转分化的组织移植物的制作方法

骨移植物被用于促进脊柱融合中的骨愈合，在颌面外科手术中或在创伤性骨缺损不愈合的情况下增加骨。从髂嵴采取的松质骨仍然被认为是用于脊柱融合的标准，但是与高并发症率相关¹。同种异体移植骨是一种常用的替代方案，但可能缺乏成骨性并增加手术部位感染的风险²。合成的β-磷酸三钙骨移植物可以单独使用或与自体干细胞组合使用，但已报道了植入失败³。通过自体细胞和天然或合成生物材料的组合制造的组织工程化骨可能构成潜在的替代方案。然而，这些移植物迄今尚未进行到临床实践，因为在缺损部位足够的血管形成的问题仍然未解决⁴。

另一个主要的临床问题是骨质疏松或创伤性椎骨骨折的治疗：目前，新近的骨折在经皮椎体后凸成形术或椎体成形术程序中通过灌注骨水泥治疗⁵。这些程序的并发症包括水泥外渗、相邻椎骨骨折和感染⁶。使用骨水泥的另一个问题是有限的生物相容性：对不同PMMA水泥的体外研究证明了它们引发细胞损伤和炎症的潜力⁷。PMMA骨水泥在聚合后没有形状改变的可能性，使得它们不适合用于治疗处于生长期的儿童和青年。可吸收的磷酸钙水泥可以用于这个患者组，但显示45％的泄漏率，具有不清楚的长期临床后果⁸。由于其对抗弯曲、吸引和剪切力的低抗性，存在水泥失效和矫正丢失的较高风险⁹。迄今为止还不存在将优良的生物相容性与合适的机械稳定性结合的合适的生物治疗。

由于不良的固有愈合能力，关节软骨的全厚度缺损仍然是未解决的临床问题。外科治疗选择包括骨髓刺激技术，如钻孔¹⁰或微骨折¹¹。两种技术均建立软骨损伤和骨髓之间的连通，从而允许来自下面的骨髓腔的间充质干细胞迁移至缺损¹²。来自关节的非负重区域的骨软骨柱的移植¹³代表另一种治疗选择。由于没有获得透明软骨，并且纤维软骨修复组织不能耐受随时间的机械应力¹⁴，这些手术程序都未导致恢复原状。

已在体外分离和扩增的自体软骨细胞的移植(ACI)代表了针对软骨修复的生物学方法¹⁵。ACI包括一系列程序：从受影响关节的非负重区域关节镜获取软骨组织。将软骨活检切成小块并酶促消化以分离关节软骨细胞，然后将其在体外扩增数周。在第二外科手术中，缺损被仔细地清创并被骨膜瓣(periostal flap)或生物膜覆盖，在其下面注射软骨细胞。在修改的该治疗中，将软骨细胞接种到胶原基质上，然后植入¹⁶。

两种方法都有困难：如果使用骨膜瓣封闭缺损¹⁵，需要修正手术的骨膜肥大在高达15.4％的病例中发生。在25％的经历基质辅助的软骨细胞移植的患者中也观察到了暂时性移植物肥大¹⁶。通常为牛或猪来源的生物膜的使用可能导致过敏反应，并因此在对动物来源的材料具有已知超敏反应的患者中是禁忌的¹⁷。因为产品未针对可传播的传染病进行常规筛选，所以它们可能对健康护理提供者¹⁸和接受者造成健康风险。

在WO 2005/018549 A2中和在2009年，Evans等人²³描述了使用用于表达BMP-2的重组腺病毒载体产生活化肌肉或脂肪移植物。此方法具有病毒感染的风险²³，具有高风险特征并且可能导致移植排斥。此外，腺病毒激活的脂肪愈合不快，在愈合骨一致性上有高变异性²³。此外，腺病毒活化的脂肪显示用于组织修复的希望，但与肌肉组织相比愈合不快。这些差异可能是方法特异性的，最终脂肪组织对腺病毒感染的易感性较低。Orlicky和Schaak报道了前脂肪细胞系3T3-L1被腺病毒载体无效率地转染²⁵。在综述²⁴中，与体内细胞活化方法相比，离体方法被认为是累赘的、非常昂贵的和较不吸引人的。

WO 03/015803A1涉及提供间充质细胞以治疗关节中的关节缺损和骨关节病并进一步产生移植物。提供合适的移植物的问题在该文献中未被解决。

Wang等人²⁶描述了分化从兔分离并且接种到无细胞软骨基质中的脂肪来源的干细胞。

Sandor等人²⁷和WO 2006/009452 A2描述了来源于分离的自体脂肪干细胞的人工构建体。分离细胞并离体扩增并接种到粒状β-磷酸三钙支架中。

Salibian等人²⁸涉及整形外科手术中的干细胞。

Inok Kim等人²⁹和Jung等人³⁰涉及纤维蛋白胶中的MSC。

Eun Hee等人³¹综述了分离的脂肪来源的干细胞的使用。

Stromps等人³²描述了分离的脂肪来源的干细胞的成软骨分化。

Sujeong等人³³涉及脂肪组织来源的干细胞的神经分化。从耳叶分离细胞并培养。

Halvorsen等人¹⁹描述了将基于分离的脂肪来源干细胞的细胞培养物用于骨细胞形成。通过胶原酶从组织中除去细胞并在体外培养。然而，这些细胞在体外的扩增不是高效的，并且在用于骨修复的糊剂中使用这样的细胞的所描述的预测失败。

