaGlyAlaProSerValPheLeuPheProProLys151015ProLysAspThrLeuMetIleSerArgThrProGluValThrCysVal202530ValValAspValSerHisGluAspProGluValLysPheAsnTrpTyr354045ValAspGlyValGluValHisAsnAlaLysThrLysProArgGluGlu505560GlnTyrAsnSerThrTyrArgValValSerValLeuThrValLeuHis65707580GlnAspTrpLeuAsnGlyLysGluTyrLysCysLysValSerAsnLys859095AlaLeuProAlaProIleGluLysThrIleSerLysAlaLysGlyGln100105110ProArgGluProGlnValCysThrLeuProProSerArgGluGluMet115120125ThrLysAsnGlnValSerLeuTrpCysLeuValLysGlyPheTyrPro130135140SerAspIleAlaValGluTrpGluSerAsnGlyGlnProGluAsnAsn145150155160TyrLysThrThrProProValLeuAspSerAspGlySerPhePheLeu165170175TyrSerLysLeuThrValAspLysSerArgTrpGlnGlnGlyAsnVal180185190PheSerCysSerValMetHisGluAlaLeuHisAsnHisTyrThrGln195200205LysSerLeuSerLeuSerProGly210215<210>64<211>216<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的肽序列<400>64AlaProGluAlaAlaGlyAlaProSerValPheLeuPheProProLys151015ProLysAspThrLeuMetIleSerArgThrProGluValThrCysVal202530ValValAspValSerHisGluAspProGluValLysPheAsnTrpTyr354045ValAspGlyValGluValHisAsnAlaLysThrLysProArgGluGlu505560GlnTyrAsnSerThrTyrArgValValSerValLeuThrValLeuHis65707580GlnAspTrpLeuAsnGlyLysGluTyrLysCysLysValSerAsnLys859095AlaLeuProAlaProIleGluLysThrIleSerLysAlaLysGlyGln100105110ProArgGluProGlnValTyrThrLeuProProCysArgGluGluMet115120125ThrLysAsnGlnValSerLeuSerCysAlaValLysGlyPheTyrPro130135140SerAspIleAlaValGluTrpGluSerAsnGlyGlnProGluAsnAsn145150155160TyrLysThrThrProProValLeuAspSerAspGlySerPhePheLeu165170175ValSerLysLeuThrValAspLysSerArgTrpGlnGlnGlyAsnVal180185190PheSerCysSerValMetHisGluAlaLeuHisAsnHisTyrThrGln195200205LysSerLeuSerLeuSerProGly210215<210>65<211>217<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的肽序列<400>65AlaProGluAlaAlaGlyAlaProSerValPheLeuPheProProLys151015ProLysAspThrLeuMetIleSerArgThrProGluValThrCysVal202530ValValAspValSerHisGluAspProGluValLysPheAsnTrpTyr354045ValAspGlyValGluValHisAsnAlaLysThrLysProArgGluGlu505560GlnTyrAsnSerThrTyrArgValValSerValLeuThrValLeuHis65707580GlnAspTrpLeuAsnGlyLysGluTyrLysCysLysValSerAsnLys859095AlaLeuProAlaProIleGluLysThrIleSerLysAlaLysGlyGln100105110ProArgGluProGlnValTyrThrLeuProProSerArgGluGluMet115120125ThrLysAsnGlnValSerLeuSerCysAlaValLysGlyPheTyrPro130135140SerAspIleAlaValGluTrpGluSerAsnGlyGlnProGluAsnAsn145150155160TyrLysThrThrProProValLeuAspSerAspGlySerPhePheLeu165170175ValSerLysLeuThrValAspLysSerArgTrpGlnGlnGlyAsnVal180185190PheSerCysSerValMetHisGluAlaLeuHisAsnArgTyrThrGln195200205LysSerLeuSerLeuSerProGlyLys210215<210>66<211>217<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的肽序列<400>66AlaProGluAlaAlaGlyAlaProSerValPheLeuPheProProLys151015ProLysAspThrLeuMetIleSerArgThrProGluValThrCysVal202530ValValAspValSerHisGluAspProGluValLysPheAsnTrpTyr354045ValAspGlyValGluValHisAsnAlaLysThrLysProArgGluGlu505560GlnTyrAsnSerThrTyrArgValValSerValLeuThrValLeuHis65707580GlnAspTrpLeuAsnGlyLysGluTyrLysCysLysValSerAsnLys859095AlaLeuProAlaProIleGluLysThrIleSerLysAlaLysGlyGln100105110ProArgGluProGlnValTyrThrLeuProProSerArgGluGluMet115120125ThrLysAsnGlnValSerLeuTrpCysLeuValLysGlyPheTyrPro130135140SerAspIleAlaValGluTrpGluSerAsnGlyGlnProGluAsnAsn145150155160TyrLysThrThrProProValLeuAspSerAspGlySerPhePheLeu165170175TyrSerLysLeuThrValAspLysSerArgTrpGlnGlnGlyAsnVal180185190PheSerCysSerValMetHisGluAlaLeuHisAsnHisTyrThrGln195200205LysSerLeuSerLeuSerProGlyLys210215<210>67<211>6<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成的核苷酸序列<400>67tccgga6<210>68<211>8<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的肽序列<400>68GlyGlyGlySerGlyGlyGlyGly15<210>69<211>9<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的肽序列<400>69GlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGly