使用重叠非等位基因特异性引物和等位基因特异性阻断剂寡核苷酸的组合物进行等位基因特异性扩增的制作方法

文档序号:11109692阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种寡核苷酸组合物,其包含:

阻断剂寡核苷酸,其在3’端或3’端附近包含功能基团或非互补序列区域,其阻止酶促延伸,其中所述阻断剂寡核苷酸包含具有靶中性子序列和阻断剂可变子序列的第一序列,其中所述阻断剂可变子序列在其3’和5’端被所述靶中性子序列侧接,并且与该靶中性子序列连续;和

第一引物寡核苷酸,所述第一引物寡核苷酸足以诱导酶促延伸,其中所述第一引物寡核苷酸包含第二序列,其中所述第二序列与所述靶中性子序列重叠至少5个核苷酸,从而所述第二序列包含重叠子序列和非重叠子序列,并且其中所述第二序列不包含所述阻断剂可变子序列。

2.如权利要求1所述的寡核苷酸组合物,其中所述功能基团包含3-碳间隔子或双脱氧核苷酸。

3.如权利要求1所述的寡核苷酸组合物,其中所述重叠子序列包含所述靶中性子序列的5’端的部分,其中所述部分为约5个核苷酸至约40个核苷酸。

4.如权利要求1所述的寡核苷酸组合物,其中所述重叠子序列包含所述靶中性子序列的5’端的部分,其中所述部分为约7个核苷酸至约30个核苷酸。

5.如权利要求1所述的寡核苷酸组合物,其中所述第二序列产生杂交标准自由能(ΔG°PT)并且所述第一序列产生杂交标准自由能(ΔG°BT),满足下述条件:

+2kcal/mol≥ΔG°PT-ΔG°BT≥-8kcal/mol。

6.如权利要求1所述的寡核苷酸组合物,其中所述非重叠子序列产生杂交标准自由能(ΔG°3),满足下述条件:

-4kcal/mol≥ΔG°3≥-12kcal/mol。

7.如权利要求1所述的寡核苷酸组合物,其中所述阻断剂寡核苷酸的浓度比所述第一引物寡核苷酸的浓度高约2-约10000倍。

8.如权利要求1所述的寡核苷酸组合物,其中所述阻断剂寡核苷酸的浓度比所述第一引物寡核苷酸的浓度高约5-约1,000倍。

9.如权利要求1所述的寡核苷酸组合物,其还包含足以诱导酶促延伸的第二引物寡核苷酸,其中所述第二引物寡核苷酸包含第三序列,其中所述第三序列不与所述第一序列或第二序列重叠,并且其中所述第三序列是靶中性的并且足以与所述第一引物寡核苷酸使用以通过聚合酶链式反应来扩增核酸区域。

10.如权利要求9所述的寡核苷酸组合物,其还包含第二阻断剂寡核苷酸,其在3’端或3’端附近包含功能基团或第二非互补序列区域,其阻止酶促延伸,其中所述第二阻断剂寡核苷酸包含具有第二靶中性子序列和第二阻断剂可变子序列的第四序列,其中所述第二阻断剂可变子序列是所述阻断剂可变子序列的互补序列,其中所述第二阻断剂可变子序列在其3’和5’端被所述第二靶中性子序列侧接,并且与该第二靶中性子序列连续;其中所述第三序列与所述第二靶中性子序列重叠至少5个核苷酸,从而所述第三序列包含第二重叠子序列和第二非重叠子序列,并且其中所述第三序列不包含所述第二阻断剂可变子序列。

11.如权利要求10所述的寡核苷酸组合物,其中所述第二功能基团包含3-碳间隔子或双脱氧核苷酸。

12.如权利要求10所述的寡核苷酸组合物,其中所述第二重叠子序列包含所述第二靶中性子序列的5’端的部分,其中所述部分为约5个核苷酸至约40个核苷酸。

13.如权利要求10所述的寡核苷酸组合物,其中所述第二重叠子序列包含所述第二靶中性子序列的5’端的部分,其中所述部分为约7个核苷酸至约30个核苷酸。

14.如权利要求10所述的寡核苷酸组合物,其中所述第三序列产生杂交标准自由能(ΔG°PT2)并且所述第四序列产生杂交标准自由能(ΔG°BT2),满足下述条件:

+2kcal/mol≥ΔG°PT2-ΔG°BT2≥-8kcal/mol。

15.如权利要求10所述的寡核苷酸组合物,其中所述第二非重叠子序列产生杂交标准自由能(ΔG°6),满足下述条件:

-4kcal/mol≥ΔG°3≥-12kcal/mol。

16.如权利要求10所述的寡核苷酸组合物,其中所述第二阻断剂寡核苷酸的浓度比所述第二引物寡核苷酸的浓度高约2-约10,000倍。

17.如权利要求10所述的寡核苷酸组合物,其中所述第二阻断剂寡核苷酸的浓度比所述第二引物寡核苷酸的浓度高约5-约1,000倍。

18.如权利要求1-17中任一项所述的寡核苷酸组合物,其还包含聚合酶链式反应所需的试剂。

19.如权利要求1-17中任一项所述的寡核苷酸组合物,其还包含多种三磷酸核苷。

20.如权利要求1-17中任一项所述的寡核苷酸组合物,其还包含DNA聚合酶。

21.如权利要求1-17中任一项所述的寡核苷酸组合物,其还包含聚合酶链式反应所需的试剂、多种三磷酸核苷、DNA聚合酶。

22.如权利要求1-17中任一项所述的寡核苷酸组合物,其中所述阻断剂可变子序列是单一核苷酸。

23.一种扩增靶序列的方法,所述方法包括步骤:

a.获取样品,所述样品含一或多拷贝的第一核酸并可能含至少一拷贝的第二核酸,所述第一核酸含变体序列,所述第二核酸含所述靶序列,其中所述靶序列和变体序列各自包含同源子序列和可变子序列,其中所述可变子序列含至少一个核苷酸,并且其中所述靶序列的可变子序列是靶特异性子序列并且所述变体序列的可变子序列是非靶特异性子序列;

b.将阻断剂寡核苷酸引入所述样品,其中所述阻断剂寡核苷酸包含具有靶中性子序列和阻断剂可变子序列的第一序列,其中所述靶中性子序列与所述同源子序列的部分互补并且所述阻断剂可变子序列与所述非靶特异性子序列互补,其中所述阻断剂可变子序列在其3’和5’端被所述靶中性子序列侧接并且与该靶中性子序列连续;和

c.将第一引物寡核苷酸引入所述样品,其中所述第一引物寡核苷酸足以诱导酶促延伸,其中所述第一引物寡核苷酸包含第二序列,其中所述第二序列与所述同源子序列的第二部分互补,其中所述第二序列与所述靶中性子序列重叠至少5个核苷酸,从而所述第二序列包含重叠子序列和非重叠子序列,并且其中所述第二序列不包含任何与所述可变子序列互补的序列;

d.向所述样品引入DNA聚合酶、三磷酸核苷、和基于聚合酶的核酸扩增所需的一种或多种试剂;和

e.在足以实现核酸扩增的条件下使所述样品反应。

24.如权利要求23所述的方法,其中所述阻断剂寡核苷酸在3’端或3’端附近包含功能基团或非互补序列区域,其阻止酶促延伸。

25.如权利要求24所述的方法,其中所述功能基团包含3-碳间隔子或双脱氧核苷酸。

26.如权利要求23所述的方法,其中所述DNA聚合酶是热稳定DNA聚合酶。

27.如权利要求26所述的方法,其中所述足以实现核酸扩增的条件包括将样品暴露于至少10个循环,其中各循环包括至少2个不同温度暴露,一个温度暴露至少85℃,一个温度暴露不高于75℃。