因此，需要提供患者良好耐受的移植物，并提供满足修复组织所需的强度和耐久性以及在血管化受体组织的情况下足够的血管生成性质的要求的足够的组织替换。

为了满足这些需要，本发明提供了通过将供体结缔组织(优选脂肪组织)直接转分化至另一种结缔组织类型来产生生物工程化结缔组织移植物的方法，包括在体外a)以至少1小时(优选至少2天)或体内和/或b)通过一种或多种结缔组织特异性生长或分化因子培养供体结缔组织。还提供了产生适合用于矫正结缔组织缺损(tissue defect)的结缔组织移植物的方法，其包括确定组织缺损的大小和形状，通过以任何顺序的下述操作处理从患者获得的供体结缔组织(优选脂肪组织)：塑型供体组织以适合组织缺损的大小和形状，并使脂肪组织与一种或多种结缔组织特异性生长或分化因子接触，从而起始组织移植物向另一种结缔组织的分化。本发明的方法使用全组织而无需从组织分离和培养干细胞。供给至转分化步骤的本发明的组织包含处于其原始细胞外基质和细胞组构(cellular organization)中的细胞，其在本文中还被称为全(供体)组织。因此，与经由分离的细胞的间接分化形成对比，本发明的方法被称为“直接”转分化，即“组织至组织”。分离的细胞和从其生长的产物(无论是在培养基中还是在人工支架中)都不被认为是根据本发明的组织。根据本发明，结缔组织、供体组织(来自供体患者)被转化为另一种结缔组织(移植物组织，其不同于供体组织类型)。供体组织优选为脂肪。本发明的移植物可用于治疗受试者中的结缔组织缺损，例如，通过将移植物插入缺损中或将移植物施加到缺损上。特别地，本发明在本文所述的任何方法实施方案中提供了将脂肪组织(作为供体组织)转分化至另一种非脂肪组织(移植物组织)的方法。还提供了用于在方法中使用的结缔组织特异性生长或分化因子以及将所述结缔组织特异性生长或分化因子用于制备用于在这样的方法如治疗方法中使用的组合物。

还提供了用于制备本发明的适合用于此组织缺损矫正治疗的移植物的离体或体内方法，以及适合用于制备和分化供体(优选脂肪)组织成合适的移植物的试剂盒。本发明的其它方面和优选实施方案描述于权利要求中。所有这些方法和实施方案是相互关联的并且可以彼此组合，例如试剂盒可以用于本发明的方法中，反之亦然，试剂盒可以被调整以适合用于执行任何一种本发明的方法；离体方法可以用作治疗方法的一部分；在离体步骤中产生的移植物可以治疗性使用或提供为用于这样的治疗用途的组合物。对于任何特定方面描述的所有优选实施方案还应被视为描述任何其它发明方面，如将立即设想这样的实施方案的一般性的本领域技术人员所清楚的。此外，每个优选实施方案还可以与每个其它优选实施方案组合；特别优选的是遵循本文所述的所有优选的建议，除非明确排除。

本发明提供了产生适合用于矫正结缔组织缺损的结缔组织移植物(其可以在使用或不使用支架的情况下应用)，从患者获得经塑型以适合患者中的组织缺损的大小和形状的供体(优选脂肪)组织，使供体(优选脂肪)组织与一种或多种结缔组织特异性生长或分化因子接触(本文中的“孵育”)，从而起始组织移植物的分化。“接触”是用各自的生长或分化因子处理组织(或所述组织内的细胞)，由此所述组织适应于由这些因素引起的新条件，进而导致转分化。

先前的离体方法聚焦于分离的细胞的细胞培养物或病毒转染。然而，体外细胞分离、单层扩增和在植入之前再分化是累赘的，并且可导致单层培养物中的去分化。本发明的代替分离的细胞的全组织的转分化减少了这些缺点并且仅需要最小的体外或离体处理，其可以在GMP顺应性的、全自动的组织处理装置中进行。例如。在优选的实施方案中，细胞培养基需要以诸如每周1-4次的常规间隔替换或更新。

任何类型的脂肪组织可以用于供体组织，包括但不限于来自诸如胸部、腹部和臀部、髋部和腰部的区域的皮下蓄积库(depot)；或异位或内脏脂肪。虽然在本发明的所有实施方案中脂肪是优选的供体组织类型，但是可以使用其它结缔组织以及供体，例如，软骨、肌肉、腱、韧带或神经供体组织，用于本发明的所有实施方案替代脂肪。

可以使用本领域中标准的用于获得用于移植的组织的方法从患者中提取组织。例如，可以使用标准或微创外科手术技术外科手术地提取这样的组织。微创手术可涉及通过身体中期望的使用位置处的天然或手术创建的小直径的开口提取脂肪组织，以使得外科手术介入是可能的而对患者施加的应激显著较小，例如，不使用全身麻醉。

在某些实施方案中，以适合用于植入特定组织缺损的大小和形状从患者中取出组织。在其它实施方案中，从患者中取出组织，然后将其离体改变为所需的大小和形状。

供体(优选脂肪)组织可包含基质细胞。其还可以包含脂肪细胞，例如白色和/或棕色脂肪细胞。通常干细胞存在于分化至特异于感兴趣的结缔组织(即组织缺损的组织)的细胞的脂肪组织中。这样的细胞可以是间充质干细胞或基质干细胞。还令人惊讶的是，存在于本发明的脂肪组织中的脂肪细胞不需要被去除，而是可以保留并被包埋在最终的分化的组织移植物中。脂肪细胞的数目可以是组织移植物的所有细胞的至少20％，至少30％或至少40％，至少50％，至少60％，至少70％或更多。

优选地，刺激脂肪细胞以减少或消耗其脂肪蓄积库。这可以通过化学品或(细胞因子或激素)受体刺激或机械刺激进行。受体刺激包括使包含脂肪细胞的供体组织与瘦素接触。机械刺激包括揉捏或分散包含脂肪细胞的供体组织。在将组织分化至骨组织的情况下，并且还在软骨组织的情况下，脂肪蓄积库的减少或消耗是特别优选的。脂肪含量可以减少到小于50％(w/w)，优选小于30％或小于20％，例如在50％-10％的范围内的脂肪量。脂肪组织具有～0.9g/ml的密度。脂肪减少或消耗可导致密度为至少0.93g/ml、优选至少0.95g/ml、甚至更优选至少0.97g/ml的组织。处理可以是将要达到例如0.93g/ml至1.10g/ml的密度。

可以任意选择使大小和形状适合于组织缺损的步骤和接触供体组织并从而起始供体组织的分化的步骤的顺序，例如医生可以首先调整形状，然后分化细胞，或者可以首先分化细胞，然后使移植物成形以适合组织缺损。当然，成形也可以在分化之前和之后进行，例如，在分化之前提供粗略形状，然后在分化后微调形状。同样，确定缺损的大小可以在分化之前或之后。优选的是在分化之前，以选择足够大小的供体组织，其当然也可以随后在插入缺损后微调至缺损的大小。

