用于鉴定和选择对北方叶枯病具有抗性的玉米植株的组合物和方法与流程

本申请要求提交于2014年8月8目的美国临时申请62/034,806的权益，其全部内容以引用方式并入本文。
技术领域：
本领域涉及植株育种以及鉴定和选择对北方叶枯病具有抗性的植株的方法。以电子方式递交的序列表的引用通过EFS-Web以电子方式将序列表的正式文本作为ASCII格式的序列表递交，该文件名称为“20150715_BB1987PCT_SequenceListing_ST25.txt”，创建日期为2015年7月15日，文件大小为10千字节，并且该文件与本说明书同时提交。在这一ASCII格式的文件中包含的序列表为所述说明书的部分并且全文以引用方式并入本文。
背景技术：
：由真菌玉米大斑病菌(Setosphaeriaturcica)(也称为玉米大斑菌或玉米大斑病)引起的北方叶枯病(NLB)是美洲、南美洲、非洲和亚洲的一种主要的玉米病害。症状可以从下叶上的雪茄形损伤到叶片完全破坏，从而减少可用于光合作用的叶表面积量，这继而影响谷物产量。病害管理策略包括轮作，通过耕作破坏老玉米残留物，以及杀真菌剂应用，所有这些都旨在减少真菌接种物。然而，控制北美枯叶病的最有效和最优选方法是种植抗性杂交种。玉米大斑病菌的多种变种和种族存在于自然界中，留给种植者两种杂交选择：部分抗性杂交，其提供针对多种族的低水平、广谱保护，以及种族特异性抗性杂交，其针对特异性种族保护。已经描述了玉米大斑病菌(Exserohilumturcicum)抗性的遗传来源，并且已经鉴定了四种玉米大斑病菌(先前称为玉米大斑病菌(Helminthosporlumturcicum))抗性基因座：Ht1、Ht2、Ht3和Htn1。基因Ht1映射到染色体2的长臂，其中其与下列紧密连锁：umc36(Coe，E.H.等人，(1988)，CornandCornImprovement，第3版，第81-258页)、sgcr506(Gupta，M.等人，(1989)MaizeGenet.Coop.Newsl.63，112)、umcl50B)Bentolila，S.等人(1991)Theor.Appl.Genet.，82∶393-398)、以及pic18a(Collins等人，(1998)MolecularPlant-MicrobeInteractions，11：968-978)，并且其由umc22和umc122紧密侧接(Li等人(1998)Hereditas，129：101-106)。基因Ht2映射到umc48-umc89区间中的染色体8的长臂(Zaitlin等人，(1992)MaizeGenet.Coop.Newsl.，66，69-70)，并且基因Ht3映射到靠近bnlg1666的染色体7(VanStaden，D等人(2001)，MaizeGeneticsConferenceAbstracts43：P134)。Htn1基因映射到染色体8，约10cM远离Ht2并且0.8cM远离RFLP标记umc117(Simcox和Bennetzen(1993)MaizeGenet.Coop.Newl.67，118-119；Simcox和Bennetzen(1993)Phytopathology，83：1326-1330；Chung等人，(2010)TheorAppGenEpub)。因为QTL响应不同种族，并且每个QTL具有对北方叶枯病抗性特性的可变影响，所以希望鉴定可以与其它已知的抗性基因座组合以增强北方叶枯病总体抗性的遗传抗性新来源。技术实现要素：本发明提供了用于鉴定和选择具有增强的北方叶枯病抗性的玉米植株的组合物和方法。本文提供了用于鉴定具有北方叶枯病抗性的玉米植株的方法。所述方法涉及分析玉米植株的DNA中与北方叶枯病抗性相关联的QTL等位基因的存在，并且如果检测到QTL等位基因，则选择具有北方叶枯病抗性的玉米植株。QTL等位基因位于染色体5上的区间内，所述区间包含PHM18056和PHM7958并且两侧为PHM18056和PHM7958，并且QTL等位基因可包含：位于PZE-105068275的“G”；位于PZE-105068432的“A”；位于PZE-105068572的“C”；位于SYN30642的“T”；位于PZE-105068746的“C”；位于PZE-105069095的“A”；位于ZE-105069706的“A”；位于PZE-105069906的“T”；以及位于PZE-105070525的“C”。其中QTL等位基因所位于的区间的子区间可由标记PZE-105068275和PZE-105070525进一步限定。本发明提供了用于将与北方叶枯病抗性相关联的QTL等位基因渗入玉米植株中的方法。所述方法涉及用至少一种标记筛选群体以确定来自所述群体的一种或多种玉米植株是否包含与北方叶枯病抗性相关联的QTL等位基因，并且从所述群体中选择具有QTL等位基因的一种或多种玉米植株。QTL等位基因可包含：位于PZE-105068275的“G”；位于PZE-105068432的“A”；位于PZE-105068572的“C”；位于SYN30642的“T”；位于PZE-105068746的“C”；位于PZE-105069095的“A”；位于ZE-105069706的“A”；位于PZE-105069906的“T”；以及位于PZE-105070525的“C”。本发明还提供了通过本文所述的方法鉴定、选择和/或产生的植株。附图和序列表的简要说明根据以下的详细描述和附图以及序列表，可以更全面地理解本公开，以下的详细描述和附图以及序列表形成本申请的一部分。此序列表中以单个字母表示核苷酸，以三字母表示氨基酸，如NucleicAcidsResearch13：3021-3030(1985)和BiochemicalJournal219(No.2)：345-373(1984)所描述的IUPAC-IUBMB标准中所规定，其以引用方式全文并入本文。用于核苷酸和氨基酸序列数据的符号和格式遵循在37C.F.R..sctn.1.822中示出的规定。图1示出了用作北方叶枯病感染评分指南的图表。SEQIDNO：1是标记PHM16750的参考序列。SEQIDNO：2是标记PHM15741的参考序列。SEQIDNO：3是标记PHM16854的参考序列。SEQIDNO：4是标记PHM3870的参考序列。SEQIDNO：5是标记PHM14018的参考序列。SEQIDNO：6是标记PHM18056的参考序列。SEQIDNO：7是标记PHM3467的参考序列。SEQIDNO：8是标记PHM7958的参考序列。SEQIDNO：9是标记PZE-105068275的参考序列。SEQIDNO：10是标记PZE-105068432的参考序列。SEQIDNO：11是标记PZE-105068572的参考序列。SEQIDNO：12是标记SYN30642的参考序列。SEQIDNO：13是标记PZE-105068746的参考序列。SEQIDNO：14是标记PZE-105069095的参考序列。SEQIDNO：15是标记PZE-105069706的参考序列。SEQIDNO：16是标记PZE-105069906的参考序列。SEQIDNO：17是标记PZE-105070525的参考序列。具体实施方式本文提供了玉米标记基因座，其展示与北方叶枯病抗性性状的统计学显著共分离。这些基因座或附加的连锁基因座的检测可以用于标记辅助选择中作为玉米育种程序的一部分，以产生对由病原体玉米大斑病菌(Exserohilumturcicum)引起的北方叶枯病具有抗性的玉米植株。除非另外说明，核酸是以5′到3′方向从左往右书写。说明书中所述的数字范围包括限定范围的端值并且包括在限定范围内的各个整数或任何非整数的分数。除非另外指明，本文所用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员的一般理解相同的含义。与本文中所述的那些类似或等同的任何方法和材料均可用于测试本文所提出的主题的实践中。在本发明的描述和权利要求中，将根据下文陈述的定义使用下列术语。提供下列定义以利于理解本公开。应当理解，本公开不受特定实施方案的限制，所述实施方案当然能够改变。也应当了解本文所用的术语仅是为了描述特定实施方案，而不旨在进行限制。当在本说明书和所附权利要求中使用时，除非内容清楚地表明，单数和单数形式的术语例如“一个”、“一种”和“所述”包括复数指代。因此，例如关于“植物”、“植株”或“作物”还包括多株植物；而且根椐上下文，所用的术语“植株”还可包括遗传学类似的植株或该植株的相同子代；所用的术语“核酸”实际上任选地包括该核酸分子的多个拷贝；类似地，术语“探针”任选地(并且通常)涵盖许多类似或相同的探针分子。