用于在癌症的预防和/或治疗中使用的放射性标记的抗体片段的制作方法

本发明涉及放射性标记的抗体片段以及它们用于预防性和/或治疗性目的用途的领域。特别是，本发明涉及在癌症的预防和/或治疗中使用的放射性标记的抗体片段。
背景技术：
：与放射性标记的抗体在治疗血液学恶性肿瘤中的巨大成功相反，在实体瘤的放射免疫疗法方面仅获得了一般的成功。放射免疫疗法成功应用的限制之一在于完整免疫球蛋白的大的分子尺寸，其导致延长的血清半衰期和不良的肿瘤渗透和摄取。随着抗体工程时代的到来，已产生了显示出改善的药代动力学和肿瘤渗透的小分子量抗体片段。然而，它们的临床应用受到未达到最优的肿瘤摄取和短暂的肿瘤停留时间的限制。因此，对于放射免疫疗法的临床成功，单独的抗体分子大小的优化是不够的。的确，除它们的大尺寸外，放射性标记的抗体在到达它们的表达于实体瘤的细胞表面上的靶标抗原之前遭遇其他障碍。这些障碍中的一些包括大肿瘤中血液流动不良、血管内皮渗透性不良、肿瘤基质的间隙流体压力升高以及不均匀的抗原表达。新的优化策略包括使用生物调节剂以调节实体瘤造成的障碍。与放射性标记的抗体组合，使用多种试剂改善肿瘤血流、提高血管渗透性、通过调节基质细胞和胞外基质组分降低肿瘤间隙流体压力、上调靶标抗原的表达和改善放射性药物的渗透和保留。尽管如此，放射免疫疗法对于实体瘤的临床成功仍似乎是遥远的梦，这是因为仅有很小量的给予的抗体(低至0.001-0.01％)定位在肿瘤中而给予较高量的放射性标记的mAb导致骨髓中毒性。为了临床成功，需要对用于实体瘤的放射免疫疗法进行优化以提高放射性标记的抗体在肿瘤中的肿瘤摄取和保留并使非靶向组织的暴露最小化。Pruszynski等人(2014)显示,当与用Nε-(3-*I-碘苯甲酰基)-lys5-Nα-马来酰亚胺基-Gly1-GEEEK的放射碘化和使用IODO-GEN的VHH的直接放射碘化相比，通过使用N-琥珀酰亚胺基-4-胍基甲基3-125-131I-碘代苯甲酸酯用131I标记的靶向HER2的VHH的改善的肿瘤靶向。通过曲妥珠单抗阻断，*I-SGMIB-VHH的肿瘤摄取显著降低，这表明了VHH和曲妥珠单抗之间竞争对HER2的结合。Pruszynski等人中公开的VHH含有含羧基末端半胱氨酸的尾，其导致形成单体和二聚体形式的平衡混合物。Pruszynski等人不能显示放射性标记的VHH的任何治疗效果。技术实现要素：本发明人已识别了在癌症治疗中使用的新型且改善的抗体片段，其特异性结合至实体瘤上存在的和/或对实体瘤或癌细胞特异的靶标蛋白。特别是，通过放射性标记与实体瘤或与癌细胞特异性相互作用的特定类型的抗体片段，即，来源于重链抗体的重链可变结构域(以下简称为VHH)，本发明人开发了改善且有效的放射免疫疗法策略，其特征在于高肿瘤摄取或癌细胞摄取值、低健康组织摄取值，低整体生物分布和从血液中快速清除。因此，如本文所公开的放射性标记的抗体片段显示出优于本领域中已知的常规(免疫球蛋白和非免疫球蛋白)结合剂的一些优势，包括更高的效力、较低的毒性以及更高的稳定性，从而获得(1)在医学应用中更高最大耐受剂量(MTD)的可能，从而允许重复和连续给予高治疗剂量，以有效阻碍肿瘤或癌细胞生长，同时仍对正常健康组织保持低于剂量限制性毒性(DLT)副作用(这在放射免疫疗法中是特别重要的)；和(2)除静脉途径之外更宽的给予途径选择，其包括口服、皮下、腹膜内、鞘内途径以及缓释制剂。另外，由于它们尺寸较小，如本文所公开的抗体片段具有渗入其他较大的多肽和蛋白质不能达到的生理学隔室、组织和器官的能力。出乎意料地，以单价形式使用如本文所公开的放射性标记的抗体片段，并且未修饰所述抗体片段以延长使用期。的确，尽管完整抗体具有特别长的半衰期，但是小抗体片段经常经受从循环中快速的消除。因此，VHH的体内应用通常依赖于已通过(例如)偶联至抗血清白蛋白VHH或通过PEG化修饰的VHH以延长血浆半衰期(Siontorou2013InternationalJournalofNanomedicine8:4215-4227；Tijink等人,2008MolCancerTher7:2288-2297)。另外，VHH的多聚化可以延长体内保留并提高亲和力(Siontorou2013)。本发明人证明了单价、使用期未延长的VHH的治疗效力。本发明提供了这类放射性标记的抗体片段以及包括一种或多种这类放射性标记的抗体片段或基本上由一种或多种这类放射性标记的抗体片段组成的多肽，和这类放射性标记的抗体片段或多肽用于预防和/或治疗目的、特别是用于放射免疫疗法的应用。在具体的实施方式中，放射性标记的抗体片段以及包括一种或多种这类放射性标记的抗体片段或基本上由一种或多种这类放射性标记的抗体片段组成的多肽可以用于癌症的预防或预防，如，例如但不限于，癌症疾病复发的预防，即在症状缓解之后避免或预防一种或多种病征、症状或疾病的复发。在一些方面，本发明提供了用于在癌症的预防和/或治疗方法中使用的放射性标记的来源于重链抗体的重链可变结构域(VHH)或其功能性片段，其特异性结合至癌细胞上存在的靶标蛋白。在其他方面，本发明提供了用于在癌症的预防和/或治疗方法中使用的放射性标记的来源于重链抗体的重链可变结构域(VHH)或其功能性片段，其特异性结合至实体瘤上存在的靶标蛋白。在一些方面，本发明提供了用于在癌症的预防和/或治疗方法中使用的包含至少一种放射性标记的VHH或其功能性片段的药物组合物，所述VHH或片段特异性结合至癌细胞上存在的和/或对癌细胞特异的靶标蛋白。在其他方面，本发明提供了用于在癌症的预防和/或治疗方法中使用的包含至少一种放射性标记的VHH或其功能性片段的药物组合物，所述VHH或片段特异性结合至实体瘤上存在的和/或对实体瘤特异的靶标蛋白。在用于在癌症的预防和/或治疗中使用的放射性标记的VHH或其功能性片段或药物组合物中的任一种的一些实施方式中，所述VHH或其功能性片段特异性结合至HER2。在用于在癌症的预防和/或治疗中使用的放射性标记的VHH或其功能性片段或药物组合物中的任一种的一些实施方式中，如使用适合的竞争测定所确定的，所述VHH或其功能性片段不与单克隆抗体曲妥珠单抗(Herceptin)或单克隆抗体帕妥珠单抗竞争与HER2的结合。在用于在癌症的预防和/或治疗中使用的放射性标记的VHH或其功能性片段或药物组合物中的任一种的一些实施方式中，将所述放射性标记的VHH或其功能性片段给予至需要其的受试者，在所述受试者中计算的平均有效剂量在0.002至0.1mSv/MBq之间。在用于在癌症的预防和/或治疗中使用的放射性标记的VHH或其功能性片段或药物组合物中的任一种的一些实施方式中，以一天一次至一月一次或者一月一次至一年一次的给予间隔将所述放射性标记的VHH或其功能性片段给予至需要其的受试者。在用于在癌症的预防和/或治疗中使用的放射性标记的VHH或其功能性片段或药物组合物中的任一种的一些实施方式中，所述放射性标记的VHH或其功能性片段以小于5nM的亲和力结合至实体瘤或癌细胞上存在的和/或对它们特异的所述靶标蛋白。在用于在癌症的预防和/或治疗中使用的放射性标记的VHH或其功能性片段或药物组合物中的任一种的一些实施方式中，所述放射性标记的VHH或其功能性片段是用放射性同位素标记的，所述放射性同位素选自α-发射(α-emitting)放射性同位素和β-发射(β-emitting)放射性同位素。在用于在癌症的预防和/或治疗中使用的放射性标记的VHH或其功能性片段或药物组合物中的任一种的一些实施方式中，所述放射性标记的VHH或其功能性片段是用放射性同位素标记的，所述放射性同位素选自由以下各项组成的组：锕-225、砹-211、铋-212、铋-213、铯-137、铬-51、钴-60、镝-165、铒-169、镄-255、金-198、钬-166、碘-125、碘-131、铱-192、铁-59、铅-212、镥-177、钼-99、钯-103、磷-32、钾-42、铼-186、铼-188、钐-153、锝-99m、镭-223、钌-106、钠-24、锶-89、铽-149、钍-227、氙-133、镱-169、镱-177、钇-90。在用于在癌症的预防和/或治疗中使用的放射性标记的VHH或其功能性片段或药物组合物中的任一种的一些实施方式中，用131-碘标记所述放射性标记的VHH或其功能性片段。在用于在癌症的预防和/或治疗中使用的放射性标记的VHH或其功能性片段或药物组合物中的任一种的一些实施方式中，使用N-琥珀酰亚胺基-4-胍基甲基-3-[I-131]碘苯甲酸酯([I-131]SGMIB)或其适合的衍生物或变体、用131-碘标记所述放射性标记的VHH或其功能性片段。在用于在癌症的预防和/或治疗中使用的放射性标记的VHH或其功能性片段或药物组合物中的任一种的一些实施方式中，所述VHH包含CDR组合中的一种，所述CDR组合选自包括以下各项的组：具有SEQIDNO:1的CDR1区、具有SEQIDNO:2的CDR2区和具有SEQIDNO:3的CDR3区，和/或具有SEQIDNO:4的CDR1区、具有SEQIDNO:5的CDR2区和具有SEQIDNO:6的CDR3区。在用于在癌症的预防和/或治疗中使用的放射性标记的VHH或其功能性片段或药物组合物中的任一种的一些实施方式中，所述VHH与SEQIDNO:7或SEQIDNO:8所示的氨基酸序列或其功能性片段中的至少一种具有至少80％的氨基酸同一性。在用于在癌症的预防和/或治疗中使用的放射性标记的VHH或其功能性片段或药物组合物中的任一种的一些实施方式中，所述VHH与SEQIDNO:7或SEQIDNO:8所示的氨基酸序列或其功能性片段中的至少一种相同。在用于在癌症的预防和/或治疗中使用的放射性标记的VHH或其功能性片段或药物组合物中的任一种的一些实施方式中，所述癌症是乳癌。在用于在癌症的预防和/或治疗中使用的放射性标记的VHH或其功能性片段或药物组合物中的任一种的一些实施方式中，结合免疫疗法实施所述癌症的预防和/或治疗。在用于在癌症的预防和/或治疗中使用的放射性标记的VHH或其功能性片段或药物组合物中的任一种的一些实施方式中，将所述放射性标记的VHH或其功能性片段静脉内、鞘内或腹膜内给予至需要其的受试者。在用于在癌症的预防和/或治疗中使用的放射性标记的VHH或其功能性片段或药物组合物中的任一种的一些实施方式中，所述VHH以单价形式存在。在用于在癌症的预防和/或治疗中使用的放射性标记的VHH或其功能性片段或药物组合物中的任一种的一些实施方式中，所述VHH或所述其功能性片段缺少含半胱氨酸的标签，优选地GGC标签。在用于在癌症的预防和/或治疗中使用的放射性标记的VHH或其功能性片段或药物组合物中的任一种的一些实施方式中，所述VHH或所述其功能性片段是使用期未延长的。在用于在癌症的预防和/或治疗中使用的放射性标记的VHH或其功能性片段或药物组合物中的任一种的一些实施方式中，所述VHH或所述其功能性片段缺少羧基末端多肽标签，优选地其中所述VHH或所述其功能性片段是未加标签的。在一个方面，本发明提供了用于在癌症的预防和/或治疗方法中使用的放射性标记的来源于重链抗体的重链可变结构域(VHH)或其功能性片段，其特异性结合至实体瘤上存在的和/或对实体瘤特异的靶标蛋白(在本文中也称为肿瘤特异性抗原)。在另一个方面，本发明提供了用于在癌症的预防和/或治疗方法中使用的放射性标记的来源于重链抗体的重链可变结构域(VHH)或其功能性片段，其特异性结合至癌细胞上存在的和/或对癌细胞特异的靶标蛋白(在本文中也称为癌细胞特异性抗原)。在某些实施方式中，本发明提供了如本文所公开的放射性标记的VHH或其功能性片段，其通过以10μg至1000μgVHH的剂量向需要其的受试者给予放射性标记的VHH或其功能性片段来用于在癌症的预防和/或治疗中使用。在某些其他实施方式中，通过向需要其的受试者给予如本文所公开的放射性标记的VHH或其功能性片段来实现癌症的预防和治疗，其特征在于在受试者中VHH或其功能性片段具有在0.002至0.1mSv/MBq之间的计算的平均有效剂量。在具体的实施方式中，本发明提供了如本文所公开的放射性标记的VHH或其功能性片段，其通过以一天一次至一月一次或者一月一次至一年一次的给予间隔向需要其的受试者给予所述放射性标记的VHH或其功能性片段来用于在癌症的预防和/或治疗中使用。在具体的实施方式中，如本文所公开的VHH或其功能性片段特异性结合至实体瘤上存在的和/或对实体瘤特异的靶标蛋白，如肿瘤特异性抗原。在其他具体实施方式中，如本文所公开的VHH或其功能性片段以小于5nM，如1至5nM之间，优选地2至3nM之间的亲和力特异性结合至实体瘤上存在的和/或对实体瘤特异的靶标蛋白。在其他具体实施方式中，如本文所公开的VHH或其功能性片段特异性结合至癌细胞上存在的和/或对癌细胞特异的靶标蛋白，如癌细胞特异性抗原。在其他具体实施方式中，如本文所公开的VHH或其功能性片段以小于5nM，如1至5nM之间，优选地2至3nM之间的亲和力特异性结合至癌细胞上存在的和/或对癌细胞特异的靶标蛋白。在其他具体实施方式中，如本文所公开的VHH或其功能性片段特异性结合至HER2。在其他具体实施方式中，如本文所公开的VHH或其功能性片段以小于5nM，如1至5nM之间，优选地2至3nM之间的亲和力特异性结合至HER2。在某些实施方式中，如使用适合的竞争测定所确定的，如本文所公开的靶向HER2的VHH或其功能性片段不与曲妥珠单抗和帕妥珠单抗竞争与HER2的结合。这有利地允许在癌症，更特别是HER2阳性癌症，如HER2阳性乳癌的预防和/或治疗方法中与曲妥珠单抗和/或帕妥珠单抗组合使用靶向HER2的如本文所公开的VHH或其功能性片段。在具体的实施方式中，如本文所公开的放射性标记的靶向HER2的VHH或其功能性片段特异地针对HER2上的结合位点，其不同于(即，不是)HER2的结构域IV，更特别是HER2的结构域IV的C-末端。在具体的实施方式中，如本文所公开的放射性标记的靶向HER2的VHH或其功能性片段特异地针对HER2上的结合位点，其不同于(即，不是)HER2的结构域II。在具体的实施方式中，如本文所公开的放射性标记的靶向HER2的VHH或其功能性片段特异地针对HER2上的结合位点，其不同于(即，不是)HER2的结构域IV，更特别是HER2的结构域IV的C-末端，和HER2的结构域II。在其他具体的实施方式中，用放射性同位素标记如本文所公开的放射性标记的VHH或其功能性片段，所述放射性同位素选自由α-发射放射性同位素和β-发射放射性同位素组成的组，包括但不限于选自由以下各项组成的组的放射性同位素：锕-225、砹-211、铋-212、铋-213、铯-137、铬-51、钴-60、镝-165、铒-169、镄-255、金-198、钬-166、碘-125、碘-131、铱-192、铁-59、铅-212、镥-177、钼-99、钯-103、磷-32、钾-42、铼-186、铼-188、钐-153、锝-99m、镭-223、钌-106、钠-24、锶-89、铽-149、钍-227、氙-133、镱-169、镱-177、钇-90。在其他具体实施方式中，用碘-131标记如本文所公开的放射性标记的VHH或其功能性片段。在某些具体的实施方式中，本发明提供了用于在癌症的预防和/或治疗中使用的特异性结合至肿瘤细胞特异性抗原或癌细胞特异性抗原的放射性标记的VHH或其功能性片段，其中使用N-琥珀酰亚胺基-4-胍基甲基-3-[I-131]碘苯甲酸酯([I-131]SGMIB)或其适合的衍生物或变体、用131-碘标记所述放射性标记的VHH或其功能性片段。在某些具体的实施方式中，本发明提供了用于在癌症的预防和/或治疗中使用的特异性结合至肿瘤细胞特异性抗原或癌细胞特异性抗原的放射性标记的VHH或其功能性片段，其中使用N-琥珀酰亚胺基-4-胍基甲基-3-[211At]砹苯甲酸酯([211At]SGMAB)或其适合的衍生物或变体、用211-砹标记所述放射性标记的VHH或其功能性片段。在具体的实施方式中，与实体瘤特异性相互作用的、如本文所公开的放射性标记的VHH或其功能性片段的氨基酸序列包含选自包括以下各项的组的CDR组合中的一个或多个：具有SEQIDNO:1的CDR1区、具有SEQIDNO:2的CDR2区和具有SEQIDNO:3的CDR3区，和/或具有SEQIDNO:4的CDR1区、具有SEQIDNO:5的CDR2区和具有SEQIDNO:6的CDR3区。在其他具体的实施方式中，与实体瘤抗原特异性相互作用的如本文所公开的放射性标记的VHH的氨基酸序列与SEQIDNO:7或SEQIDNO:8所示的氨基酸序列或其功能性片段中的至少一种具有至少80％的氨基酸同一性。在其他具体的实施方式中，与肿瘤特异性抗原特异性相互作用的如本文所公开的放射性标记的VHH的氨基酸序列与SEQIDNO:7或SEQIDNO:8所示的氨基酸序列或其功能性片段中的至少一种相同。在其他具体的实施方式中，与癌细胞特异性抗原特异性相互作用的如本文所公开的放射性标记的VHH的氨基酸序列与SEQIDNO:7或SEQIDNO:8所示的氨基酸序列或其功能性片段中的至少一种具有至少80％的氨基酸同一性。在其他具体的实施方式中，与癌细胞特异性抗原特异性相互作用的如本文所公开的放射性标记的VHH的氨基酸序列与SEQIDNO:7或SEQIDNO:8所示的氨基酸序列或其功能性片段中的至少一种相同。在某些实施方式中，本发明提供了用于在癌症的预防和/或治疗中使用的如本文所公开的放射性标记的VHH或其功能性片段，其中所述癌症是乳癌。在某些其他实施方式中，本发明提供了用于在癌症的预防和/或治疗中使用的如本文所公开的放射性标记的VHH或其功能性片段，其中与免疫疗法组合实施所述癌症的预防和/或治疗。在某些其他实施方式中，通过向需要其的受试者静脉内或腹膜内或鞘内给予如本文所公开的放射性标记的VHH或其功能性片段来实现癌症的预防和治疗。在其他具体的实施方式中，与实体瘤抗原或与癌细胞特异性抗原特异性相互作用的如本文所公开的放射性标记的VHH或其功能性片段的氨基酸序列以单价形式存在。在其他实施方式中，如本文所公开的VHH或其功能性片段缺少引起VHH或功能性片段多聚化如二聚化的标签，更特别是含半胱氨酸的标签，如GGC标签。在某些实施方式中，与实体瘤抗原或与癌细胞特异性抗原特异性相互作用的如本文所公开的放射性标记的VHH或其功能性片段以使用期未延长的形式存在。在某些实施方式中，与实体瘤抗原或与癌细胞特异性抗原特异性相互作用的如本文所公开的放射性标记的VHH或其功能性片段缺少羧基末端多肽标签。相对于羧基末端多肽标签的VHH，如带His标签的VHH和带Myc-His标签的VHH，没有羧基末端多肽标签的VHH是有利的，益处在于它们在肾中较少保留。在另一个方面，本发明提供了用于在癌症的预防和/或治疗方法中使用的包含至少一种放射性标记的VHH或至少一种其功能性片段的多肽，所述VHH或其功能性片段特异性结合至实体瘤上存在的和/或对实体瘤特异的和/或对癌细胞特异的靶标蛋白。在其他方面，本发明提供了用于在癌症的预防和/或治疗方法中使用的包含至少一种放射性标记的VHH或其功能性片段的药物组合物，所述VHH或其功能性片段特异性结合至实体瘤上存在的和/或对实体瘤特异的和/或对癌细胞特异的靶标蛋白。在其他具体的实施方式中，如本文所公开的药物组合物还包含药用载体和/或一种或多种适合的佐剂。在一些方面，本发明公开还涉及用于癌症的预防和治疗之一或两者的方法，所述方法包括向需要其的受试者给予有效量的来源于重链抗体(VHH)的放射性标记的、未加标签的单价重链可变结构域或其功能性片段，其特异性结合至癌细胞或实体瘤上存在的靶标蛋白。在如本文所描述的方法中的任一种的一些实施方式中，用卤素放射性同位素标记放射性标记的、未加标签的单价VHH或其功能性片段。在如本文所描述的方法中的任一种的一些实施方式中，用131-碘标记放射性标记的、未加标签的单价VHH或其功能性片段。在如本文所描述的方法中的任一种的一些实施方式中，使用N-琥珀酰亚胺基-4-胍基甲基-3-[I-131]碘苯甲酸酯([I-131]SGMIB)或其适合的衍生物或变体、用131-碘标记所述放射性标记的、未加标签的单价VHH或其功能性片段。在如本文所描述的方法中的任一种的一些实施方式中，用放射性同位素标记所述放射性标记的、未加标签的单价VHH或其功能性片段，所述放射性同位素选自由α-发射放射性同位素和β-发射放射性同位素组成的组。在一些实施方式中，用放射性同位素标记所述放射性标记的、未加标签的单价VHH或其功能性片段，所述放射性同位素选自由以下各项组成的组：锕-225、砹-211、铋-212、铋-213、铯-137、铬-51、钴-60、镝-165、铒-169、镄-255、金-198、钬-166、碘-125、碘-131、铱-192、铁-59、铅-212、镥-177、钼-99、钯-103、磷-32、钾-42、铼-186、铼-188、钐-153、锝-99m、镭-223、钌-106、钠-24、锶-89、铽-149、钍-227、氙-133、镱-169、镱-177、钇-90。在如本文所描述的方法中的任一种的一些实施方式中，所述放射性标记的、未加标签的单价VHH或其功能性片段特异性结合至HER2。在如本文所描述的方法中的任一种的一些实施方式中，所述放射性标记的、未加标签的单价VHH或其功能性片段特异性结合至HER2并且用卤素放射性同位素标记所述VHH或其功能性片段。在如本文所描述的方法中的任一种的一些实施方式中，所述放射性标记的、未加标签的单价VHH或其功能性片段特异性结合至HER2并且用131-碘标记。在如本文所描述的方法中的任一种的一些实施方式中，所述放射性标记的、未加标签的单价VHH或其功能性片段特异性结合至HER2，并且使用N-琥珀酰亚胺基-4-胍基甲基-3-[I-131]碘苯甲酸酯([I-131]SGMIB)或其适合的衍生物或变体、用131-碘标记所述VHH或其功能性片段。在如本文所描述的方法中的任一种的一些实施方式中，如使用竞争测定所确定的，所述放射性标记的、未加标签的单价VHH或其功能性片段不与单克隆抗体(曲妥珠单抗)或单克隆抗体帕妥珠单抗竞争与HER2的结合。在如本文所描述的方法中的任一种的一些实施方式中，以在所述受试者中0.002至0.1mSv/MBq之间的计算的平均有效剂量，将所述放射性标记的、未加标签的单价VHH或其功能性片段给予至受试者。在如本文所描述的方法中的任一种的一些实施方式中，以一天一次至一月一次或者一月一次至一年一次的给予间隔，将所述放射性标记的、未加标签的单价VHH或其功能性片段给予至受试者。在如本文所描述的方法中的任一种的一些实施方式中，所述放射性标记的、未加标签的单价VHH或其功能性片段以小于5nM的亲和力结合至实体瘤或癌细胞上存在的HER2。在如本文所描述的方法中的任一种的一些实施方式中，所述放射性标记的、未加标签的单价VHH或其功能性片段包含CDR组合中的一种，所述组合选自：具有SEQIDNO:1的CDR1区、具有SEQIDNO:2的CDR2区和具有SEQIDNO:3的CDR3区，和具有SEQIDNO:4的CDR1区、具有SEQIDNO:5的CDR2区和具有SEQIDNO:6的CDR3区。在如本文所描述的方法中的任一种的一些实施方式中，所述放射性标记的、未加标签的单价VHH或其功能性片段与SEQIDNO:7和SEQIDNO:8所示的氨基酸序列中的至少一种具有至少80％的氨基酸同一性。在如本文所描述的方法中的任一种的一些实施方式中，所述放射性标记的、未加标签的单价VHH或其功能性片段与SEQIDNO:7和SEQIDNO:8所示的氨基酸序列中的至少一种相同。在如本文所描述的方法中的任一种的一些实施方式中，所述放射性标记的、未加标签的单价VHH或其功能性片段包含CDR组合中的一种，所述组合选自包括以下各项的组：具有SEQIDNO:1的CDR1区、具有SEQIDNO:2的CDR2区和具有SEQIDNO:3的CDR3区，和具有SEQIDNO:4的CDR1区、具有SEQIDNO:5的CDR2区和具有SEQIDNO:6的CDR3区；和使用N-琥珀酰亚胺基-4-胍基甲基-3-[I-131]碘苯甲酸酯([I-131]SGMIB)或其适合的衍生物或变体、用131-碘标记它们。在如本文所描述的方法中的任一种的一些实施方式中，所述放射性标记的、未加标签的单价VHH或其功能性片段与SEQIDNO:7和SEQIDNO:8所示的氨基酸序列中的至少一种具有至少80％的氨基酸同一性，并且使用N-琥珀酰亚胺基-4-胍基甲基-3-[I-131]碘苯甲酸酯([I-131]SGMIB)或其适合的衍生物或变体、用131-碘标记所述VHH或其功能性片段。在如本文所描述的方法中的任一种的一些实施方式中，所述放射性标记的、未加标签的单价VHH或其功能性片段与SEQIDNO:7和SEQIDNO:8所示的氨基酸序列中的至少一种相同，并且使用N-琥珀酰亚胺基-4-胍基甲基-3-[I-131]碘苯甲酸酯([I-131]SGMIB)或其适合的衍生物或变体、用131-碘标记所述VHH或其功能性片段。在如本文所描述的方法中的任一种的一些实施方式中，所述癌症是乳癌。在如本文所描述的方法中的任一种的一些实施方式中，所述方法还包括对受试者实施免疫疗法。在如本文所描述的方法中的任一种的一些实施方式中，将所述放射性标记的单价VHH或其功能性片段静脉内、鞘内或腹膜内给予至受试者。