分化导致产生增加数量的移植结缔组织(包括骨、软骨、肌肉(生肌组织)、腱(生腱组织(tenogenic tissue))、韧带或神经细胞(神经源性组织))的细胞，和优选还产生特异于移植结缔组织的细胞外基质。然而，供体组织(特别是脂肪组织)的细胞外基质还可以至少部分地保留在最终的移植物组织中。通过选择本领域技术人员已知的合适的结缔组织特异性生长或分化因子和/或适合用于所述分化的孵育时间，本领域技术人员可以将分化引导至特定类型的移植物组织。特别地，移植结缔组织类型可以是骨或软骨。

“起始组织移植物的分化”是指不一定完全分化供体结缔组织(优选脂肪组织)的所有应答性细胞(例如干细胞)，但通常足以起始分化反应，以使得细胞即使在(离体)孵育之后(特别是在插入组织缺损后)也将继续分化。优选(离体)分化发生至少直到移植物达到缺损组织的至少5％、优选至少50％的拉伸强度。在骨移植物的情况下，移植物组织具有比骨更低的拉伸强度，以允许容易地处理移植物组织，从而保持移植物组织的柔性。在骨的情况下，优选的拉伸强度为缺损组织的约5％至15％。特别地，但不限于，在软骨、肌肉、腱、韧带或神经移植物靶的情况下，优选地，移植物达到缺损组织的至少25％，优选至少50％的拉伸强度。或者或另外，优选差异发生至少直到移植物达到至少20％，优选至少40％，例如至少20％的密度。20％至60％的缺损组织。本文给出的拉伸强度和密度是指如从原始供体组织到靶移植物组织比较的拉伸强度或密度的变化。百分比将参数(拉伸强度或密度)的变化定义为以所述百分比值至靶组织方向的逐渐变化。移植参数可以通过A+(B-A)*P计算，其中A是供体组织的参数，B是缺损的靶组织的参数，P是给定的百分比值。在用于骨缺损的骨移植物的情况下，优选分化发生至少直到移植物达到缺损组织的至少20％，优选至少40％，例如20％至60％的矿化含量。矿化含量可以通过组织学和确定2D切片中矿化区域的含量来确定。

对于椎骨骨折的治疗，优选(离体)分化发生至少直到移植物达到缺损组织的至少10％，优选至少20％，例如10％至30％的矿化含量。通常，在通过小通道配合移植物组织的情况下(例如在椎骨骨折的情况下)，优选的是，移植物组织具有足够的弹性以用于通过通道例如以折叠状态输送并且上述较低的矿化是优选的。

本发明的方法还可以包括将分化的移植物组织置于患者的组织缺损中。优选地，患者和/或供体是人或非人动物。非人动物包括哺乳动物，例如包括马，牛，狗，猫，猪，羊，鸟类如鸵鸟或鹦鹉，爬行动物如鳄鱼。优选地，具有组织缺损的患者和提供供体组织的患者是相同的患者(自体组织)。

在一个实施方案中，将移植物离体孵育足以允许供体组织中的至少一部分细胞分化或起始分化为用于组织移植物的所需细胞类型的一段时间。接触步骤(孵育)的示例时间为1小时(h)至10周(w)，优选1小时至6周。优选的时间是至少1小时，至少2小时，至少3小时，至少5小时，至少8小时，至少12小时，至少18小时，至少24小时(1天；1d)，至少30小时，至少36小时，至少2d，至少3d，至少4d，至少5d，至少6d，至少7d，至少8d，至少9d，至少10d，至少11d，至少12d，至少14d。可选择地或与这些最小时期中的任一个组合地，接触步骤(孵育)为至多10w，至多8w、6w，至多5w，至多4w，至多3w，至多2w，至多10d，至多8d，至多6d，至多4d，至多3d，至多2d，至多1d，至多18h。优选的范围是2d至4w。

在替代离体分化或与其组合的实施方案中，本发明的移植物在体内分化。因此，没有离体分化的供体移植物或部分离体分化的移植物被放置或植入到组织缺损中，并被刺激以分化为缺损组织的组织类型。这可以通过对植入的移植物施用(例如通过局部注射)结缔组织特异性生长或分化因子(特异于缺损组织)来完成。可以根据组织类型和移植物大小来选择施用的剂量和间隔。结缔组织特异性生长或分化因子可以与下文对于离体方法所进一步描述的相同，其是本发明的优选实施方案。

根据本发明，供体组织的细胞优选不经分离和扩增，而是仅经转分化。

在优选的实施方案中，移植的结缔组织是软骨(成软骨分化组织)。分化可以包括将脂肪组织的细胞分化至软骨细胞和/或成软骨细胞，优选以及它们的特异性细胞外基质。例如，移植物组织可以包含软骨细胞外基质的标记物，例如如图2a-c所示的。分化因子随后是软骨细胞分化因子。这样的因子或因子的混合物优选包含TGF-β。TGF-β可以包括TGFβ-1、TGFβ-2或TGFβ-3中的任一种或其混合物，例如TGFβ-1和TGFβ-2。此外，优选的是胰岛素样生长因子(IGF)。其它成软骨生长和分化因子包括BMP-2，BMP-4，BMP-6，BMP-7，BMP-9，地塞米松，α-FGF，FGF-2，IGF-1，IGF-2，其全都可以任选地附加使用(例如附加于TGF-β)或作为替代物使用。在软骨靶移植物组织的情况下，优选在不存在血清的情况下培养组织。软骨组织质量可以通过在转分化期间或之后加入BMP-14(GDF-5)来进一步改善。

在进一步的优选实施方案中，移植的结缔组织是骨(成骨分化组织)。分化可以包括脂肪组织的细胞分化至骨细胞和/或成骨细胞，优选以及其特异性细胞外基质，例如矿化。分化因子随后是成骨分化因子。这样的因子或因子的混合物优选包含β-甘油磷酸酯。其它成骨生长和分化因子包括地塞米松，bFGF，BMP-2，PGF，成骨蛋白，GDF-5，CTFG，其全都可以任选地附加使用(例如附加于β-甘油磷酸酯)或作为替代物使用。特别优选的是如下文进一步详细描述的作为添加剂的血清。特别优选的是β-甘油磷酸酯、地塞米松和抗坏血酸的组合，优选进一步与血清组合。