术语“等位基因”是指在特定基因座处出现的两个或更多个不同的核苷酸序列中的一个。“等位基因频率”是指等位基因存在于个体、一个品系、或群体品系中的基因座处的频率(比例或百分比)。例如，就等位基因“A”而言，基因型“AA”、“Aa”、或“aa”的二倍体个体分别具有1.0、0.5、或0.0的等位基因频率。人们能够通过平均化来自品系的个体样品的等位基因频率来估计该品系中的等位基因频率。相似地，人们能够通过平均化构成该群体的品系的等位基因频率来计算该群体品系中的等位基因频率。就具有限定数目的个体或品系的群体而言，可将等位基因频率表示为包含等位基因的个体或品系(或任何其它指定组)的计数。“扩增子”是被扩增的核酸，例如使用任何可用的扩增方法(例如PCR、LCR、转录等)通过扩增模板核酸制备的核酸。在核酸扩增的情况下术语“扩增”是其中产生附加拷贝的所选择核酸(或其转录形式)的任何过程。典型的扩增方法包括基于多种聚合酶的复制方法，包括聚合酶链反应(PCR)、连接酶介导的方法诸如连接酶链反应(LCR)、以及基于RNA聚合酶的扩增(例如通过转录)方法。术语“装配”应用于BAC以及它们聚集以形成连续的DNA片段的倾向。BAC基于序列比对“装配”成重叠群，如果BAC进行测序，或经由它的BAC指纹与其它BAC指纹的比对“装配”成重叠群。可使用因特网上公开可用的MaizeGenomeBrowser找到公开的装配。当等位基因是影响性状表达的DNA序列或等位基因的一部分或与之连锁时，所述等位基因“关联”所述性状。等位基因的存在是该性状将如何被表达的指征。“BAC”，或细菌人工染色体，是来源于天然存在的大肠杆菌(Escherichiacoli)的F因子的克隆载体，其自身是能够作为环状质粒存在或者能够被整合进细菌染色体的DNA元件。BAC能够接收DNA序列的较大插入序列。在玉米中，各自包含来自玉米近交系B73的玉米基因组DNA的较大插入序列的大量BAC已经装配成为重叠群(重叠的连续基因片段，或“连续DNA”)，并且这一装配可在因特网上公开获得。BAC指纹是分析多个DNA样品之间的相似度的方法，其基于特定限制性位点的存在或缺乏而进行(限制性位点是由切割或“限制”DNA的酶所识别的核苷酸序列)而进行。使用相同的限制性酶组消化两种或更多种BAC样品并且比较所形成的片段的大小，这通常使用凝胶分离进行。“回交”是指其中杂交子代反复与亲本之一来回杂交的过程。在回交方案中，“供体”亲本是指具有待掺入的所需(一种或多种)基因、(一种或多种)基因座或特异性表型的亲本植株。“受体”亲本(使用一次或多次)或“轮回”亲本(使用两次或更多次)是指将基因或基因座渗入其中的亲本植株。例如，参见Ragot，M.等人(1995)Marker-assistedbackcrossing：apracticalexample，inTechniquesetUtilisationsdesMarqueursMoleculairesLesColloques，第72卷，第45-56页，以及Openshaw等人，(1994)Marker-assistedSelectioninBackcrossBreeding，AnalysisofMolecularMarkerData，第41-43页。初始杂交产生F1代；于是术语“BC1”是指轮回亲本的第二次使用，“BC2”是指轮回亲本的第三次使用，以此类推。厘摩(“cM”)是重组频率的量度单位。1cM等于经过单代杂交在一个基因座上的标记将与在第二基因座上的标记分离的1％的概率。如本文所用，术语“染色体区间”指位于植株单个染色体上的基因组DNA的连续的线性区域。位于单个染色体区间上的遗传因子或基因是物理上连锁的。染色体区间的大小没有特定的限制。在一些方面，位于单个染色体区间内的遗传因子是遗传连锁的，通常具有例如小于或等于20cM或者小于或等于10cM的遗传重组距离。即，在单个染色体区间内的两个遗传因子发生重组的频率小于或等于20％或10％。“染色体”是包含许多基因的单独的一段盘绕的DNA，这些基因在细胞分裂过程中作为一个整体起作用和移动并因此能够被称为是连锁的。“染色体”也可称为“连锁群”。在本专利申请中，短语“紧密连锁”指两个连锁基因座间重组的发生频率为等于或小于约10％(即在基因图谱上的分离频率不超过10cM)。换句话说，紧密连锁的基因座至少90％的情况下共分离。当标记基因座显示与期望性状(例如北方叶枯病抗性)共分离(连锁)的显著概率时，它们对于本公开的主题是尤其有用的。紧密连锁的基因座诸如标记基因座和第二基因座可显示10％或更低，优选约9％或更低，还更优选约8％或更低，还更优选约7％或更低，还更优选约6％或更低，还更优选约5％或更低，还更优选约4％或更低，还更优选约3％或更低，并且更优选约2％或更低的基因座内重组频率。在高度优选的实施方案中，关联基因座显示约1％或更低的重组频率，例如约0.75％或更低，更优选约0.5％或更低，或更优选约0.25％或更低的重组频率。位于相同染色体上，并且它们间的距离使得两个基因座间的重组发生频率小于10％(例如约9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.75％、0.5％、0.25％或更低)的两个基因座也称为彼此“邻近”。在某些情况下，两个不同标记能够具有相同的基因图谱坐标。在那种情况下，两个标记彼此足够接近使得它们之间的重组发生频率低至无法检测。术语“互补序列”是指与给定核苷酸序列互补的核苷酸序列，即所述序列根据沃森-克里克(Watson-Crick)碱基配对原则而相关联。术语“连续DNA”是指未中断的基因组DNA片段，其由部分重叠的片段或重叠群表示。当涉及两个遗传因子间的关系时，例如有助于北方叶枯病抗性的遗传因子和邻近的标记，“相引”相连锁指示下述状态：其中在北方叶枯病抗性基因座上的“有利”等位基因与相应连锁的标记基因座的“有利”等位基因物理上关联在相同染色体链上。在偶合相中，两个有利等位基因被继承了该染色体链的子代一起继承。术语“受到杂交”或“杂交”是指有性杂交，并且涉及两组单倍体配子通过授粉进行的融合，从而产生二倍体子代(例如，细胞、种子或植株)。该术语包括一株植物被另一株植物授粉和自交(或自花授粉，例如当花粉和胚珠来自同一植株时)。本文称为“二倍体”的植株具有两组染色体(基因组)。本文称为“双单倍体”的植株通过倍增单倍体染色体组进行开发(即，正常染色体数目的一半)。双单倍体植株具有两组相同的染色体，并且认为全部基因座是纯合的。“优良品系”是源自育种并选择优异农学性能的任何品系。“外来玉米株系”或“外来玉米种质”是来源于不属于可得的优良玉米品系或种质株系的玉米植株的株系。在杂交发生在两个玉米植株或种质株系之间的情况下，外来种质的子代不与它杂交的优良种质密切相关。最常见的是外来种质不来源于任何已知的玉米优良品系，而是选择将新遗传因子(通常新等位基因)导入育种程序中。“有利等位基因”是在特定基因座的等位基因，它赋予或有助于农学上所期望的表型，例如北方叶枯病抗性，并允许对具有农学上所期望表型的植株的鉴定。标记的有利等位基因是与有利表型共分离的标记等位基因。“片段”旨在表示核苷酸序列的一部分。使用本文所公开的方法，片段可用作杂交探针或PCR引物。“基因图谱”是对给定物种中一个或多个染色体(或连锁群)上的基因座间的基因连锁关系的描述，一般以图表或表格形式描述。对于每一基因图谱，基因座之间的距离是通过它们的等位基因在群体内一起出现的频繁程度(它们的重组频率)测量的。利用DNA或蛋白质标记、或可观察的表型，能够检测等位基因。基因图谱是作图的群体、使用的标记的类型、以及不同群体间各个标记的多态性潜力的产物。一个基因图谱与另一个基因图谱在基因座之间的遗传距离可以不同。然而，使用共同标记能够将一个图谱与另一个图谱的信息关联。本领域的普通技术人员可使用共同标记位置来鉴定在各个个体基因图谱上的标记位置和受关注的其它基因座。尽管由于，例如，在不同群体中检测替代性的重复基因座的标记、用于将标记定序的统计方法中的差异、新型突变或实验室误差而在标记顺序上经常存在细微变化，但是基因座的顺序在图谱间不应变化。“基因图谱位置”是在相同连锁群上，在基因图谱上的相对于围绕的遗传标记的位置，其中能够在给定种群中发现指定标记。“基因作图”是限定基因座的连锁关系的方法，该方法通过使用遗传标记、标记的群体分离、以及重组频率的标准遗传原则进行。“遗传标记”是群体中的多态核酸，并且其中可通过一种或多种分析方法检测并区分出它们的等位基因，例如RFLP、AFLP、同功酶、SNP、SSR等。