在如本文所描述的方法中的任一种的一些实施方式中，所述放射性标记的单价VHH或其功能性片段是使用期未延长的。在如本文所描述的方法中的任一种的一些实施方式中，所述放射性标记的单价VHH或其功能性片段缺少羧基末端多肽标签，优选地，是未加标签的。本发明公开的其他方面涉及来源于重链抗体(VHH)的放射性标记的、未加标签的单价重链可变结构域或其功能性片段，其特异性结合至癌细胞或实体瘤上存在的靶标蛋白。在一些实施方式中，所述放射性标记的、未加标签的单价VHH或其功能性片段特异性结合至HER2。在一些实施方式中，使用N-琥珀酰亚胺基-4-胍基甲基-3-[I-131]碘苯甲酸酯([I-131]SGMIB)或其适合的衍生物或变体、用131-碘标记所述放射性标记的、未加标签的单价VHH或其功能性片段。在一些实施方式中，所述放射性标记的、未加标签的单价VHH或其功能性片段特异性结合至HER2，并且使用N-琥珀酰亚胺基-4-胍基甲基-3-[I-131]碘苯甲酸酯([I-131]SGMIB)或其适合的衍生物或变体、用131-碘标记所述VHH或其功能性片段。在本文所描述的放射性标记的、未加标签的单价VHH或其功能性片段中的任一种的一些实施方式中，如使用竞争测定所确定的，所述VHH或其功能性片段不与单克隆抗体或单克隆抗体帕妥珠单抗竞争与HER2的结合。在本文所描述的放射性标记的、未加标签的单价VHH或其功能性片段中的任一种的一些实施方式中，所述放射性标记的单价VHH或其功能性片段以小于5nM的亲和力结合至实体瘤或癌细胞上存在的HER2。在本文所描述的放射性标记的、未加标签的单价VHH或其功能性片段中的任一种的一些实施方式中，所述放射性标记的单价VHH或其功能性片段包含CDR组合中的一种，所述组合选自包括以下各项的组：具有SEQIDNO:1的CDR1区、具有SEQIDNO:2的CDR2区和具有SEQIDNO:3的CDR3区，和具有SEQIDNO:4的CDR1区、具有SEQIDNO:5的CDR2区和具有SEQIDNO:6的CDR3区。在本文所描述的放射性标记的、未加标签的单价VHH或其功能性片段中的任一种的一些实施方式中，所述放射性标记的单价VHH或其功能性片段与SEQIDNO:7和SEQIDNO:8所示的氨基酸序列中的至少一种具有至少80％的氨基酸同一性。在本文所描述的放射性标记的、未加标签的单价VHH或其功能性片段中的任一种的一些实施方式中，所述放射性标记的单价VHH或其功能性片段与SEQIDNO:7和SEQIDNO:8所示的氨基酸序列中的至少一种相同。在本文所描述的放射性标记的、未加标签的单价VHH或其功能性片段中的任一种的一些实施方式中，所述放射性标记的单价VHH或其功能性片段包括CDR组合中的一种，所述组合选自包括以下的组：具有SEQIDNO:1的CDR1区、具有SEQIDNO:2的CDR2区和具有SEQIDNO:3的CDR3区，和具有SEQIDNO:4的CDR1区、具有SEQIDNO:5的CDR2区和具有SEQIDNO:6的CDR3区；并且使用N-琥珀酰亚胺基-4-胍基甲基-3-[I-131]碘苯甲酸酯([I-131]SGMIB)或其适合的衍生物或变体、用131-碘标记所述放射性标记的单价VHH或其功能性片段。在本文所描述的放射性标记的、未加标签的单价VHH或其功能性片段中的任一种的一些实施方式中，所述放射性标记的单价VHH或其功能性片段与SEQIDNO:7和SEQIDNO:8所示的氨基酸序列中的至少一种具有至少80％的氨基酸同一性，并且使用N-琥珀酰亚胺基-4-胍基甲基-3-[I-131]碘苯甲酸酯([I-131]SGMIB)或其适合的衍生物或变体、用131-碘标记所述VHH或其功能性片段。在本文所描述的放射性标记的、未加标签的单价VHH或其功能性片段中的任一种的一些实施方式中，所述放射性标记的单价VHH或其功能性片段与SEQIDNO:7和SEQIDNO:8所示的氨基酸序列中的至少一种相同，并且使用N-琥珀酰亚胺基-4-胍基甲基-3-[I-131]碘苯甲酸酯([I-131]SGMIB)或其适合的衍生物或变体、用131-碘标记所述VHH或其功能性片段。在本文所描述的放射性标记的、未加标签的单价VHH或其功能性片段中的任一种的一些实施方式中，所述放射性标记的单价VHH或其功能性片段是使用期未延长的。在本文所描述的放射性标记的、未加标签的单价VHH或其功能性片段中的任一种的一些实施方式中，所述放射性标记的单价VHH或其功能性片段缺少羧基末端多肽标签。本发明公开的其他方面涉及药物组合物，其包含如本文所描述的放射性标记的、未加标签的单价VHH或其功能性片段中的任一项。在所述药物组合物的一些实施方式中，所述放射性标记的、未加标签的单价VHH或其功能性片段特异性结合至癌细胞或实体瘤上存在的靶标蛋白。在所述药物组合物的一些实施方式中，所述放射性标记的、未加标签的单价VHH或其功能性片段特异性结合至HER2。在所述药物组合物的一些实施方式中，使用N-琥珀酰亚胺基-4-胍基甲基-3-[I-131]碘苯甲酸酯([I-131]SGMIB)或其适合的衍生物或变体、用131-碘标记所述放射性标记的、未加标签的单价VHH或其功能性片段。在所述药物组合物的一些实施方式中，所述放射性标记的、未加标签的单价VHH或其功能性片段特异性结合至HER2，并且使用N-琥珀酰亚胺基-4-胍基甲基-3-[I-131]碘苯甲酸酯([I-131]SGMIB)或其适合的衍生物或变体、用131-碘标记所述VHH或其功能性片段。在所述药物组合物的一些实施方式中，如使用竞争测定所确定的，所述VHH或其功能性片段不与单克隆抗体曲妥珠单抗或单克隆抗体帕妥珠单抗竞争与HER2的结合。在所述药物组合物的一些实施方式中，所述放射性标记的单价VHH或其功能性片段以小于5nM的亲和力结合至实体瘤或癌细胞上存在的HER2。在所述药物组合物的一些实施方式中，所述放射性标记的单价VHH或其功能性片段包含CDR组合中的一种，所述组合选自包括以下各项的组：具有SEQIDNO:1的CDR1区、具有SEQIDNO:2的CDR2区和具有SEQIDNO:3的CDR3区，和具有SEQIDNO:4的CDR1区、具有SEQIDNO:5的CDR2区和具有SEQIDNO:6的CDR3区。在所述药物组合物的一些实施方式中，所述放射性标记的单价VHH或其功能性片段与SEQIDNO:7和SEQIDNO:8所示的氨基酸序列中的至少一种具有至少80％的氨基酸同一性。在所述药物组合物的一些实施方式中，所述放射性标记的单价VHH或其功能性片段与SEQIDNO:7和SEQIDNO:8所示的氨基酸序列中的至少一种相同。在所述药物组合物的一些实施方式中，所述放射性标记的单价VHH或其功能性片段包括CDR组合中的一种，所述组合选自包括以下各项的组：具有SEQIDNO:1的CDR1区、具有SEQIDNO:2的CDR2区和具有SEQIDNO:3的CDR3区，和具有SEQIDNO:4的CDR1区、具有SEQIDNO:5的CDR2区和具有SEQIDNO:6的CDR3区；并且使用N-琥珀酰亚胺基-4-胍基甲基-3-[I-131]碘苯甲酸酯([I-131]SGMIB)或其适合的衍生物或变体、用131-碘标记所述放射性标记的单价VHH或其功能性片段。在所述药物组合物的一些实施方式中，所述放射性标记的单价VHH或其功能性片段与SEQIDNO:7和SEQIDNO:8所示的氨基酸序列中的至少一种具有至少80％的氨基酸同一性，并且使用N-琥珀酰亚胺基-4-胍基甲基-3-[I-131]碘苯甲酸酯([I-131]SGMIB)或其适合的衍生物或变体、用131-碘标记所述VHH或其功能性片段。在所述药物组合物的一些实施方式中，所述放射性标记的单价VHH或其功能性片段与SEQIDNO:7和SEQIDNO:8所示的氨基酸序列中的至少一种相同，并且使用N-琥珀酰亚胺基-4-胍基甲基-3-[I-131]碘苯甲酸酯([I-131]SGMIB)或其适合的衍生物或变体、用131-碘标记所述VHH或其功能性片段。在所述药物组合物的一些实施方式中，所述放射性标记的单价VHH或其功能性片段是使用期未延长的。在所述药物组合物的一些实施方式中，所述放射性标记的单价VHH或其功能性片段缺少羧基末端多肽标签。具体实施方式[定义][一般定义]将相对于具体实施方式说明本发明，但是本发明不限于此，而是仅受权利要求的限制。权利要求中的任何参考符号不应视作对范围的限制。仅为了帮助理解本发明，提供了以下术语或定义。除非在本文中明确定义，否则本文所使用的术语的含义与本发明所属领域的技术人员通常理解的含义相同。对于本领域的定义和术语，实践者具体参考：Sambrook等人,MolecularCloning:ALaboratoryManual,第2版,ColdSpringHarborPress,Plainsview,NewYork(1989)；和Ausubel等人,CurrentProtocolsinMolecularBiology(Supplement47),JohnWiley&Sons,NewYork(1999)。本文所提供的定义的范围不应视为具有小于本领域技术人员所理解的范围。除非另外说明，否则可以实施未详细明确描述的所有方法、步骤、技术和操作，并且由于对于技术人员将是清楚的，因此以本身已知的方式进行。例如，另外参考了标准手册、以上提及的一般
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和其中引用的其他参考文献。如本文所使用的，除非上下文明确规定，否则单数形式的“一个(a)”，“一种(an)”和“该(the)”包括单数和复数对象。如本文所使用的术语“包括(comprising/comprises/comprisedof)”与“包括(including/includes)”或“含有(containing/contains)”是同义的，并且是包含两端在内或开放式的，并且不排除其他未列举的成员、要素或方法步骤。通过端点列举的数值范围包括包含在各个范围内的所有数值和部分以及列举的端点。当表示可测量值，如参数、量、短暂持续时间等时，如本文所使用的术语“约”表示涵盖了给定值的和与给定值相差+/-10％或更小的，优选地+/-5％或更小的，更优选地+/-1％或更小，并且更优选地+/-0.1％或更小的变化，在该范围内，在所公开的发明中实施这些变化是合理的。应理解本身还具体并且优选地公开了修饰词“约”所涉及的值。如本文所使用的，将通过它们的全称或者根据标准3字母或单字母氨基酸密码表示氨基酸残基。如本文所使用的，术语“多肽”、“蛋白质”、“肽”和“氨基酸序列”是可互换使用的，并且表示任何长度的氨基酸的多聚形式，它可以包括编码和非编码氨基酸、化学或生物化学修饰或衍生化的氨基酸和具有修饰的肽主链的多肽。如本文所使用的，术语“核酸分子”、“多核苷酸”、“多聚核酸”、“核酸”是可互换使用的，并且表示任何长度的核苷酸(脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其类似物)的多聚形式。多核苷酸可以具有任何立体结构，并且可以实施任何已知的或未知的功能。多核苷酸的非限制性实例包括基因、基因片段、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转运RNA、核糖体RNA、核糖酶、cDNA、重组多核苷酸、分枝多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的DNA、控制区、任何序列的分离的RNA、核酸探针和引物。核酸分子可以是线性的或环形的。如本文所使用的，术语“同源性”表示两个大分子之间(特别是，两个多肽或多核苷酸之间，其来自相同或不同的分类单元)至少的二级结构相似性，其中所述相似性是由于共有祖先所造成的。因此，术语“同源物”表示具有所述二级和可选地具有三级结构相似性的所相关的大分子。为了比较两个或更多个核苷酸序列，可以使用本领域技术人员已知的方法计算第一核苷酸序列与第二核苷酸序列之间的“序列同一性(的百分比)”，例如，通过将第一核苷酸序列中与第二核苷酸序列对应位置处的核苷酸相同的核苷酸的数目除以第一核苷酸序列中核苷酸的总数并乘以100％或者通过使用用于序列对比的已知的计算机算法，如NCBIBlast。确定两个氨基酸序列之间的序列同一性程度时，技术人员可以考虑所谓的“保守”氨基酸取代，它通常可以被描述为其中氨基酸残基被具有类似化学结构的另一种氨基酸残基替代并且对多肽的功能、活性或其他生物性质具有很少或基本无影响的氨基酸取代。可能的保守氨基酸取代将对本领域技术人员是显而易见的。如果在它们的整个长度上具有100％的序列同一性，则氨基酸序列和核酸序列被称为是“完全相同的”。如本文所使用的，术语“亲和力”是指多肽(特别是免疫球蛋白，如抗体或免疫球蛋白片段，如VHH)结合至抗原从而使抗原和多肽的平衡向通过它们的结合所形成的复合物的存在移动的程度。因此，例如，当抗原和抗体(片段)以相对相等的浓度结合时，高亲和力的抗体(片段)将结合至可用的抗原，从而使平衡向高浓度的所得复合物的方向移动。解离常数通常用于描述蛋白结合域和抗原靶标之间的亲和力。通常，解离常数小于10-5M。优选地，解离常数小于10-6M，更优选地，小于10-7M。最优选地，所述解离常数小于10-8M，如小于10-9M。如本文所使用的，术语“特异性结合”一般是指多肽，特别是免疫球蛋白，如抗体或免疫球蛋白片段，如VHH或其功能性片段优先结合至存在于不同抗原的均一混合物中的特定抗原的能力。在某些实施方式中，特异性结合相互作用将区分样品中希望和不希望的抗原，在一些实施方式中，大于约10至100倍或以上(例如，大于约1000或10000倍)。因此，当氨基酸序列对靶标(或对靶标的至少一部分或片段)具有亲和力，对靶标(或对靶标的至少一部分或片段)具有特异性和/或特异地针对靶标(或对靶标的至少一部分或片段)时，称如本文所公开的氨基酸序列，特别是抗体片段，如VHH或其功能性片段“特异性结合至”特定靶标。当结合至感兴趣的第一靶标抗原的亲和力比如本文所公开的氨基酸序列结合至感兴趣的第二靶标抗原的亲和力高至少5倍，如至少10倍，至少100倍和优选地至少1000倍时，称与感兴趣的第二靶标抗原相对，如本文所公开的氨基酸序列，特别是抗体片段，如VHH或其功能性片段对感兴趣的第一靶标抗原是“特异的”。因此，在某些实施方式中，当相对于感兴趣的第二靶标抗原，将如本文所公开的氨基酸序列称为对感兴趣的第一靶标抗原是“特异的”，则它可以特异性结合至(如本文所定义的)感兴趣的第一靶标抗原，但不能特异性结合至感兴趣的第二靶标抗原。可以基于亲和力(affinity)和/或亲和度(avidity)确定如本文所公开的氨基酸序列，特别是抗体片段，如VHH或其功能性片段的“特异性”。通过如本文所公开的氨基酸序列和它所结合的感兴趣的靶标蛋白的解离的平衡常数来表示如本文所公开的氨基酸序列的“亲和力”。KD值越小，则如本文所公开的氨基酸序列和它所结合的感兴趣的靶标蛋白之间的结合强度越强。可替代地，亲和力还可以表示为亲和常数(KA)，其对应于1/KD。根据感兴趣的具体靶标蛋白，可以以技术人员已知的方式确定如本文所公开的氨基酸序列的结合亲和力。如本文所公开的氨基酸序列的“亲和度”是如本文所公开的氨基酸序列和感兴趣的相关靶标蛋白之间结合强度的量度。亲和度与感兴趣的靶标蛋白上的结合位点和如本文所公开的氨基酸序列上的结合位点之间的亲和力以及如本文所公开的氨基酸序列上存在的相关结合位点的数目有关。通常，如本文所公开的氨基酸序列将以小于约1微摩尔(1μM)，并且优选地小于约1纳摩尔(1nM)的解离常数(KD)[即约1,000,000每摩尔(106M-1，1E6/M)或以上并且优选地约1,000,000,000每摩尔(109M-1，1E9/M)或以上的结合常数(KA)]结合至感兴趣的靶标蛋白。通常认为大于约1毫摩尔的KD值表示非结合或非特异性结合。在本领域中通常已知KD还可以表示为复合物解离速率常数[记作kOff(以秒-1或s-1表示)]与其结合速率常数[记作kOn(以摩尔-1秒-1或M-1s-1表示)]的比值。特别是，如本文所公开的氨基酸序列将以0.1至0.0001s-1范围内的kOff和/或1,000至1,000,000M-1s-1范围内的kOn结合至感兴趣的靶标蛋白。可以通过本领域技术人员已知的方法确定结合亲和力，kOff和kOn速率，例如，ELISA法，等温滴定量热法、表面等离子共振、荧光激活细胞分类分析等。如本文所使用的，当已从产生它的宿主细胞和/或培养基中提取或纯化时，将如本文所公开的氨基酸序列，特别是抗体片段，如VHH认为是“(处于)基本分离的(形式)”。相对于如本文所公开的氨基酸序列，特别是抗体片段，如VHH或其功能性片段，如本文所公开的，术语在本文中公开的氨基酸序列上存在的“结合区”、“结合位点”或“相互作用位点”将表示如本文所公开的氨基酸序列上存在的负责结合至靶标分子的氨基酸残基的特定位点、部分、结构域或延伸。这种结合域本质上由来自如本文所公开的氨基酸序列的与靶标分子接触的特定氨基酸残基组成。如在本文中可互换使用的，术语“(与)竞争”、“交叉阻断”、“交叉结合”和“交叉抑制”一般是指如使用适合的体外、细胞或体内测定所测量的，可以干扰如本文所公开的其他氨基酸序列与感兴趣的靶标蛋白的结合的如本文所公开的氨基酸序列，特别是抗体片段，如VHH。因此，更特别是，使用如本文所公开的氨基酸序列的“(与)竞争”、“交叉阻断”、“交叉结合”和“交叉抑制”可以表示干扰或竞争如本文所公开的另一种氨基酸序列与感兴趣的靶标蛋白的结合，由此，如使用适合的体外、细胞或体内测定所测量的，与在不使用“交叉阻断”如本文所公开的氨基酸序列的情况下，如本文所公开的其他氨基酸序列与感兴趣的靶标蛋白的结合相比，将所述结合降低了至少10％，但优选地至少20％，例如，至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％，至少95％或以上。据称如果对这两种不同的感兴趣的靶标蛋白是特异的(如本文所定义的)，则如本文所公开的氨基酸序列，特别是抗体片段，如VHH或其功能性片段对两种不同的感兴趣的靶标蛋白显示出“交叉反应性”。在如本文所公开的氨基酸序列，特别是抗体片段，如VHH或其功能性片段的两个或更多个结合位点中的所有结合位点均针对或特异性结合至感兴趣的靶标的氨基酸残基的相同位点、决定簇、部分、结构域或延伸的情况下，据称如本文所公开的氨基酸序列是“二价的”(就所述氨基酸序列上的两个结合位点来说)或多价的(就氨基酸序列上大于两个结合位点来说)，如例如三价的。如本文所使用的，当表示抗体片段，如VHH或其功能性片段时，术语“单价”是指处于单体形式的抗体片段。单价抗体片段仅含有一个结合位点。在这方面，抗体片段，如VHH或其功能性片段的结合位点涵盖了针对或特异性结合至感兴趣的靶标的氨基酸残基的特定位点、决定簇、部分、结构域或延伸的抗体片段的一个或多个“互补决定区”或“CDR”。如本文所使用的，当表示抗体片段，如VHH或其功能性片段时，术语“未加标签的”表示不含外来多肽序列(例如，仅含使用如本文所描述的放射性同位素标记的VHH序列或其片段)的抗体片段。示例性外来多肽序列包括羧基末端多肽标签，例如，His标签、含半胱氨酸标签(例如，GGC标签)和/或Myc标签。当表示如本文所公开的氨基酸序列，特别是抗体片段，如VHH时，术语“双重特异的”表示a)如本文所公开的氨基酸序列的两个或更多个结合位点针对或特异性结合至感兴趣的相同靶标，但是不结合至所述靶标的氨基酸残基的相同(即结合至不同)位点、决定簇、部分、结构域或延伸，则称如本文所公开的氨基酸序列是“双重特异的”(就所述氨基酸序列上的两个结合位点来说)或多重特异的(就氨基酸序列上大于两个结合位点来说)，或者b)如本文所公开的氨基酸序列的两个或更多个结合位点针对或特异性结合至不同的感兴趣的靶标分子。在如本文所公开的氨基酸序列上存在大于两个结合位点的情况下，使用术语“多重特异的”。因此，如本文所使用的“双重特异的”氨基酸序列或抗体片段，如“双重特异的”VHH，或者“多重特异的”氨基酸序列或抗体片段，如“多重特异的”VHH应表示分别包含两个或至少两个结合位点的如本文所公开的氨基酸序列，特别是抗体片段，如VHH，其中这两个或更多个结合位点具有不同的结合特异性。因此，如果在相同单体氨基酸序列中分别存在两个或大于两个不同的结合区，则认为如本文所公开的氨基酸序列，特别是抗体片段，如VHH是“双重特异的”或“多重特异的”。如本文所公开的氨基酸序列，特别是抗体片段，如VHH或其功能性片段的“半衰期”一般可用定义为如本文所公开的氨基酸序列的体内血清浓度降低50％所需的时间。可以通过本领域技术人员已知的任何方式，如通过药代动力学分析确定如本文所公开的氨基酸序列的体内半衰期。如技术人员将清楚的，可以使用参数，如t1/2-α、t1/2-β和曲线下面积(AUC)表示半衰期。体内半衰期提高的特征通常在于参数t1/2-α、t1/2-β和曲线下面积(AUC)中的一个或多个并且优选地全部三个均提高。当表示如本文所公开的抗体片段，如VHH或其功能性片段时，术语“使用期延长的”用于表示已修饰抗体片段来延长抗体片段的半衰期。延长抗体和抗体片段的半衰期的策略在本领域中是熟知的，并且包括(例如，但不限于)连接(化学或其他方式)至延长半衰期的一个或多个基团或部分，如聚乙二醇(PEG)或牛血清白蛋白(BSA)或人血清白蛋白(HSA)、抗体Fc片段或靶向血清蛋白，如血清白蛋白的抗原结合性抗体片段。如本文所使用的，术语“抑制”、“降低”和/或“防止”可以表示特异性结合至感兴趣的靶标抗原并且抑制、降低和/或防止感兴趣的靶标抗原与其天然结合伴侣之间的相互作用的如本文所公开的氨基酸序列，特别是抗体片段，如VHH或其功能性片段(的应用)。术语“抑制”、“降低”和/或“防止”还可以表示特异性结合至感兴趣的靶标抗原并且抑制、降低和/或防止感兴趣的靶标抗原的生物活性(如使用适合的体外、细胞或体内测定所测量的)的如本文所公开的氨基酸序列，特别是抗体片段，如VHH或其功能性片段(的应用)。因此，术语“抑制”、“降低”和/或“防止”还可以表示特异性结合至感兴趣的靶标抗原并且抑制、降低和/或防止其中涉及感兴趣的靶标抗原的一种或多种生物或生理机制、作用、反应、功能途径或活性的如本文所公开的氨基酸序列(的应用)。取决于感兴趣的靶标抗原，可以以任何适合的方式和/或使用任何本领域中已知的适合的(体外，并且通常细胞或体内)测定确定如本文所公开的氨基酸序列作为拮抗剂的这种作用。因此，更特别是，使用如本文所公开的氨基酸序列，特别是抗体片段，如VHH或其功能性片段的“抑制”、“降低”和/或“防止”可以表示如使用适合的体外、细胞或体内测定所测量的，与相同条件但不使用如本文所公开的氨基酸序列的情况下、在相同测定中感兴趣的靶标抗原的活性相比，将感兴趣的靶标抗原与其天然结合伴侣之间的相互作用抑制、降低和/或防止，或将感兴趣的靶标抗原的活性抑制、降低和/或防止，或将其中涉及感兴趣的靶标抗原的一种或多种生物或生理机制、作用、反应、功能途径或活性抑制、降低和/或防止(如)至少10％，但优选地至少20％，例如至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或以上。另外，“抑制”、“降低”和/或“防止”还可以表示与相同条件但不存在如本文所公开的氨基酸序列时相比，引起感兴趣的靶标抗原对其天然结合伴侣中的一种或多种的亲和力(affinity)、亲和度(avidity)、特异性和/或选择性的降低和/或引起感兴趣的靶标抗原对感兴趣的靶标抗原所处的媒介或环境的一种或多种条件(如pH、离子强度、辅因子的存在等)的敏感性的降低。在本发明的背景中，“抑制”、“降低”和/或“防止”还可以涉及感兴趣的靶标抗原的活性的变构抑制、降低和/或防止。如本文所使用的，术语“增强”、“升高”和/或“激活”可以表示特异性结合至感兴趣的靶标蛋白并且增强、升高和/或激活感兴趣的靶标蛋白与其天然结合伴侣之间的相互作用的如本文所公开的氨基酸序列，特别是抗体片段，如VHH或其功能性片段(的应用)。术语“增强”、“升高”和/或“激活”还可以表示特异性结合至感兴趣的靶标蛋白并且增强、升高和/或激活感兴趣的靶标蛋白的生物活性(如使用适合的体外、细胞或体内测定所测量的)的如本文所公开的氨基酸序列，特别是抗体片段，如VHH或其功能性片段(的应用)。因此，“增强”、“升高”和/或“激活”还可以表示特异性结合至感兴趣的靶标蛋白并且增强、升高和/或激活其中涉及感兴趣的靶标蛋白的一种或多种生物或生理机制、作用、反应、功能途径或活性的如本文所公开的氨基酸序列(的应用)。取决于感兴趣的靶标蛋白，可以以本领域中已知的任何适合的方式和/或使用任何适合的(体外，并且通常是细胞或体内)测定来确定如本文所公开的氨基酸序列作为激动剂(agonist)的这种作用。抑制或拮抗如本文所公开的氨基酸序列，特别是抗体片段，如VHH或其功能性片段的活性或者提高或激动(agonize)其活性可以是可逆的或不可逆的，但对于药物和药理学应用通常将可逆地发生。如本文所使用的，当已从产生它的宿主细胞和/或培养基中提取或纯化时，将如本文所公开的氨基酸序列，特别是抗体片段，如VHH或其功能性片段认为是“(处于)基本分离的(形式)”。