在进一步优选的实施方案中，移植结缔组织是腱(生腱分化组织)。分化可以包括将供体组织(优选脂肪组织)的细胞分化至腱细胞。分化因子随后是生腱分化因子。这样的因子或因子的混合物优选包括在具有或不具有BMP-2、PGE₂、BMP-12、BMP-14、TGFβ₃和富含血小板的血浆释放物、优选以及血清中的任何一种或多种的情况下的机械体外拉伸。示例性生腱分化培养基包含补充有1％FCS和BMP-12(优选约10ng/ml BMP-12)的DMEM-F12。

在进一步优选的实施方案中，移植结缔组织是肌肉(肌原性分化组织)。分化可以包括将供体组织(优选脂肪组织)的细胞分化至肌细胞。分化因子随后是生肌分化因子。这样的因子或因子的混合物优选包括5-氮杂胞苷、两性霉素B、bFGF和优选以及血清中的任何一种或多种。

在进一步优选的实施方案中，移植结缔组织是神经(神经源性分化组织)。分化可以包括将供体组织(优选脂肪组织)的细胞分化至神经细胞。分化因子随后是神经源性分化因子。这样的因子或因子的混合物优选包括FGF-2、视黄酸、2-巯基乙醇、氢化可的松、cAMP、aFGF、Shh、脑源性神经营养因子(brain derived neurotropic factor)、神经生长因子、玻连蛋白、AsA、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、毛喉素和佛波醇肉豆蔻酸乙酸酯(优选其20nM)以及优选血清中的任何一种或多种。

在进一步优选的实施方案中，移植结缔组织是韧带。分化可以包括将供体组织(优选脂肪组织)的细胞分化至韧带细胞。分化因子随后是成纤维细胞分化因子。这样的因子或因子的混合物优选包括TGF-β1、IGF-1、PDGF、BMP-12、bFGF和胰岛素以及优选血清中的任何一种或多种。

对于软骨分化，生长和分化因子可以包括地塞米松、抗坏血酸-2-磷酸盐、胰岛素、亚硒酸、转铁蛋白、丙酮酸钠和转化生长因子β(TGF-β)、BMP-14和/或胰岛素样生长因子(例如IGF-1)中的一种或多种。特别优选的是TGF-β和/或IGF-1。可以用所有这些组分实现特别有效的分化。

还可以包括的另外的营养物包括Dulbecco改良的Eagle培养基和Ham营养混合物F12、任何蛋白质性氨基酸(proteinogenic amino acid)，例如L-谷氨酰胺。

对于成骨(骨)分化，考虑到软骨发育是骨发育的前兆，软骨生长和分化因子可以与另外的骨生长和分化因子一起使用。

成骨分化因子是例如描述于参考文献21中的，并且可以包括1-1000nM的地塞米松(Dex)、0.01-4mM L-抗坏血酸-2-磷酸酯(AsAP)或0.25mM抗坏血酸和1-10mMβ-甘油磷酸酯(βGP)。其可以包括DMEM基础培养基加上100nM Dex、0.05mM AsAP和10mMβGP。

优选地，骨分化和生长因子包括选自以下的一种或多种：抗坏血酸，任何蛋白质性氨基酸，例如L-谷氨酰胺，地塞米松，β-甘油磷酸酯和瘦素。特别优选的是β-甘油磷酸酯和/或瘦素。可以用所有这些组分实现特别有效的分化。

还优选在骨分化期间使用如在Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)和/或血清中的营养物。DMEM提供了可在本发明的任何方法中用于在分化期间和之后培养任何预分化的脂肪组织的基本营养物，包括氨基酸。

优选地，在分化步骤期间将血清，特别是来自转分化的组织移植物的接受者的自体血清添加至供体(优选脂肪)组织，优选在离体培养物中进行。血清可以是哺乳动物血清，例如牛血清，特别优选的是胎小牛血清或胎牛血清，但在人患者的情况下优选人血清。血清可以以1％至80％(v/v)，优选2％至60％，3％至50％，4％至40％，5％至30％，特别优选6％至20％的浓度提供。血清通常仅用于维持某些细胞存活或增殖-甚至是软骨细胞，然而其在存在或血清存在下去分化至其它细胞和/或减少其胶原和糖胺聚糖合成。血清优选不用于软骨移植物。转分化通常不依赖于血清。根据本发明的方法，可以在骨、肌肉、腱、韧带或神经产生期间使用血清。可以使用其它步骤来促进向这些组织的细胞的分化。

优选地，IGF(特别是IGF-1)用于骨分化。

优选地，结缔组织特异性生长和/或分化因子外在地提供至组织，例如，组织与这些因子接触，并且因子不在供体或移植物组织的细胞中重组表达。

令人惊讶的是，发现可以促进骨分化，而不需要骨形态发生蛋白，例如BMP-2。因此，在本发明的优选实施方案中，BMP或编码BMP的核酸不加入到用于软骨和/或骨分化的脂肪组织中。在其它实施方案中，可以使用BMP，例如BMP-5或BMP-7。BMP是BMP1，BMP2，BMP3，BMP4，BMP5，BMP6，BMP7，BMP8a，BMP8b，BMP10，BMP15。

优选地，核酸(例如转基因)不用作生长或分化因子。本发明的分化或生长因子是蛋白质或肽。另外或可选地，可以使用具有至多10kDa，优选至多5kDa，特别优选至多2kDa的大小的小有机分子。

优选地，结缔组织特异性生长或分化因子包括抗坏血酸或抗坏血酸酯，优选抗坏血酸-2-磷酸酯，或其任何药学上可接受的盐。抗坏血酸及其酯(例如L-抗坏血酸2-磷酸酯)刺激胶原累积、细胞增殖以及通过皮肤成纤维细胞形成三维结构。因此，在本发明的任何方法及其任何实施方案(包括软骨或骨分化)中，抗坏血酸及其衍生物是作为结缔组织特异性生长或分化因子的优选组分或作为这样的因子的混合物中的添加剂。

优选地，分化(孵育)在30至40℃的温度下进行。还优选地，分化(孵育)在包含0.01％至10％(w/v)CO₂的气氛下进行。还优选地，分化(孵育)在包含70％-98％湿度的气氛下进行。优选地，但不是必须地，使用这些参数的组合。