该术语也指与基因组序列互补的核酸序列，诸如用作探针的核酸。对应于群体成员之间的遗传多态性的标记能够通过本领域已建立的方法进行检测。这些方法包括例如基于PCR的序列特异性扩增方法、限制性片段长度多态性检测(RFLP)、同功酶标记检测、通过等位基因特异性杂交(ASH)进行的多核苷酸多态性检测、植株基因组的扩增可变序列检测、自主序列复制检测、简单重复序列检测(SSR)、单核苷酸多态性检测(SNP)、或扩增片段长度多态性检测(AFLP)。已经建立的方法也已知用于检测表达序列标签(EST)和来源于EST序列的SSR标记以及随机扩增的多态性DNA(RAPD)。“遗传重组频率”是两个基因座之间的交换事件(重组)的频率。在标记和/或减数分裂后性状的分离后可观察到重组频率。“基因组”是指总DNA或整组基因，由染色体或染色体组携带。术语“基因型”是个体(或个体组)在一个或多个基因座处的基因组成。基因型由一个或多个已知基因座的等位基因限定，个体已经从其亲本中继承了所述基因型。术语基因型可被用于指个体在单个基因座处的基因组成，在多个基因座上的基因组成，或更一般地，术语基因型可被用于指个体在其基因组中的所有基因的基因组成。“种质”是指遗传物质，其属于或来自于个体(例如，植株)、个体的组(例如，植株品系、品种或家族)或来自品系、品种、物种或培养物的克隆，或更一般地某一物种或多个物种的全部个体(例如，玉米种质集合(maizegermplasmcollection)或Andean种质集合(Andeangermplasmcollection))。种质可为生物体或细胞的部分，或者可从生物体或细胞中分离得到。一般来讲，种质给遗传物质提供特异性分子构成，该分子构成向生物体或细胞培养物的一些或全部遗传特质提供物理基础。如本文所用，种质包括可从中生长出新植株的细胞、种子或组织，或植株部分诸如叶、茎、花粉、或细胞，它们能够被培养成整个植株。称为“单倍体”的植株具有一组染色体(基因组)。“单倍型”是个体的多个基因座处的基因型，即等位基因的组合。通常，单倍型描述的基因座通常是物理上和遗传上连锁的，即在相同染色体片段上。术语“单倍型”可指位于特定基因座处的等位基因或指沿染色体片段位于多个基因座上的等位基因。术语“异质”用于指明一组内的个体在一个或多个特定基因座处基因型不同。材料的杂交反应或“杂种优势”能够被定义为当与其他不同的或不相关的群杂交时，超过亲本的平均(或高值亲本)的性能。“杂种优势群”包含一组基因型，它们当与来自不同杂种优势群的基因型杂交时表现良好(Hallauer等人，(1998)Cornbreeding，第463-564页，在G.F.Sprague和J.W.Dudley(编)Cornandcornimprovement)。将近交系归类为杂种优势群，并且将其进一步细分为杂种优势群内的家族，所述分类基于若干个标准如家谱、基于分子标记的关联、以及杂交体组合的性能(Smith等人，(1990)Theor.Appl.Gen.80：833-840)。美国两个最广泛使用的杂种优势群称为“爱荷华刚性茎秆合成群体(IowaStiffStalkSynthetic)”(本文中也称为“刚性茎秆”)和“Lancaster”或“LancasterSureCrop”(有时称为NSS或非刚性茎秆)。一些杂种优势群具有作为雌性亲本所需的性状，而另一些具有用于雄性亲本的性状。例如，在玉米中，产生自从被称为BSSS的群体(爱荷华刚性茎秆合成群体)释放的公开的近交系的产出已使得这些近交系以及它们的衍生物成为了美国中部玉米种植带的雌性库。BSSS近交系已与其他近交系(例如SD105和MaizAmargo)杂交，并且这种一般性的材料群体已作为刚性茎秆合成(StiffStalkSynthetics(SSS))为人们所知，尽管并非全部的这些近交系均来源于初始的BSSS群体(Mikel和Dudley(2006)CropSci：46：1193-1205)。默认地，与SSS近交系良好组合的全部其他近交系被指定为雄性库，其由于缺少更好的名称已被称为NSS，即“非刚性茎秆”。该群体包括了多个主要的杂种优势群，诸如LancasterSurecrop、Iodent和LeamingCorn。如果多于一种的等位基因类型存在于给定基因座处(例如二倍体个体具有两个不同等位基因中的每一个的一个拷贝)，则该个体是“杂合的”。术语“同质性”指一组成员在一个或多个特定基因座处具有相同基因型。如果个体在给定基因座处仅具有一种类型的等位基因(例如二倍体个体在两个同源染色体中的每一个的基因座处具有相同等位基因的一个拷贝)，则该个体是“纯合的”。术语“杂交体”是指至少两个基因相异的亲本间杂交获得的子代。“杂交”或“核酸杂交”是指互补RNA和DNA链配对以及互补DNA单链配对。术语“杂交”指核酸链的互补区域之间形成碱基对。“IBM基因图谱”可指任何下列图谱：IBM、IBM2、IBM2邻接、IBM2FPC0507、IBM22004邻接、IBM22005邻接、IBM22005邻接框、IBM22008邻接、IBM22008邻接框、或maizeGDB网站的最新版本。IBM基因图谱基于B73×Mo17群体，其中来自初始杂交的子代在构建重组近交系用于作图前随机交配产生多代。较新的版本反映了遗传的或BAC作图的基因座的添加，以及由于从其它遗传图谱或物理图谱、经过清理的数据或新算法的使用获得的信息的整合而提高的图谱精度。术语“近交”是指已经进行育种以获得遗传同质性的品系。术语“插入缺失”是指插入或缺失，其中可指一个品系相对于第二品系具有插入的核苷酸或DNA片段，或可指所述第二品系相对所述第一品系具有缺失的核苷酸或DNA片段。术语“基因渗入”是指遗传基因座的所需等位基因从一种遗传背景传递到另一种遗传背景。例如在特定基因座处的期望等位基因的基因渗入经由相同物种的两个亲本间的有性杂交可被传递到至少一个子代，其中至少一个亲本在其基因组中具有期望的等位基因。另选地，例如等位基因的传递能够通过两个供体基因组之间的重组而发生，例如在融合原生质体中，其中供体原生质体中的至少一个在其基因组中具有期望的等位基因。所期望的等位基因可以，例如，通过关联于表型的标记在QTL(即，QTL等位基因)、转基因等等中被检测。在任何情况下，能够将包含期望等位基因的子代与具有期望遗传背景的品系反复回交并对期望的等位基因进行选择以产生固定在所选择遗传背景中的等位基因。当重复“基因渗入”过程两次或更多次时，该过程常被称为“回交”。“品系”或“品种”是一组具有相同亲缘关系的个体，它们一般是某种程度的近交体，并且一般在大多数基因座是纯合的和均一的(同基因的或接近同基因的)。“亚系”是指子代的近交体子集，它们与相同祖先来源的其它相似近交体子集遗传上不同。如本文所用，术语“连锁”用于描述一种标记基因座与另一种标记基因座或其它一些基因座的相关联程度。分子标记和影响表型的基因座之间的连锁关系用“概率”或“调整概率”表示。连锁可表示为所期望的界限或范围。例如，在一些实施方案中，任何标记与任何其他标记当所述标记以单一减数分裂图谱(基于经过一轮减数分裂的群体(诸如，例如F2)的基因图谱；IBM2图谱包括多次减数分裂)的小于50、40、30、25、20、或15个图谱单位(或cM)被分离时是(遗传上和物理上)连锁的。在一些方面，限定范围形式的连锁，例如介于10cM和20cM之间、介于10cM和30cM之间、或者介于10cM和40cM之间，是有利的。标记与第二基因座连锁越紧密，标记越可能变成第二基因座的指示。因此，“紧密连锁的基因座”诸如标记基因座和第二基因座显示10％或更低，优选约9％或更低，更优选约8％或更低，更优选约7％或更低，更优选约6％或更低，更优选约5％或更低，更优选约4％或更低，更优选约3％或更低，更优选约2％或更低的基因座内重组频率。在高度优选的实施方案中，关联基因座显示约1％或更低的重组频率，例如约0.75％或更低，更优选约0.5％或更低，或更优选约0.25％或更低的重组频率。位于相同染色体上，并且它们间的距离使得两个基因座间的重组发生频率小于10％(例如约9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.75％、0.5％、0.25％、或更低)的两个基因座也称为彼此“邻近”。因为1cM是显示出1％的重组频率的两个标记之间的距离，任何标记与紧邻的任何其它标记紧密连锁(基因上和物理上)，例如等于或小于10cM的距离。在相同染色体上的两个紧密连锁的标记可相互定位为9、8、7、6、5、4、3、2、1、0.75、0.5或0.25cM或更近。术语“连锁不平衡”(或LD)指基因座或性状(或两者都有)非随机地分离。