相对于如本文所公开的氨基酸序列，特别是抗体片段，如VHH或其功能性片段，在本文中术语如本文所公开的氨基酸序列上存在的“结合区”、“结合位点”或“相互作用位点”将表示所述靶标分子上存在的特定位点(site)、区域(region)、座位(locus)、部分或结构域，其中特定位点、区域、位点、部分或结构域负责与靶标分子的结合。因此，该结合区基本由靶标分子的特定位点、区域、座位、部分或结构域组成，当与该靶标分子结合时，其与氨基酸序列接触。如本文所使用的，术语“抗体”是指多克隆抗体、单克隆抗体、人源化抗体、单链抗体及其片段，如Fab、F(ab)2、Fv以及保留了亲本抗体的抗原结合功能的其他片段。如此，抗体可以表示免疫球蛋白或糖蛋白或者其片段或部分，或者表示包含抗原结合部分的构建体，所述抗原结合部分包含在修饰的免疫球蛋白样构架内，或者表示包含在构建体内的抗原结合部分，所述构建体包含非免疫球蛋白样构架或支架。如本文所使用的，术语“单克隆抗体”是指具有同源性抗体群体的抗体组合物。对于抗体的物种或来源，该术语不受限制，并且它不意欲受其制备方式的限制。该术语涵盖了保留了抗体的抗原结合功能的完整免疫球蛋白以及片段等。可以在本发明中使用任何哺乳动物物种的单克隆抗体。然而，在实践中，由于大鼠或鼠科细胞系对于制备产生单克隆抗体所需的杂交细胞系或杂交瘤的使用的可用性，抗体通常将是大鼠或鼠科来源的。如本文所使用的，术语“多克隆抗体”是指具有不均匀抗体群体的抗体组合物。多克隆抗体通常来源于来自免疫的动物或来自所选的人的混合血清。如本文所使用的，“抗体的重链可变结构域或其功能性片段”表示(i)重链抗体的重链可变结构域，其天然缺少轻链(此后还表示为VHH)，其包括但不限于骆驼或鲨鱼的重链抗体的重链可变结构域；或者(ii)常规四链抗体的重链可变结构域(此后还表示为VH)，其包括但不限于常规四链抗体的重链骆驼化的(camelized)(如本文进一步定义的)可变结构域(此后还表示为骆驼化的VH)，或其任何功能性片段如但不限于特别适合于结合至肿瘤抗原或癌细胞上存在的抗原的氨基酸残基的一个或多个延伸(即小肽)，所述抗原存在于和/或可以引入如本文所公开的VHH(或者可以基于和/或来源于如本文所公开的VHH的CDR序列)。如下文中进一步描述的，可以认为(然而并不限于此)抗体的重链可变结构域的氨基酸序列和结构由四个框架区或“FR”组成，其在本领域和下文中分别称为“框架区1”或“FR1”；“框架区2”或“FR2”；“框架区3”或“FR3”；和“框架区4”或“FR4”，该框架区被3个互补决定区或CDR隔开，它们在本领域中分别称为“互补决定区1”或“CDR1”；“互补决定区2”或“CDR2”；和“互补决定区3”或“CDR3”。如本文所使用的，在抗体背景内，术语“互补决定区”或“CDR”是指H(重)或L(轻)链(还分别缩写为VH和VL)的可变区并且包含能够特异性结合至抗原靶标的氨基酸序列。这些CDR区负责抗体对特定抗原决定簇结构的基本特异性。这些区还被称为“高变区”。CDR代表可变区内的氨基酸的非邻接延伸，但是，与物种无关，已发现这些关键氨基酸序列在可变重链和轻链区内的位置定位在可变链的氨基酸序列内具有相似的定位。所有标准抗体(canonicalantibodies)的可变重链和轻链各具有3个CDR区，对于各轻(L)链和重(Η)链，每个CDR区与其他CDR区不邻接(称为L1、L2、L3、H1、H2、H3)。还如下文进一步描述的，抗体的重链可变结构域(包括VHH或VH)中氨基酸残基的总数可以在110-130的范围内，优选地，112-115，并且最优选地113。然而，应注意抗体重链可变结构域的部分、片段或类似物不具体受限于它们的长度和/或大小，只要这些部分、片段或类似物保留了功能活性(的至少一部分)和/或保留了这些部分、片段或类似物所来源的抗体的原始重链可变结构域的结合特异性(的至少一部分)。在本文中，保留了功能活性(的至少一部分)和/或保留了这些部分、片段或类似物所来源的抗体的原始重链可变结构域的结合特异性(的至少一部分)的部分、片段或类似物还进一步被称为重链可变结构域的“功能性片段”。如在以上引用的Riechmann和Muyldermans的论文中对来自骆驼的VHH结构域所应用的(参见，例如，所述参考文献的图2)，根据Kabat等人(“Sequenceofproteinsofimmunologicalinterest”,USPublicHealthServices,NIHBethesda,Md.,PublicationNo.91)提供的对重链可变结构域的一般编号方法，对抗体的重链可变结构域(包括VHH或VH)的可变结构域的氨基酸残基编号。根据这种编号，重链可变结构域的FR1包含位置1-30的氨基酸残基，重链可变结构域的CDR1包含位置31-35的氨基酸残基，重链可变结构域的FR2包含位置36-49的氨基酸残基，重链可变结构域的CDR2包含位置50-65的氨基酸残基，重链可变结构域的FR3包含位置66-94的氨基酸残基，重链可变结构域的CDR3包含位置95-102的氨基酸残基和重链可变结构域的FR4包含位置103-113的氨基酸残基。在这方面，应指出—如本领域中对VHH结构域所熟知的—每个CDR中氨基酸残基的总数可以改变并且可以不对应于Kabat编号所指明的氨基酸残基的总数(也就是说，在真实序列中可以不占据根据Kabat编号的一个或多个位置，或真实序列可以含有比Kabat编号所允许的数目更多的氨基酸残基)。这表示通常根据Kabat的编号可以或可以不对应于真实序列中氨基酸残基的真实编号。然而，通常可以说根据Kabat编号并且不管CDR中氨基酸残基的数目，根据Kabat编号的位置1对应于FR1的起始反之亦然，根据Kabat编号的位置36对应于FR2的起始反之亦然，根据Kabat编号的位置66对应于FR3的起始反之亦然，并且根据Kabat编号的位置103对应于FR4的起始反之亦然。用于重链可变结构域的氨基酸残基编号的替代方法是Chothia等人(Nature342,877-883(1989))所述的方法，所谓的“AbM定义”和所谓的“接触定义”。然而，在本发明的说明、权利要求和附图中，除非另外说明，否则将遵守如通过Riechmann和Muyldermans应用于VHH域的根据Kabat的编号。对于重链抗体及其可变结构域的一般说明，特别参考以下参考文献，其作为一般
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提及：VrijeUniversiteitBrussel的WO94/04678、WO95/04079和WO96/34103；Unilever的WO94/25591、WO99/37681、WO00/40968、WO00/43507、WO00/65057、WO01/40310、WO01/44301、EP1134231和WO02/48193；VlaamsInstituutvoorBiotechnologie(VIB)的WO97/49805、WO01/21817、WO03/035694、WO03/054016和WO03/055527；AlgonomicsN.V.andAblynxNV的WO03/050531；theNationalResearchCouncilofCanada的WO01/90190；theInstituteofAntibodies的WO03/025020(＝EP1433793)；以及AblynxNV的WO04/041867、WO04/041862、WO04/041865、WO04/041863、WO04/062551以及AblynxNV的其他公开的专利申请；Hamers-Casterman等人,Nature1993Jun.3；363(6428):446-8；DaviesandRiechmann,FEBSLett.1994Feb.21；339(3):285-90；Muyldermans等人,ProteinEng.1994September；7(9):1129-3；DaviesandRiechmann,Biotechnology(NY)1995May；13(5):475-9；Gharoudi等人,9thForumofAppliedBiotechnology,Med.Fac.LandbouwUniv.Gent.1995；60/4apartI:2097-2100；DaviesandRiechmann,ProteinEng.1996June；9(6):531-7；Desmyter等人,NatStructBiol.1996September；3(9):803-11；Sheriff等人,NatStructBiol.1996September；3(9):733-6；Spinelli等人,NatStructBiol.1996September；3(9):752-7；ArbabiGhahroudi等人,FEBSLett.1997Sep.15；414(3):521-6；Vu等人,Mol.Immunol.1997November-December；34(16-17):1121-31；Atarhouch等人,JournalofCarnelPracticeandResearch1997；4:177-182；Nguyen等人,J.Mol.Biol.1998Jan.23；275(3):413-8；Lauwereys等人,EMBOJ.1998Jul.1；17(13):3512-20；Frenken等人,ResImmunol.1998July-August；149(6):589-99；Transue等人,Proteins1998Sep.1；32(4):515-22；MuyldermansandLauwereys,J.Mol.Recognit.1999March-April；12(2):131-40；vanderLinden等人,Biochim.Biophys.Acta1999Apr.12；1431(1):37-46；Decanniere等人,StructureFold.Des.1999Apr.15；7(4):361-70；Ngyuen等人,Mol.Immunol.1999June；36(8):515-24；Woolven等人,Immunogenetics1999October；50(1-2):98-101；RiechmannandMuyldermans,J.Immunol.Methods1999Dec.10；231(1-2):25-38；Spinelli等人,Biochemistry2000Feb.15；39(6):1217-22；Frenken等人,J.Biotechnol.2000Feb.28；78(1):11-21；Nguyen等人,EMBOJ.2000Mar.1；19(5):921-30；vanderLinden等人,J.Immunol.Methods2000Jun.23；240(1-2):185-95；Decanniere等人,J.Mol.Biol.2000Jun.30；300(1):83-91；vanderLinden等人,J.Biotechnol.2000Jul.14；80(3):261-70；Harmsen等人,Mol.Immunol.2000August；37(10):579-90；Perez等人,Biochemistry2001Jan.9；40(1):74-83；Conrath等人,J.Biol.Chem.2001Mar.9；276(10):7346-50；Muyldermans等人,TrendsBiochemSci.2001April；26(4):230-5；MuyldermansS.,J.Biotechnol.2001June；74(4):277-302；Desmyter等人,J.Biol.Chem.2001Jul.13；276(28):26285-90；Spinelli等人,J.Mol.Biol.2001Aug.3；311(1):123-9；Conrath等人,AntimicrobAgentsChemother.2001October；45(10):2807-12；Decanniere等人,J.Mol.Biol.2001Oct.26；313(3):473-8；Nguyen等人,AdvImmunol.2001；79:261-96；Muruganandam等人,FASEBJ.2002February；16(2):240-2；Ewert等人,Biochemistry2002Mar.19；41(11):3628-36；Dumoulin等人,ProteinSci.2002March；11(3):500-15；Cortez-Retamozo等人,Int.J.Cancer.2002Mar.20；98(3):456-62；Su等人,Mol.Biol.Evol.2002March；19(3):205-15；vanderVaartJM.,MethodsMol.Biol.2002；178:359-66；Vranken等人,Biochemistry2002Jul.9；41(27):8570-9；Nguyen等人,Immunogenetics2002April；54(1):39-47；Renisio等人,Proteins2002Jun.1；47(4):546-55；Desmyter等人,J.Biol.Chem.2002Jun.28；277(26):23645-50；Ledeboer等人,J.DairySci.2002June；85(6):1376-82；DeGenst等人,J.Biol.Chem.2002Aug.16；277(33):29897-907；Ferrat等人,Biochem.J.2002Sep.1；366(Pt2):415-22；Thomassen等人,EnzymeandMicrobialTechnol.2002；30:273-8；Harmsen等人,Appl.Microbiol.Biotechnol.2002December；60(4):449-54；Jobling等人,Nat.Biotechnol.2003January；21(1):77-80；Conrath等人,Dev.Comp.Immunol.2003February；27(2):87-103；Pleschberger等人,Bioconjug.Chem.2003March-April；14(2):440-8；Lah等人,J.Biol.Chem.2003Apr.18；278(16):14101-11；Nguyen等人,Immunology.2003May；109(1):93-101；Joosten等人,Microb.CellFact.2003Jan.30；2(1):1；Li等人,Proteins2003Jul.1；52(1):47-50；Loris等人,Biol.Chem.2003Jul.25；278(30):28252-7；vanKoningsbruggen等人,J.Immunol.Methods.2003August；279(1-2):149-61；Dumoulin等人,Nature.2003Aug.14；42(6950):783-8；Bond等人,J.Mol.Biol.2003Sep.19；332(3):643-55；Yau等人,J.Immunol.Methods.2003Oct.1；281(1-2):161-75；Dekker等人,J.Virol.2003November；77(22):12132-9；Meddeb-Mouelhi等人,Toxicon.2003December；42(7):785-91；Verheesen等人,Biochim.Biophys.Acta2003Dec.5；1624(1-3):21-8；Zhang等人,JMolBiol.2004Jan.2；335(1):49-56；Stijlemans等人,JBiol.Chem.2004Jan.9；279(2):1256-61；Cortez-Retamozo等人,CancerRes.2004Apr.15；64(8):2853-7；Spinelli等人,FEBSLett.2004Apr.23；564(1-2):35-40；Pleschberger等人,Bioconjug.Chem.2004May-June；15(3):664-71；Nicaise等人,ProteinSci.2004July；13(7):1882-91；Omidfar等人,TumourBiol.2004July-August；25(4):179-87；Omidfar等人,TumourBiol.2004September-December；25(5-6):296-305；Szynol等人,AntimicrobAgentsChemother.2004September；48(9):3390-5；Saerens等人,J.Biol.Chem.2004Dec.10；279(50):51965-72；DeGenst等人,J.Biol.Chem.2004Dec.17；279(51):53593-601；Dolk等人,Appl.Environ.Microbiol.2005January；71(1):442-50；Joosten等人,ApplMicrobiolBiotechnol.2005January；66(4):384-92；Dumoulin等人,J.Mol.Biol.2005Feb.25；346(3):773-88；Yau等人,JImmunolMethods.2005February；297(1-2):213-24；DeGenst等人,J.Biol.Chem.2005Apr.8；280(14):14114-21；Huang等人,Eur.J.Hum.Genet.2005Apr.13；Dolk等人,Proteins.2005May15；59(3):555-64；Bond等人,J.Mol.Biol.2005May6；348(3):699-709；Zarebski等人,J.Mol.Biol.2005Apr.21。通常，应注意如本文以其最广泛的含义所使用的术语“重链可变结构域”不局限于特定的生物来源或特定的制备方法。例如，如以下将更详细地讨论的，如本文所公开的来源于重链抗体(即VHH)的重链可变结构域可以通过以下方式获得：(1)通过分离天然存在的重链抗体的VHH域；(2)通过表达编码天然存在的VH结构域的核苷酸序列；(3)通过来自任何动物物种，特别是，哺乳动物物种，如人的天然存在的VH结构域的“骆驼化”(如下所述)，或者通过表达编码这些骆驼化的VH结构域的核酸；(4)如Ward等人所述(如上)，通过“域抗体”或“Dab”的“骆驼化”，或者通过表达编码该骆驼化的VH结构域的核酸；(5)使用用于制备蛋白质、多肽或其他氨基酸序列的合成或半合成技术；(6)通过使用核酸合成技术制备编码VHH的核酸，然后表达因此所获得的核酸；和/或(7)通过上述方法的任何组合。基于本文的公开内容，用于实施上述内容的适合的方法和技术对于技术人员将是清楚的，并且例如，包括下文更详细描述的方法和技术。如本文所使用的术语“有效量”表示实现所期望的结果所需的量。如本文所使用的，术语“确定”、“测量”、“评估”、“监测”和“测定”是可互换使用的并且包括定量和定性测定两者。如本文所使用的，术语“预防和/或治疗”包括预防和/或治疗特定疾病和/或病症，预防特定疾病和/或病症的发作，减缓或逆转特定疾病和/或病症的发展，预防或减缓与特定疾病和/或病症有关的一种或多种症状的发生，降低和/或减轻与特定疾病和/或病症有关的一种或多种症状，降低特定疾病和/或病症的严重程度和/或持续时间，和一般地，有益于正在治疗的受试者或患者的如本文所公开的氨基酸序列的任何预防或治疗效果。如本文所使用的，如本文所使用的术语“诊断”、“预测”和/或“预后”包括诊断、预测和/或预后特定疾病和/或病症，由此预测特定疾病和/或病症发生和/或存在，和/或预测特定疾病和/或病症的发展和/或持续时间，和/或预测患有特定疾病和/或病症的患者对疗法的反应。[发明相关定义]如本文所使用的，术语“实体瘤特异性抗原”、“肿瘤特异性抗原”、“肿瘤抗原”、“(实体)瘤上存在的和/或对(实体)瘤特异的靶标蛋白”、“肿瘤特异靶标(蛋白)”、“肿瘤相关抗原”在本文中可互换使用并且包括仅存在于肿瘤细胞上而不存在于任何其他细胞上的任何蛋白，或者存在于一些肿瘤细胞上以及一些正常、健康细胞上的任何蛋白。肿瘤抗原的非限制性实例包括组织分化抗原、突变体蛋白抗原、致癌病毒抗原、癌症-睾丸抗原和血管或基质特异性抗原。如本文所使用的，术语“肿瘤细胞”是指存在于原发瘤或转移性瘤病变中的细胞。在这方面，肿瘤不仅由癌细胞组成，而且应认为是器官-样结构，其中在转化和非转化细胞之间存在复杂的双向相互作用。转化细胞的恶性可能需要来自基质的适当支承结构，其可以由成纤维细胞、脂肪细胞、血液和淋巴管组成，但是还可以明显被宽范围的免疫细胞浸润。如本文所使用的，术语“癌细胞特异性抗原”、“癌特异性抗原”、“癌抗原”、“癌细胞上存在的和/或对癌细胞特异的靶标蛋白”、“癌细胞特异靶标(蛋白)”、“癌(细胞)相关抗原”在本文中可互换使用并且包括仅存在于肿瘤细胞上而不存在于任何其他细胞上的任何蛋白，其存在于一些癌细胞上以及一些正常、健康细胞上的任何蛋白。癌细胞特异性抗原的非限制性实例包括组织分化抗原、突变体蛋白抗原、致癌病毒抗原、癌症-睾丸抗原和血管或基质特异性抗原。如本文所使用的，“放射性标记的”氨基酸序列、“放射性标记的”抗体片段或者“放射性标记的”VHH中的术语“放射性标记的”是指氨基酸序列、抗体片段或VHH的放射性同位素标记，其中通过将放射性核素包含、偶联或化学连接至其氨基酸序列结构来标记该氨基酸序列、抗体片段或VHH。如本文所使用的，术语“放射性核素(radionuclide，radioactivenuclide)”或“放射性同位素(radioisotope，radioactiveisotope)”可互换使用并且表示具有不稳定核的原子，其特征为赋予核内新产生的辐射颗粒或通过内部转换可用的多余能量。在该过程中，据称放射性核素经历放射性衰变，从而导致发射γ射线和/或亚原子粒子，如α或β粒子。这些发射构成电离辐射。放射性核素自然产生或可以人工产生。“实体瘤”或“肿瘤”表示原发瘤和/或转移瘤(无论位于何处)，如但不限于神经胶质瘤、胰腺肿瘤；肺癌，例如，小细胞肺癌、乳癌；表皮样癌；神经内分泌肿瘤；妇科和泌尿科癌，例如，宫颈癌、子宫癌、卵巢癌、前列腺癌、肾细胞癌、睾丸生殖细胞肿瘤或癌；胰腺癌(胰腺腺癌)；成胶质细胞瘤；头颈癌(headand/orneckcancer)；CNS(中枢神经系统)癌；骨肿瘤；儿科实体瘤；血液学恶性肿瘤；AIDS相关癌症；软组织肉瘤和皮肤癌，包括黑素瘤和卡波济氏肉瘤。如本文所使用的，术语“癌细胞”是指以不受控制的生长异常且无限制地分裂和复制的细胞，并且其可以脱离并移动至身体其他部分并建立另一位点，这称之为转移癌。如本文所使用的“病变”可以表示由损伤或疾病造成的身体组织或器官的任何异常变化。在癌症术语中，病变通常是指肿瘤。如本文所使用的，如“HER-2阳性(癌症)病变”、“HER-2阳性(乳)癌”或“HER-2阳性肿瘤”中的术语“HER-2阳性”是指其特征为HER2基因扩增或HER2蛋白过表达并因此具有与正常健康细胞相比异常高水平的HER2基因和/或HER2蛋白的癌性或恶性细胞或组织。HER-2阳性乳癌的特征在于以HER2基因扩增或HER2蛋白过表达为特征的癌性乳腺细胞。在每5个乳癌中的约1个中，由于一个或多个基因突变，癌细胞产生过量的HER2，从而主要导致HER2基因扩增。可以在多种类型的癌症中发生它所造成的HER2蛋白水平的升高，并因此不限于乳癌。如本文所使用的，如“HER-2阴性(癌症)病变”、“HER-2阴性(乳)癌”、“HER-2阴性肿瘤”或“HER-2阴性细胞”中的术语“HER-2阴性”可以表示癌性或恶性细胞或组织或者表示正常健康细胞或组织，两者的特征在于不存在HER2基因扩增或HER2蛋白过表达并因此具有正常水平的HER2基因和/或HER2蛋白。如本文所使用的术语“原位杂交(ISH)”是指一种杂交测定，其使用标记的互补DNA或RNA链(即探针)在(原位)组织部分或切片中，或者如果组织足够小(例如，植物种子、果蝇胚胎)则在整个组织中(全(组织)标本包埋ISH)、在细胞和在循环肿瘤细胞(CTC)中定位特定DNA或RNA序列。原位杂交是识别组织切片中单个细胞内特定mRNA物质、从而提供对生理学过程和疾病病理发生的认识的强有力的技术。特别是，原位杂交用于揭示染色体上或组织中特定核酸序列的位置，这是理解基因的组织、调控和功能的关键步骤。目前使用的关键技术包括：用寡核苷酸和RNA探针(两者均是放射性同位素标记的和半抗原标记的)原位杂交至mRNA；用光学和电子显微镜分析；全(组织)标本包埋原位杂交；RNA和RNA加蛋白的双重检测；和荧光原位杂交以检测染色体序列。DNAISH可以用于确定染色体的结构。荧光DNAISH(FISH)可以例如用于医学诊断以评估染色体完整性。RNAISH(RNA原位杂交)用于测量和定位组织切片、细胞、全(组织)标本包埋和循环肿瘤细胞(CTC)内的RNA(mRNA、lncRNA和miRNA)。