在本发明的方法中，供体和移植物组织的细胞(至少组织内经转分化的细胞)保持存活。

在特定方面，本发明提供了用于将供体(优选脂肪)组织制备成适合用于结缔组织修复的分化的移植物的离体方法，其包括使供体(优选脂肪)组织与一种或多种结缔组织特异性生长或分化因子接触，从而起始组织移植物的分化，其中所述接触在30至40℃的温度、0.01％至10％(w/v)CO₂和70％至98％的湿度下持续1小时至4周的时间，优选其中所述方法进一步通过如上或如下所述的其它步骤来限定。特别地，结缔组织特异性生长或分化因子由大小为至多10kDa的蛋白质、肽和小分子组成，例如不使用在脂肪组织的细胞中的重组表达。

如果需要，可将供体或移植物组织切成所需大小的切片以促进微创插入。所需的大小长度可以为0.3mm至10mm。优选地，移植物组织或转分化之前或期间的本发明的供体具有0.001mm³至1000cm³的大小，优选0.01mm³至100cm³的大小，或0.1mm³至10cm³的大小，1mm³至1cm³或10mm³至100mm³的大小。

将分化的组织移植物插入组织缺损中或组织缺损上，并且进一步优选地其中插入通过组织密封剂(优选纤维蛋白胶)固定。

将任何一种上述分化步骤即孵育作为本发明的另一方面提供于包括所述孵育步骤的用于将脂肪组织转化为结缔组织的组织移植物的离体或体内方法中。

优选地，本发明的任何一种方法进一步包括使组织与组织密封剂接触，优选在用所述结缔组织特异性生长或分化因子处理后和/或在将组织移植物的大小和形状调节至适合患者的结缔组织缺损的任选步骤之后。调整形状和大小意味着组织移植物将装配到缺损空间中或其上，以允许缺损愈合，即移植物附着至相邻结缔组织。使用组织密封剂的处理允许移植物牢固地附着至周围的结缔组织并且增强结缔组织的细胞的生长。组织密封剂还可以涂覆到组织缺损中。在任何方式下，组织密封剂用于将移植物与周围的结缔组织连接。

通常，组织缺损的治疗可以包括将本发明的移植物植入例如由于损伤或由于手术天然缺失的一定体积的缺失组织(组织缺损)中。移植物还可以用于治疗表面组织缺损(在其上固定移植物，并且从其发生增强效应至下面的缺损)，例如通过活化或分化的干细胞从移植物组织迁移到缺损中。

特别优选地，移植物组织包含血管。来自供体移植物组织的血管得到维持并且不需要再生长。移植物中的这样的血管可以在移植后与组织缺损附近的血管连接，并且允许移植物与具有原始缺损的周围或邻近组织的良好结合。

缺损可以在可能需要例如矫形外科手术、颌面外科手术、牙科或整形和重建手术的许多组织中。

使用本发明的组织移植物的缺损和疗法实例包括(通过移植物或缺损组织分类)：

软骨移植物组织可用于治疗软骨缺损。待治疗的软骨类型的缺损包括局灶性软骨损伤，例如剥脱性骨软骨炎或创伤性软骨损伤，例如在膝关节或距骨中；骨关节炎，特别是由于骨关节炎引起的软骨磨损；椎间盘再生；半月板再生；髓核突出和随后的微椎间盘切除术引起的椎间盘损伤。转分化组织移植物可用作生物髓核替代物。它可以用于通过植入成软骨转分化移植物作为髓核替代物来治疗退行性椎间盘疾病。软骨移植物组织可以进一步用于治疗创伤性或退行性半月板撕裂。在撕裂的半月板的部分切除后，转分化的移植物可以缝合到半月板缺损中。

韧带移植物组织可以用于治疗韧带缺损，包括治疗膝关节中的创伤性十字韧带撕裂；治疗外侧踝韧带的创伤性撕裂。

腱移植物组织可用于治疗腱缺损，包括治疗创伤性或退化性肩袖撕裂；治疗跟腱撕裂。

骨移植物组织可用于治疗骨缺损，包括骨外科手术，例如在脊柱畸形或退行性椎间盘疾病的情况下的脊柱融合术中：成骨转分化移植物可用于移除椎间盘和制备椎间隙后的笼和椎间隙填充。移植物还可以单独使用或与BMP组合使用，以通过移植附着到脊柱上来实现脊柱融合。移植物可用于治疗骨折后的不愈合，或者移植物可以移植到损伤区域以促进骨愈合。它可以用于治疗骨质疏松缺损或用于骨增加，包括预防性治疗，例如在椎体后凸成形术或椎体成形术中作为椎体骨折的治疗或用于预防性骨增加。成骨转分化移植物可以插入椎体并促成生物骨折愈合。其可用于治疗通常需要骨移植的骨缺损，例如动脉瘤和幼年骨囊肿，或用于骨增强，例如在插入牙种植体之前。例如，其可以用于牙科中的窦提升。待根据本发明治疗的具有缺损的骨可以是根据骨类型的常见分类的长骨、短骨、扁平骨、籽骨或不规则骨。

可以提供通过本发明的方法制备的移植物用于任何治疗性组织缺损治疗。

在另一方面还提供了试剂盒，其适合用于实施本发明的方法，特别是将脂肪组织的细胞分化至具有分化细胞的合适的结缔组织移植物的方法，并任选进一步适合用于将移植物附着至组织缺损。试剂盒可以包含结缔组织特异性生长或分化因子(优选如上所述的)和组织密封剂，优选纤维蛋白胶。可以包括如上所述的任何其它组分。还可以提供孵育容器，例如烧瓶或盘。还提供的可以是调节合适的气氛的组件，例如CO₂烧瓶。

所述试剂盒可以进一步包含软骨或骨组织标签或标记物，其适合用于监测分化的进展并且评估转化到结缔组织移植物中的脂肪组织的给定分化阶段是否足以插入到缺损中。分化的阶段可以如上所述。

本发明的进一步特征在于以下附图和实施例，而不限于本发明的这些实施方案。

附图：

图1：与显示不规则、不均匀的表面形成的相应对照(b)相比，成软骨转分化脂肪移植物(a)的平滑表面转化。

图2：成软骨转分化脂肪移植物(a)和相应的对照(d)的阿尔新蓝糖胺聚糖染色；脂肪移植物(b)和对照(e)的俾斯麦棕染色；脂肪移植物(c)和对照(f)的番红O染色。