28.如权利要求23所述的方法,其还包含将选自下组的酶引入所述样品的步骤:切口酶、重组酶、解旋酶、RNA酶、逆转录酶或其任何组合。

29.如权利要求23所述的方法,其中所述重叠子序列包含所述靶中性子序列的5’端的部分,其中所述部分为约5个核苷酸至约40个核苷酸。

30.如权利要求23所述的方法,其中所述重叠子序列包含所述靶中性子序列的5’端的部分,其中所述部分为约7个核苷酸至约30个核苷酸。

31.如权利要求23所述的方法,其中所述第二序列产生杂交标准自由能(ΔG°PT)并且所述第一序列产生杂交标准自由能(ΔG°BT),满足下述条件:

+2kcal/mol≥ΔG°PT-ΔG°BT≥-8kcal/mol。

32.如权利要求23所述的方法,其中所述非重叠子序列产生杂交标准自由能(ΔG°3),满足下述条件:

-4kcal/mol≥ΔG°3≥-12kcal/mol。

33.如权利要求23所述的方法,其中所述阻断剂寡核苷酸的浓度比被引入所述样品的第一引物寡核苷酸的浓度高约2-约10000倍。

34.如权利要求23所述的方法,其中所述阻断剂寡核苷酸的浓度比被引入所述样品的第一引物寡核苷酸的浓度高约5-约1,000倍。

35.如权利要求23所述的方法,其还包括向所述样品引入第二引物寡核苷酸的步骤,其中所述第二引物寡核苷酸包含第三序列,其中所述第三序列不与所述可变子序列重叠,并且其中所述第三序列是靶中性的并且足以与所述第一引物寡核苷酸使用以扩增含所述靶序列的核酸区域。

36.如权利要求35所述的方法,其还包括向所述样品引入第二阻断剂寡核苷酸的步骤,其中所述第二阻断剂寡核苷酸包含具有第二靶中性子序列和第二阻断剂可变子序列的第四序列,其中所述第二阻断剂可变子序列是所述阻断剂可变子序列的互补序列,其中所述第二阻断剂可变子序列在其3’和5’端被所述第二靶中性子序列侧接,并且与该第二靶中性子序列连续,其中所述第三序列与所述第二靶中性子序列重叠至少5个核苷酸,从而所述第三序列包含第二重叠子序列和第二非重叠子序列。

37.如权利要求36所述的方法,其中所述第二阻断剂寡核苷酸在3’端或3’端附近包含第二功能基团或第二非互补序列区域,其阻止酶促延伸。

38.如权利要求37所述的方法,其中所述第二功能基团选自下组:3-碳间隔子或双脱氧核苷酸。

39.如权利要求36所述的方法,其中所述第二重叠子序列包含所述第二靶中性子序列的5’端的部分,其中所述部分为约5个核苷酸至约40个核苷酸。

40.如权利要求36所述的方法,其中所述第二重叠子序列包含所述第二靶中性子序列的5’端的部分,其中所述部分为约7个核苷酸至约30个核苷酸。

41.如权利要求36所述的方法,其中所述第三序列产生杂交标准自由能(ΔG°PT2)并且所述第四序列产生杂交标准自由能(ΔG°BT2),满足下述条件:

+2kcal/mol≥ΔG°PT2-ΔG°BT2≥-8kcal/mol。

42.如权利要求36所述的方法,其中所述第二非重叠子序列产生杂交标准自由能(ΔG°6),满足下述条件:

-4kcal/mol≥ΔG°3≥-12kcal/mol。

43.如权利要求36所述的方法,其中所述第二阻断剂寡核苷酸的浓度比被引入所述样品的第二引物寡核苷酸的浓度高约2-约10000倍。

44.如权利要求36所述的方法,其中所述第二阻断剂寡核苷酸的浓度比被引入所述样品的第二引物寡核苷酸的浓度高约5-约1,000倍。

45.如权利要求23所述的方法,其中在步骤(e)之后从所述样品移出等分试样并重复步骤(b)至(e)。

当前第2页1 2 3 
网友询问留言 已有0条留言
  • 还没有人留言评论。精彩留言会获得点赞!
1