如本文所使用的术语“荧光原位杂交(FISH)”是指用于检测和定位染色体上是否存在特异性DNA序列的特定类型的原位杂交测定。FISH使用了仅结合至与它们显示出高度序列互补性的那些染色体部分的荧光探针。荧光显微术可以用于找出荧光探针结合染色体的位置。FISH通常用于找出用于在遗传咨询、医学和物种识别中使用的DNA中的特异性特征。FISH还可以用于在细胞、循环肿瘤细胞和组织样品中检测和定位的特异性RNA靶标(mRNA、lncRNA和miRNA)。在这方面，它可以帮助限定细胞和组织内基因表达的时空模式。如本文所使用的术语“免疫组织化学(IHC)”是指通过利用特异性结合至生物组织切片中抗原的抗体的原理检测组织切片细胞中抗原(例如，蛋白质)的过程。在异常细胞如癌性肿瘤中存在的那些的诊断中广泛使用免疫组织化学染色。IHC也在基础研究中广泛使用以理解不同生物组织部分中的生物标志物和差异表达的蛋白的分布和定位。“曲妥珠单抗”(商品名：)是干扰HER2/neu受体的单克隆抗体。其主要用途是治疗某些乳癌。“帕妥珠单抗”或“2C4”(商品名：)是结合至HER2、更特别是HER2的结构域II的单克隆抗体，由此抑制HER2与其他HER受体的二聚化。其主要用途是治疗HER2阳性乳癌。如本文所使用的术语“原发瘤”是在解剖位点生长的肿瘤，在该位点肿瘤开始发展并继续产生癌性块。如本文所使用的术语“转移性病变”是指恶性或癌性肿瘤，其从它们的原始位置扩散至身体其他部分。可以互换使用的相关医学术语包括晚期阶段癌症、晚期癌或转移性疾病。总体上，转移性病变被认为是不可医治的，尽管治疗通常可用以控制癌性细胞的扩散并潜在地提高个体的期望寿命。转移是用于癌症扩散超出其体内原始位点的术语。因此，转移性病变是发现于原发瘤原始起点之外的位置中的癌性肿瘤。当来自原发瘤的细胞脱落并经由淋巴系统和血流移动到身体较远部分时发生转移性瘤。可替代地，来自原始肿瘤的细胞可以在邻近器官或组织接种成新的肿瘤。如本文所使用的“转移性疾病”是指晚期癌症并且是指如以下的医学分类：当癌细胞发现于原始肿瘤附近的淋巴结中时，癌症为处于III期，或当癌细胞移动到原发瘤位点之外至身体较远部分时，癌症为处于IV期。转移性病变最通常存在于脑、肺、肝脏或骨骼中。具有转移性癌症的个体可以或可以不经受任何症状，并且症状可以与其中重新定位有转移细胞的区域有关。一旦转移性病变存在于身体中，对于大部分癌症类型，个体的癌症将认为是不可治愈的。这意味着非常难以通过可用的治疗消除每个存在的癌细胞。这种情况下，治疗目标变为减缓肿瘤生长以维持最高的可能生活质量并潜在延长个体的预期寿命。在一些情况下，通过用于症状控制的适当治疗，具有转移性病变的人可以存活数年。如本文所使用的，受试者内照射的“(计算平均)有效剂量”是指身体所有指定组织和器官中等价剂量的组织加权之和，并且表示随机健康风险，它是递送至身体部位的电离辐射引起癌症的概率和遗传影响。考虑了辐射类型和每个辐射的器官和组织的性质。它是国际放射性辐射防护委员会(InternationalCommissiononRadiologicalProtection，ICRP)设计的国际放射保护系统中对放射保护的剂量限制的中心量。有效剂量的SI单位是西弗特(Sv)，它是1焦耳/千克(J/kg)。在1991年，在ICRP剂量数量系统中，有效剂量数量替换了先前的“有效剂量当量。”对于使用放射性药物的程序，有效剂量通常表示为每单位注射活性，表示为mSv/MBq。那么，个体患者的有效剂量将基于放射性药物的注射活性，表示为MBq，和计算的平均有效剂量，表示为mSv/MBq。使用FDA在2004年批准的软件计算放射性药物的有效剂量。个人电脑代码对放射性药物进行剂量计算和动力学建模(OLINDA/EXM代表器官水平内部剂量评价/指数建模)。对不同的身体器官计算来自全身给予的放射性药物的辐射剂量，并对用户-提供的生物动力学数据进行回归分析以支持用于核医学药物的这些计算。这些计算用于在核医学的诊断和治疗应用中进行使用这些药物的风险/效益评价。该技术使用了用于成人、儿童、孕妇等的一些标准身体模型，它在内剂量团体中是广泛接受和使用的。这些计算对研究当对患者或研究受试者提供放射性药物时，应递送的可接受的辐射剂量的制药工业开发人员、核医学专业人员、教育者、管理者、研究人员等是有用的。计算有效剂量取决于所选的标准身体模型和所选的膀胱排尿模型。已使用成年女性模型和1h的膀胱排尿间隔计算本文所提供的值。在本说明书中引用的所有文档以其全部内容作为参考并入本文。除非另外定义，否则在公开本发明时使用的所有术语(包括技术和科学术语)的含义与本发明所属领域中技术人员通常理解的含义相同。通过进一步指导，包含了术语定义以更好理解本发明的教导内容。[说明主体]本发明人已识别了用于在癌症的预防和/或治疗中使用的与对实体瘤和/或对癌细胞特异的抗原特异性相互作用的实体瘤结合性抗体片段和癌细胞结合性抗体片段，更特别是，VHH或其功能性片段。另外并且更重要地，通过放射性标记如本文所公开的VHH，已开发了用于放射免疫疗法的改善且有效的方法，从而在需要其的受试者、并且特别是在需要其的人患者中产生高的肿瘤或癌细胞摄取值，低的健康组织摄取值，低的整体生物分布和从血液快速清除。因此，如本文所公开的放射性标记的VHH或其功能性片段不但显示出高治疗效力，而且通过它们被正常健康组织的低摄取以及它们的快速清除，显示出低毒性影响，并因此与常规免疫疗法或已知的放射免疫疗法试剂相比，在治疗患者中显示出更低的副作用。因此，如本文所公开的抗体片段的效力和效能因此提示了医学应用中更高的最大耐受剂量(MTD)的潜能，从而允许重复且连续给予高治疗剂量，从而有效阻断肿瘤或癌细胞生长，同时对正常健康组织仍保持低于剂量限制性毒性(DLT)副作用。因此，本发明首次证明放射性标记的抗体片段，并且特别是放射性标记的VHH或其功能性片段可以用于有效保护或治疗动物或人的癌症。更特别是，本发明显示出放射性标记的、单价且使用期未延长的VHH或其功能性片段的治疗效力。本文所公开的放射性标记的抗体片段可以来源于天然存在的多肽，或者可替代地，它们可以是完全人工设计的。该类天然存在的多肽的非限制性实例包括重链抗体(hcAb)，如但不限于骆驼科动物重链抗体。特别是，如本文所公开的来源于重链抗体的重链可变结构域(即VHH)由单个多肽链组成并且未翻译后修饰。更特别是，如本文所公开的VHH或其功能性片段来源于先天或适应性免疫系统，优选地来自先天或适应性免疫系统的蛋白质。更特别是，如本文所公开的VHH包含4个框架区和3个互补决定区或者其任何适合的片段(那么，其通常将包含形成互补决定区中至少一个的至少一些氨基酸残基)。特别是，如本文所公开的VHH易于以高得率产生，优选地，在微生物重组表达系统中产生，并且易于后续分离和/或纯化。根据具体实施方式，本发明提供了一些特别适合于结合至肿瘤抗原或癌细胞抗原如但不限于HER2的氨基酸残基的延伸(即，小肽)。这些氨基酸残基的延伸可能存在于和/或可能引入到如本文所公开的VHH中，特别是，以它们形成该VHH的抗原结合位点(的一部分)的方式。由于这些氨基酸残基的延伸首先作为抗体的CDR序列产生(或者可能基于和/或来源于这些CDR序列，如本文进一步描述的)，它们在本文中通常还将被称为“CDR序列”(即分别称为CDR1序列、CDR2序列和CDR3序列)。然而，应注意本发明以其最广泛的含义不局限于这些氨基酸残基的延伸可以在如本文所公开的重链可变结构域中具有的特定结构作用或功能，只要这些氨基酸残基的延伸允许如本文所公开的可变结构域特异性结合至肿瘤抗原和/或癌细胞特异性抗原。因此，通常，本发明以其最广泛的含义涉及用于在癌症的治疗和/或预防中使用的放射性标记的VHH，所述VHH包含如本文所描述的CDR序列的组合并且特异性针对肿瘤特异性或癌细胞特异性靶标蛋白。因此，在具体但非限制性实施方式中，如本文所公开的VHH包含选自由本文所描述的CDR1序列、CDR2序列和CDR3序列组成的组的至少一种氨基酸序列。特别是，如本文所公开的VHH可以包含至少一个抗原结合位点，其中所述抗原结合位点包含本文所描述的CDR1序列、CDR2序列和CDR3序列的至少一种组合。如本文所公开的并且具有这些CDR序列组合中的一种的任何VHH抗体片段优选地使得它可以特异性结合至(如本文所定义的)肿瘤特异性抗原和/或癌细胞特异性抗原，并且更特别是，使得它在溶液中以10-8摩尔/升或以下的所述可变结构域的解离常数(Kd)特异性结合至肿瘤特异性抗原和/或癌细胞特异性抗原。在具体的实施方式中，使如本文所公开的抗HER2的VHH抗体片段可以以小于5nM，如1至5nM之间，优选地2至3nM之间的解离常数(Kd)特异性结合至HER2。可以通过本身已知的任何适合的方式确定VHH肿瘤抗原或癌细胞抗原的特异性结合，方式包括例如生物淘选、斯卡查德分析和/或竞争性结合测定，如放射免疫测定(RIA)、酶免疫测定(EIA)和夹心竞争测定以及本领域中已知的它们的不同的变体。在其他具体实施方式中，如本文所公开的VHH包含CDR序列的至少一种组合，所述序列选自包括以下的组：具有SEQIDNO:1的CDR1区、具有SEQIDNO:2的CDR2区和具有SEQIDNO:3的CDR3区，和/或具有SEQIDNO:4的CDR1区、具有SEQIDNO:5的CDR2区和具有SEQIDNO:6的CDR3区。因此，在具体的实施方式中，本发明提供了具有(一般)结构的来源于重链抗体的重链可变结构域FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4其中FR1至FR4分别表示框架区1至4，并且其中CDR1至CDR3分别表示互补决定区1至3，并且是在本文中进一步定义的。SEQIDNO:7和SEQIDNO:8(参见表1)提供了抗肿瘤特异性抗原，特别是抗HER2产生的重链可变结构域的氨基酸序列。表1：VHH序列特别是，在一些具体实施方式中，本发明提供了针对肿瘤特异性或癌细胞特异性靶标抗原的放射性标记的VHH结构域，其与SEQIDNO:7或SEQIDNO:8(参见表1)的重链可变结构域、或其功能性片段的至少一种具有至少80％，优选地至少85％，如90％或95％或以上的序列同一性，和编码这些重链可变结构域或其功能性片段的核酸序列。如本文所公开的一些特别优选的重链可变结构域序列是可以结合至和/或针对HER2并且与SEQIDNO:7或SEQIDNO:8(参见表1)的重链可变结构域中的至少一种具有至少90％的氨基酸同一性的那些，其中出于确定氨基酸同一性程度的目的，不考虑形成CDR序列的氨基酸残基。在这些重链可变结构域中，CDR序列(参见表2)通常如本文进一步定义的。表2：CDR序列的具体组合(使用IMGT编号标示CDR序列)名称CDR1序列SEQIDCDR2序列SEQIDCDR3序列SEQID2Rs15dGYIFNSCG1ISGDGDT2AVCYNLETY32Rb17cGFIFSNDA4INWSGTHT5VTGYGVTKTP6应注意本发明不限于本文所公开的VHH片段(或者表达它们的核苷酸序列)的来源，并且不限于(已)产生或获得本文所公开的VHH片段或核苷酸序列的方式。因此，本文所公开的VHH片段可以是天然存在的氨基酸序列(来自任何适合的物种)或者是合成或半合成的氨基酸序列。在本发明的具体但非限制性方面中，氨基酸序列是(来自任何适合物种的)天然存在的免疫球蛋白序列或者合成或半合成的免疫球蛋白序列，其包括但不限于“人源化”免疫球蛋白序列(如部分或完全人源化的小鼠或兔免疫球蛋白序列，并且特别是部分或完全人源化的VHH序列)、“骆驼化的”免疫球蛋白序列，以及通过以下技术获得的免疫球蛋白序列，如亲和力成熟(例如，从合成、随机或天然存在的免疫球蛋白序列起始)、CDR移植(CDRgrafting)、镶饰、组合来源于不同免疫球蛋白序列的片段，使用重叠引物的PCR拼装(PCRassembly)和技术人员熟知的用于工程免疫球蛋白序列的类似技术；或者任何上述技术的任何适合的组合。另外，如本文进一步描述的，可以将如本文所公开的VHH序列或其功能性片段适当人源化，以提供一种或多种本发明的进一步(部分或完全)人源化的氨基酸序列。类似地，当氨基酸序列包括合成或半合成序列(如部分人源化序列)时，还如本文所描述的，可以可选地进一步适当人源化所述序列，以提供如本文所公开的一种或多种进一步(部分或完全)人源化的氨基酸序列。特别是，人源化氨基酸序列可以是其中存在至少一个是人源化取代的氨基酸残基和/或对应于人源化取代的氨基酸残基(并且特别是，在框架残基中的至少一种)的氨基酸序列。另外或者可替代地，可以通过将天然存在的VHH序列的框架区序列与一种或多种密切相关的人VH序列的相应框架序列相比较来确定其他可能有用的人源化取代，然后，可以将由此确定的一种或多种可能有用的人源化取代(或它们的组合)引入所述VHH序列(以任何本身已知的方式，如本文进一步描述的)并且可以测试所产生的人源化VHH序列或其功能性片段对靶标的亲和力、稳定性、表达容易程度和水平和/或其他所需的性质。以这种方式，通过有限程度的试错，技术人员可以确定其他适合的人源化取代(或其适合的组合)。为了适合如本文所公开的医学目的并且特别是适合如本文所公开的癌症中的治疗和预防应用，其中其旨在杀死表达如本文所公开的VHH或其功能性片段所针对的抗原的肿瘤细胞或癌细胞，或者减少或减缓这些肿瘤细胞或癌细胞的生长和/或增殖，将VHH连接或偶联如化学偶联至放射性核素。为了提供用于癌症的预防和/或治疗的细胞毒性化合物，可以连接至如本文所公开的VHH的适合的放射性核素的实例对于技术人员是清楚的并且可以例如无任何限制地选自α-发射放射性同位素和β-发射放射性同位素组成的组，其包括但不限于选自由以下各项组成的组的放射性同位素：锕-225、砹-211、铋-212、铋-213、铯-137、铬-51、钴-60、镝-165、铒-169、镄-255、金-198、钬-166、碘-125、碘-131、铱-192、铁-59、铅-212、镥-177、钼-99、钯-103、磷-32、钾-42、铼-186、铼-188、钐-153、锝-99m、镭-223、钌-106、钠-24、锶-89、铽-149、钍-227、氙-133、镱-169、镱-177、钇-90。在其他具体实施方式中，用碘-131标记如本文所公开的放射性标记的VHH或其功能性片段。因此，在一个方面，本发明提供了用于在癌症的预防和/或治疗中使用的特异性针对肿瘤抗原和/或癌细胞抗原的放射性标记的VHH序列或其功能性片段。在具体的实施方式中，本发明提供了用于在癌症的预防和/或治疗中使用的，并且更特别是用于在乳癌的预防和/或治疗中使用的特异性针对肿瘤抗原和/或癌细胞抗原的放射性标记的VHH序列或其功能性片段。在其他具体实施方式中，本发明提供了用于在癌症的预防和/或治疗中使用的特异性针对肿瘤抗原和/或癌细胞抗原的放射性标记的VHH序列，其具有与SEQIDNO:7或SEQIDNO:8或其功能性片段中的至少一个具有至少80％，优选地至少85％，如90％或95％或以上的序列同一性的氨基酸序列。在其他具体实施方式中，本发明提供了用于在癌症的预防和/或治疗中使用的特异性针对肿瘤抗原和/或癌细胞抗原的放射性标记的VHH序列，其具有选自SEQIDNO:7或SEQIDNO:8或其功能性片段组成的组的氨基酸序列。在其他具体实施方式中，本发明提供了用于在癌症的预防和/或治疗中使用的特异性针对肿瘤抗原和/或癌细胞抗原的131I标记的VHH序列。在具体的实施方式中，本发明提供了用于在癌症的预防和/或治疗中使用的、并且更特别是用于在乳癌的预防和/或治疗中使用的特异性针对肿瘤抗原和/或癌细胞抗原的131I标记的VHH序列或其功能性片段。在其他具体实施方式中，本发明提供了用于在癌症的预防和/或治疗中使用的特异性针对肿瘤抗原和/或癌细胞抗原的131I标记的VHH序列，其具有与SEQIDNO:7或SEQIDNO:8或其功能性片段中的至少一个具有至少80％，优选地至少85％，如90％或95％或以上的序列同一性的氨基酸序列。在其他具体实施方式中，本发明提供了用于在癌症的预防和/或治疗中使用的特异性针对肿瘤抗原和/或癌细胞抗原的具有SEQIDNO:7或SEQIDNO:8或其功能性片段的131I标记的VHH序列。在其他具体实施方式中，本发明提供了用于在乳癌的预防和/或治疗中使用的特异性针对肿瘤抗原和/或癌细胞抗原的131I标记的VHH序列，其具有与SEQIDNO:7或SEQIDNO:8或其功能性片段中的至少一个具有至少80％，优选地至少85％，如90％或95％或以上的序列同一性的氨基酸序列。在其他具体实施方式中，本发明提供了用于在乳癌的预防和/或治疗中使用的特异性针对肿瘤抗原和/或癌细胞抗原的具有SEQIDNO:7或SEQIDNO:8或其功能性片段的131I标记的VHH序列。在特别优选的实施方式中，本发明提供了处于其单体形式的VHH结构域或其功能性片段以及包含处于其单体形式的VHH结构域或其功能性片段的多肽和药物组合物，即，仅包含1个VHH结构域以尽可能最大程度降低所述多肽和药物组合物的体内半衰期。[重链可变结构域序列的变体]在某些方面，特异性结合至如本文所公开的肿瘤特异性抗原和/或癌细胞特异性抗原的放射性标记的VHH结构域或其功能性片段可以可选地经由一个或多个接头连接至一个或多个其他基团、部分或残基。这些一个或多个其他基团、部分或残基可以用于结合至其他感兴趣的靶标。应明确这些其他基团、残基、部分和/或结合位点可以或可以不为如本文所公开的重链可变结构域提供其他官能度，和可以或可以不改变如本文所公开的重链可变结构域的性质。这些基团、残基、部分或结合单元还可以是例如可以在生物学上是活性的化学基团。在具体的实施方式中，这些基团、部分或残基N-或C-末端连接至重链可变结构域，特别是C-末端连接。在具体的实施方式中，还可以化学修饰特异性结合至如本文所公开的肿瘤特异性抗原和/或癌细胞特异性抗原的放射性标记的VHH结构域或其功能性片段。例如，这些修饰可以包括向重链可变结构域中或在重链可变结构域上引入或连接(键接，linkage)一种或多种官能团、残基或部分。这些基团、残基或部分可以为重链可变结构域赋予一种或多种所需的性质或官能度。这些官能团的实例将对技术人员是清楚的。例如，将这些官能团引入或键连至重链可变结构域可以获得重链可变结构域溶解度和/或稳定性的提高，重链可变结构域毒性的降低或者重链可变结构域任何不希望的副作用的消除或减少和/或其他有利的性质。在具体的实施方式中，通过一个或多个适合的接头或间隔子将一个或多个基团、残基、部分连接至重链可变结构域。优选地，一个或多个基团、残基或部分不赋予如本文所公开的放射性标记的VHH或其功能性片段延长的半衰期。因此，在优选的实施方式中，如本文所公开的放射性标记的VHH或其功能性片段是使用期未延长的。还优选地，一个或多个基团、残基或部分不引起如本文所公开的放射性标记的VHH或其功能性片段的多聚化如二聚化。例如，含有含羧基末端半胱氨酸的标签如GCC标签的VHH导致产生了单体和二聚体形式的平衡混合物(Pruszyski等人,2013NuclMedBiol.40:52-59)。因此，在具体的实施方式中，如本文所公开的放射性标记的VHH或其功能性片段缺少引起多聚化如二聚化的标签，更特别是，含半胱氨酸的标签，更特别是GGC标签。在具体的实施方式中，如本文所公开的放射性标记的VHH或其功能性片段缺少C末端多肽标签如His标签和/或Myc标签，优选地是未加标签的。有利地，与加多肽标签如加His标签和加Myc-His标签的VHH相比，当使用无羧基末端多肽标签的VHH时肾保留显著降低。尽管如本文所公开的特异性结合至肿瘤特异性抗原和/或癌细胞特异性抗原的放射性标记的VHH域优选地处于单体形式(如本文进一步描述的)，在具体的替代实施方式中，可以将两个或更多个如本文所公开的特异性结合至肿瘤特异性抗原和/或癌细胞特异性抗原的放射性标记的VHH域或其功能性片段彼此连接或者可以相互连接。在具体的实施方式中，经由一个或多个适合的接头或间隔子将两个或更多个重链可变结构域或其功能性片段彼此连接。在如本文所公开的不同的重链可变结构域的连接中使用的适合的间隔子或接头将对技术人员是清楚的并且通常可以是在本领域中用于连接肽和/或蛋白质的任何接头或间隔子。一些特别适合的接头或间隔子包括(例如，但不限于)多肽接头，如甘氨酸接头、丝氨酸接头、混合的甘氨酸/丝氨酸接头、富含甘氨酸和富含丝氨酸的接头或由基本上极性的多肽片段组成的接头，或者同或异双官能化学交联化合物，如戊二醛，或可选地是PEG间隔的马来酰亚胺或NHS酯。例如，多肽接头或间隔子可以是长度在1至50个氨基酸之间，如1至30个氨基酸之间，并且特别是1至10个氨基酸残基之间的适合的氨基酸序列。应明确接头的长度、柔性程度和/或其他性质可以对重链可变结构域的性质具有一些影响，其包括但不限于对肿瘤靶标或癌细胞上的靶标的亲和力(affinity)、特异性或亲和度(avidity)。应明确当使用两种或更多种接头时，这些接头可以是相同或不同的。在本发明的背景和公开中，出于连接如本文所公开的重链可变结构域的目的，本领域技术人员将能够确定最佳接头，而无需任何过多的实验负担。[重链可变结构域的片段]本发明还涵盖了如本文所公开的特异性结合至肿瘤特异性抗原和/或癌细胞特异性抗原的放射性标记的VHH结构域的部分、片段、类似物、突变体、变体和/或衍生物和/或包含一种或多种这些部分、片段、类似物、突变体、变体和/或衍生物或基本由这些部分、片段、类似物、突变体、变体和/或衍生物组成的多肽，只要这些部分、片段、类似物、突变体、变体和/或衍生物适合于本文设想的目的。根据本发明的这些部分、片段、类似物、突变体、变体和/或衍生物仍能够特异性结合至肿瘤特异性抗原和/或结合至癌细胞特异性抗原。例如，本发明提供了一些氨基酸残基的延伸(即小肽)，在本文中也称为如本文所公开的VHH的CDR序列，其特别适合于结合至肿瘤抗原或癌症抗原。这些延伸可以被认为是如本文所公开的VHH的功能性片段，并且可以存在于任何适合的骨架(蛋白质)中和/或可以引入任何适合的骨架(蛋白质)中，任何适合的骨架(蛋白质)如但不限于如本文所公开的VHH，特别是以这种方式使它们形成适合的骨架或VHH的抗原结合位点(的部分)。然而，应注意本发明以其最广泛的含义不局限于特定结构作用或功能：这些氨基酸残基的延伸可以存在于如本文所公开的骨架或VHH中，只要这些氨基酸残基的延伸允许如本文所公开的这些骨架或VHH特异性结合至肿瘤抗原或癌症抗原。[核酸序列]在另一个方面，在如本文所公开的组合物中，本发明提供了编码VHH结构域氨基酸序列的核酸序列(或其适合的片段)。这些核酸序列还可以处于载体或遗传构建体或多核苷酸的形式。如本文所公开的核酸序列可以是合成或半合成序列，分离自文库(并且特别是，表达文库)的核苷酸序列、使用重叠引物通过PCR制备的核苷酸序列或者使用本身已知的用于DNA合成的技术制备的核苷酸序列。[构建体、载体、宿主细胞]如本文所公开的遗传构建体可以是DNA或RNA，并且优选地是双链DNA。本发明的遗传构建体还可以处于适合于预期宿主细胞或宿主生物转化的形式，或者处于适合于整合至预期宿主细胞的基因组DNA的形式，或者处于适合于在预期宿主生物中独立复制、维持和/或遗传的形式。例如，本发明的遗传构建体可以处于载体的形式，如例如质粒、粘粒、YAC、病毒载体或转座子。特别是，载体可以是表达载体，即，可以提供用于体外和/或体内表达的载体(例如，在适合的宿主细胞、宿主生物和/或表达系统中)。因此，在另一个其他方面，本发明还提供了包含如本文所公开的一种或多种核酸序列的载体。在其他方面，本发明提供了表达或能够表达一种或多种如本文所公开的氨基酸序列的宿主或者宿主细胞。对于技术人员来说，用于本发明的VHH序列、多肽的表达的宿主或宿主细胞的适合的实例将是清楚的。[包含VHH结构域的多肽]在另一个方面，本发明提供了包含本发明的至少一个VHH序列或基本由本发明的至少一个VHH序列组成的多肽(在本文中也称为“如本文所公开的多肽”)，该至少一个VHH序列特异性结合至肿瘤特异性抗原和/或癌细胞特异性抗原。本发明的多肽可以包含如本文所公开的至少一种VHH或其功能性片段和可选地通过一个或多个接头连接的可选的一个或多个其他基团、部分、残基。在特别优选的实施方式中，本发明提供了包含处于其单体形式的VHH结构域，即仅包含1个VHH结构域的多肽和药物组合物，从而尽可能最大程度降低所述多肽和药物组合物的体内半衰期。然而，在替代性实施方式中，本发明还提供了包含两个或更多个相同的或不同的VHH结构域的多肽和药物组合物，产生了二价(或多价)或者双重特异性或(多重特异性)多肽。如本文所公开的多肽可以至少含有一个或多个其他基团、部分或残基以用于结合至其他感兴趣的靶标或靶标蛋白。应明确这些其他基团、残基、部分和/或结合位点可以或可以不为如本文所公开的氨基酸序列(和/或它所存在的多肽或组合物)提供其他官能度，并且可以或可以不改变如本文所公开的氨基酸序列的性质。这些基团、残基、部分或结合单元还可以是例如可以在生物学和/或药理学上是活性的化学基团。优选地，其他基团、残基或部分不赋予多肽延长的半衰期。因此，在优选的实施方式中，如本文所公开的多肽是使用期未延长的。