在任一情况下，连锁不平衡意味着相关的基因座沿着一定长度的染色体在物理上足够接近，以便它们以高于随机(即非随机)的频率一起分离。显示连锁不平衡的标记被认为是连锁的。连锁基因座在超过50％的情况下共分离，例如约51％至约100％的情况。换句话说，共分离的两个标记具有小于50％(并且根据定义，在相同连锁群上分离距离小于50cM)的重组频率。如本文所用，连锁可存在于两个标记之间或者标记和影响表型的基因座之间。标记基因座可与性状“相关联”(连锁)。标记基因座和影响表型性状的基因座的连锁程度可以根据，例如，该分子标记与所述表型共分离的统计概率(例如，F统计或LOD评分)加以测量。连锁不平衡最常见地用量度r2估计，它使用Hill，W.G.和Robertson，A，Theor.Appl.Genet.38：226-231(1968)描述的式计算。当r2＝1时，两个标记基因座间存在完全的LD，意味着所述标记还未进行重组分离并且具有相同的等位基因频率。r2值应依赖于所使用的群体。r2值大于1/3显示了可用于作图的足够强的LD(Ardlie等人，NatureReviewsGenetics3：299-309(2002))。因此，当成对标记基因座间的r2值大于或等于0.33、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、或1.0时，等位基因处于连锁不平衡。如本文所用，“连锁平衡”描述其中两个标记独立地分离的情况，即，在子代中随机分离。认为显示连锁平衡的标记不连锁(无论它们是否位于相同染色体上)。“基因座”是染色体上的位置，例如，核苷酸、基因、序列或标记所处的位点。“优势对数(LOD)值”或“LOD评分”(Risch，Science255：803-804(1992))用于基因区间作图以描述两个标记基因座之间的连锁程度。两个标记间LOD评分为三指示连锁概率为无连锁的概率的1000倍，而LOD评分为二指示连锁概率为无连锁的概率的100倍。大于或等于二的LOD评分可用于检测连锁。LOD评分还可用于在“数量性状基因座”作图中显示标记基因座和数量性状之间的关联强度。在这一情况下，LOD评分大小取决于所述标记基因与影响所述数量性状的基因座之间的接近度，以及所述数量性状效应的大小。“玉米(maize)”是指玉米(ZeamaysL.ssp.mays)植株并且也称为“玉米(corn)”。术语“玉米植株”包括整个玉米植株、玉米植株细胞、玉米植株原生质体、可从其中再生玉米植株的玉米植株细胞或玉米组织培养物、玉米植株愈伤组织、玉米植株丛生物和玉米植株中的完整玉米植株细胞或玉米植株的部分，诸如玉米种子、玉米穗轴、玉米花、玉米子叶、玉米叶、玉米茎、玉米芽、玉米根、玉米根尖等。“标记”是发现基因或物理图谱上的位置或发现标记与性状基因座(影响性状的基因座)之间的连锁的手段。标记所检测的位置可通过检测多态性等位基因及其基因作图而获知，或通过对已经进行物理标测的序列进行杂交、序列匹配或扩增而获知。标记可以是DNA标记(检测DNA多态性)、蛋白质(检测所编码多肽的变异)或简单遗传表型(诸如‘蜡质’表型)。可通过基因组核苷酸序列或表达的核苷酸序列(例如，通过剪接的RNA或cDNA)开发DNA标记。根据DNA标记技术，所述标记将由侧接所述基因座的互补引物和/或与该基因座处的多态性等位基因杂交的互补探针组成。DNA标记，或遗传标记，还能够被用于描述其自身染色体上的基因、DNA序列或核苷酸(而不是用于检测基因或DNA序列的组分)，并且当该DNA标记与人类遗传学中的特定性状相关联时经常被使用(例如，针对乳腺癌的标记)。术语标记基因座是该标记所检测的基因座(基因、序列或核苷酸)。检测群体成员之间的遗传多态性的标记在本领域中是已建立的。标记可由其所检测的多态性的类型以及用于检测所述多态性的标记技术所限定。标记类型包括但不限于：限制性片段长度多态性检测(RFLP)、同功酶标记检测、随机扩增的多态性DNA(RAPD)、扩增片段长度多态性检测(AFLP)、简单重复序列检测(SSR)、植株基因组的扩增可变序列检测、自主序列复制检测、或单核苷酸多态性检测(SNP)。SNP能够通过，例如，DNA测序、基于PCR的序列特异性扩增方法、通过等位基因特异性杂交(ASH)对多核苷酸多态性的检测、动态等位基因特异性杂交(DASH)、分子信标、微阵列杂交、寡核苷酸连接酶测定、Flap内切核酸酶、5’内切核苷酸、引物延伸、单链构象多态性(SSCP)或温度梯度凝胶电泳(TGGE)被检测。DNA测序，诸如焦磷酸测序技术，具有能够检测组成单倍型的一系列连锁的SNP等位基因的优点。单倍型倾向于比SNP更具信息性(检测更高水平的多态性)。“标记等位基因”或“标记基因座的等位基因”可以指群体中位于标记基因座处的多个多态性核苷酸序列中的一个。“标记辅助选择”(MAS)是基于标记基因型选择个体植株的方法。“标记辅助反选择”是一种通过它将标记基因型用于鉴定植株的方法，所述植株将不被选择，使得它们被从育种程序或种植中除去。“标记单倍型”是指在标记基因座处的等位基因的组合。“标记基因座”是物种基因组中的特定染色体位置，其中可存在特定标记。“标记基因座”可用于跟踪第二连锁基因座的存在情况，例如影响表型性状表达的连锁基因座。例如，标记基因座能够用于监控在遗传上或物理上连锁的基因座处的等位基因的分离。“标记探针”是可用于通过核酸杂交鉴定标记座位存在与否的核酸序列或分子，例如与标记座位序列互补的核酸分子探针。包含标记座位的30个或更多连续的核苷酸(标记座位序列的“所有或部分”)的标记探针可用于核酸杂交。另选地，在一些方面，标记探针是指能够区别(即基因型)存在于标记座位处的特定等位基因的任何类型的探针。如上所述，当鉴定连锁基因座时，术语“分子标记”可用于指遗传标记或用作参照点的编码产物(例如，蛋白质)。标记能够来源于基因组核苷酸序列或来源于表达的核苷酸序列(例如来源于剪接的RNA、cDNA等)，或来源于编码的多肽。该术语也指与标记序列互补或侧接标记序列的核酸序列，诸如用作探针或能够扩增标记序列的引物对的核酸。“分子标记探针”是能够被用于鉴定标记基因座的存在的核酸序列或分子，例如与标记基因座序列互补的核酸探针。另选地，在一些方面，标记探针指能够区别(即基因型)存在于标记座位处的特定等位基因的任何类型的探针。当核酸在溶液中特异性杂交时，例如根据Watson-Crick碱基配对原则杂交，核酸是“互补的”。当位于插入缺失区域，诸如本文所述的非共线区域时，本文所述的一些标记也称为杂交标记。这是因为，根据定义，插入区域是关于无插入的植株的多态性。因此，标记仅需要指明插入缺失区域是否存在。任何合适的标记检测技术都可用于鉴定此类杂交标记，例如，SNP技术用于本文提供的示例中。当等位基因与性状连锁时，以及当存在的等位基因是期望的性状或性状形式将不出现在包含上述等位基因的植株中的指示时，等位基因与性状“负”相关。“核苷酸序列”、“多核苷酸”、“核酸序列”、和“核酸片段”可互换使用，并且指作为单链或双链的RNA或DNA聚合物，任选含有合成的、非天然的或改变的核苷酸碱基。“核苷酸”是构成DNA或RNA聚合物的单体单元，它由嘌呤或嘧啶碱基、戊糖和磷酸基团组成。核苷酸(通常以它们的5′-单磷酸形式存在)可以用它们的单字母名称指代如下：“A”为腺苷酸或脱氧腺苷酸(分别针对RNA或DNA)，“C”表示胞苷酸或脱氧胞苷酸，“G”表示鸟苷酸或脱氧鸟苷酸，“U”表示尿苷酸，“T”表示脱氧胸苷酸，“R”表示嘌呤(A或G)，“Y”表示嘧啶(C或T)，“K”表示G或T，“H”表示A或C或T，“I”表示肌苷，并且“N”表示任意核苷酸。术语“表型”、“表型性状”或“性状”可指基因或系列基因的可观测表达。表型对于肉眼或本领域任何其它已知评估手段而言可以是可观测的，例如称重、计数、测量(长度、宽度、角度等)、显微法、生化分析或机电分析法。在一些情况下，表型由单个基因或基因座直接控制，即“单基因性状”或“简单遗传性状”。在无较大水平的环境变化时，可在群体中分离单基因性状以给出“定性”或“离散”分布，即表型属于离散类。在其它情况下，表型是若干个基因的结果并且可被视为“多基因性状”或“复杂性状”。在群体中分离多基因性状以给出“定量的”或“连续”分布，即表型不可分为离散类。单一基因和多基因性状均可受到其表达所处的环境的影响，但是多基因性状倾向于具有更大的环境组分。基因组的“物理图谱”是显示染色体DNA上可辨认的界标(包括基因、标记等)的线性顺序的图谱。然而与基因图谱相比，界标间的距离是绝对的(例如以碱基对测量的或分离的和重叠的连续基因片段)并且不基于基因重组(所述基因重组可在不同群体中有所变化)。