图3：成软骨转分化脂肪移植物的糖胺聚糖含量。

图4：通过阳性von Kossa染色(a)和茜素红染色(b)指示的成骨转分化脂肪移植物的矿化。相应的对照(d，e)没有显示矿化的迹象。与未分化的对照(f)相比，偶氮卡红(Azan)染色显示转分化脂肪移植物(c)中的胶原组织增加。

图5：成骨转分化移植物的5μm切片中矿化的定量

图6：使用HET-CAM血管生成测定评价成骨转分化移植物的血管生成和组织整合。在体内5天后，移植物显示良好的组织整合并连接至接受者的容器系统(a，b)。许多血管在移植物内可见(c；箭头)。如通过阳性von Kossa染色所显示的，成骨分化得到维持(d)。

图7：在成软骨转分化脂肪组织移植物的植入后14天的膝关节的透明软骨。移植物很好地整合到接受者组织中。

图8：分离的神经源性分化间充质干细胞显示典型的神经元和轴突形成(图8a，箭头)。在对照组中未观察到轴突和神经元形成(图8b)。神经源性转分化脂肪移植物显示阳性尼氏体染色(图8c，箭头)，其在对照组(8d)中未观察到。

图9：a)对照脂肪组织，其显示典型的脂肪组织表型。b)6周后神经源性转分化脂肪垫：脂泡已被指示阳性甲酚紫染色的神经源性组织代替。c)可以观察到周围神经组织的区带分化，包括神经束膜(黑色箭头)和神经外膜(灰色箭头)以及伴随的血管(黄色箭头)。d)神经束膜内的尼氏体在神经源性转分化样品中可见(箭头)。

图10：a)在分化起始后两周，朝向腱细胞表型(tenocytic phenotype)的分离的间充质干细胞的分化。b)对照组的未改变的表型。c)显示圆形取向的腱细胞分化细胞岛存在于转分化脂肪垫中，但不存在于对照组织中(d)。

图11：生肌分化：a)朝向定向肌细胞的早期分化；b)对照组中无分化。c)脂泡部分地被显示纵向取向和阳性Goldner染色的肌肉组织替代；d)对照样品中不存在肌肉组织形成。

实施例：

实施例1：脂肪组织转分化至透明软骨移植物

脂肪移植物制备：

在脊柱减压手术期间获得的小脂肪活检被放置在无菌容器中用于运输到组织培养实验室。将样品在无菌盐水溶液中洗涤以除去污染性红细胞。在通过污染检查后，将样品分成两部分。将A部分(转分化样品)在旨在用于间充质干细胞分化的市售成软骨分化培养基(Promocell，Heidelberg/Germany)中孵育。为了获得间充质干细胞分化，通常将细胞置于含有地塞米松、抗坏血酸-2-磷酸酯、胰岛素、亚硒酸、转铁蛋白、丙酮酸钠和转化生长因子β(TGF-β)的确定培养基¹⁵中的聚集体或沉淀培养物中。将B部分(对照)在补充有10％胎小牛血清和2mM L-谷氨酰胺的Dulbecco改良的Eagle培养基与Ham营养混合物F12的1:1混合物中孵育。为了防止细菌污染，向该两种培养基中加入50μg/ml庆大霉素。在37℃、5％CO₂和90％湿度下进行孵育2-3周。每周更换培养基两次。

组织学评价：

在孵育期结束时，将样品在4％甲醛中固定，在磷酸缓冲盐水中洗涤，并在升高的浓度的乙醇中排干。将组织包埋在塑化石蜡中，制备5μm切片。通过阿尔新蓝、俾斯麦棕和番红O染色评价成软骨分化。

糖胺聚糖合成的评价：

在2周的转分化后，将样品在溶解于含有1mM EDTA的50mM Tris中的1mg/ml蛋白酶K中消化过夜。使用二甲基-亚甲基蓝测定法测量糖胺聚糖含量，并在525nm处读取吸光度。使用鲨鱼硫酸软骨素产生标准曲线。

形态学结果：

在体外3周的转分化后，脂肪组织显示具有平滑表面重塑的紧凑的球形形态(图1)。

组织学结果：

成软骨分化的组织学染色在转分化脂肪组织中是阳性的：糖胺聚糖合成可以通过阿尔新蓝染色检测。通过阳性番红O染色进一步显现蛋白聚糖，并且阳性俾斯麦棕染色表明存在软骨组织典型的细胞外基质(图2)。

糖胺聚糖合成的评价：

在转分化过程起始的两个星期后，转分化脂肪移植物含有16.56μg糖胺聚糖/mg组织，而对照仅显示1.92μg/mg的平均糖胺聚糖含量(p<0.0001；图3)。

实施例2：脂肪组织转分化至骨移植物

脂肪移植物制备：

在脊柱减压手术期间获得的小脂肪活检被放置在无菌容器中用于运输到组织培养实验室。将样品在无菌盐水溶液中洗涤以除去污染性红细胞。在通过污染检查后，将样品分成两部分。使A部分(转分化样品)经受反复的机械刺激，随后在成骨分化培养基中孵育。成骨分化培养基由补充有10％胎小牛血清、0.05mg/ml抗坏血酸、2mM L-谷氨酰胺、1μM地塞米松、10mMβ-甘油磷酸钠和1μg/ml瘦素的Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)组成。将B部分(对照)在补充有10％胎小牛血清和2mM L-谷氨酰胺的Dulbecco改良的Eagle培养基与Ham营养混合物F12的1:1混合物中孵育。为了防止细菌污染，向该两种培养基中加入50μg/ml庆大霉素。在37℃、5％CO₂和95％湿度下进行孵育3周。每周更换培养基两次。

组织学评价：

在孵育期结束时，将样品在4％甲醛中固定，在磷酸缓冲盐水中洗涤，并在升高的浓度的乙醇中排干。将组织包埋在塑化石蜡中，制备5μm切片。样品用偶氮卡红、von Kossa和茜素红染色。

组织学结果：

如由阳性von Kossa和茜素红染色所示的，转分化脂肪移植物显示出胶原含量的增加和矿化的迹象(图4)。

矿化的定量：

通过测定成骨转分化3周后茜素红染色的光密度(OD)，从5μm切片定量矿化程度。

茜素红染色结果：

成骨转分化移植物的平均OD为0.25/5μm切片。相应对照切片的OD为0.12(p<0.005；图5)