还优选地，其他基团、残基或部分不引起如本文所公开的多肽的多聚化，如二聚化。因此，在具体的实施方式中，如本文所公开的多肽缺少引起多聚化如二聚化的标签，更特别是含半胱氨酸的标签，更特别是GGC标签。在具体的实施方式中，如本文所公开的多肽缺少C末端多肽标签如His标签和/或Myc标签，优选地如本文所公开的多肽是未加标签的。在具体的实施方式中，这些基团、部分或残基N-或C-末端连接至如本文所公开的氨基酸序列。[如本文所公开的VHH序列、多肽和组合物的来源和形式]应注意本发明不限制本发明的VHH序列或其功能性片段、多肽或组合物(或者用于表达它们的本发明的核苷酸序列)的来源。此外，本发明也不限制产生或获得如本文所公开的VHH序列、多肽或核苷酸序列的方式。因此，如本文所公开的氨基酸序列可以是合成的或半合成的氨基酸序列、多肽或蛋白质。本发明所提供的氨基酸序列、多肽和组合物可以基本上处于分离形式(如本文所定义的)，或可替代地，可以形成如本文所公开的多肽或组合物的一部分，其可以包含如本文所公开的至少一种氨基酸序列或基本由其组成，并且其可以可选地还包含一种或多种其他基团、部分或残基(所有均可选地经由一个或多个适合的接头连接)。[靶标物质和交叉反应性]基于本文公开内容会理解，对于预防和/或治疗应用，如本文所公开的VHH序列或其功能性片段、多肽和组合物将在原理上针对或特异性结合至所有形式的肿瘤特异性抗原和/或癌细胞特异性抗原。然而，当如本文所公开的VHH序列或者其功能性片段、多肽和组合物旨在用于兽医目的时，它们将针对或特异性结合至来自旨在进行治疗的物种的所有形式的肿瘤特异性抗原和/或癌细胞特异性抗原，或它们至少将与来自旨在进行治疗的物种的所有形式的肿瘤特异性抗原和/或癌细胞特异性抗原具有交叉反应性。因此，特异性结合至来自一个受试者物种的所有形式的抗原的VHH序列或其功能性片段、多肽和组合物可以或可以不对来自一个或多个其他受试者物种的所有形式的抗原显示出交叉反应性。当然，设想在开发用于人或动物的氨基酸序列的背景中，可以开发结合至来自另一物种的肿瘤特异性抗原和/或癌细胞特异性抗原形式的VHH序列，而不是来自在研究和实验室测试中使用的要治疗的物种。还预期本发明的VHH序列和多肽会结合至肿瘤特异性抗原和/或癌细胞特异性抗原的一些天然存在的或合成的类似物、变体、突变体、等位基因、部分和片段。更特别是，预期本发明的VHH序列和多肽会至少结合至(仍)含有那些VHH序列和多肽要结合的(天然/野生型)抗原的结合位点、部分或结构域的肿瘤特异性抗原和/或癌细胞特异性抗原的那些类似物、变体、突变体、等位基因、部分和片段。[靶标]在具体的实施方式中，通过对实体瘤和/或癌细胞上存在的和/或对实体瘤和/或癌细胞特异的特定靶标蛋白的亲和力选择获得了本文所公开的VHH结构域。可以例如通过对于肿瘤特异性抗原和/或癌细胞特异性抗原的结合，筛选在其表面上表达VHH的细胞组、集合或文库(例如，噬菌体)，从而通过对特定实体瘤抗原或癌细胞的亲和力选择获得适合的多肽；可以以本身已知的方式进行这些中的全部，方式基本包括以下非限制步骤：a)获得肿瘤特异性或癌细胞特异性蛋白靶标分子的分离溶液或混悬液，所述分子已知是潜在癌症药物的靶标；b)针对所述蛋白靶标分子，从VHH文库生物淘选噬菌体或其他细胞；c)分离结合至肿瘤特异性或癌细胞特异性蛋白靶标分子的噬菌体或其他细胞；d)从单个结合噬菌体或其他细胞确定编码VHH插入物的核苷酸序列；e)根据该序列，使用重组蛋白表达产生一定量的VHH，和f)确定所述VHH结构域对所述肿瘤特异性或癌细胞特异性蛋白靶标分子的亲和力，和可选地g)在生物测定中测试所述VHH结构域的杀肿瘤或抗癌活性。可以使用多种方法确定VHH结构域和肿瘤特异性或癌细胞特异性蛋白靶标分子之间的亲和力，其包括例如酶联免疫吸附测定(ELISA)或者表面等离子共振(SPR)测定，它们在本领域中是常用的，例如，如在Sambrook等人(2001),MolecularCloning,ALaboratoryManual.第3版.ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY中所描述的。解离常数通常用于描述多肽及其靶标分子之间的亲和力。通常，多肽及其靶标分子之间结合的解离常数低于10-5M，更优选地，解离常数低于10-6M，更优选地，解离常数低于10-7M，最优选地，解离常数低于10-8M，如优选地低于10-9M，更优选地低于0.5.10-9M，如低于10-10M。在具体的实施方式中，如本文所公开的VHH片段以小于5.10-9M，如约1.10-9M至约5.10-9M之间，如约2.10-9M至约3.10-9M之间的解离常数特异性结合至实体瘤抗原。肿瘤特异性抗原或癌细胞特异性抗原是分别特异性存在于或特异性表达于和/或在肿瘤细胞或癌细胞表面上富含的分子，并且优选地不存在或仅以相对低浓度或密度存在于正常健康细胞的表面上。当这些肿瘤-特异或癌细胞特异性抗原结合至如本文所公开的放射性标记的VHH时，通过辐射毒性的机制杀死或至少阻碍其上表达抗原的相应肿瘤或癌细胞或者抑制或降低它们的生长。对于技术人员，适合的肿瘤特异性或癌细胞特异性靶标分子容易地可获自现有文献或专利数据库，并且无限制地包括在具有归因于突变的异常结构的肿瘤细胞中产生的任何蛋白，其包括ras和p53基因的异常产物、组织分化抗原、突变蛋白抗原、致癌病毒抗原、癌症-睾丸抗原、癌胚抗原和血管或基质特异性抗原。特异性肿瘤抗原的实例包括但不限于CTAG1B、MAGEA1、酶酪氨酸酶、甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、EBV和HPV、异常结构细胞表面糖脂和糖蛋白和HER2、EGFR及其变体。在具体的实施方式中，用于在癌症的预防和/或治疗中使用的如本文所公开的放射性标记的VHH域特异性针对HER2。在具体的实施方式中，本发明提供了用于在乳癌的预防和/或治疗中使用的特异性针对HER2的放射性标记的VHH序列。在其他具体实施方式中，本发明提供了用于在癌症的预防和/或治疗中使用的特异性针对HER2的放射性标记的VHH序列，其具有与SEQIDNO:7或SEQIDNO:8或其功能性片段中的至少一个具有至少80％，优选地至少85％，如90％或95％或以上的序列同一性的氨基酸序列。在其他具体实施方式中，本发明提供了用于在癌症的预防和/或治疗中使用的特异性针对HER2的放射性标记的VHH序列，其具有选自由SEQIDNO:7或SEQIDNO:8或其功能性片段组成的组的氨基酸序列。在其他具体实施方式中，本发明提供了用于在癌症的预防和/或治疗中使用的特异性针对肿瘤抗原和/或癌细胞抗原的131I标记的VHH序列或其功能性片段。在具体的实施方式中，本发明提供了用于在癌症的预防和/或治疗中使用的，并且更特别是用于在乳癌的预防和/或治疗中使用的特异性针对HER2的131I标记的VHH序列或其功能性片段。在其他具体实施方式中，本发明提供了用于在癌症的预防和/或治疗中使用的特异性针对HER2的131I标记的VHH序列，其具有与SEQIDNO:7或SEQIDNO:8或其功能性片段中的至少一个具有至少80％，优选地至少85％，如90％或95％或以上的序列同一性的氨基酸序列。在其他具体实施方式中，本发明提供了用于在癌症的预防和/或治疗中使用的特异性针对HER2的具有SEQIDNO:7或SEQIDNO:8或其功能性片段的131I标记的VHH序列。在其他具体实施方式中，本发明提供了用于在乳癌的预防和/或治疗中使用的特异性针对HER2的131I标记的VHH或其功能性片段，其具有与SEQIDNO:7或SEQIDNO:8或其功能性片段中的至少一个具有至少80％，优选地至少85％，如90％或95％或以上的序列同一性的氨基酸序列。在其他具体实施方式中，本发明提供了用于在乳癌的预防和/或治疗中使用的特异性针对HER2的具有SEQIDNO:7或SEQIDNO:8的131I标记的VHH序列或其功能性片段。在某些非限制性实施方式中，本发明的放射性标记的VHH序列或其功能性片段特异性针对HER2上的结合位点，其不同于HER2上(曲妥珠单抗)的结合位点和/或不与竞争与HER-2的结合，如使用适合的竞争测定所确定的。在具体的实施方式中，本发明的放射性标记的VHH序列特异性针对HER2上的结合位点，其不同于(即，不是)HER2的结构域IV。在其他具体的实施方式中，本发明的放射性标记的VHH序列或其功能性片段特异性针对HER2上的结合位点，其不同于(即，不是)HER2的结构域IV的C-末端。因此，在具体的实施方式中，如使用适合的竞争测定所确定的，本发明的放射性标记的VHH序列或其功能性片段不与单克隆抗体(曲妥珠单抗)竞争与HER2的结合。在某些实施方式中，如使用适合的竞争测定所确定的，本发明的放射性标记的VHH序列或其功能性片段不与单克隆抗体帕妥珠单抗竞争与HER2的结合。在其他实施方式中，本发明的放射性标记的VHH序列或其功能性片段特异性针对HER2上的结合位点，其不同于HER2上(帕妥珠单抗)的结合位点，更特别是，本发明的放射性标记的VHH序列特异性针对HER2上的结合位点，其不同于(即，不是)HER2的结构域II。在某些实施方式中，如使用适合的竞争测定所确定的，本发明的放射性标记的VHH序列或其功能性片段不与单克隆抗体曲妥珠单抗和单克隆抗体帕妥珠单抗竞争与HER2的结合。在其他实施方式中，本发明的放射性标记的VHH序列或其功能性片段特异性针对HER2上的结合位点，其不同于HER2上曲妥珠单抗和帕妥珠单抗的结合位点。在具体的实施方式中，本发明的放射性标记的VHH序列特异性针对HER2上的结合位点，其不同于(即，不是)HER2的结构域IV，更特别是，HER2的结构域IV的C-末端，和HER2的结构域II。用于确定抗原-靶向(例如靶向HER2的)放射性标记的VHH或其功能性片段是否与靶向相同抗原的结合剂，如单克隆抗体竞争的适合的竞争测定可以例如，但非限制地，是体内竞争测定。在体内竞争测定中，在单独给予放射性标记的VHH或其功能性片段的测试动物和在给予放射性标记的VHH或其功能性片段之前用结合剂预处理的测试动物中，比较了放射性标记的VHH或其功能性片段的生物分布，其中基本相同的生物分布谱表明放射性标记的VHH或其功能性片段不与结合剂竞争与靶标抗原的结合。[靶标抗原的形式]基于本文的公开内容会理解对于医学，即预防和/或治疗应用，如本文所公开的重链可变结构域在原理上会针对或特异性结合至一些不同形式的肿瘤特异性抗原或癌细胞特异性抗原。还预期如本文所公开的VHH或其功能性片段将结合至它们的肿瘤抗原或癌症抗原的一些天然存在的或合成的类似物、变体、突变体、等位基因、部分和片段。更特别是，预期如本文所公开的重链可变结构域将至少结合至(仍)含有那些VHH或其功能性片段所结合的天然肿瘤或癌症抗原的结合位点、部分或结构域的肿瘤或癌症抗原的那些类似物、变体、突变体、等位基因、部分和片段。在具体的实施方式中，当本发明提供了特异性针对HER2的VHH或其功能性片段时，如本文所公开的VHH仅可以结合处于单体形式的HER2，或仅可以结合处于多聚体形式的HER2，或可以结合处于单体和多聚体形式的HER2两者是在本发明的范围内的。此外，在这种情况下，如本文所公开的VHH或其功能性片段可以以与如本文所公开的VHH结合多聚体形式的亲和力和特异性相同或不同(即，高于或低于)的亲和力和/或特异性结合HER2的单体形式。另外，当HER2可以与其他蛋白质或多肽(例如，与其他ERBB受体，也称为异二聚化)结合以形成蛋白质复合物(例如，与多个亚基)时，如本文所公开的VHH可以以其非结合状态结合至HER2，或以其结合状态结合至HER2，或可以结合至两者是在本发明的范围内的。通常，如对于技术人员将清楚的，如本文所公开的VHH序列将至少结合至从生物学和/或治疗的角度来说最相关的那些HER2形式(包括单体、多聚体和结合形式)。[产生和生产如本文所公开的VHH序列的方法]本发明还提供了制备或产生VHH结构域序列或其功能性片段的方法，以及用于产生编码这些的核酸和包含这些重链可变结构域序列的宿主细胞、产物和组合物的方法。根据本文的进一步描述，这些方法的一些优选但非限制性实例将更加清晰。如对于技术人员会是清楚的，制备如本文所公开的重链可变结构域序列的一个特别有用的方法通常包括以下步骤：(a)表达编码如本文所公开的重链可变结构域序列的核苷酸序列或包含编码该重链可变结构域序列的核苷酸序列的载体或遗传构建体，和(b)可选地分离和/或纯化重链可变结构域序列。在本文设想的具体实施方式中，可以通过以下方法获得肿瘤特异性或癌细胞特异性重链可变结构域序列，该方法包括：产生VHH序列的随机文库并对该文库筛选能够特异性结合至肿瘤特异性或癌细胞特异性靶标蛋白的VHH序列。因此，在具体的实施方式中，制备如本文所公开的重链可变结构域序列的方法包括以下步骤：a)提供VHH结构域的氨基酸序列的组、集合或文库；和b)对所述氨基酸序列的组、集合或文库筛选可以结合至肿瘤特异性或癌细胞特异性靶标和/或对肿瘤特异性或癌细胞特异性靶标具有亲和力的氨基酸序列。和c)分离可以结合至肿瘤特异性或癌细胞特异性靶标和/或对肿瘤特异性或癌细胞特异性靶标具有亲和力的氨基酸序列。在该方法中，VHH序列的组、集合或文库可以是任何适合的氨基酸序列的组、集合或文库。例如，氨基酸序列的组、集合或文库可以是(如本文所描述的)免疫球蛋白片段序列的组、集合或文库，如免疫球蛋白片段序列的初始型组、集合或文库；免疫球蛋白片段序列的合成或半合成的组、集合或文库；和/或已进行亲和力成熟的免疫球蛋白片段序列的组、集合或文库。在该方法的具体实施方式中，VHH序列的组、集合或文库可以是免疫球蛋白片段序列的免疫组、集合或文库，例如，来源于已用肿瘤特异性或癌细胞特异性靶标或用基于其上或来源其中的适合的抗原决定簇(如其抗原部分、片段、区域、结构域、环或其他表位)适当免疫的哺乳动物。在一个具体方面，所述抗原决定簇可以是胞外部分、区域、结构域、环或其他胞外表位。在上述方法中，VHH序列的组、集合或文库可以在噬菌体、噬粒、核糖体或适合的微生物(如酵母)上展示以有利于筛选。例如，根据本文中进一步的公开内容，用于展示和筛选氨基酸序列(的组、集合或文库)的适合的方法、技术和宿主生物将对本领域技术人员是清楚的。参考Hoogenboom在NatureBiotechnology,23,9,1105-1116(2005)中的综述。在其他实施方式中，用于产生如本文所公开的重链可变结构域序列的方法包含至少以下步骤：a)提供表达VHH结构域氨基酸序列的细胞集合或样品；b)对所述细胞的集合或样品筛选表达可以结合至肿瘤特异性或癌细胞特异性靶标和/或对肿瘤特异性或癌细胞特异性靶标具有亲和力的氨基酸序列的细胞；和c)(i)分离所述氨基酸序列；或(ii)从所述细胞分离编码所述氨基酸序列的核酸序列，然后是表达所述氨基酸序列。例如，细胞集合或样品可以是B细胞集合或样品。另外，在这方法中，所述细胞样品可以来源于已用肿瘤特异性或癌细胞特异性靶标或用基于其上或来源其中的适合的抗原决定簇(如其抗原部分、片段、区域、结构域、环或其他表位)适当免疫的哺乳动物。在一个具体的实施方式中，所述抗原决定簇可以是胞外部分、区域、结构域、环或其他胞外表位。在其他实施方式中，用于产生针对肿瘤特异性或癌细胞特异性靶标的重链可变结构域序列的方法可以包括至少以下步骤：a)提供编码VHH结构域氨基酸序列的核酸序列的组、集合或文库；b)对所述核酸序列的组、集合或文库筛选编码可以结合至肿瘤特异性或癌细胞特异性靶标和/或对肿瘤特异性或癌细胞特异性靶标具有亲和力的氨基酸序列的核酸序列；和c)分离所述核酸序列，然后是表达所述氨基酸序列。在上述方法中，编码氨基酸序列的核酸序列的组、集合或文库可以(例如)是编码免疫球蛋白片段序列的初始型组、集合或文库的核酸序列的组、集合或文库；编码免疫球蛋白片段序列的合成的或半合成的组、集合或文库的核酸序列的组、集合或文库；和/或编码已进行亲和力成熟的免疫球蛋白片段序列组、集合或文库的核酸序列的组、集合或文库。特别是，在该方法中，核酸序列的组、集合或文库编码针对(如本文所定义的)肿瘤特异性或癌细胞特异性抗原的VHH结构域的组、集合或文库。在上述方法中，核苷酸序列的组、集合或文库可以在噬菌体、噬粒、核糖体或适合的微生物(如酵母)上展示以有利于筛选。例如，根据本文中进一步的公开内容，用于展示和筛选编码氨基酸序列的核苷酸序列(的组、集合或文库)的适合的方法、技术和宿主生物将对本领域技术人员是清楚的。参考Hoogenboom在NatureBiotechnology,23,9,1105-1116(2005)中的综述。本发明还涉及通过上述方法，或者作为另外一种选择通过包含上述方法之一和另外至少以下步骤的方法可获得的或获得的VHH序列，所述步骤为：确定所述VHH序列的核苷酸序列或氨基酸序列；和以本身已知的方式表达或合成所述VHH序列，如通过在适合的宿主细胞或宿主生物中表达或通过化学合成。[如本文所公开的VHH结构域的分离]在一些情况下，如本文所设想的用于产生特异性结合至肿瘤特异性或癌细胞特异性靶标的氨基酸序列的方法可以另外包括以下步骤：从氨基酸序列文库分离至少一种对肿瘤特异性或癌细胞特异性靶标具有可检测的结合亲和力或可检测的体外影响的VHH结构域。这些方法可以另外包括以下步骤：扩增编码至少一种对肿瘤特异性或癌细胞特异性靶标具有可检测的结合亲和力或可检测的体外影响的VHH结构域的序列。例如，展示特定氨基酸序列的噬菌体克隆，所述氨基酸序列获自本文所描述方法的选择步骤，可以通过细菌寄主的再感染和在生长培养基中的培育扩增。在具体的实施方式中，这些方法可以涵盖确定能够结合至肿瘤特异性或癌细胞特异性靶标的一种或多种氨基酸序列的序列。当在适合的细胞或噬菌体或颗粒上展示包含在氨基酸序列的组、集合或文库中的重链可变结构域序列时，有可能从所述细胞或噬菌体或颗粒中分离编码该氨基酸序列的核苷酸序列。以这种方法，可以通过常规测序方法确定所选的氨基酸序列文库成员的核苷酸序列。在其他具体实施方式中，如本文所设想的产生VHH结构域的方法包括以下步骤：在适合的条件下在宿主生物中表达所述核苷酸序列以获得实际需要的氨基酸序列。可以通过本领域技术人员已知的方法进行该步骤。另外，可选地在已识别它们的序列之后，可以作为可溶性蛋白构建体合成对肿瘤特异性或癌细胞特异性靶标具有可检测的结合亲和力或可检测的体外影响的所获得的VHH结构域序列。例如，可以使用本领域中已知的重组或化学合成方法合成通过上述方法获得的、可获得的或选择的VHH结构域序列。另外，可以通过基因工程技术产生通过上述方法获得的、可获得的或选择的氨基酸序列。因此，用于合成通过上述方法获得的、可获得的或选择的VHH序列的方法可以包括用编码对肿瘤特异性或癌细胞特异性靶标具有可检测的结合亲和力或可检测的体外影响的氨基酸序列的核酸或载体转化或感染宿主细胞。因此，可以通过重组DNA方法制备对肿瘤特异性或癌细胞特异性靶标具有可检测的结合亲和力或可检测的体外影响的VHH序列。可以使用常方案序容易地合成编码氨基酸序列的DNA。一旦制备，可以将DNA引入至表达载体，然后可以将所述载体转化或转染到宿主细胞(如大肠杆菌(E.coli))或任何适合的表达系统中，从而在重组宿主细胞和/或这些重组宿主细胞所存在的培养基中获得氨基酸序列的表达。如蛋白质表达和纯化领域的技术人员已知的，应理解可以用例如His标签或易于纯化的其他序列标签标记(通常在氨基酸序列的N末端或C末端)使用适合表达系统从表达载体中产生的VHH结构域。可以通过本领域技术人员已知的多种方式完成核酸或载体向宿主细胞中的转化或转染，这些方式包括：磷酸钙-DNA共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、聚凝胺介导的转染、电穿孔、微注射、脂质体融合、脂质转染、原生质体融合、反转录病毒感染和基因枪。无论位于体外或体内，用于表达所需重链可变结构域序列的适合的宿主细胞可以是任何真核或原核细胞(例如，细菌细胞如大肠杆菌(E.coli)、酵母细胞、哺乳动物细胞、鸟类细胞、两栖动物细胞、植物细胞、鱼类细胞和昆虫细胞)。例如，宿主细胞可以位于转基因植物中。因此，本发明申请还提供了用于产生对肿瘤或癌细胞特异性抗原具有可检测的结合亲和力或可检测的体外影响的VHH结构域的方法，其包括用编码这些VHH序列的核酸序列或载体转化、转染或感染宿主细胞并在适合的条件下表达它们的氨基酸序列。在另一个实施方式中，本发明还提供了用于生产(或者“产生”，等价措辞)如本文所公开的药物组合物的方法。在具体的实施方式中，本发明提供了用于产生如本文所公开的药物组合物的方法，其至少包括以下步骤：-获得至少一种VHH或其功能性片段，其特异性结合至肿瘤或癌细胞特异性抗原，和-在药物组合物中配制所述VHH或其功能性片段。在这些方法的具体实施方式中，获得至少一个特异性结合至肿瘤特异性或癌细胞特异性抗原的重链可变结构域或其功能性片段的步骤包括：(a)表达编码特异性结合至肿瘤特异性或癌细胞特异性抗原的VHH或其功能性片段的核苷酸序列，和可选地(b)分离和/或纯化该VHH或其功能性片段。在这些方法的其他具体实施方式中，获得至少一个特异性结合至肿瘤特异性或癌细胞特异性靶标的VHH或其功能性片段的步骤包括：a)提供VHH序列的VHH结构域序列或功能性片段的组、集合或文库；b)对所述VHH结构域序列或其功能性片段序列的组、集合或文库筛选特异性结合至肿瘤抗原和/或对肿瘤抗原具有亲和力的序列，和可选地c)分离特异性结合至肿瘤特异性或癌细胞特异性抗原和/或对肿瘤特异性或癌细胞特异性抗原具有亲和力的VHH序列或其功能性片段序列。[如本文所公开的VHH结构域的放射性标记]为了适合于预防和治疗目的，特别是适合于预防和/或治疗癌症相关疾病和病症，当其旨在杀死或至少降低或减缓表达如本文所公开的VHH所针对的肿瘤特异性或癌细胞特异性抗原的肿瘤细胞或癌细胞的生长或增殖时，将如本文所公开的VHH连接或偶联如化学偶联至放射性核素。为了提供用于癌症的预防和/或治疗的细胞毒性化合物，可以连接至如本文所公开的VHH或其功能性片段的适合的放射性核素的实例对于技术人员是清楚的并且可以例如而无任何限制地选自α-发射放射性同位素和β-发射放射性同位素组成的组，其包括但不限于选自由以下各项组成的组的放射性同位素：锕-225、砹-211、铋-212、铋-213、铯-137、铬-51、钴-60、镝-165、铒-169、镄-255、金-198、钬-166、碘-125、碘-131、铱-192、铁-59、铅-212、镥-177、钼-99、钯-103、磷-32、钾-42、铼-186、铼-188、钐-153、锝-99m、镭-223、钌-106、钠-24、锶-89、铽-149、钍-227、氙-133、镱-169、镱-177、钇-90。在其他具体实施方式中，用碘-131标记如本文所公开的放射性标记的VHH或其功能性片段。有多个放射性同位素标记策略可用于将放射性核素引入到蛋白质。放射化学家的技术选择主要基于所使用的放射性核素。碘的放射性同位素具有通过亲电子取代直接或通过共轭间接掺入到分子中的能力。另一方面，通过与螯合剂络合标记放射性金属。多种金属放射性核素具有与螯合剂形成稳定络合物的能力，因而允许与蛋白质结合。用碘核素放射性同位素标记分子在药物放射化学中具有重要意义。存在超过30种不同的所识别的碘同位素，但是在放射性碘化学中常用的仅有4个：123I、124I、125I和131I。蛋白质的直接放射性碘化是合成靶向肿瘤的或靶向癌细胞的放射性药物的关键方法。通常，存在两个基本的蛋白质放射性碘化方法。最直接的方法是使用亲电子取代在酪氨酸和组氨酸残基处直接蛋白质标记。将放射性碘化物氧化，从而原位产生亲电体*I+。这是使用氧化剂如氯胺T、和N-卤代琥珀酰亚胺进行的。所产生的亲电体进攻氨基酸酪氨酸的富含电子的芳香环，形成σ-复合物。由于稳定σ-复合物的供电子羟基，在酪氨酸残基处进行这种取代。由于蛋白质标记必需在温和条件下发生，因此碘与酪氨酸的连接是非常适合的。该方法在温和条件下进行，它对标记蛋白质是最佳的。然而，仅当蛋白质含有可接近的酪氨酸或组氨酸残基时这才是可能的。通过结合(缀合，conjugation)的蛋白质间接碘化是常用的替代方法。在该方法中，通过应用含有两个官能团的辅基掺入碘以使得能够放射性碘化和掺入蛋白质。存在多种用于放射性碘化的辅基，但是最常用的是N-琥珀酰亚胺基5-[*1]碘-3-吡啶羧基([131I]SIPC)和N-琥珀酰亚胺基-3-[*1]-碘代苯甲酸酯([*I]SIB)。将两种活性酯结合至蛋白质的氨基并显示出高体内稳定性。用于芳基的酰基化的另一种辅基是N-琥珀酰亚胺基-4-胍基甲基-3-[I-131]碘苯甲酸酯酯([I-131]SGMIB)。在本发明的具体实施方式中，使用N-琥珀酰亚胺基-4-胍基甲基-3-[I-131]碘苯甲酸酯酯([I-131]SGMIB)或其适合的衍生物或变体、用碘-131标记如本文所公开的放射性标记的VHH。对于专家来说，用于放射疗法的详细方案是容易获得的(CancerRadiotherapy:MethodsandProtocols(MethodsinMolecularMedicine),HuddartRA主编,HumanPress2002)。