“植株”可为整个植株、其任何部分、或来源于植株的细胞或组织培养物。因此，术语“植株”可指如下中的任何一种：整个植株、植株组分或器官(例如叶、茎、根等)、植株组织、种子、植株细胞、和/或它们的子代。植株细胞是从植株中获得的植株的细胞或来源于从植株中所获得的细胞的培养物。“来源于刚性茎秆合成群体中的近交体”的玉米植株可以是杂交体。“多态性”是群体内的两个或更多个个体之间DNA的变化。多态性在群体中优选地具有至少1％的频率。可用的多态性可包括单核苷酸多态性(SNP)、简单重复序列(SSR)、或插入/缺失多态性，本文也称为“插入缺失”。当等位基因与性状连锁时，以及当存在的等位基因是期望的性状或性状形式将出现在包含上述等位基因的植株中的指示基因时，等位基因与性状“正”相关。“概率值”或“p-值”是表型的特定组合和特定标记等位基因的存在或不存在是否随机的统计学概率。因此，概率评分越低，基因座和表型相关联的可能性就越高。概率评分可受到第一基因座(通常是标记基因座)与影响该表型的基因座的邻近度以及表型效应的量级(由等位基因置换导致的表型变化)的影响。在一些方面，认为概率评分“显著”或“不显著”。在一些实施方案中，认为随机分离的概率评分为0.05(p＝0.05，或5％的概率)是关联的显著性指示。然而，可接受的概率可为小于50％(p＝0.5)的任何概率。例如，显著概率能够小于0.25、小于0.20、小于0.15、小于0.1、小于0.05、小于0.01或小于0.001。“生产标记”或“生产SNP标记”是已经为高通量目的而开发的标记。生产SNP标记被开发用于检测特异性多态性，并且被设计用于与多种化学反应和平台一起使用。所使用的标记名称以代表‘PioneerHi-Bred标记(PioneerHi-BredMarker)’的前缀PHM开始，然后是从其设计的序列特异性的数字，然后是“.”或“-“，然后是DNA多态性特异性的后缀。还可以接着有标记的版本(A、B、C等)，表示对该特定多态性设计的标记的版本。术语“子代”是指杂交产生的后代。“子代植株”是通过两个植株间的杂交所生成的植株。术语“数量性状基因座”或“QTL”是指在至少一种遗传背景下(例如在至少一个育种群体中)，具有与数量表型性状的差异表达相关联的DNA区域。QTL的区域涵盖影响所考虑的性状的一个或多个基因或与其密切连锁。“QTL的等位基因”(或“QTL等位基因”)可包含连续的基因组区域或连锁群中的多个基因或其它遗传因子。QTL的等位基因可由特定窗口内的单倍型限定，其中所述窗口是能够用一组的一个或多个多态性标记限定和跟踪的连续的基因组区域。单倍型则由特定窗口内的每一标记处的等位基因的独特“指纹”限定。“参考序列”或“共有序列”是用作序列比对基准的定义序列。PHM标记的参考序列通过对基因座上的多个品系进行测序、以序列比对程序进行核苷酸序列比对(例如Sequencher)、然后获取比对的最常见核苷酸序列来获取。见于个体序列中的多态性标注于该共有序列中。参考序列通常并非任何个体DNA序列的精确拷贝，而是可用序列的混合体并且可用于设计针对该序列内的多态性的引物和探针。在“相斥”相连锁中，在受关注基因座处的“有利”等位基因与在邻近的标记基因座处的“不利”等位基因物理上连锁，并且两个“有利”等位基因不被一起继承(即这两个基因座彼此“异相”)。“北方叶枯病”(NLB)，有时被称为玉米大斑病(NCLB)，是由病原菌玉米大斑病菌(Exserohilumturcicum)引起的病害。所述病害(特征在于叶片组织上的雪茄型损害)可对产量具有严重影响，尤其是在热带环境中或在温带气候的雨季期间。如本文所用，“北方叶枯病抗性”是指当与对照植株相比时，对导致北方叶枯病的病原真菌的增强的抗性或耐受性。效果可以从对病原真菌的影响的耐受性的略微增加(例如部分抑制)，直至使得植株不受病原真菌存在的影响这样的完全抗性。针对特定病原真菌或针对广谱病原真菌的增加的抗性水平构成“增强的”或改善的真菌抗性。本公开的实施方案将增强或改善对引起北方叶枯病的病原真菌的抗性，使得植株对病原真菌或病原体的抗性将增加。术语“增强”是指提高、增加、扩大、倍增、提升、上升等。“顶交测试”是通过将各个体(例如，选择物、近交系、克隆或子代个体)与相同的花粉亲本或“测试物(tester)”(通常是纯合品系)杂交而实施的测试。短语“在严格条件下”是指在该条件下探针或多核苷酸将与特定核酸序列杂交，杂交通常在核酸复合混合物中进行，但是基本上无其它序列。严格条件是序列依赖性的，并且在不同的情况中将会不同。较长序列具体地讲在较高温度下杂交。特定序列在限定离子强度、pH的情况下，严格条件通常选择比热解链温度(Tm)低约5-10℃。Tm是(在限定离子强度、pH和核酸浓度的情况下)50％的与靶互补的探针平衡杂交到靶序列上(因为存在的靶序列过多，在Tm下，50％的探针被平衡占用)的温度。严格条件将是如下那些条件：在pH7.0至8.3下盐浓度低于约1.0M钠离子，通常约0.01至1.0M钠离子浓度(或其他盐)，并且对于短探针(例如10至50个核苷酸)温度为至少约30℃，而对于长探针(例如多于50个核苷酸)温度为至少约60℃。严格条件还可以通过添加去稳定剂诸如甲酰胺来实现。就选择性杂交或特异性杂交而言，阳性信号是至少两倍于背景，优选10倍于背景杂交。示例性严格杂交条件通常为：50％甲酰胺、5xSSC和1％SDS，在42℃下温育，或者5xSSC、1％SDS，在65℃下温育，并用0.2xSSC和0.1％SDS在65℃下洗涤。对于PCR，约36℃的温度通常用于低严格性扩增，尽管退火温度可根据引物长度在介于约32℃和48℃之间变化。决定杂交参数的附加准则在多个参考文献中提供。标记的“不利等位基因”是与不利植株表型共分离的标记等位基因，因此提供鉴定能从育种程序或栽培中去除的植株的有益效果。术语“收率”是指每单位面积具有商业价值的特定植株产品的生产能力。例如玉米收率一般以每季每英亩种子蒲式耳数或每季每公顷种子公吨数来测量。收率受遗传和环境因素两者的影响。“农学”、“农学性状”、和“农学性能”是指给定植株品种的性状(以及产生性状的遗传因子)，所述性状有助于生长季过程的收率。单个农学性状包括出苗活力、营养势、胁迫耐受性、病害抗性或耐受性、抗除草剂性、发生分枝、开花、结实率、种子大小、种子密度、抗倒伏性、脱粒率等。因此抗是所有农学特性的最终结果。序列比对和同一性百分比计算可用设计用于检测同源序列的多种比较方法来测定，这些方法包括但不限于生物信息计算包(Inc.，Madison，WI)的程序。除非另外说明，本文提供的序列的多重比对用CLUSTALV比对方法(Higgins和Sharp，CABIOS.5：151-153(1989))采用默认参数(空位罚分＝10、GAPLENGTHPENALTY＝10)执行。使用CLUSTALV方法进行蛋白质序列的逐对比对和百分比同一性计算的默认参数是KTUPLE＝1、空位罚分＝3，窗口＝5，以及对角线保存(DIAGONALSSAVED)＝5。对于核酸，这些参数是KTUPLE＝2、空位罚分＝5，窗口＝4，以及对角线保存＝4。在序列比对后，使用CLUSTALV程序，通过参阅相同程序上的“序列距离”表可能获得“百分比同一性”和“趋异度”值；除非另外说明，本文提供的和受权利要求书保护的同一性百分比和趋异度是以该方式计算。本文使用的标准重组DNA和分子克隆技术是本领域所熟知的并且在如下文献中有更全面的描述：Sambrook，J.，Fritsch，E.F.andManiatis，T.，MolecularCloning：ALaboratoryManual；ColdSpringHarborLaboratoryPress：ColdSpringHarbor，1989(下文称为“Sambrook”)。基因图谱--与增强的玉米大斑病抗性相关联的基因座的鉴定在很长一段时间里，人们已经认识到与特定表型例如北方叶枯病抗性相关联的特定基因座可在生物的基因组中作图。有利的是，植株育种人员可使用基因座(即，分子标记)通过检测在所述基因座处的等位基因鉴定期望的个体，所述等位基因显示与期望表型共分离的统计意义上显著的概率，表现为连锁不平衡。通过鉴定与受关注的性状共分离的分子标记或分子标记簇，植株育种人员能够对合适的分子标记等位基因进行正选择(该过程称为标记辅助选择或MAS)从而迅速选择期望表型。育种人员也可使用此类标记通过计算机设计基因型并实施全基因组选择。本领域熟知的多种方法可用于检测与受关注的性状例如北方叶枯病抗性共分离的分子标记或分子标记簇。这些方法的基本原理是检测具有显著不同平均表型的供选择基因型(或等位基因)的标记。