血管生成和组织整合的评价：

使用HET-CAM(Hen Egg Test-Chorionallantoic Membrane)测定法评价血管生成和组织整合。将成骨转分化移植物异位植入到受精的、无特异性病原体的鸡蛋的暴露的绒毛膜尿囊膜上。植入后5天，切除CAM的移植物负载区域并经加工用于组织学分析。

HET-CAM测试结果：

在体内5天后，植入物被良好整合并连接至接受者的血管系统(图6a，b)。在移植物内可见许多小血管(图6c；箭头)。尽管剥夺了分化因子，但是成骨分化得到维持(图6d)。

实施例3：软骨损伤的治疗

移植物收获和制备：

在局部麻醉下收获皮下脂肪活检。这可以在计划的外科手术之前大约14天在门诊环境中完成。将脂肪组织无菌地置于含有组织培养基的无菌容器中，并且例如如上所述进行处理，即移植物在37℃、5％CO₂和90％湿度下进行成软骨转分化2周。在计划的手术当天，将移植物送至手术室。体外转分化的软骨移植植入物显示在图7中。

缺损制备：

执行小关节切开术，并对缺损仔细清创。通过使用模板(例如无菌锡箔)，制造缺损的精确模具。

移植物制备和植入：

通过使用模板，使移植物适合于缺损的大小。然后使用纤维蛋白胶将移植物植入缺损中。在5分钟的硬化时间后，用手术刀除去过量的胶，并且使关节弯曲和完全伸展10次。在关节运动期间检查移植物的稳定性和位置。随后，闭合伤口。

手术后程序：

患者经历关节的部分负重(10kg)治疗14天，之后进行取决于肿胀的渐进负重。移植物在约8周后完全负重。

实施例4：椎骨骨折的治疗：

移植物收获和准备：

在局部麻醉下收获皮下脂肪活检。这可以在计划的外科手术之前约1-2周在门诊环境中完成。将脂肪无菌地切成具有2mm²长度的边缘的切片，置于含有组织培养基的无菌容器中，并且例如如上所述进行处理，即移植物在37℃、5％CO₂和90％湿度下进行成骨转分化1-2周。在计划的手术当天，将移植物送至手术室。

手术程序：

患者以俯卧位置被放置在射线可透射的台上。在荧光镜检查下确定切口的位置之后，制作穿刺切口。将接入器械插入并向前移动，直到达到蒂部接触。确认恰当的轨迹后，使器械前进到椎体内。可以通过导丝或套针获得椎体的接近。如果需要，可以恢复椎体高度，从而执行椎体后凸成形术程序。

移植物制备和植入：

移植物在无菌施用装置中递送。将施用装置连接至接入装置。移植物和纤维蛋白在荧光镜引导下同时注射到椎体中。在已将所需量的移植物插入椎体后，取出接入器械并闭合伤口。

手术后程序：

松动(mobilisation)可以在手术的当天开始。推荐支撑直到没有疼痛，应开具足够的止痛药。聚焦于腰椎稳定的锻炼计划应在疼痛情况允许的情况下尽快开始。

实施例5：神经源性转分化的起始

概念验证：

通过胶原酶消化从脂肪组织活检中分离间充质干细胞。细胞在单层培养中扩增。在获得足够量的细胞后，将细胞以3×10⁴个细胞的密度接种到48孔板的两个孔中。通过加入市售的神经源性分化培养基在一个孔中起始神经源性分化。将剩余的细胞在对照培养基中培养，所述对照培养基由补充有10％胎小牛血清和2mM L-谷氨酰胺的Dulbecco改良的Eagle培养基与Ham营养混合物F12的1:1混合物组成。为了防止细菌污染，向该两种培养基中加入50μg/ml庆大霉素。在37℃、5％CO₂和90％湿度下进行孵育。每周更换培养基两次。3天后，观察到对神经元样细胞典型的树突和轴突的形成(图8a)。在对照培养基中培养的细胞保持其对间充质干细胞典型的多边形形状(图8b)。

脂肪移植物制备：

将小脂肪活检置于无菌容器中用于运输到组织培养实验室。将样品在无菌盐水溶液中洗涤以除去污染性红细胞。在通过污染检查后，将样品分成两部分。将A部分(转分化样品)在旨在用于间充质干细胞分化的市售神经源性分化培养基(Promocell，Heidelberg/Germany)中孵育。将B部分(对照)在补充有10％胎小牛血清和2mM L-谷氨酰胺的Dulbecco改良的Eagle培养基与Ham营养混合物F12的1:1混合物中孵育。为了防止细菌污染，向该两种培养基中加入50μg/ml庆大霉素。在37℃、5％CO₂和90％湿度下进行孵育6周。每周更换培养基两次。

组织学评价：

在孵育期结束时，将样品在4％甲醛中固定，在磷酸缓冲盐水中洗涤，并在升高的浓度的乙醇中排干。将组织包埋在塑化石蜡中，制备5μm切片。通过使用甲酚紫的尼氏体组织化学染色评估神经源性分化。

结果：

在对照组织中没有观察到形态学变化(图9a)。神经源性转分化移植物显示出阳性甲酚紫染色，由细胞质内黑-紫色尼氏体的存在指示的(图8c，箭头)。在神经源性转分化样品中，脂泡逐渐被表现出对于神经细胞典型的阳性甲酚紫染色的含有具有大的核周体的圆形细胞的神经源性组织替代(图9b)。在转分化样品中可以观察到周围神经组织的区带分化，其包含围绕神经细胞的清晰可辨的神经束膜和神经外膜以及伴随的血管(图9c)。在对照样品中未观察到尼氏体的形成(图8d)。

实施例6：生腱分化的诱导

概念的初步验证：

作为生腱分化培养基的初始评价，通过胶原酶消化从脂肪组织活检中分离间充质干细胞。细胞在单层培养中扩增。在获得足够量的细胞后，将细胞以5×10⁴个细胞的密度接种到48孔板的两个孔中。通过加入由补充有1％FCS和10ng/ml BMP-12的DMEM-F12组成的生腱分化培养基在一个孔中起始生腱分化。将剩余的细胞在对照培养基中培养，所述对照培养基由补充有10％胎小牛血清和2mM L-谷氨酰胺的Dulbecco改良的Eagle培养基与Ham营养混合物F12的1:1混合物组成。为了防止细菌污染，向该两种培养基中加入50μg/ml庆大霉素。在37℃、5％CO₂和90％湿度下进行孵育。每周更换培养基两次。在两周后在分化组中可以看到朝向纺锤形腱细胞的分化(图10a)。在对照组中未观察到形态学变化(图10b)。