技术人员知道如何根据疾病性质和患者体质来确定适当剂量给予和应用计划。特别是，技术人员知道如何评价剂量限制性毒性(DLT)并因此知道如何确定最大耐受剂量(MTD)。在具体的实施方式中，以低于约800mCi，如例如低于约150mCi，如例如低于约30mCi，如低于约15mCi的放射性剂量给予如本文所公开的放射性标记的VHH或其功能性片段。在具体的实施方式中，取决于放射性核素，放射免疫结合物的比活力为约0.5mCi/mg至约8000mCi/mg，如例如1mCi/mg至约1500mCi/mg，如例如1mCi/mg至约300mCi/mg，如例如1mCi/mg至约150mCi/mg，并且可以通过静脉内、腹膜内或其他途径，如鞘内途径给予所述所述放射免疫结合物。取决于所需的治疗持续时间和有效性，可以将如本文所公开的放射性核素-VHH结合物与其他治疗药物或放射增敏剂组合给予一次或几次。所应用的放射免疫结合物的量取决于癌的准确性质。每次给予的放射性剂量必需足够高从而是有效的，但是必需低于剂量限制性毒性(DLT)。[用于预防和/或治疗和/或目的VHH序列、多肽和药物组合物]在其他方面，提供了组合物，其包含一种或多种本文所公开的VHH序列或其功能性片段和/或如本文所设想的核酸序列，和可选地至少一种可用载体(在本文中还称为如本文所设想的药物组合物)。根据某些具体实施方式，如本文所设想的组合物还可以可选地包含至少一种其他化合物。在具体的实施方式中，如本文所公开的组合物是药物组合物。如本文所设想的药物组合物可以在与感兴趣的肿瘤特异性或癌细胞特异性靶标分子有关的疾病和病症的预防和/或治疗中使用。特别是，本发明申请提供了适合于温血动物，并且特别是哺乳动物，并且更特别是人类中的预防和/或治疗性使用的药物组合物，其包含如本文所设想的一个或多个VHH序列或其功能性片段。还提供了可以在一种或多种癌症相关疾病、病症或病况的预防和/或治疗中用于兽医目的药物组合物，其包含如本文所设想的一个或多个VHH序列或其功能性片段。总体上，治疗的剂量、给予途径、应用方案、重复和持续时间将取决于疾病的性质(肿瘤或癌细胞的类型、等级和阶段等)以及患者的性质(体质、年龄、性别等)，并且由负责治疗的医学专家确定。对于如上所述的所公开的组合的组成的可能剂量，显然负责治疗的医学专家将小心监测是否会发生任何剂量限制性毒性或其他严重副作用并实施管理它们所必需的步骤。通常，对于药物使用，可以将如本文所设想的VHH序列或其功能性片段配制为药物制剂或组合物，所述药物制剂或组合物包含至少一种如本文所设想的VHH序列或多肽以及至少一种药用载体、稀释剂或赋形剂和/或佐剂，和可选地一种或多种其他药物活性多肽和/或化合物。这些制剂可以适合于腹膜内、静脉内或其他给予如鞘内给予。因此，取决于肿瘤或癌细胞的位置、类型和来源，可以将如本文所设想的VHH序列或其功能性片段或多肽和/或包括它们的组合物例如全身、局部或体表(topically)给予至感兴趣的组织或器官，并且根据所使用的具体药物制剂或组合物，优选腹膜内、静脉内或鞘内给予。临床医师将能够选择适合的给予途径和在这种给予中使用的适合的药物制剂或组合物。适合于注射或输注的药物剂量形式可以包括含有活性成分的无菌水溶液或分散体或无菌粉剂，所述活性成分适合于无菌可注射或可输注溶液或分散体的即用制备，其可选地包封在脂质体中。在所有情况下，在生产和储存条件下，最终剂量形式必须是无菌的、液体的和稳定的。液体载体或媒介物可以是溶剂或液体分散媒介，其包括例如：水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、植物油、无毒甘油酯和它们适合的混合物。在预防和/或治疗中使用所需的如本文所设想的VHH序列或其功能性片段和多肽的量不但可以随所选择的具体VHH序列或其功能性片段或多肽而改变，而且还可以随给予途径、要治疗的病况的性质以及患者的年龄和状况而改变，并最终由监护医生或临床医师处理。另外，本文设想的VHH序列或其功能性片段和多肽的剂量可以根据靶细胞、肿瘤、组织、移植物或器官而改变。特别是，以特别是根据要治疗的病况和患者严重程度，通过执业医生所确定的量给予如本文所设想的VHH序列或其功能性片段和多肽。通常，对于每种疾病适应症，将确定指明每千克体重每天要给予的量的最适剂量，该剂量是连续地(例如，通过输注)，作为单个日剂量或在一天内作为多个分剂量。取决于本文所提及的因素，临床医师通常会能够确定适合的日剂量。还将清楚在具体的情况下，临床医师可以选择偏离这些量，例如在以上提到的因素及其专业判断的基础上。可以通过确定它们的体外活性和/或动物模型中的体内活性来确定VHH和包含如本文所设想的VHH或其功能性片段的多肽的有用剂量。在某些实施方式中，本发明提供了如本文所公开的放射性标记的VHH或其功能性片段，通过以10g至1000gVHH的剂量向需要其的受试者给予放射性标记的VHH或其功能性片段来用于在癌症的预防和/或治疗中使用。在其他具体实施方式中，通过以10μg至500μg放射性标记的VHH之间的剂量，如特别是10至100μg放射性标记的VHH之间，优选地20至70μg放射性标记的VHH之间，如40至60μg放射性标记的VHH之间，更优选地但不限于约50μg放射性标记的VHH的剂量向需要其的受试者给予放射性标记的VHH，本发明提供了如本文所公开的放射性标记的VHH或其功能性片段，用于在癌症的预防和/或治疗中使用。因此，在某些实施方式中，通过向需要其的受试者给予如本文所公开的放射性标记的VHH实现癌症的预防和/或治疗，其特征在于在受试者中VHH或其功能性片段具有在0.001至0.05mSv/MBq之间的计算的平均有效剂量，如但不限于在0.02至0.05mSv/MBq之间，更优选地在0.02至0.04mSv/MBq之间，最优选地在0.03至0.05mSv/MBq之间的计算的平均有效剂量。因此，每次给予时应用于患者的放射性剂量必需足够高从而是有效的，但是必需低于剂量限制性毒性(DLT)。对于包含放射性标记的抗体(例如用131-碘标记)的药物组合物，必需确定最大耐受剂量(MTD)，在治疗背景中不可超过该最大耐受剂量。根据适合于预防和/或治疗要预防或治疗的疾病或病症的治疗方案给予如本文所设想的多肽和/或包含它们的组合物。临床医师通常将能够确定适合的治疗方案。通常，治疗方案将包括一种或多种VHH序列或多肽，或者包含它们的一种或多种组合物，以一种或多种药物有效的量或剂量的给予。所需剂量可以方便地以单个剂量存在，或者作为分剂量(其还可以是亚剂量)以适当间隔给予。给予方案可以包括长期(即至少2周，并且例如，几个月或几年)或每天治疗。特别是，给予方案可以在一天一次至一月一次之间改变，如一天一次至每两周一次，如但不限于每周一次。因此，取决于治疗所期望的持续时间和有效性，如本文所公开的药物VHH组合物可以给予一次或几次，还可以不连续给予，例如，以每天为基础给予几天、几周或几个月或以不同的剂量。本文所公开的VHH组合物的应用量取决于具体的癌症疾病的性质。多次给予是优选的。然而，放射性标记材料通常以相隔4至24周的间隔，优选地，12至20周的间隔给予。然而，技术人员知道如何选择将给予分为两次或多次应用，其可以在彼此之后不久应用，或者以例如1天至1周范围的一些其他预定间隔应用。特别是，如本文所设想的VHH序列或其功能性片段和多肽可以与用于或可以用于本文所引用的疾病和病症的预防和/或治疗的其他药物活性化合物或原理组合使用，作为其结果，可以或可以不获得协同作用。对于临床医师，这些化合物和原理的实例以及用于给予它们的途径、方法和药物制剂或组合物将是清楚的。在本发明的上下文中，“与…组合”、“在组合疗法中”或“在组合治疗中”应表示在方案中，将如本文所公开的放射性标记的VHH序列或包含如本文所公开的放射性标记的VHH序列的多肽与一种或多种其他药物活性化合物或原理一起应用于患者，其中所述患者可以得益于这种组合的有益效果。特别是，将两种治疗以接近的时间应用于患者。在优选的实施方式中，将两种治疗在4周(28天)内应用于患者。更优选地，将两种治疗在2周(14天)，更优选地，在1周(7天)内应用。在优选的实施方式中，在2天或3天内应用两种治疗。在另一个优选的实施方式中，在同一天，即在24小时内应用两种治疗。在另一个实施方式中，在4小时或2小时或1小时内应用两种治疗。在另一个实施方式中，将两种治疗同时，即在相同时间应用，或者两次给予在时间上是重叠的。在具体的非限制性实施方式中，将如本文所公开的放射性标记的VHH序列或其功能性片段或包含如本文所公开的放射性标记的VHH序列的多肽与一种或多种治疗性抗体或治疗性抗体片段一起应用。因此，在这些具体的非限制性实施方式中，将使用如本文所公开的放射性标记的VHH序列或其功能性片段或包含如本文所公开的放射性标记的VHH序列或其功能性片段的多肽的放射免疫疗法与使用一种或多种治疗性抗体或治疗性抗体片段的常规免疫疗法组合。在其他具体实施方式中，将如本文所公开的放射性标记的VHH序列或其功能性片段或包含这些放射性标记的VHH序列的多肽在使用一种或多种治疗性抗体或治疗性抗体片段的组合疗法或组合治疗方法中使用，如但不限于使用曲妥珠单抗和/或帕妥珠单抗的组合治疗。例如，可以将如本文所公开的放射性标记的VHH序列或其功能性片段或包含所述放射性标记的VHH序列的多肽与一种或多种治疗性抗体或治疗性抗体片段，如但不限于曲妥珠单抗和/或帕妥珠单抗同时输注，或者所述输注在时间上可以重叠。如果同时给予两种药物，则可以将它们在一个单一药物制剂中配制在一起，或者可以在从两个不同的药物制剂中给予前立即将它们混合在一起，例如，通过将它们溶解或稀释在一个单一输注溶液中。在另一个实施方式中，单独给予两种药物，即作为两个单独的药物组合物。在一个优选的实施方式中，两种治疗的给予处于患者体内的肿瘤细胞同时暴露于有效量的细胞毒性药物和辐射的方式。在另一个优选的实施方式中，如本文所公开的放射性标记的VHH序列或其功能性片段或包含放射性标记的VHH序列或其功能性片段的多肽和一种或多种治疗性抗体或治疗性抗体片段，如但不限于曲妥珠单抗和/或帕妥珠单抗的有效量同时存在于肿瘤位点。本发明还涵盖了其他试剂的使用，除所定义的组合之外给予所述其他试剂。这还可以是例如一种或多种其他化疗剂。它还可以是应用以预防、抑制或改善任何另一种给予药物不希望的副作用的一种或多种试剂。例如，可以应用刺激白细胞增殖的细胞因子以改善白血球减少症或嗜中性白血球减少症的影响。根据其他方面，提供了特异性结合至感兴趣的肿瘤特异性或癌细胞特异性靶标分子的如本文所设想的VHH序列或其功能性片段或多肽用于制备用于预防和/或治疗至少一种癌症相关疾病和/或病症的药剂的应用，所述至少一种癌症相关疾病和/或病症涉及所述肿瘤特异性或癌细胞特异性靶标分子。因此，本发明申请提供了特异性结合至肿瘤特异性或癌细胞特异性靶标，如但不限于HER2的VHH序列或其功能性片段、多肽和药物组合物，用于在预防和/或治疗至少一种其中涉及所述肿瘤特异性或癌细胞特异性靶标的癌症相关疾病和/或病症中使用。在具体的实施方式中，还提供了用于预防和/或治疗至少一种癌症相关疾病和/或病症的方法，其包括向需要其的受试者给予药物活性量的一种或多种如本文所设想的VHH序列或其功能性片段、多肽和/或药物组合物。用本文所描述的多肽治疗的受试者或患者可以是任何患有癌症相关疾病和/或病症或具有癌症相关疾病和/或病症的患病风险的温血动物，但特别是是哺乳动物，并且更特别是是人类。取决于所涉及的具体疾病或病症，可以使用任何本身已知的适合的体外测定、基于细胞的测定、体内测定和/或动物模型或它们的任何组合测试本文所描述的VHH序列或其功能性片段和多肽以及包含它们的组合物的效力。适合的测定和动物模型将对技术人员是清楚的。取决于所涉及的肿瘤特异性或癌细胞特异性靶标，技术人员通常能够选择适合的体外测定、细胞测定或动物模型来测试本文所描述的VHH序列或其功能性片段和多肽对肿瘤特异性或癌细胞特异性的结合；以及它们对于一种或多种癌症相关疾病和病症的治疗和/或预防效果。因此，提供了包含至少一种放射性标记的VHH序列或其功能性片段的多肽或基本由至少一种放射性标记的VHH序列或其功能性片段组成的多肽作为药剂使用，并且更特别是在用于癌症相关疾病或病症治疗，并且具有地实体瘤的预防和/或治疗的方法中使用。在具体的实施方式中，将本文设想的VHH序列或其功能性片段和多肽用于治疗和/或预防癌症和肿瘤病况。癌症或肿瘤病况的实例包括但不限于纤维肉瘤、肌肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、胃癌、食道癌、直肠癌、胰癌、卵巢癌、前列腺癌、子宫癌、头颈癌、皮肤癌、脑癌、鳞状细胞癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝脏癌、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎癌、胚胎性癌肉瘤、宫颈癌、睾丸癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、寡枝神经胶质细胞瘤、脑膜瘤、黑素瘤、成神经细胞瘤、成视网膜细胞瘤、白血病、淋巴瘤或卡波西肉瘤。如本文所设想的VHH序列和多肽还可以用于治疗多种增殖性病症。增殖性病症的实例包括造血组织肿瘤病症和细胞增殖和/或分化性病症，如但不限于：上皮细胞增生、硬化性腺病和小管乳头状瘤；肿瘤，例如，基质肿瘤如纤维腺瘤、叶状肿瘤和肉瘤，和上皮细胞瘤如大管乳头状瘤；乳癌，其包括原位(非扩散)癌，其包括原位导管癌(包括佩吉特氏病)和小叶原位癌，和侵袭性(浸润性)癌，其包括但不限于侵袭性导管癌、侵袭性小叶癌、髓样癌、胶质(粘液性)癌、小管癌和侵袭性乳头状癌、其他(杂项，miscellaneous)恶性肿瘤、男性乳癌、支气管癌，包括副肿瘤综合征、细支气管肺泡癌、神经内分泌瘤，如支气管类癌、其他肿瘤和转移性瘤；胸膜病理，包括炎症性胸膜积液、非炎症性胸膜积液、气胸和胸膜肿瘤，包括孤立性纤维性肿瘤(胸膜纤维瘤)、恶性间皮瘤、非肿瘤息肉、腺瘤、家族性综合征、结肠直肠癌发生、结肠直肠癌、类癌瘤、结节性增生、腺瘤和恶性肿瘤，包括原发肝脏癌和转移性瘤，体腔上皮肿瘤、血清肿瘤、粘液性肿瘤、子宫内膜样肿瘤、透明细胞腺癌、囊腺纤维瘤、布伦纳氏瘤、表面上皮细胞瘤；生殖细胞肿瘤，如成熟(良性)畸胎瘤、单胚层畸胎瘤、不成熟恶性畸胎瘤、无性细胞瘤、内胚窦瘤、绒毛膜癌；性索间质肿瘤，如粒层泡膜细胞瘤、泡膜细胞瘤纤维瘤(thecomafibromas)、男性母细胞瘤(androblastomas)、希尔细胞瘤(hillcelltumors)和性腺胚细胞瘤；和转移性瘤，如卵巢克鲁根勃氏瘤。附图说明现将通过以下非限制性实施例和附图进一步描述上述公开，其中附图显示：图1：在注射了加His标签的[131I]SGMIB标记的二价抗HER2VHH2Rb17c后，在自动γ粒子计数器中对感兴趣的不同组织进行131I活性计数。摄取值表示为％注射的活性/克组织(％IA/g)。从左至右显示了注射后3h、24h和72h时的摄取值。所获得的数据用于计算肿瘤与健康组织的比值。使用1h的膀胱排尿间隔，使用OLINDA1.0软件，由小鼠的生物分布数据计算成年人类女性的辐射剂量估值。基于时间-活性曲线进行计算以确定器官中衰变的数目。对各个器官使用适当的权重因子计算器官剂量和有效剂量。图2：在注射加His标签的[131I]SGMIB标记的单价抗HER2VHH2Rb17c后，在自动γ粒子计数器中对感兴趣的不同组织进行131I活性计数。摄取值表示为％注射的活性/克组织(％IA/g)。从左至右显示了注射后3h、24h和72h时的摄取值。所获得的数据用于计算肿瘤与健康组织的比值。使用1h的膀胱排尿间隔，使用OLINDA1.0软件，根据小鼠生物分布数据计算成年女性的辐射剂量估值。基于时间-活性曲线进行计算以确定器官中衰变的数目。对各个器官使用适当的权重因子计算器官剂量和有效剂量。图3：在注射了加His标签的[131I]SGMIB标记的单价抗HER2VHH2Rs15d后，在自动γ粒子计数器中对感兴趣的不同组织进行131I活性计数。摄取值表示为％注射的活性/克组织(％IA/g)。从左至右显示了注射后3h、24h和72h时的摄取值。所获得的数据用于计算肿瘤与健康组织的比值。使用1h的膀胱排尿间隔，使用OLINDA1.0软件，根据小鼠生物分布数据计算成年女性的辐射剂量估值。基于时间-活性曲线进行计算以确定器官中衰变的数目。对各个器官使用适当的权重因子计算器官剂量和有效剂量。图4：全身成像和99mTc标记的VHH的生物分布。在未治疗过的(天然，naive)小鼠(a，e)、5T33MM(b，f)或5T2MM小鼠(c，g)中，注射(p.i.)99mTc-cAbBCII10(a-c)或99mTc-R3B23(e-g)后1h，融合的SPECT/微型-CT扫描图像的矢状位图。示出每组的一个代表性图。使用国立卫生研究院的色标，并且相对于图中最大活性，将所有的图同比缩小至25％，并对注射活性进行修正。在p.i1.5h时，天然的、5T33MM和5T2MM患病小鼠中99mTc-cAbBCII10(d)和99mTc-R3B23(h)的摄取值。放射活性的量表示为对衰变修正的每克组织或器官的百分比注射活性(％IA/g)。图5：使用177镥-结合的R3B23VHH对5T2MM小鼠的预防性治疗。(a)使用177Lu-R3B23(n＝6)、177Lu-cAbBcII10(n＝6)或盐水溶液(未处理的；n＝3)治疗5周的5T2MM小鼠的融合SPECT/微型-CT扫描图像的矢状位图。出于成像的目的，对所有小鼠注射99mTc-R3B23VHH，并在注射后1h采集SPECT/微型-CT扫描图。使用国立卫生研究院的色标，并且相对于图中最大活性，将所有的图同比缩小至20％。示出每组的一个代表性图。(b)使用177Lu-R3B23治疗5周后，心脏中99mTc-R3B23示踪剂摄取的相对量。(c)使用177Lu-R3B23治疗7周后的脾脏重量。*P<0.05；**P<0.005；***P<0.0005；n.s.，不显著。图6：VHHR2A6、R2A57、R3B23和R3B41结合5T2MM独特型上临近的、极大重叠的表位。(A)如通过表面等离子共振测量所确定的，VHH之间对结合至固定的5T2MM独特型的代表性竞争研究。在每幅图中，显示了等摩尔浓度(各1mM)的两个VHH之间的竞争。当第一阶段中1个VHH的饱和结合阻断了第二阶段中竞争VHH的结合时，两个VHH竞争5T2MMid上相同的表位。(B)4个研究的VHH在5T2MMid抗原的重叠表位上结合的建议模型。图7：VHHR2A6、R2A57、R3B23和R3B41对5T2MMid的特异性识别。带有His标签和HA标签的纯化的VHH在固定化的5T2MMid、5T33MMid、小鼠总IgG或空白孔上的ELISA。使用HRP偶联的抗HA第二抗体检测结合的VHH。结果表示为三次独立实验的平均值的平均值±标准误差。图8：VHHR2A6、R2A57、R3B23和R3B41的结合亲和力测量。(A)固定化的5T2MM独特型上纯化的VHH的表面等离子共振(SPR)感应图。每幅感应图代表从500至1.95nM的2倍稀释系列的第一阶段结合，然后是第二阶段从抗原的解离。(B)根据用两阶段结合模型拟合的曲线，通过SPR在固定化的5T2MM独特型上的计算结合速率常数ka1和ka2，解离速率常数kd1和kd2以及平衡解离常数KD。图9：5T2MM细胞上纯化的加HA标签的VHH的流式细胞术分析。用对照VHHcAbBcII10、抗5T2MMidVHH或抗5T2MMid抗体培育离体5T2MM细胞。通过抗HA抗体和抗IgG1APC抗体检测VHH结合。通过抗IgGAPC直接检测抗5T2MMid抗体。示出针对每个VHH的一个代表性谱图(n＝3)。用抗5T2MMidMoAb膜染色显示对于5T2MMid，总群体的66.8％为阳性。当与使用抗5T2MMidMoAb的染色相比，VHHR2A6、R2A57和R3B41能够(分别)检测85.2％、28.7％和24.1％的5T2MMid阳性群体。VHHR3B23检测了98.7％的5T2MMid阳性群体，而对照VHHcAbBcII10不染色这些细胞。图10：使用99mTc标记的R3B23VHH监测疾病发展。在用5T2MM肿瘤细胞接种后0、6、9和12周扫描的小鼠的融合SPECT/微型-CT扫描的矢状位图。作为非侵入性测量示踪剂血液水平的间接方法，我们定量了心脏中ROI中的％IA/cm3。使用NIH色标，并且相对于图中最大活性，将所有的图同比缩小至75％，并对注射活性进行修正。从5T2MM细胞接种后6周开始，我们能够定量血液中示踪剂摄取(0.83±0.06％)，并且该值在第9周升高(0.99±0.04％)并在12周保持恒定(0.99±0.02％)。在未治疗过的(天然，)小鼠中，血液混合(血池，blood-pool)水平极低(0.0146±0.0004％)。示出一个代表性的随访研究(n＝5)。图11：多个未加标签的2Rs15d结合物的(放射)色谱分析。(A)非结合的VHH、(B)CHX-A”-DTP-2Rs15d、(C)1B4M-DTPA-2Rs15d、(D)177Lu-DTPA-2Rs15d、(E)111In-DTPA-2Rs15d；(A-C)Superdex10/30上的SEC、(D)Superdex755/150GL上的放射-SEC、(E)PLRP-S上的放射HPLC。每幅图中示出主要峰的R时间。图12：在健康Wistar大鼠中注射多种111In标记的2Rs15d形式后，作为时间函数的肾中放射性的积累(n＝3)；(A-D)示出通过γ相机动态闪烁显像获得的图像选择；(A)2Rs15d-Myc-His标签、(B)2Rs15d-His标签、(C)未加标签的2Rs15d、(D)与80mg/kg鱼精蛋白(Gelofusin)共输注的未加标签的2Rs15d。(E)大鼠中肾保留的时间-活性曲线(每个条件n＝3)。对于和150mg/kg鱼精蛋白共输注的111In标记的未加标签的2Rs15d，观察到肾中最低的积累。图13：p.i1h时，HER2pos肿瘤异种移植小鼠中177Lu标记的2Rs15d构建体的离体生物分布分析。用21.5MBq(4μg)放射性结合物注射动物。柱，平均值(n＝3)；条线，SD。通过移除C末端氨基酸标签并且通过与鱼精蛋白共输注，肾积累显著降低。肿瘤靶标不受影响。图14：靶向放射性核素疗法期间，肿瘤生长的监测。使用(A)生物发光成像(ph/s/cm2/sr)或(B)卡尺测量(mm3)，作为时间(天)的函数定量肿瘤体积。用未加标签的177Lu标记的2Rs15d(20.7±0.4MBq)每周注射并且在对照组中用PBS或177Lu标记的BCII10(19.3±0.8MBq)治疗动物(每组n＝8)。与150mg/kg鱼精蛋白共注射一起进行所有治疗。就肿瘤生长而言，对于卡尺和生物发光测量两者来说，在对照组和治疗组之间观察到重要区别。图15：(A)靶向放射性核素疗法期间无事件的存活。事件定义为：1.死亡；2.>20％体重减轻；3.肿瘤组织溃烂；4.肿瘤体积>250mm3。用未加标签的177Lu标记的2Rs15d(20.7±0.4MBq)每周注射并且在对照组中用PBS或177Lu标记的BCII10(19.3±0.8MBq)治疗动物(每组n＝8)。与150mg/kg鱼精蛋白共注射一起进行所有治疗。(B)肾组织病理学。将177Lu-剂量给予动物组的肾与PBS-治疗动物组相比较。对切片进行H&E染色，并检查肾毒性的迹象。在接受(B.1)PBS、(B.2)未加标签的177Lu标记的BCII10或(B.3)未加标签的177Lu标记的2Rs15d的动物组之间观察肾组织学方面无差异。图16：(A)未加标签的2Rs15d、(B)未加标签的CHX-A”-DTPA-2Rs15d和(C)未加标签的1B4M-DTPA-2Rs15d的ESI-Q-ToF-MS分析。CHX-A”-DTPA与未加标签的2Rs15d的反应示出结合至未加标签的2Rs15d的1、2和3个DTPA的混合物。使用1B4M-DTPA，观察到结合至2Rs15d的2和3个DTPA的混合物。1B4M-DTPA和CHX-A”-DTPA两者与未加标签的2Rs15d的主要结合比(螯合剂:VHH)是2:1。图17：曲妥珠单抗结合物的(放射)色谱分析。(A)非结合曲妥珠单抗、(B)1B4M-DTPA-曲妥珠单抗、(C)177Lu-DTPA-曲妥珠单抗；(A，B)Superdex7510/30上的SEC、(B)Superdex755/150GL上的放射-SEC；每幅图中示出主要峰的R时间。图18：注射111In标记的抗HER2VHH后，通过γ相机动态闪烁显像在健康Wistar大鼠中作为时间的函数的肾中放射性的积累(每个条件n＝3)。(A)VHH2Rb17c、(B)VHH1R136d。图19：雄性C57bl/6小鼠中未加标签的单价[131I]SGMIB标记的抗HER2VHH2Rs15d的血液清除。值表示为％注射活性/总血体积(％IA/TBV)。图20：未加标签的单价[131I]SGMIB标记的抗HER2VHH2Rs15d的治疗效果。