因此，比较标记座位之间的供选择基因型(或等位基因)之间的差异大小或差异显著性水平。推断性状基因位于最靠近一个或多个标记的位置，所述标记与基因型差异具有最大的关联性。两种用于检测所关注的性状基因座的此类方法是：1)基于群体的关联分析和2)传统的连锁分析。在基于群体的关联分析中，从具有多个创始者(例如优良育种品系)的已有群体中获得品系。基于群体的关联分析依靠连锁不平衡(LD)的弱化和下列观点：在非结构化的群体中，在如此多代随机交配之后，仅有控制受关注性状的基因和与这些基因紧密连锁的标记之间的相关性将保存下来。实际上，大多数已有群体具有群体亚结构。因此，通过把个体分配到群体中，使用得自无规分布于基因组上的标记的数据，采用结构关联方法有助于控制群体结构，从而最小化由于单个群体(也称为亚群)内的群体结构带来的不平衡。表型值与在亚群中每个品系的每个标记座位处的基因型(等位基因)进行比较。显著的标记-性状关联指示标记座位和涉及该性状表达的一个或多个基因座接近。传统连锁分析采用同样的原理；然而，LD是通过用少量创始者构建群体而产生的。选择创始者以最大化结构化群体内的多态性水平，并且评估多态性位点与给定表型的共分离水平。许多统计学方法已经用于鉴定显著的标记-性状关联。一种此类方法是区间作图方法(Lander和Botstein，Genetics121：185-199(1989)，其中针对控制受关注性状的基因位于该位置的概率来测试沿基因图谱(1cM的区间)的许多位点中的每一个位点。基因型/表型数据用于计算每个测试位置的LOD评分(概率比率的对数)。当LOD评分大于阈值时，存在控制受关注性状的基因位置位于基因图谱上的该位置上的显著证据(它将位于两个特定标记基因座之间)。本文提供了分子标记基因座，其展示了如通过关联作图和传统连锁作图技术所测定的，与北方叶枯病抗性的统计意义上的显著共离析。这些标记基因座或附加连锁标记基因座的检测可用于标记辅助的玉米育种程序以产生具有增强的北方叶枯病抗性的植株或用于从育种程序或栽培过程中除去不具有增强的北方叶枯病抗性的植株。与北方枯叶病抗性相关联的标记本文提供了方法，所述方法涉及检测与玉米植株种质中增强的北方叶枯病抗性相关联的一种或多种标记等位基因(在一个或多个标记基因座处)的存在。玉米植株可以是杂交体或自交体。标记基因座可选自本文提供的标记基因座中的任一个，其包括但不限于：PHM16750、PHM15741、PHM16854、PHM3870、PHM14018、PHM18056、PHM3467、PHM7958、PZE-105068275、PZE-105068432、PZE-105068572、SYN30642、PZE-105068746、PZE-105069095、PZE-105069706、PZE-105069906、和PZE-105070525；以及与这些标记连锁的任何其它标记(可从MaizeGDB源确定连锁标记)。连锁的常见量度是性状共分离的频率。这可以共分离百分比(重组频率)表示，或以厘摩(cM)表示。cM是基因重组频率的量度单位。1cM等于由于在一代中的杂交导致的在一个基因座上的性状将与在另一个基因座上的性状分离的概率为1％(意味着性状99％的情况下共分离)。因为染色体距离与性状间交换事件的频率大约成比例，存在与重组频率相关的近似物理距离。标记基因座本身是性状，并且在分离期间能够通过跟踪标记基因座、根据标准连锁分析进行评估。因此，1cM等于经过单代杂交的标记基因座将与另一个基因座分离的1％的概率。标记距离控制受关注性状的基因越近，则标记作为期望性状的指示越有效和有利。紧密连锁的基因座显示约10％或更低，优选约9％或更低，更优选约8％或更低，更优选约7％或更低，更优选约6％或更低，更优选约5％或更低，更优选约4％或更低，更优选约3％或更低，并且更优选约2％或更低的基因座内交换频率。在高度优选的实施方案中，相关基因座(例如标记基因座和靶基因座)显示约1％或更低的重组频率，例如约0.75％或更低，更优选地约0.5％或更低，或更优选地约0.25％或更低的重组频率。因此，基因座的分开距离为约10cM、9cM、8cM、7cM、6cM、5cM、4cM、3cM、2cM、1cM、0.75cM、0.5cM或0.25cM或更低。换句话说，位于相同染色体上，并且它们间的距离使得两个基因座间的重组发生频率小于10％(例如约9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.75％、0.5％、0.25％、或更低)的两个基因座称为彼此“接近”。尽管特定标记等位基因可显示与北方叶枯病抗性表型共分离，但重要的是注意到标记基因座不一定是负责表达北方叶枯病抗性表型。例如，不要求标记多核苷酸序列是赋予增强的北方叶枯病抗性的基因的部分(例如是基因开放阅读框的部分)。特定标记等位基因与增强的北方叶枯病抗性表型的关联，是由于在等位基因从中起源的祖先玉米品系中，标记等位基因和等位基因之间的最初“相引”相连锁。最后通过反复重组，标记和基因座间的交换事件能够改变这种取向。正是因为这个原因，有利标记等位基因可根据存在于耐受性亲本中的相连锁发生改变，所述耐受性亲本用于制备分离群体。这不改变可使用标记监控表型的分离的事实。它仅仅改变在给定分离群体中认为哪个标记等位基因是有利的。染色体区间提供与北方叶枯病抗性相关的染色体区间。本领域熟知的多种方法可用于鉴定染色体区间。此类染色体区间的边界扩展到涵盖将与控制受关注性状的基因连锁的标记。换句话说，扩展染色体区间使得位于区间内的任何标记(包括限定区间边界的末端标记)可用作玉米大斑病抗性标记。每个区间包含至少一个QTL，此外甚至可包含多于一个的QTL。相同区间中非常接近的多个QTL可搅乱特定标记与特定QTL的相关性，因为一个标记可显示与多于一个的QTL连锁。相反地，例如如果非常接近的两个标记显示与期望表型性状共分离，有时分不清楚是否那些标记中的每个鉴定相同的QTL或两个不同的QTL。无论如何，完成或实施本文提出的主题材料不需要了解在特定区间中有多少QTL。包含与北方叶枯病抗性相关联的一个或多个QTL的染色体5上的区间可由下列限定并包括它们：PHM18056和PHM7958。所述区间可进一步改进成由PZE-105068275和PZE-105070525限定并包含它们在内的染色体区间，其表示由PHM18056和PHM7958限定并包含它们在内的染色体区间的子区间。发现位于任何这些区间内的任何标记可用作玉米中北方叶枯病抗性的标记。染色体区间也可通过与感兴趣的标记连锁(表现出连锁不平衡)的标记限定，r2是关联性研究中连锁不平衡(LD)的常见量度。如果本文鉴定的任何标记基因座和染色体5区间内的另一种标记(也描述于本文)之间的LD的r2值大于1/3(Ardlie等人，NatureReviewsGenetics3:299-309(2002))，则基因座连锁。标记等位基因和单倍型组合一个或多个标记基因座处的等位基因的单倍型或组合可代表QTL等位基因的遗传特征。本文所述的标记等位基因中的任一个可单独或组合使用以通过鉴定代表QTL等位基因的单倍型来鉴定并选择具有增强的北方叶枯病的玉米植株，如与本文所述标记等位基因连锁不平衡的任何标记等位基因那样。代表QTL等位基因的标记等位基因可包括：位于PZE-105068275的“G”；位于PZE-105068432的“A”；位于PZE-105068572的“C”；位于SYN30642的“T”；位于PZE-105068746的“C”；位于PZE-105069095的“A”；位于ZE-105069706的“A”；位于PZE-105069906的“T”；以及位于PZE-105070525的“C”。本文提供了用于鉴定具有北方叶枯病抗性的玉米植株的方法。所述方法涉及分析玉米植株的DNA中与北方叶枯病抗性相关联的QTL等位基因的存在，并且如果检测到QTL等位基因就选择具有北方叶枯病抗性的玉米植株。QTL等位基因可包括单独或组合的以下标记等位基因中的任一种：位于PZE-105068275的“G”；位于PZE-105068432的“A”；位于PZE-105068572的“C”；位于SYN30642的“T”；位于PZE-105068746的“C”；位于PZE-105069095的“A”；位于ZE-105069706的“A”；位于PZE-105069906的“T”；以及位于PZE-105070525的“C”。在一个方面，QTL等位基因位于由PHM4598和PHM14092限定并包含它们在内的染色体区间中的染色体5上；在另一方面，QTL等位基因位于由PZE-105068275和PZE-105070525限定并包含它们在内的染色体区间中的染色体5上，其是PHM18056和PHM7958区间的子区间。