15<210>70<211>7<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的肽序列<400>70GlyPheAsnArgGlyGluCys15<210>71<211>7<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的肽序列<400>71GlyValGluProLysSerCys15<210>72<211>6<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的肽序列<400>72GlyGlyCysGlyGlyGly15<210>73<211>6<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的肽序列<400>73GlyCysProProCysPro15<210>74<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的肽序列<400>74GlyGlyThrGlyGlyCysProProCysPro1510<210>75<211>16<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的肽序列<400>75GlyGluProLysSerSerAspLysThrHisThrCysProProCysPro151015<210>76<211>21<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的肽序列<400>76GlyGlyThrGlyGlyGlyGluProLysSerSerAspLysThrHisThr151015CysProProCysPro20<210>77<211>9<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的肽序列<400>77LysAlaProSerSerSerProMetGlu15<210>78<211>6<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的肽序列<400>78HisHisHisHisHisHis15<210>79<211>13<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的肽序列<400>79GlyGlyCysGlyGlyAspTyrLysAspAspAspAspLys1510<210>80<211>277<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的肽序列<400>80GlnSerValLeuThrGlnProProSerValSerAlaAlaProGlyGln151015LysValThrIleSerCysSerGlySerSerSerAsnIleGlyAsnAsn202530TyrValSerTrpTyrGlnGlnLeuProGlyThrAlaProLysLeuLeu354045IleTyrAspAsnAsnLysArgProSerGlyIleProAspArgPheSer505560GlySerLysSerGlyThrSerAlaThrLeuGlyIleThrGlyLeuGln65707580ThrGlyAspGluAlaAspTyrTyrCysGlyThrTrpAspSerSerLeu859095SerAlaValValPheGlyGlyGlyThrLysLeuThrValLeuGlyGly100105110GlySerGlyGlyGlyGlyGluValGlnLeuValGluSerGlyGlyGly115120125LeuValGlnProGlyGlySerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGly130135140PheThrPheSerThrTyrAlaMetAsnTrpValArgGlnAlaProGly145150155160LysGlyLeuGluTrpValGlyArgIleArgSerLysTyrAsnAsnTyr165170175AlaThrTyrTyrAlaAspSerValLysGlyArgPheThrIleSerArg180185190AspAspSerLysAsnSerLeuTyrLeuGlnMetAsnSerLeuLysThr195200205GluAspThrAlaValTyrTyrCysValArgHisGlyAsnPheGlyAsn210215220SerTyrValSerTrpPheAlaTyrTrpGlyGlnGlyThrLeuValThr225230235240ValSerSerGlyGlyCysGlyGlyGlyLysValAlaAlaLeuLysGlu245250255LysValAlaAlaLeuLysGluLysValAlaAlaLeuLysGluLysVal260265270AlaAlaLeuLysGlu275<210>81<211>270<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的肽序列<400>81GlnAlaValValThrGlnGluProSerLeuThrValSerProGlyGly151015ThrValThrLeuThrCysArgSerSerThrGlyAlaValThrThrSer202530AsnTyrAlaAsnTrpValGlnGlnLysProGlyGlnAlaProArgGly354045LeuIleGlyGlyThrAsnLysArgAlaProTrpThrProAlaArgPhe505560SerGlySerLeuLeuGlyGlyLysAlaAlaLeuThrIleThrGlyAla65707580GlnAlaGluAspGluAlaAspTyrTyrCysAlaLeuTrpTyrSerAsn859095LeuTrpValPheGlyGlyGlyThrLysLeuThrValLeuGlyGlyGly100105110GlySerGlyGlyGlyGlyGluValGlnLeuValGlnSerGlyAlaGlu115120125ValLysLysProGlyAlaSerValLysValSerCysLysAlaSerGly130135140TyrThrPheThrSerTyrGlyIleSerTrpValArgGlnAlaProGly145150155160GlnGlyLeuGluTrpMetGlyTrpIleSerAlaTyrAsnGlyAsnThr165170175AsnTyrAlaGlnLysLeuGlnGlyArgValThrMetThrThrAspThr180185190SerThrSerThrAlaTyrMetGluLeuArgSerLeuArgSerAspAsp195200205ThrAlaValTyrTyrCysAlaThrIleAspThrAlaSerAlaPheAsp210215220IleTrpGlyGlnGlyThrMetValThrValSerSerGlyGlyCysGly225230235240GlyGlyGluValAlaAlaLeuGluLysGluValAlaAlaLeuGluLys245250255GluValAlaAlaLeuGluLysGluValAlaAlaLeuGluLys260265270<210>82<211>277<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的肽序列<400>82GlnSerValLeuThrGlnProProSerValSerAlaAlaProGlyGln151015LysValThrIleSerCysSerGlySerSerSerAsnIleGlyAsnAsn202530TyrValSerTrpTyrGlnGlnLeuProGlyThrAlaProLysLeuLeu354045IleTyrAspAsnAsnLysArgProSerGlyIleProAspArgPheSer505560GlySerLys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