用未加标签的单价[131I]SGMIB标记的抗HER2VHH2Rs15d(131I-SGMIB-2Rs15dnb)每周注射和在对照组中用媒介物溶液(媒介物溶液)或未加标签的单价[131I]SGMIB标记的非靶标对照VHH(131I-SGMIB-非靶向nb)治疗动物(每组n＝6/7)。当体重减轻大于20％或者肿瘤体积大于1cm3时，将动物安乐死。示出不同组中动物的存活。以下非限制性实施例描述了根据本发明的方法和方式。除非在实施例中另有说明，否则所有技术根据本领域中的方案标准进行。包括了下列实施例以描述本发明的实施方式。根据本发明公开，本领域技术人员应理解可以在不背离本发明的概念、精神和范围的情况下在所公开的具体实施方式中做出多种改变并仍获得类似或相似的结果。更特别是，显而易见的是可以用化学和生理学相关的某些试剂替代本文所描述的试剂并同时实现相同或相似的结果。对于本领域技术人员显而易见的所有这些相似的替代和改变被视为包含在如所附权利要求所定义的本发明的精神、范围和概念之内。因此，仅提供附图、序列表和实验部分/实施例以进一步描述本发明，并且除非在本文中明确说明，否则不应将其理解为或视为以任何方式对本发明和/或所附权利要求范围的限制。实施例实施例1：抗HER2VHH的放射性标记1.131-碘的实验设置放射化学程序如下所示进行用于放射碘化VHH的规定程序：将必需量的[I*]碘化钠转移至均溶于氯仿的3％(v/v)乙酸、30％(v/v)叔丁基化过氧氢和N-琥珀酰亚胺基4-[N1,N2-双(叔丁氧羰基)胍基甲基]-3-(三甲基甲锡烷基)苯甲酸酯(4-[N1,N2-双(叔丁氧羰基)胍基甲基]-3-(三甲基甲锡烷基)苯甲酸N-琥珀酰亚胺基酯，N-succinimidyl4-[N1,N2-bis(tert-butyloxycarbonyl)guanodinomethyl]-3-(trimethylstannyl)benzoate)的混合物中。在搅拌的同时，将混合物在室温下培育50分钟。随后，使用乙酸乙酯/己烷梯度，在正相HPLC上纯化[I*]SGMIB-BisBoc。在室温下用三氟乙酸培育15分钟后实现脱保护。最后，在室温下在20min期间，将脱保护的[I*]SGMIB与100μg的抗HER2VHH序列在pH8.5的硼酸盐缓冲液中反应。在PBS中平衡的PD-10柱上纯化加His标签的[131I]SGMIB-二价(2Rb17c-2Rb17c)、加His标签的[131I]SGMIB-单价(2Rb17c)和加His标签的[131I]SGMIB-单价(2Rs15d)VHH。质量控制通过使用浸渍的硅胶带的玻璃微纤维片(Varian,LakeForest,CA,USA)，用pH7.4的PBS运行(run)的快速薄层层析(iTLC)进行质量控制。同时，使用聚苯乙烯-二乙烯基苯共聚物反相柱(PLRP-S5μm,250/4mm,Agilent,Diegem,Belgium)进行分析放射HPLC。在以下方案中使用0.1％TFA的水溶液和乙腈溶液的混合物：0-5min，25％乙腈；5-7min，25-34％乙腈；7-10min，75-100％乙腈；10-25min100％乙腈，流速1mL/min。实施例2：肿瘤HER2+异种移植小鼠中放射性标记的抗HER2VHH的生物分布和剂量测定在植入肿瘤前2天，在10-12周龄的雌性Balbcnu/nu无胸腺小鼠背部植入60天连续释放的17-β-雌二醇颗粒(0.72mg,InnovativeResearchofAmerica:Sarasota,FL,USA)。将50％Martigel(BDBiosciences,Bedford,MA,USA)中的HER2+/荧光素酶+肿瘤细胞(5×106)皮下注射到右胁(rightflank)并使其生长直至达到350-500mm3的体积。在静脉内注射加His标签的[131I]SGMIB标记的抗HER2VHH二价2Rb17c(图1；表3)、加His标签的[131I]SGMIB标记的单价2Rb17c(图2；表4)和加His标签的[131I]SGMIB标记的单价2Rs15d(图3；表5)后，通过过量给予异氟烷杀死异种移植小鼠，并在注射后3、24和72h解剖，然后除去感兴趣的组织、称重并在自动γ粒子计数器中对131I活性计数。摄取值表示为％注射的活性/克组织(％IA/g)。在注射加His标签的[131I]SGMIB标记的抗HER2VHH后，除去感兴趣的组织、称重并在自动γ粒子计数器中对131I活性计数。将所获得的数据(表示为％IA/g)用于计算相应肿瘤与健康组织的比值(表6)。表3表4表5表6实现了极高的比值，突出显示在健康组织中极低的吸收并因此具有低毒性。到目前为止，尚未对其他放射性免疫生物剂发表过如使用131碘-SGMIB标记的加His标签的VHH所观察到的这种延长的比值。由于用同位素如99mTc、68Ga或甚至131I放射性标记的VHH的其他形式通常产生在肾中保留的极高的％IA/g组织，非常出乎意料的是当使用SGMIB用131I标记时，肾中对于加His标签的2Rs15d或者2Rb17c检测到极低的摄取值。这些肾摄取值甚至比最近对被称为5F7GGC的另一种靶向HER2的VHH所报道的还要低(Pruszynski等人,J.Nucl.Med.；2014；Apr；55(4):650-6.；DOI:10.2967/jnumed.113.127100)。因此，使用如上述文稿中所述的用于计算肾辐射吸收剂量的相同方法并且基于注射后3h和24h获得的％IA/g组织值，分别对131I-SGMIB标记的加His标签的单价2Rs15d或2Rb17cVHH获得了1055cGy/mCi或586cGy/mCi的值，基于来自上述文稿的生物分布数据，其小于对5F7GGC所获得的值。作为计算各个身体组织中吸收辐射剂量的另一种方法，使用1h的膀胱排尿间隔，使用OLINDA1.0软件，根据小鼠生物分布数据计算成年女性的平均有效剂量估值(小鼠数据外推为人预测值)。这些计算获得了加His标签的[131I]SGMIB标记的抗HER2VHH单价2Rs15d、加His标签的[131I]SGMIB标记的单价2Rb17c和加His标签的[131I]SGMIB标记的二价2Rb17c的平均有效剂量估值，其分别为0.031±0.00040mSv/MBq、0.032±0.00081mSv/MBq和0.032±0.00026mSv/MBq(值表示为平均值±SD)。实施例3：使用抗独特型VHH的多发性骨髓瘤的成像和放射免疫疗法多发性骨髓瘤(MM)的特征在于骨髓(BM)中恶性浆细胞的单克隆扩增以及单克隆蛋白(M-蛋白)的产生。随着自体同源干细胞移植的实施以及使用地塞米松、硼替佐米、沙利度胺和来那度胺的高剂量化疗，存活率得到改善，但是MM患者仍会复发，即使他们实现了完全缓解(CR)。因此，需要新的治疗策略来靶向残余的恶性细胞并消除最小的残余疾病(MRD)以改善患者结局。本发明中，我们利用存在于鼠科5T2MM模型中的M-蛋白证明了VHH在MM中的潜在应用。5TMM模型是同系、免疫活性模型，其在临床和生物学上与人MM类似。5T33MM和5T2MM模型是表征得最好的。前者代表了侵袭性肿瘤，其在短期(4周)内发展，而后者代表在3个月的一段时间内发展的更缓和的肿瘤。两者在细胞膜表面上表达不同的独特型(分别为5T33MMid和5T2MMid)。通过用纯化的5T2MMM-蛋白免疫单峰驼并通过单一选择法，我们能够选择、产生并纯化一组识别独特型上附近表位的非常特异性的抗5T2MM-独特型VHH(α5T2MMid-Nb)。对体外表征这些VHH后，R3B23成为最好的结合剂(参见图7、图8和图9)，并因此选择它用于体内试验。使用以上建立的方案，用放射性核素99m锝(99mTc)和177镥(177Lu)标记R3B23。对于核医学成像技术，在SPECT中使用99mTc(半衰期：6h)，而由于发射低能β-负粒子而将177Lu(半衰期：6.7天)主要用于治疗应用。首先，我们研究了R3B23的体内特异性。注射(p.i.)后1h，如上所述使用针孔SPECT和微型-CT对麻醉小鼠成像。成像后30min，将小鼠杀死，除去不同的器官、称重并测量放射性。使用非靶向性对照VHH99mTc-cAbBCII10获自未处理过的小鼠的融合SPECT/微型-CT图像显示示踪剂仅在膀胱和肾中吸收(图4a)。对于通过肾过滤排出体外的未结合的示踪剂，如所期望的，生物分布实验(图4d)确认了在两侧肾中的高示踪剂摄取(>200％IA/g)并且在其他器官中仅小量水平的吸收(从肌肉组织中的0.20±0.04％IA/g到肺中的1.02±0.26％IA/g)。重要地，在注射99mTc-R3B23的未处理过的小鼠中观察到了类似的结果(图4e和图4h)，这表明R3B23不结合至循环免疫球蛋白或其他体内靶标。注射99mTc-cAbBCII10(图4b和图4d)或者99mTc-R3B23(图4f和图4h)的患晚期疾病的5T33MM小鼠和注射99mTc-cAbBcII10(图4c和图4d)的5T2MM小鼠的SPECT/微型-CT扫描图像和生物分布研究示出类似的类型，其中肾和膀胱中示踪剂摄取较高而所有其他器官中摄取较低，这表明MM疾病不影响VHH摄取。注射99mTc-R3B23的5T2MM小鼠的SPECT/微型-CT扫描图像(图4g)示出全身示踪剂摄取，其通过生物分布研究确认(图4h)。血液中多至100倍升高的示踪剂水平(44.56±2.54％IA/g)可以归因于抗独特型VHH与晚期疾病模型中高水平的循环M-蛋白的结合。升高的示踪剂血池活性说明了肾中观察到的摄取的降低(大约8％IA/g)并且导致其他器官中升高的摄取(范围为从肌肉中的0.91±0.04％IA/g至肺中的11.63±2.35％IA/g)。值得注意的是可以通过使用99mTc-R3B23的SPECT/微型-CT扫描监测循环M-蛋白随时间的体内升高(图10)。总之，生物分布研究证明R3B23不结合至健康小鼠中的任何靶标或具有不同独特型的M-蛋白，并因此它是真正抗独特型的。最后，我们评价了与177镥结合的VHHR3B23(177Lu-R3B23)对肿瘤生长的影响。在向未处理过的小鼠接种5T2MM细胞后1周，我们开始了通过静脉给予177Lu-R3B23或阴性对照177Lu-cAbBCII10的每周治疗。治疗5周后，通过使用99mTc-R3B23的SPECT/微型-CT扫描对动物成像(图5)。根据微型-CT图像，围绕心脏画出感兴趣的椭圆体区。作为血池活性的度量，心脏中示踪剂的摄取被表示为组织中的计数除以注射的活性/立方厘米(％IA/cm3)。在用177Lu-R3B23处理的小鼠心脏中检测的％IA/cm3(5.55±1.42)显著低于未处理小鼠中(10.03±0.27；P<0.005)和用对照VHH177Lu-cAbBcII10处理的小鼠中测量的值(9.19±0.84；P<0.05)。用177Lu-R3B23处理的小鼠中较低的血液99mTc-R3B23摄取值不是由于和治疗剂177Lu标记的VHH的体内竞争造成的，这是由于后者已被全身清除。的确，在用10μg177Lu-VHH注射后5天，实施10μg99mTc-R3B23注射和后续SPECT/微型-CT扫描。此外，在该时间点，尽管177Lu的物理半衰期较长，但在任何组中在SPECT177Lu-通道中不能检测到信号(图5)。治疗7周后，杀死小鼠并通过毛细管电泳测量血清M-蛋白和确定May-GrünwaldGiemsa-染色的BM细胞涂片上的浆细胞增多来评价肿瘤负荷。在未处理的小鼠中，可以检测恶性浆细胞(<10％)和循环M-蛋白(0.06-0.16g/dl之间)的边界量，但是在另外两个组中未能获得可测量的值(数据未显示)。然而，这表明通过VHH的SPECT/微型-CT扫描对M-蛋白的早期检测比毛细管电泳更灵敏。在小鼠中，脾脏肿大是MM-疾病的标志之一。明显地，我们观察到与用177Lu-cAbBCII10处理的(0.19±0.01g；P<0.005)和未处理的小鼠(0.21±0.01g；P<0.0005)相比，在用177Lu-R3B23处理的小鼠中显著较低的脾脏重量(0.06±0.02g)。在未处理的组和177Lu-cAbBCII10组之间未观察到显著性差异。这些结果表明在177Lu-R3B23处理的小鼠中所观察到的影响是由于5T2MM细胞的选择性靶向造成的。总之，我们在本文中作为原理的证据证明有可能产生针对在MM中非常特异的肿瘤标志物的VHH并将它们用于通过ELISA和流式细胞术体外检测5T2MMid。此外，与放射性核素结合的VHH能够监测体内疾病发展并在MRD样设置中靶向MM细胞，由此提供VHH在MM的新型诊断和治疗技术发展中的应用的进一步的证据。实施例4：使用177Lu标记的抗HER2VHH的靶向放射性核素疗法在该研究中，我们关注使用治疗性放射性核素177Lu(T1/2＝6.72天，<Eβ>＝133keV)的HER2pos异种移植肿瘤的基于VHH的靶向放射性核素疗法。1.材料和方法a)细胞系和培养条件人卵巢癌细胞系SKOV3(HER2pos)获自美国典型培养物保藏中心(ATCC,Manassas,VA,USA)。通过用编码荧光素酶的慢病毒颗粒转染SKOV3细胞内部制备SKOV3-LUC(HER2pos/荧光素酶pos)。使用麦考伊氏(McCoy's)5A培养基培养SKOV3细胞，SKOV3-LUC在DMEM培养基中。两种培养基都富含10％胎牛血清、L-谷氨酰胺(2mM)、100U/mL青霉素和0.1mg/mL链霉素。细胞在具有5％CO2的加湿气氛中，在37℃生长。在出于体外和体内目的使用前，使用胰蛋白酶-EDTA将细胞剥离。所有培养基和补充物获自LifeTechnologies(Paisley,UK)。b)VHH的生产和纯化使用3种类型的C末端氨基酸标签：未加标签的(VHH)、His标签(VHH-HHHHHH(SEQIDNO:9))和Myc-His标签(VHH-AAAEQKLISEEDLNGAA-HHHHHH(SEQIDNO:10))产生抗HER2VHH2Rs15d、2Rb17c和1R136b。在细菌中表达VHH并纯化。简要地，将序列亚克隆到含有His标签(pHEN6)、Myc-His标签(pHEN18)或缺少任何标签(pHEN21)的表达载体中。将重组载体转化到大肠杆菌(E.coli)WK6细胞中用于VHH表达并提取胞质蛋白质。在His选择性镍亲和凝胶(GEHealthcare)上，通过亲和色谱法进一步纯化加His标签和加Myc-His标签的VHH。在蛋白ASepharose珠(GEHealthcare)上纯化识别细菌酶的未加标签的对照VHHBcII10以及两个未加标签的2Rb17c和1R136b。使用Superdex7516/60柱(GEHealthcare)，在PBS中通过尺寸-排阻色谱法进行所有VHH的最后纯化。在Superdex7510/30(GEHealthcare)上，在PBS中，以0.5mL/min的流速使用SEC评价蛋白质的纯度和完整性。另外，以正离子模式进行ESI-Q-ToF-MS(Waters,Micromass)。c)VHH序列分析使用Zimmerman极性得分图估计C末端变化对VHH极性的影响。简言之，基于侧链的偶极矩，对VHH序列中的氨基酸给予极性指数值。然后，用GraphpadPrism对这些值作图。d)1B4M-DTPA和CHX-A″-DTPA与VHH的结合在RT，将10倍摩尔过量的双官能螯合剂1B4M-DTPA(用于177Lu)或者CHX-A″-DTPA(用于111In)与600μL的0.05M的碳酸钠缓冲液(pH8.5)中的VHH中的赖氨酸的游离ε-氨基结合3h。通过将混合物的pH降低至7.0使结合反应淬灭。在Superdex7510/30(GEHealthcare)上，在0.1M乙酸铵缓冲液(pH7.0)中纯化VHH-螯合剂。以正离子模式，使用ESI-Q-ToF-MS(Waters,Micromass)评价平均结合程度。e)111In-和177Lu-DTPA-VHH的制备如前所述用177Lu标记VHH(20)。无载体的177Lu作为氯化物溶液获自ITG(Garching,Germany)，其比活力为3000GBq/mg。类似地进行111In的放射性同位素标记。111InCl3购自Mallinckrodt(Petten,TheNetherlands)，其比活力为1850GBq/mg。将必需量的177Lu/111In加入至含有无金属的0.1M乙酸铵缓冲液(pH5.0)的测试小瓶中以达到200μL的最终体积。然后，加入25-100μg的VHH-DTPA(1mg/mL)并在RT培育30min。在一次性Nap-5凝胶过滤柱(GEHealthcare)上纯化放射性标记的VHH溶液并将其推动通过0.22μm过滤器。以0.2M柠檬酸作为流动相使用iTLC并使用分析性放射-HPLC或放射-SEC评价放射化学纯度。使用聚苯乙烯-二乙烯基苯共聚物反相柱(PLRP-S300,5μm,250/4mm,Agilent,Diegem,Belgium)进行放射-HPLC。在本发明中，通过以下梯度，将0.1％TFA的H2O溶液和ACN溶液的混合物用作洗脱液：0-5min，25％ACN；5-7min，25-34％ACN；7-10min，75-100％ACN；10-25min100％ACN，流速1mL/min。在Superdex755/150GL上使用PBS作为流动相，以0.3mL/min的流速进行放射-SEC。用于动态平面闪烁扫描术研究的未加标签的111In-DTPA-2Rs15d由7:1比值的VHH:111In组成。对于使用未加标签的177Lu-DTPA-2Rs15d的离体生物分布实验，实现了9:1(VHH:177Lu)的比值，而对于靶向放射性核素疗法，使用了具有3:1的比值的VHH:177Lu的未加标签的177Lu-DTPA-2Rs15d的样品。f)177Lu-DTPA-曲妥珠单抗的制备实施1B4M-DTPA与曲妥珠单抗的结合以获得5:1的DTPA:曲妥珠单抗比值。简要地，在RT，将100倍摩尔过量的双官能螯合剂1B4M-DTPA与3500μL的0.05M的碳酸钠缓冲液(pH8.5)中的曲妥珠单抗(Hoffman-LaRoche,Missis-sauga,ON,USA)中的赖氨酸的游离ε-氨基结合过夜。通过将pH降低至7.0使反应淬灭。在Superdex7510/30(GEHealthcare)上，在0.1M乙酸铵缓冲液(pH7.0)中纯化DTPA-曲妥珠单抗。以正离子模式，使用ESI-Q-ToF-MS(Waters,Micromass)评价结合程度。将必需量的177Lu加入至含有无金属的0.1M乙酸铵缓冲液(pH5.0)的测试小瓶中以达到200μL的最终体积。然后，加入100-250μgDTPA-曲妥珠单抗(2.4mg/mL)并在RT培育30min。在一次性Nap-5凝胶过滤柱(GEHealthcare)上纯化177Lu-DTPA-曲妥珠单抗并将其推动通过0.22μm过滤器。如上所述，使用iTLC和放射-SEC评价放射化学纯度。g)动物研究在动态平面闪烁扫描术研究中使用健康雄性Wistar大鼠(255±53g体重)。在2.5％异氟烷麻醉(Abbott,Ottignies-Louvain-la-Neuve，Belgium)下，对雌性无胸腺裸鼠(20±5g体重)在右后腿s.c.接种8×106个在PBS中的SKOV3细胞。出于生物分布的目的，肿瘤达到205±68mm3的尺寸。通过用3×106个SKOV3-LUC细胞对雌性无胸腺小鼠在右后腿接种获得了SKOV3-LUC异种移植。出于靶向放射疗法的目的，肿瘤生长至达到26±5mm3。VrijeUniversiteitBrussel伦理委员会批准了动物方案。h)111In-DTPA-VHH在健康Wistar大鼠中的肾保留在i.v.注射111In-DTPA-VHH(35.8±5.4MBq)之前，通过i.p.注射250μL戊巴比妥使Wistar大鼠(n＝3)麻醉。在单独的组中，与80mg/kg鱼精蛋白(40g/l,BraunMedical,Diegem,Belgium)平行另外共注射111In-DTPA-未加标签的VHH。为了记录放射性标记的VHH的快速体内动力学，注射后立即进行动态平面成像(30s100帧)。使用AMIDE医学成像数据检查(AMIDEMedicalImageDataExaminer)软件产生肾的时间-活性曲线。围绕整个身体和肾画出ROI以相对于注射的总活性计算肾中保留的放射性(％IA)。i)177Lu-DTPA-VHH的体内肿瘤靶向用每种177Lu-DTPA-2Rs15dVHH形式(21.5±1.7MBq)i.v.注射带有SKOV3肿瘤的小鼠(n＝3)。在单独的组中，与150mg/kg鱼精蛋白共注射177Lu-DTPA-未加标签的2Rs15d。在p.i.1h，将小鼠安乐死并解剖，将组织称重并用自动γ粒子计数器(CobraInspector5003,CanberraPackard,USA)对放射性计数。将存在于不同组织中的放射性的量表示为％IA/g组织。j)相对于177Lu-DTPA-曲妥珠单抗，单剂量177Lu-DTPA-未加标签的2Rs15d和鱼精蛋白的比较剂量测定计算用14.7±1.3MBq的177Lu-DTPA-未加标签的2Rs15d和150mg/kg鱼精蛋白或10.1±0.2MBq的177Lu-DTPA-曲妥珠单抗i.v.注射带有SKOV3肿瘤的小鼠。在p.i.1、3、6、24、48、72和120h，将小鼠(n＝3)安乐死并解剖以如上所述进行放射性计数，并获得表示为％IA/g的组织生物分布值。对于177Lu-DTPA-曲妥珠单抗的剂量测定计算，包括时间点168hp.i.。将这些值时间积分以获得每克组织的停留时间。简要地，使用梯形法做出时间0和120h(或者对于177Lu-DTPA-曲妥珠单抗，168h)之间的积分。使用最后2个点来估计120h至无穷大的停留时间。对于每个数据组，计算吸收的剂量。177Lu的S值获自RADARphantoms(www.doseinfo-radar.com/RADARphan.html)。将1g球形的S值(0.0233mGy/MBqs)用于剂量计算。k)使用177Lu-DTPA-未加标签的2Rs15d和鱼精蛋白的实验性靶向放射性核素疗法当SKOV3-LUC肿瘤达到20-30mm3的体积(第7天)时，将动物随机分成3组(n＝8)。每组中的小鼠接受含有20.7±0.4MBq177Lu-DTPA-未加标签的2Rs15d、19.3±0.8MBq177Lu-DTPA-未加标签的BcII10或PBS的体积的7次i.v.注射剂(每周一次，注射7周)。将所有样品在150mg/kg鱼精蛋白中稀释。在肿瘤细胞接种后125天终止研究。每周监测动物体重，并通过卡尺测量监测肿瘤生长。在i.p.注射150mg/kg萤光素之后，每2周一次，使用生物发光成像使肿瘤负荷可视化。以无事件存活曲线总结结果，事件定义为(1)死亡、(2)>20％的体重减轻、(3)肿瘤组织溃烂或(4)肿瘤体积超过250mm3。在研究结束时，将动物安乐死、解剖并保留肾组织。l)肾组织病理学将177Lu-剂量组和对照组的肾样品在福尔马林中固定4小时、脱水并在石蜡中包埋。根据标准方案，将石蜡切片(3μm)处理用于H&E、PAS和Masson三色染色。使用光学显微术对染色切片评价肾组织中的坏死、细胞凋亡、炎症和血管变化。m)统计以双尾t检验分析生物分布的统计学显著差异，并使用对数秩检验(log-ranktest)分析处理组间无事件存活(P<0.05)。2.结果a)1B4M-DTPA和CHX-A″-DTPA与VHH的结合将CHX-A″-DTPA用于111In标记并将1B4M-DTPA用于177Lu标记。SEC谱和ESI-Q-ToF-MS分析表明双官能DTPA-螯合剂与不同的VHH构建体的成功结合。图11A-图11C示出未加标签的2Rs15d、未加标签的1B4M-DTPA-2Rs15d和未加标签的CHX-A″-DTPA-2Rs15d的SEC谱。将DTPA结合至赖氨酸残基的ε-氨基，由此形成硫脲键。因此，由于2Rs15d含有多个赖氨酸，因此，如通过ESI-Q-ToF-MS分析所确定的，结合反应导致产生了具有1、2和3个DTPA螯合剂的分子的混合物。图16示出未加标签的2Rs15d(MW：12624Da)、未加标签的CHX-A″-DTPA-2Rs15d(主峰对应于2个DTPA的结合，MW：13923)和未加标签的1B4M-DTPA-2Rs15d(主峰对应于2个DTPA的结合，MW：13842)的MS谱。因此，1B4M-DTPA和CHX-A″-DTPA与未加标签的2Rs15d的主要结合比(螯合剂:VHH)为2:1。通过应用标准方案，还对VHH2Rb17c和1R136d获得了程度一致的2:1(螯合剂:VHH)的结合。b)111In-和177Lu-DTPA-VHH的制备对于111In标记，将VHH与CHX-A″-DTPA结合。在放射性同位素标记后，iTLC显示SEC纯化前后放射化学纯度分别为95.1±1.7％和>99％。如通过iTLC所确定的，以高得率用177Lu标记与1B4M-DTPA结合的2Rs15dVHH构建体，即SEC纯化前97.2±2.5％和SEC纯化后>99％。