技术人员将期望存在附加的多态性位点，所述位点位于本文鉴定的5号染色体标记内部的以及周围的标记基因座上，其中一个或多个多态性位点与代表性单倍型的一个或多个多态性位点连锁不平衡(LD)。不同多态性位点处的两个特定等位基因，在其中一个位点处所述等位基因的存在倾向于推测在相同染色体上的另一位点处存在等位基因的情况下，所述等位基因被称为处于LD(Stevens，Mol.Diag.4：309-17(1999))。检测QTL等位基因的存在不以任何方式表示QTL等位基因可仅由单倍型限定，所述单倍型包括：位于PZE-105068275的“G”；位于PZE-105068432的“A”；位于PZE-105068572的“C”；位于SYN30642的“T”；位于PZE-105068746的“C”；位于PZE-105069095的“A”；位于ZE-105069706的“A”；位于PZE-105069906的“T”；以及位于PZE-105070525的“C”。相反，QTL等位基因的存在可使用单独或组合的任何本文所限定的标记等位基因和/或与本文所限定的标记等位基因中任一种连锁不平衡的特异性染色体区间内的任何其它标记等位基因来检测。标记辅助选择(MAS)分子标记可用于多种植株育种应用(如参见Staub等人，(1996)Hortscience31：729-741；Tanksley(1983)PlantMolecularBiologyReporter.1：3-8)。受关注的主要领域之一是使用标记辅助选择(MAS)增加回交和基因渗入的效率。展示出与影响期望表型性状的基因座连锁的分子标记提供了在植株群体中选择性状的有用工具。当表型难以测定(例如很多病害抗性性状)，或表型发生在植株发育的晚期(例如籽粒特征)时，尤其如此。由于DNA标记测定比田间表型分析更省力并且占用的物理空间更小，可测定更大的群体，增加了发现具有从供体品系移动至受体品系的靶片段的重组体的概率。连锁越紧密，标记越有用，这是因为重组不太可能发生于标记和引起性状的基因之间，所述重组可导致假阳性。由于需要双重组事件，侧接标记减少了假阳性选择发生的概率。理想情况是基因本身具有标记，使得标记和基因之间的重组不能发生。此类标记称为“完美标记”。当基因通过MAS渗入时，不仅引入了基因而且引入了侧接区域(Gepts.(2002))。CropSci；42：1780-1790)。这称为“连锁累赘”。在供体植株与受体植株极不相关的情况下，这些侧接区域携带可编码农学上不良性状的附加基因。该“连锁累赘”也可导致收率减少或其它负面农学特性，即便与优良玉米品系回交多个周期后。这有时也称为“收率累赘”。侧接区域的大小可通过附加的回交而减小，虽然这并不总是成功的，因为育种人员不能控制该区域或重组断点的大小(Young等人，(1998)Genetics120：579-585)。在经典育种中，通常只是单凭偶然因素选取有助于减小供体片段大小的重组(Tanksley等人，(1989))。Biotechnology7：257-264)。即使在此类回交次数达20次后，可预期找到的仍与所选基因连锁的供体染色体还是具有相当大的片段。然而如果使用标记的话，就可能选取那些在受关注的基因附近经历了重组的稀有个体。在150株回交植株中，至少一株植株经历交换有95％的概率，所述交换在基于单次减数分裂图距的1cM基因内进行。标记使得能够明确鉴定这些个体。对于300株植株的一次附加回交，在基因另一侧的1cM单次减数分裂图距内有95％的交换概率，从而产生在基于单次减数分裂图距小于2cM的靶基因附近的片段。用标记时在两代就可实现，而不用标记时则需要平均100代(参见Tanksley等人，同上)。当基因的确切位置已知时，围绕基因的侧接标记可用于在不同的群体大小中对重组进行选择。例如，在更小的群体中，预期重组可进一步远离基因，因此需要更远端的侧接标记来检测重组。包含增强密度的公开玉米标记的玉米基因组整合连锁图谱的可用性促进了玉米基因作图和MAS。参见例如IBM2Neighbors图谱，该图谱可在MaizeGDB网站上在线获得。具体实施MAS的关键部分为：(i)限定群体，在该群体中将确定标记-性状关联性，该群体可以是分离群体、或随机或结构化群体；(ii)监控相对于性状的多态性标记的分离或关联性，并且使用统计方法确定连锁或关联性；(iii)基于统计分析的结果限定一组所期望的标记，以及(iv)将该信息用于和/或外推出当前组育种种质，使基于标记的选择决定得以作出。本公开中描述的标记，以及其它标记类型例如SSR和FLP，可用于标记辅助选择方案。一般来讲，出于本文所述的目的，MAS使用多态性标记，所述标记已经被鉴定为具有与北方叶枯病抗性共分离的显著可能性的标记。推测此类标记在图谱上接近赋予植株其北方叶枯病抗性表型的一个或多个基因，并且认为此类标记是期望性状的指示、或标记。测试植株是否在标记中存在期望的等位基因，并且期望在一个或多个基因座上包含期望基因型的植株将期望基因型与期望表型一起转移到它们的子代。从连锁作图和相关性分析中将标记鉴定为与北方叶枯病抗性相关联。由SEQIDNO：1-17表示各个标记的参考序列。所述SNP能够单独地或以组合方式(即，SNP单倍型)被用于选择与北方叶枯病抗性相关联的有利的QTL等位基因。本文提供用于将与北方叶枯病抗性相关联的QTL等位基因渗入玉米植株中的方法。所述方法涉及用至少一种标记选择群体以确定来自所述群体的一种或多种玉米植株是否包含与北方叶枯病抗性相关联的QTL等位基因，并且从所述群体中选择具有QTL等位基因的一种或多种玉米植株。QTL等位基因可包含：位于PZE-105068275的“G”；位于PZE-105068432的“A”；位于PZE-105068572的“C”；位于SYN30642的“T”；位于PZE-105068746的“C”；位于PZE-105069095的“A”；位于ZE-105069706的“A”；位于PZE-105069906的“T”；以及位于PZE-105070525的“C”。技术人员将预期在本文鉴定的5号染色体标记内和它们周围的标记基因座可能存在附加的多态性位点，其中一个或多个多态性位点处于与所述单倍型中的一个或多个多态性位点处的等位基因的连锁不平衡(LD)中，并从而能够被用于标记辅助选择程序中，以使所关注的QTL等位基因渗入。不同多态性位点处的两个特定等位基因，在其中一个位点处所述等位基因的存在倾向于推测在相同染色体上的另一位点处存在等位基因的情况下，所述等位基因被称为处于LD(Stevens，Mol.Diag.4：309-17(1999))。标记基因座能够位于北方叶枯病抗性QTL的5cM、2cM、或1cM内(在基于单次减数分裂的基因图谱上)。技术人员还将理解等位基因频率(进而单倍型频率)可因种质库不同而不同。种质库由于成熟期差异、杂种优势群、地理分布等等而不同。因此，SNP和其它多态性可能在一些种质库中无法提供信息。植株组成通过任何上文所述的方法鉴定、选择和/或产生的玉米植株也是所关注的。种子处理为了保护和增强产量和性状技术，种子处理选项能够提供附加的作物计划灵活性和对昆虫、杂草和病害的节省成本的控制，从而进一步强化本文描述的方法和组合物。能够用包含化学或生物除草剂、除草剂安全剂、杀虫剂、杀真菌剂、发芽抑制剂和增强剂、营养物质、植株生长调节剂和激活剂、杀菌剂、杀线虫剂、杀鸟剂和/或杀软体动物剂的组合的组合物处理种子材料，通常为表面处理。这些化合物通常与制剂领域惯常采用的另外的载体、表面活性剂或应用促进性助剂一起被配制。可通过用液体制剂浸渍繁殖材料或通过用混合的湿的或干燥的制剂涂覆来施加包衣。下列文献中提供了可用作种子处理的多种类型的化合物的示例：ThePesticideManual：AWorldCompendium，C.D.S.Tomlin编辑，theBritishCropProductionCouncil出版，该文献以引用方式并入本文。