脂肪移植物制备：

将小脂肪活检置于无菌容器中用于运输到组织培养实验室。将样品在无菌盐水溶液中洗涤以除去污染性红细胞。在通过污染检查后，将样品分成两部分。将A部分(转分化样品)在生腱分化培养基中孵育。将B部分(对照)在补充有10％胎小牛血清和2mM L-谷氨酰胺的Dulbecco改良的Eagle培养基与Ham营养混合物F12的1:1混合物中孵育。为了防止细菌污染，向该两种培养基中加入50μg/ml庆大霉素。在37℃、5％CO₂和90％湿度下进行孵育6周。每周更换培养基两次。

组织学评价：

在孵育期结束时，将样品在4％甲醛中固定，在磷酸缓冲盐水中洗涤，并在升高的浓度的乙醇中排干。将组织包埋在塑化石蜡中，制备5μm切片。使用H/E染色评价生腱分化。

结果：

在转分化脂肪垫中存在显示圆形取向的腱细胞分化组织的岛(图10c)，但其不存在于对照组(d)中。

实施例7：生肌分化的诱导

概念的初步验证：

作为概念的初步验证，通过胶原酶消化从脂肪组织活检中分离间充质干细胞。细胞在单层培养中扩增。在获得足够量的细胞后，将细胞以5×10⁴个细胞的密度接种到48孔板的两个孔中。通过加入市售的生肌分化培养基在一个孔中起始生肌分化。将剩余的细胞在对照培养基中培养，所述对照培养基由补充有10％胎小牛血清和2mM L-谷氨酰胺的Dulbecco改良的Eagle培养基与Ham营养混合物F12的1:1混合物组成。为了防止细菌污染，向该两种培养基中加入50μg/ml庆大霉素。在37℃、5％CO₂和90％湿度下进行孵育。每周更换培养基两次。两周后在分化组中可以看到朝向定向肌细胞的分化(图11a)，但在对照组中未观察到(图11b)。

脂肪移植物制备：

将小脂肪活检置于无菌容器中用于运输到组织培养实验室。将样品在无菌盐水溶液中洗涤以除去污染性红细胞。在通过污染检查后，将样品分成两部分。将A部分(转分化样品)在生肌分化培养基中孵育。将B部分(对照)在补充有10％胎小牛血清和2mM L-谷氨酰胺的Dulbecco改良的Eagle培养基与Ham营养混合物F12的1:1混合物中孵育。为了防止细菌污染，向该两种培养基中加入50μg/ml庆大霉素。在37℃、5％CO₂和90％湿度下进行孵育6周。每周更换培养基两次。

组织学评价：

在孵育期结束时，将样品在4％甲醛中固定，在磷酸缓冲盐水中洗涤，并在升高的浓度的乙醇中排干。将组织包埋在塑化石蜡中，制备5μm切片。使用Masson Goldner染色评价生肌分化。

结果：

在分化6周后，脂泡被显示纵向取向和阳性Goldner染色的肌肉组织部分地替代(图11c)。在对照样品中不存在肌肉组织形成(图11d)。

参考资料

¹Ekanayake E.等人Acta Neurochir.152:651-653

²Chien-Lung C.等人J Chin Med Assoc 69(12):581–584

³Eder C.等人Eur Spine J.2013 May 1.[Epub ahead of print]

⁴Amini A.R.等人Crit Rev Biomed Eng.2012；40(5):363–408.

⁵Yang Y.等人Med Sci Monit.2013；19:826–836

⁶Robinson Y.Patient Safety in Surgery 2008,2:2

⁷Thomsaon LA.Biomaterials 1992；13(12):811-8.

⁸Schmelzer-Schmied N.Eur Spine J 2009；18:624-629

⁹Blattert TR.Spine(Phila PA 1976)2009 Jan 15；34(2):108-14

¹⁰Pridie KH.J Bone Joint Surg Br.1959；41:618.

¹¹Steadman JR等人Clin Orthop Relat Res.2001；391 Suppl:362-369

¹²Gomoll AH等人Knee Surg Sports Traumatol Arthrosc.2010:18(4):434-447

¹³Hangody L.等人Orthopedics.1998；2(7):751-756

¹⁴Orth P.等人Stem cells and Cloning:Advances and Applications 2014,7:1-17

¹⁵Brittberg M.等人N Engl J Med.1994；331(14):889-895

¹⁶National Institute for health and clinical excellence:The use auf autologous chondrocyte implantation for the treatment of cartilage defects in knee joints.Review of Technology Appraisal 16,May 2008 www.nice.org.uk/nicemedia/pdf/TA089guidance.pdf

¹⁷Niemeyer P.等人Am J Sports Med.2008Nov；36(11):2091-9

¹⁸Pietschmann M.F.等人Am J Sports Med.2012 Jan；40(1):68-74

¹⁹Safety informationwww.carticel.com

²⁰Solchaga L.A.等人Methods Mol.Biol.2011,698:253-278

²¹Jaiswal N等人J Cell Biochem.1997Feb；64(2):295-312.

²²Halvorsen YC等人2000；24,Suppl 4:S41-S44

²³Evans等人,European Cells and Materials 2009；18:96-111

²⁴Evans,Injury 2011 June；42(6):599–604 as NIH Public Access manuscript of 1 June 2012

²⁵Orlicky D.J.,Schaack J.J Lipid Res 2001；42:460-466

²⁶Wang等人,Genet.Mol.Res.13(2)(2014):4599-4606

²⁷Sandor等人,Journal of oral and maxillofacial surgery 71(5)(2013):938-950

²⁸Salibian等人,Archives of plastic surgery 40(6)(2013):666

²⁹Inok Kim等人,Tissue engineering part a 19(21-22)(2013):2372-2381

³⁰Jung等人,The journal of craniofacial surgery 21(2)(2010):468-462

³¹Eun Hee等人,World journal of stem cells 6(1)(2014):65

³²Stromps等人,Biomed research international 111(1)(2014):79-7

³³Sujeong等人,BMC cell biology 11(1)(2010):25