用放射-HPLC或放射-SEC确认放射化学纯度。图11D-图11E示出未加标签的111In-DTPA-2Rs15d的放射-HPLC谱和未加标签的177Lu-DTPA2Rs15d的放射-SEC谱。c)177Lu-DTPA-曲妥珠单抗的制备SEC谱和ESI-Q-ToF-MS分析表明1B4M-DTPA与曲妥珠单抗的成功结合。177Lu-DTPA-曲妥珠单抗的放射化学纯度为99.5±0.2％(iTLC)并通过放射-SEC进行确认。图17示出未结合的曲妥珠单抗和DTPA-曲妥珠单抗的SEC谱，以及177Lu-DTPA-曲妥珠单抗的放射-SEC谱。d)111In-DTPA-VHH在健康Wistar大鼠中的肾保留为了确认VHHC末端极性强烈影响肾保留程度，对Wistar大鼠注射不同的111In-DTPA-VHH构建体。图12A-图12D示出代表性的且同比例的平面图像。最终，画出整体和肾ROI并作为时间函数作图以获得肾中积累的放射性的相对量(图12E)。对于加Myc-His标签的2Rs15d，然后是加His标签的和未加标签的2Rs15d确认了p.i.50min时肾中放射性的较高积累，其值分别为52.44±4.70、36.45±4.28和18.24±1.71％IA。所有三条曲线示出类似的抛物线形状。在p.i.50min时，对于和80mg/kg鱼精蛋白共输注的未加标签的2Rs15d观察到了肾中最低的积累，其值仅为6.52±0.18％IA。在本发明中，曲线显示在肾中放射性初始倾斜，然后快速达到稳定的低放射性量。对另外两个靶向HER2的VHH2Rb17c和1R136d确认了这些发现(图18)。e)177Lu-DTPA-2Rs15dVHH的体内肿瘤靶向用不同的177lu-DTPA-2Rs15dVHH注射SKOV3肿瘤异种移植小鼠(n＝3)。肿瘤靶向不受C末端标签的改变或者与鱼精蛋白的共注射的影响，对于加Myc-His标签的、加His标签的、未加标签的和与150mg/kg鱼精蛋白一起的未加标签的VHH，摄取值分别为5.9±0.7％；6.4±0.8％；6.9±0.4％和6.5±0.2％IA/g。更重要地，再次在肾摄取中观察到显著差异性，对于加Myc-His标签的、加His标签的、未加标签的和与150mg/kg鱼精蛋白一起的未加标签的VHH，其降低的值为195.8±23.7％；127.7±2.9％；25.8±1.3％和10.4±1.7％IA/g(图13)。主要器官和组织中的摄取值无显著差异。f)相对于177Lu-DTPA-曲妥珠单抗，单剂量177Lu-DTPA-未加标签的2Rs15d和鱼精蛋白的比较剂量测定计算对于未加标签的177Lu-DTPA-2Rs15dVHH，在早期时间点观察到最高的肿瘤摄取值并从p.i1h的6.50±0.24％IA/g降低至p.i.48h的2.15±0.11％IA/g和p.i.120h的1.15±0.16％IA/g。肾摄取值的峰值为p.i.1h的10.36±1.73％IA/g，然后降低至p.i.48h的2.08±0.29％IA/g和p.i.120h的0.40±0.29％IA/g。骨活性较低，表明177Lu未大量释放。其他主要器官和组织中放射性浓度较低，其值低于早期时间点的0.5％IA/g，并随时间降低。相反，177Lu-DTPA-曲妥珠单抗的肿瘤摄取在早期时间点较低并从1.07±0.31％IA/g提高至96h的28.09±0.58％IA/g和p.i.168h的17.13±2.00％IA/g。血液值较高，1h时为23.32±4.36％IA/g，并且在p.i.168h时仍为10.69±1.77％IA/g。在所有时间点，其他器官(特别是肝脏、肺和脾脏)中的放射性浓度仍比未加标签的177Lu-DTPA-2Rs15d的高得多。对于未加标签的177Lu标记的2Rs15d，将最高辐射摄取剂量递送至肿瘤和肾，其当量值为0.9Gy/MBq，而其他健康组织的辐射积存量(radiationburden)极低。另一方面，177Lu-DTPA-曲妥珠单抗为肿瘤递送了5.55Gy/MBq的计算剂量。然而，对血液、肝脏、脾脏和肺的辐射也较高，并且估计分别为4.18、1.72、1.60和1.55Gy/MBq。g)使用177Lu-DTPA-未加标签的2Rs15d和鱼精蛋白的实验性靶向放射性核素疗法对具有小SKOV3-LUC肿瘤的小鼠i.v.注射未加标签的177Lu-DTPA-2Rs15d、未加标签的177Lu-DTPA-BcII10(非靶向性对照VHH)或媒介物PBS，所有均共输注150mg/kg鱼精蛋白。对于PBS处理(n＝8)和177Lu-DTPA-BcII10处理(n＝8)的动物，如使用卡尺所测量的，在接种后33和75天之间，所有动物的肿瘤体积均已超过250mm3的值(图14B)。由于发展出大肿瘤(>1cm3)，在第85天将对照组的所有动物安乐死，如图14B所示。在两个对照组之间，在无事件存活方面未观察到统计学显著差异。相反，在多至第125天，在用未加标签的抗HER2177Lu-DTPA-2Rs15d处理的小鼠(n＝8)中未观察到肿瘤尺寸的显著增加。显著地，如通过生物发光成像所确认的，8只小鼠中有5只完全没有肿瘤负荷(图14A)。另外3只小鼠发展出小的LUCpos，但是无明显肿瘤。该组中1只动物由于体重减轻大于20％(第95天)而必须安乐死。总的来说，分别与接受PBS(P<0.0001)或177Lu-DTPA-BcII10(P<0.0001)的对照组相比，治疗组的无事件存活显著更长。肾组织的组织病理学分析显示实验组之间无差异。肾小球、小管和脉管系统形态正常并且未观察到坏死。间质未加宽或纤维化，并且无炎性细胞。未观察到蛋白管型(图15B)。3.讨论在本研究中，我们一方面研究了C末端氨基酸标签对VHH序列的整体极性的影响，并且另一方面研究了肾保留程度。氨基酸标签通常连接至蛋白质，如抗体片段用于纯化和放射性同位素标记的目的(His标签)或用于体外检测(Myc标签)。然而，引入潜在带电荷的氨基酸将影响蛋白质的整体极性，并因此还影响其体内行为。通过评价不同的111In-DTPA-VHH形式在健康Wistar大鼠中的体内行为最终确认了该假设。对于加Myc-His标签的2Rs15d，观察到了肾中保留的最高活性。将Myc-His标签改变为His标签导致标记物保留在p.i.50min降低31％。与加Myc-His标签的2Rs15d相比，C末端氨基酸标签的完全移除将肾保留降低了多至65％。最后，将未加标签的111In-DTPA-2Rs15d与鱼精蛋白共注射将肾保留进一步降低了另外65％。用另外两个靶向HER2的VHH确认了该观察结果。在HER2pos异种移植小鼠中注射用177Lu放射性标记的不同的2Rs15d形式之后观察到了类似的趋势。图13确认了来自肾保留相关的动态扫描的观测结果。对于加Myc-His标签的形式，观察到了肾中最高的摄取值，而用未加标签的2Rs15d和150mg/kg鱼精蛋白达到了最低的摄取。肿瘤靶向不受调节C末端氨基酸标签和共注射鱼精蛋白的影响。相对于单剂量177Lu-DTPA-曲妥珠单抗，分别评价了单剂量未加标签的177Lu-DTPA-2Rs15d和150mg/kg鱼精蛋白的比较性离体生物分布直至120h和168hp.i.。注射未加标签的177Lu-DTPA-2Rs15dVHH示出从所有非靶向器官和组织的活性的快速清除。在p.i.48h，肿瘤中的放射性超过了存在于肾中的量，从而导致与肿瘤和肾可比较的辐射摄取剂量。递送至非靶向组织如血液、肝脏和脾脏的剂量极低。此外，递送至骨的低剂量表明不存在游离的177Lu。相反，尽管与未加标签的177Lu-DTPA-2Rs15d相比，177Lu-DTPA-曲妥珠单抗向肿瘤提供了6倍更高的剂量，但是肺、肝脏、脾脏、骨和血液的辐射积存量相伴地高155、34、80、26和4180倍。最后，在作为模拟最小残余或微小转移疾病的基础模型的具有20-30mm3小肿瘤体积的HER2pos异种移植小鼠中进行基于VHH的靶向放射性核素疗法。就肿瘤生长抑制而言，接受非特异性177Lu标记的BcII10VHH的两个实验组或媒介物PBS组未观察到显著差异。在接种后33至75天之间，两个对照组中所有动物的肿瘤体积已超过250mm3的值。在多至125天，治疗组中无动物的肿瘤超过250mm3。此外，8只治疗小鼠中有5只显示完全无肿瘤形成。另外3只小鼠发展出小但不明显的肿瘤，然而该肿瘤通过生物发光成像是可检测的。总的来说，本发明的结果显示使用治疗性放射性核素镥-177，在具有肿瘤的小鼠中成功应用了基于VHH的靶向放射性核素疗法。由于对多种癌症相关抗原易于产生高特异性VHH，因此可以将基于VHH的靶向放射性核素疗法引入几种类型的癌症疾病。4.结论我们证明当使用未加标签的VHH和与150mg/kg鱼精蛋白共输注时，肾保留显著降低。因此，抗HER2VHH构成了靶向放射性核素疗法的有效小分子载体。当用177Lu放射性标记时，抗HER2VHH有效抑制异种移植小鼠中表达HER2的肿瘤的生长，同时不会显著非特异性辐射健康组织。此外，肾组织的组织病理学分析显示无明显毒性。实施例5：C57bl/6小鼠中单价、使用期未延长的、未加标签的[131I]SGMIB标记的抗HER2VHH2Rs15d的血液清除。材料&方法将6只正常雄性C57bl/6小鼠用于评价血液清除。每只动物接受静脉注射2500kBq未加标签的单价[131I]SGMIB标记的抗HER2VHH2Rs15d(约4mg)。在注射后2、5、10、15、20、40、60和120和180min，用毛细管收集血液样品。结果表示为注射活性百分比每总血液体积(％IA/TBV)。总血液体积估计为总体重的7％。使用GraphPadPrism，通过两阶段非线性回归拟合(biphasicnonlinearregressionfit)确定血液半衰期。结果根据两阶段血液曲线(图19)，未加标签的单价[131I]SGMIB标记的抗HER2VHH2Rs15d被清除。初始快速清除阶段的计算半衰期为约1.93min。60min后，在血液中测量到小于2％IA/TBV(注射活性的百分比每总血液体积)。实施例6：HER2+肿瘤异种移植小鼠中，单价的、使用期未延长的、未加标签的[131I]SGMIB标记的抗HER2VHH2Rs15d的生物分布和剂量测定，以及在成年人类女性中的辐射剂量估计材料&方法在植入肿瘤前1天，在雌性6周龄CRL:Nu-FoxNInu无胸腺小鼠背部植入60天连续释放的17-β-雌二醇颗粒(0.72mg,InnovativeResearchofAmerica:Sarasota,FL,USA)。将50％Martigel(BDBiosciences,Bedford,MA,USA)中的HER2+BT474/M1人乳癌细胞(10×106)皮下注射到右胁并使其生长直至达到250-350mm3的体积。确定了未加标签的单价[131I]SGMIB标记的抗HER2VHH2Rs15d的生物分布谱。用1185kBq的未加标签的单价[131I]SGMIB标记的抗HER2VHH2Rs15d(2.0μg)注射动物(n＝3)。在注射后1、3、6、24、48、72、96、120、144h，用过剂量的氟烷使小鼠安乐死、将其解剖并采集它们的器官。将感兴趣的组织称重，并与注射标准品一起在γ-计数器中对131I放射性计数(表7)。将所获得的数据(表示为％IA/g)用于计算相应肿瘤与健康组织的比值(表8)。另外，将未加标签的单价131I-SGMIB-抗HER2VHH2Rs15d的生物分布值用于剂量测定计算(表9)。将这些值时间积分以获得每克组织的停留时间。简要地，使用梯形法在时间0和144h之间积分。然后，计算吸收的剂量。在吸收的剂量计算中，131I的S值获自在因特网上公开的RADARphantoms(单位密度球体)。总体上，将1g球体的S值(0.0000304Gy.Kg/MBq.s)用于计算所有器官的剂量。这种简化的剂量测定计算是由于以下事实的启示：131I衰变中的低能β-粒子被局部吸收，而光子及其他穿透性辐射的贡献程度较低，这意味着小鼠中不同器官之间的串扰(cross-talk)是可忽略的。通过使用1h的膀胱排尿间隔，使用OLINDA软件，将不同时间点下小鼠中未加标签的单价[131I]SGMIB标记的抗HER2VHH2Rs15d的生物分布数据对成年女性模型(phantom)的外推，在成年人类女性中进行器官-吸收的剂量的估算(表10)。基于时间-活性曲线进行计算以确定器官中衰变的数目。对各个器官使用适当的权重因子计算器官剂量和有效剂量。结果实现了极高的肿瘤与健康组织的比值(表8)，这突出显示健康组织中摄取极低并因此毒性较低。到目前为止，尚未对其他放射免疫生物剂公开如使用未加标签的单价[131I]SGMIB标记的抗HER2VHH2Rs15d所观察到的这种程度的肿瘤与组织的比值。特别是，与被称为5F7GGC的靶向HER2的加半胱氨酸标签的VHH相比(Pruszynski等人,2014；J.Nucl.Med.55(4):650-656)，这些比值显著较高。相对于5F7GGCVHH，对于未加标签的单价[131I]SGMIB标记的抗HER2VHH2Rs15d，在时间点1和24h，肿瘤与肺、心脏、肝脏、肾、胃、脾脏、肌肉和血液的比值均显著较高。特别出乎意料地，对未加标签的单价[131I]SGMIB标记的抗HER2VHH2Rs15d，在肾中检测到极低的摄取值。这种肾摄取值甚至低于已对5F7GGCVHH所报道的摄取值。表7：注射未加标签的单价[131I]SGMIB标记的抗HER2VHH2Rs15d后，在自动γ粒子计数器中对21种不同的感兴趣的组织的131I活性计数。除甲状腺、肾上腺和胆囊使用％IA外，摄取值表示为％注射的活性/克组织(％IA/g)。值表示为平均值(n＝3)±SD。表7(续)表8：计算的肿瘤与健康组织比。值表示为平均值(n＝3)±SD。表8(续)使用Pruszynski等人中所述的用于计算肾辐射吸收剂量的相同方法并基于％IA/g组织值(表7)，对未加标签的单价[131I]SGMIB标记的抗HER2VHH2Rs15d获得了835.96cGy/mCi的值(表9)，其小于基于来自Pruszynski等人的剂量测定数据对5F7GGCVHH所获得的值的一半。对于未加标签的单价[131I]SGMIB标记的抗HER2VHH2Rs15d，对肝脏、脾脏、肺、胃和血液也观察到了低得多的值。对未加标签的单价[131I]SGMIB标记的抗HER2VHH2Rs15d(835.96cGy/mCi)所获得的值出乎意料地小于肾对于加his标签的单价[131I]SGMIB标记的抗HER2VHH2Rs15d(1055cGy/mCi，参见实施例2)的吸收的剂量。表9：雌性HER2+肿瘤异种移植小鼠中未加标签的单价[131I]SGMIB标记的抗HER2VHH2Rs15d的剂量测定计算使用OLINDA1.0软件，根据小鼠中未加标签的单价[131I]SGMIB标记的抗HER2VHH2Rs15d的生物分布数据计算成年女性的辐射剂量估值。基于时间-活性曲线进行计算以确定20个源器官中衰变的数目。对各个器官使用适当的权重因子计算器官剂量、有效剂量和有效剂量当量。表10总结了计算的器官-摄取剂量。有效剂量估计为0.0273mSv/MBq。表10：基于OLINDA计算，对于成年女性不同器官的辐射剂量估值。实施例7：HER2+肿瘤异种移植小鼠中与曲妥珠单抗和/或帕妥珠单抗竞争的未加标签的单价[131I]SGMIB标记的抗HER2VHH2Rs15d的生物分布。在用曲妥珠单抗、帕妥珠单抗或两者的组合预处理之后，在HER2+肿瘤异种移植小鼠中评价未加标签的单价[131I]SGMIB标记的抗HER2VHH2Rs15d的生物分布谱。曲妥珠单抗(商品名：)和帕妥珠单抗(商品名：)是干扰HER2/neu受体的单克隆抗体。它们的主要用途是治疗某些乳癌。材料和方法在植入肿瘤前1天，在6周龄的雌性CRL:Nu-FoxNInu无胸腺小鼠背部植入60天连续释放的17-β-雌二醇颗粒(0.72mg,InnovativeResearchofAmerica:Sarasota,FL,USA)。将50％Martigel(BDBiosciences,Bedford,MA,USA)中的HER2+BT474/M1人乳癌细胞(5×106)皮下注射到右胁并使其生长直至达到150-250mm3的体积。在未加标签的单价[131I]SGMIB标记的抗HER2VHH2Rs15d给予前72h，用100倍摩尔过量的抗HER2mAb预处理动物(n＝3)。然后，它们接受了1185kBq的未加标签的单价[131I]SGMIB标记的抗HER2VHH2Rs15d(5.0μg)。注射后1h，用过剂量的氟烷使小鼠安乐死、将其解剖并采集它们的器官。将感兴趣的组织称重，并与注射标准品一起在γ-计数器中对131I放射性计数。结果表示为注射活性百分比每克组织(％IA/g)。结果结果如表11所示。在仅接受未加标签的单价[131I]SGMIB标记的抗HER2VHH2Rs15d的动物组和接受和/或预处理的动物组之间对于肿瘤摄取未观察到显著差异。因此，根据本发明的未加标签的单价[131I]SGMIB标记的抗HER2VHH2Rs15d或其功能性片段不与单克隆抗体和竞争对HER2的结合，如通过本发明的体内竞争测定所示。表11.在雌性HER2+肿瘤异种移植小鼠中，在与或不与曲妥珠单抗、帕妥珠单抗或这两种抗HER2mAb的组合竞争的情况下，未加标签的单价[131I]SGMIB标记的抗HER2VHH2Rs15d的生物分布数据。除甲状腺外使用使用％IA外，值表示为％注射的活性/克组织(％IA/g)。值表示为平均值(n＝3)±SD。实施例8：HER2+肿瘤异种移植小鼠中未加标签的单价[131I]SGMIB标记的抗HER2VHH2Rs15d的治疗效力通过测量其在HER2+肿瘤异种移植小鼠中抑制肿瘤生长的能力来评价未加标签的单价[131I]SGMIB标记的抗HER2VHH2Rs15d的治疗效力。通过包含2个对照：(1)给予未加标签的单价[131I]SGMIB标记的非靶向性对照VHH和(2)给予媒介物溶液PBS来评价其治疗效力的特异性。材料和方法在19只CRL:Nu-FoxNInu小鼠的右后腿接种5×106个处于50/50matrigel/细胞培养基中的HER2+BT474/M1肿瘤细胞。如通过卡尺测量所确定的，肿瘤生长直至50±30mm3。然后，将动物随机分成3个处理组；处理组1(n＝6)：未加标签的单价[131I]SGMIB标记的抗HER2VHH2Rs15d(250±50mCi/处理)，处理组2(n＝6)：未加标签的单价[131I]SGMIB标记的非靶向性对照VHH(250±50mCi/处理)和处理组3(n＝7)：媒介物溶液。动物处理5次(每周1次，处理5周)。每周测量肿瘤体积和动物体重。当观察到肿瘤达到1cm3或者当体重减轻>20％时，将动物安乐死。150天后。将结果合并到存活曲线中，然后进行统计分析(对数轶和(Mantel-Cox)检验)。结果对具有小HER2+BT474/M1肿瘤(50±30mm3)的小鼠静脉内注射未加标签的单价[131I]SGMIB标记的抗HER2VHH2Rs15d、未加标签的单价[131I]SGMIB标记的非靶向性对照VHH或媒介物溶液PBS。由于发展出大肿瘤(>1cm3)，在150天将PBS处理的所有动物(n＝7)以及未加标签的单价[131I]SGMIB标记的非靶向性对照VHH处理组中除1只动物外的其他所有动物(n＝6)安乐死(图20)。在两个对照组之间，在无事件存活方面未观察到统计学显著差异。相反，与两个对照动物组相比，在用未加标签的单价[131I]SGMIB标记的抗HER2VHH2Rs15d处理的组中，肿瘤生长显著延迟(图20)。此外，多至第150天，处理动物组中一半显示完全没有肿瘤负荷。总的来说，分别与接受PBS(P<0.05)或未加标签的单价[131I]SGMIB标记的非靶向性对照VHH(P<0.05)的对照组相比，治疗组的存活显著更长。该发现非常出乎意料，这是由于显示出放射性标记的、未加标签的、使用期未延长的单价VHH具有治疗效果，尽管通常认为对于治疗效果，需要使用期延长和多价。实施例9：*在小鼠中对131I-SGMIB标记的2Rs15d或其他VHH建立了剂量递增毒性曲线以评价这些探针的毒性限制性剂量。*在人类志愿者乳癌患者中进行低剂量GMP级131I-SGMIB-2Rs15d的生物分布分析以建立HER2阳性肿瘤病变的有效靶向，但在其他身体组织，如肾中低背景信号。*在具有用编码荧光素酶的慢病毒颗粒转染的皮下Her2+SKOV3细胞的无胸腺裸鼠中评价了以7次每周注射的方案给予高剂量131I-SGMIB-2Rs15d的治疗效力，由此与对照组小鼠相比通过卡尺测量和/或生物发光成像测量了肿瘤生长停滞。序列表<110>布鲁塞尔自由大学(VRIJEUNIVERSITEITBRUSSEL)<120>用于在癌症的预防和/或治疗中使用的放射性标记的抗体片段<130>VUB-064-PCT<150>14178943.8<151>2014-07-29<160>10<170>PatentIn版本3.5<210>1<211>8<212>PRT<213>人工序列<220><223>VHH2Rs15d的CDR1序列<400>1GlyTyrIlePheAsnSerCysGly15<210>2<211>7<212>PRT<213>人工序列<220><223>VHH2Rs15d的CDR2序列<400>2IleSerGlyAspGlyAspThr15<210>3<211>9<212>PRT<213>人工序列<220><223>VHH2Rs15d的CDR3序列<400>3AlaValCysTyrAsnLeuGluThrTyr15<210>4<211>8<212>PRT<213>人工序列<220><223>VHH2Rb17c的CDR1序列<400>4GlyPheIlePheSerAsnAspAla15<210>5<211>8<212>PRT<213>人工序列<220><223>VHH2Rb17c的CDR2序列<400>5IleAsnTrpSerGlyThrHisThr15<210>6<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>VHH2Rb17c的CDR3序列<400>6ValThrGlyTyrGlyValThrLysThrPro1510<210>7<211>115<212>PRT<213>人工序列<220><223>VHH序列2Rs15d<400>7GlnValGlnLeuGlnGluSerGlyGlyGlySerValGlnAlaGlyGly151015SerLeuLysLeuThrCysAlaAlaSerGlyTyrIlePheAsnSerCys202530GlyMetGlyTrpTyrArgGlnSerProGlyArgGluArgGluLeuVal354045SerArgIleSerGlyAspGlyAspThrTrpHisLysGluSerValLys505560GlyArgPheThrIleSerGlnAspAsnValLysLysThrLeuTyrLeu65707580GlnMetAsnSerLeuLysProGluAspThrAlaValTyrPheCysAla859095ValCysTyrAsnLeuGluThrTyrTrpGlyGlnGlyThrGlnValThr100105110ValSerSer115<210>8<211>117<212>PRT<213>人工序列<220><223>VHH序列2Rb17c<400>8GlnValGlnLeuGlnGluSerGlyGlyGlyLeuValGlnProGlyGly151015SerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyPheIlePheSerAsnAsp202530AlaMetThrTrpValArgGlnAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpVal354045SerSerIleAsnTrpSerGlyThrHisThrAsnTyrAlaAspSerVal505560LysGlyArgPheThrIleSerArgAspAsnAlaLysArgThrLeuTyr65707580LeuGlnMetAsnSerLeuLysAspGluAspThrAlaLeuTyrTyrCys859095ValThrGlyTyrGlyValThrLysThrProThrGlyGlnGlyThrGln100105110ValThrValSerSer115<210>9<211>6<212>PRT<213>人工序列<220><223>His标签<400>9HisHisHisHisHisHis15<210>10<211>23<212>PRT<213>人工序列<220><223>Myc-His标签<400>10AlaAlaAlaGluGlnLysLeuIleSerGluGluAspLeuAsnGlyAla151015AlaHisHisHisHisHisHis20当前第1页1 2 3