可用于作物种子的一些种子处理包括但不限于，一种或多种脱落酸、阿拉酸式苯-S-甲基、阿维菌素、氨基三唑、阿扎康唑、固氮螺菌属、印楝素、嘧菌酯、芽孢杆菌属物种(包括蜡状芽孢杆菌(cereus)、坚强芽孢杆菌(fimus)、巨大芽孢杆菌(megaterium)、短小芽孢杆菌(pumilis)、球形芽孢杆菌(sphaericus)、枯草芽孢杆菌(subtilis)和/或苏云金芽孢杆菌(thuringiensis)中的一种或多种)、慢生根瘤菌属物种(包括betae、canariense、埃氏慢生根瘤菌(elkanii)、西表岛慢生根瘤菌(iriomotense)、大豆慢生根瘤菌(japonicum)、辽宁慢生根瘤菌(liaoningense)、pachyrhizi和/或圆明慢生根瘤菌(yuanmingense)中的一种或多种的)、克菌丹、萎锈灵、脱乙酰壳多糖、可尼丁、铜、氰虫安、苯醚甲环唑、土菌灵、氟虫腈、咯菌腈、氟喹唑、解草胺、氟草肟、超敏蛋白、抑霉唑、吡虫啉、种菌唑、异黄酮类、脂-壳寡糖、代森锰锌、锰、代森锰、精甲霜灵、甲霜灵、叶菌唑、PCNB、戊苯吡菌胺、青霉菌、吡噻菌胺、氯菊酯、啶氧菌酯、丙硫菌唑、唑菌胺酯、氯虫酰胺、S-异丙甲草胺、皂素、氟唑环菌胺、TCMTB、戊唑醇、噻菌灵、噻虫嗪、硫双灭多威(thiocarb)、福美双、甲基立枯磷、三唑醇、木霉属、肟菌酯、灭菌唑和/或锌。PCNB种子涂层是指EPA注册号00293500419，包含五氯硝基苯和氯唑灵。TCMTB是指2-(硫氰酸基甲硫基)苯并噻唑。可对产生具有特定性状(诸如北方叶枯病抗性)的植株的种子进行测试来确定何种种子处理选项和施用速度可辅助该植株以便提高收率。此外，由种子处理剂的正确使用造成的良好的根建立和早期出苗可导致更有效的氮利用、更好的抵抗北方叶枯病的能力以及当与种子处理剂混合时包含某一性状的一种或多种植株的收率潜力的总体增加。实施例提供以下实施例以示出受权利要求书保护的主题，但所述主题不受以下实施例的限制。应当理解本文所述的实施例和实施方案仅用于例证性的目的，并且本领域的技术人员将认识到在不脱离所附权利要求范围的情况下可改变多种试剂或参数。实施例1北方叶枯病感染的表型可以1(高度易感)至9(高度抗性)等级来评价玉米植株的北方叶枯病(NLB)，其中1-3分表示“易感”，4-6分表示“中间”，并且7-9分表示“抗性”。图1中的评分图可用作指南，其中重点放在穗上的损害。通过检查损害是具有平滑侧面的雪茄或船形和/或通过将样品送到诊断实验室以确认病原体的身份，可验证损害由北方叶枯病感染引起。在开花之后两至四周，分数可由一些已知的易感品系获得，并且然后与它们的历史分数进行比较。如果已知的易感品系等级高于其历史分数至少两个分数，则测试组中所述品系的评分可延迟，从而使得病害进展到标准感染状态。评分阶段只能延长直至植株衰老之前。因此，如果4-5周之后分数仍然太高，则病害压力不足以有效评分。如果来自已知易感品系的分数与开花之后2-4周直至植株衰老之前的时间段中的其历史分数确实相关，则可以使用图1中的评分图作为指南以图为基础对测试品系进行评分。实施例2关联作图分析使用关联作图策略鉴定与北方叶枯病抗性相关联的玉米基因标记。使用SNP基因分型(1536-plex测定)分析玉米品系的集合。SNP变型用于产生基因组区域的跨近交系的特异性单倍型。该数据用于在基因组水平上，鉴定等位基因和北方叶枯病抗性之间的相关性。将抗性分数和基因型信息并入关联作图分析中。使用标准关联作图方法进行基于结构的关联分析，其中使用标记数据控制群体结构。两种染色体5标记，PHM16750和PHM15741，在非穗茎亚群中与北方叶枯病抗性性状显著相关联。此外，三种染色体5标记，PHM16854、PHM3870和PHM14018，在热带亚群中与北方叶枯病抗性性状显著相关联。表1使用结构相关作图法提供了染色体5标记的标记信息，其展示了与北方叶枯病表型的连锁不平衡。表1：在结构关联分析中，玉米标记与北方叶枯病感染抗性显著相关联此外，对一组阿根廷近交系进行关联分析。该关联分析还鉴定在染色体5的相同区间中亚群2的显著标记性状相关性(表2)。表2：在对一组阿根廷近交系进行的关联分析中，玉米标记与北方叶枯病感染抗性显著相关联标记等位基因和表型独立分离的统计概率反映在表1和2的关联作图调整概率值(p)中，其是从基因型和表型之间的关联分析得出的概率(P)。概率值越低，该基因座处的标记基因型与北方叶枯病感染耐受表型之间的关联越显著。注：表1和2中所示的结果是基于两个独立的数据组。表2示出来自阿根廷近交系的单一数据组的结果。实施例3使用双单倍体育种群体进行QTL作图使用由PHBNB和PHFHH之间的杂交产生的186双单倍体群体进行QTL区间作图分析以鉴定与北方叶枯病抗性相关联的染色体区间和标记。品系PHBNB比品系PHFHH对北方叶枯病感染具有更大的抗性。在单个生长季节和两个位置中，在天然北方叶枯病感染下，对由杂交产生的双单倍体品系进行表型。玉米双单倍体子代使用分布于玉米基因组中的一组768SNP进行基因分型。显著的峰在染色体5上，在内部衍生的单减数分裂基因图谱上90至100cM之间识别，指示所述区域容纳与北方叶枯病抗性相关联的一个或多个QTL。使用区间作图分析，多个标记示出与表型在p＜0.05的置信水平下的相关性。该发现与其它实施例一致，示出不同的方法鉴定相同的区域。表3示出QTL在染色体5，位置90-100cM上的遗传效应。表3：PHBNB×PHFHH杂交的单倍型效应单倍型Chr590-100cMNLFBLT的平均值n有利(来自PHBNB)5.78138不利(来自PHFHH)4.9886实施例4高分辨率基因作图和近等基因系和杂种通过纯合重组植株的后代测试进行高分辨率基因作图以进一步改进北方枯叶病抗性QTL。由PH890RCl和近交PHBNB的杂交产生作图群体。用于精细作图的另一群体由近交系PHFHH和PHBD6的杂交产生。PH890RC1×PHBNB群体由94个BC5F3家族组成，其由从总计约3000种在染色体5上在90至105cM的区域处包含杂合片段的BC5植株中自交选择和固定选择的重组BC5植株产生。该策略允许覆盖整个QTL区域的重组。PHFHH×PHBD6群体由37个BC4F3家族组成，其由从总计约3000种在染色体5上在90至105cM的区域处包含杂合片段的BC4植株中自交选择和固定选择的重组BC4植株产生。在优选的标记区域处包含等位基因变体的BC5F3和BC4F3近等基因系(NIL)由对两种杂交体的标记辅助选择产生。NIL通过将来自PHBNB或PHBD6的QTL区渗入轮回亲本，清洁遗传背景，并且在优选标记区选择特异性重组来产生。通过在优选标记的区域处包含杂合片段的单个BC4F2/BC5F2植株自交，衍生阴性和阳性近等基因系，并且QTL被作为单个孟德尔因子处理。表型评分来自涉及PH890RC1×PHBNB的杂交和来自PHFHH×PHBD6杂交的不同家族，杂交体的亲本和产生的NIL中的每一种的表型评分基于从一个作物季节中获得的田地(在自然感染下的田地实验；三个位置)收集的表型数据组。玉米基因分型使用在染色体5上的QTL区域的多态性SNP，将来自PH890RC1×PHBNB杂交的玉米BC5F3子代和来自PHFHH×PHBD6的BC4F3子代，杂交体的亲本和产生的NIL进行基因分型。WindowsQTLCartographer用于回归分析和QTL区间作图两者。根据标准QTL作图程序预测目标区域内的LOD评分(优势对数比率)。平均分数用于QTL区间作图。LOD阈值为2.5。对每个QTL评估置信区间。因为这些群体由标记辅助选择(不是重组的随机事件)产生，所以认为标记回归分析与区间作图分析一样强大。近等基因系和精细作图在阿根廷和美国，在优选标记区域(在基于专有单个减数分裂的基因图谱上93.3-96.8cM)包含等位基因变体的近等基因遗传物质在其对病害的响应方面示出显着差异。以增加的个体数评价附加的标记基因座，以努力进一步缩小QTL区。将容纳QTL的区域进一步改进成介于以下标记之间并包括它们的区域：PZE-105068275(参考序列由SEQIDNO：9表示)和PZE-105070525(参考序列由SEQIDNO：17表示)，其分别位于96.7cM和97.5cM处。SNP单倍型表4示出有利抗性单倍型的优选标记区域处的SNP基因型。表4：SNP单倍型标记基因图谱位置SNPRefSeqSNP位置PZE-10506827596.67GSEQIDNO：951PZE-10506843296.72ASEQIDNO：1051PZE-10506857296.78CSEQIDNO：1151SYN3064296.79TSEQIDNO：1261PZE-10506874696.84CSEQIDNO：1351PZE-10506909597.02ASEQIDNO：1451PZE-10506970697.31ASEQIDNO：1551PZE-10506990697.39TSEQIDNO：1651PZE-10507052597.45CSEQIDNO：1751本研究鉴定了与北方叶枯病抗性相关的染色体区间和个体标记。位于这些区间内的标记可用于MAS，以及其它目的。当前第1页1 2 3