合成的犀牛角类似物的制作方法

文档序号:11528426阅读:1430来源:国知局
合成的犀牛角类似物的制造方法与工艺

相关申请的交叉参考

本申请要求2014年9月23日提交的第62/053,990号美国临时专利申请的优先权,所述申请的全部内容以引用的方式并入本文中。

本发明提供合成的犀牛角类似物和其合成方法。可以将具有药物作用的化合物并入到所述类似物中。还可以将遗传指纹并入到所述类似物中。所述类似物可以被调配成组合物。



背景技术:

存在五个犀牛现存物种,三个在亚洲并且两个在非洲。因为接二连三的偷猎和栖息地破坏,所以大部分剩余犀牛属于两个非洲物种中的一个:白犀(白)或黑犀(黑)。现在,甚至连那些物种也受到了威胁。威胁来自东亚和东南亚重新兴起的对犀牛角的需求。虽然犀牛角出于各种原因一直受到许多文明的推崇,但是其当前的复苏部分地归因于它过去在亚洲传统医学(traditionalasianmedicine;tam)中的用途。tam和其变形的完整说明超出了本发明的范围;然而,在西方,犀牛角的假定药物指示包括缓解发热、减轻疼痛、对抗感染、预防或消除宿醉、治愈癌症以及提高性功能。

正在研发缓解犀牛偷猎危机的新技术。令人遗憾的是,这些技术很多都有固有缺点。举例来说,可以用来巡逻犀牛范围的自主无人机可能被偷猎者盗用来猎捕犀牛。这可能通过计算机黑客入侵合法无人机、贿赂合法无人机操作员(所谓的“卡其领犯罪(khakicollarcrime)”)或使用非法无人机而发生。具有固有缺点的另一种技术是犀牛的遗传指纹识别。dna图谱分析系统确实可以帮助执法者解决野生动物罪案。但同时,这种系统也会被消费者用来鉴别假冒的角(例如,水牛角),从而给黑市施加了更大的压力,交付真正的犀牛角。最后,文献(中国专利cn100407907c)中披露了一种自动刮掉所饲养犀牛的角的设备。撇开道德问题不谈,也不能大规模养殖犀牛来满足对犀牛角的不断增长的需求。也就是说,收成受到现存犀牛数量、出生率、死亡率以及每只动物的角的生长速率的限制。



技术实现要素:

本发明提供以合成方式产生的犀牛角类似物。所披露的类似物和方法具有若干优点。举例来说,所披露的类似物与真正的角几乎不可区分,使得类似物成为了真角的可接受的替代物。此外,所披露的类似物可以比犀牛角纯(例如,含有更少的污染物)。在某些情况下,所披露的类似物会更有效,可能使得它们比天然犀牛角更可取。所披露方法的一个具体优点是它们能成规模。也就是说,它们使得响应于需求变化来调整生产变得相对较为容易。就时间、安全性、土地以及供应来说,所披露方法还使得资源不那么密集。另一个优点是所披露的类似物和其附带的方法都不是两用的,意指它们不会被误用于促进针对野生动物的犯罪。

附图说明

图1描绘β-折叠的化学图。

图2是说明如图1中所示的β-折叠可以如何改变构形以捕获多个化学添加剂的示意图。

图3是根据本文所披露的合成方法产生的犀牛角类似物的ftir谱图。

图4含有若干动物的角的ftir光谱,用于参考目的。

图5是一张表格,给出了seqidno、dna序列(从5'端写到3'端,其中引物区大写)、dna序列内的假定等位基因(在二核苷酸重复序列中)以及先前针对已知dna图谱分析系统的每个基因座所观察到的等位基因。

图6是一张表格,列举了白犀牛中所存在的硬角蛋白的氨基酸序列。

具体实施方式

存在五个犀牛现存物种,三个在亚洲并且两个在非洲。因为接二连三的偷猎和栖息地破坏,所以大部分剩余犀牛属于两个非洲物种中的一个:白犀(白)或黑犀(黑)。现在,甚至连那些物种也受到了威胁。

正在研发缓解犀牛偷猎危机的新技术。令人遗憾的是,这些技术很多都有固有缺点。举例来说,可以用来巡逻犀牛范围的自主无人机可能被偷猎者盗用来猎捕犀牛。具有固有缺点的另一种技术是犀牛的遗传指纹识别。dna图谱分析系统确实可以帮助执法者解决野生动物罪案。但同时,这种系统也会被消费者用来鉴别假冒的角(例如,水牛角),从而给黑市施加了更大的压力,交付真正的犀牛角。最后,文献(中国专利cn100407907c)中披露了一种自动刮掉所饲养犀牛的角的设备。撇开道德问题不谈,也不能大规模养殖犀牛来满足对犀牛角的不断增长的需求。

本发明提供以合成方式产生的犀牛角类似物。所披露的类似物和方法具有若干优点。举例来说,所披露的类似物与真正的角几乎不可区分,使得类似物成为了真角的可接受的替代物。此外,在某些情况下,所披露的类似物会更有效,可能使得它们比犀牛角更可取。所披露方法的一个具体优点是它们能成规模。也就是说,它们使得响应于需求变化来调整生产变得相对较为容易。就时间、安全性、土地以及供应来说,所披露方法还使得资源不那么密集。另一个优点是所披露的类似物和其附带的方法都不是两用的,意指它们不会被误用于促进针对野生动物的犯罪。必要时,可以把dna水印并入到所披露的类似物中,以便减轻不同意上述声明的人的忧虑。

犀牛角主要包括角蛋白基质中的钙和黑色素。角蛋白基质由表皮细胞经历角质化并且以类似于人发和指甲的生长的方式死亡而产生。关于犀牛角的这些事实掩饰了合成与其类似的物质的复杂性。复杂性是在制造任何体外产生的物理上硬的生物物质时所固有的,这是因为在需要高度还原环境的蛋白质分泌方面缺乏科学进展。

犀牛角类似物的实施例包括呈纤维或小折叠结构的角蛋白基底、真正的犀牛角中所存在的蛋白质和氨基酸以及与真正的犀牛角具有类似的物理性质(例如,硬度、密度、颜色、脆性、拉伸强度和光学表示)的所得物质。在一些实施例中,角蛋白基底可以包括α-螺旋。

作为一个实例,北白犀牛角的天然组成包括2%精氨酸;5%赖氨酸;9%胆固醇;3%牛磺酸;0.2%-1%己糖胺(果糖胺和葡糖胺);以及0.2%鞘氨醇,在含有钙和黑色素的角蛋白基质内。根据野生犀牛的饮食,以上百分比的偏差可以高达±20%。因此,在特定实施例中并且尤其适用于北白犀,真正的犀牛角可以包括:1.6%-2.4%精氨酸;4-6%赖氨酸;7.2-10.8%胆固醇;2.75-3.25%牛磺酸;0%-1.25%己糖胺(果糖胺和葡糖胺);以及0.1%-0.3%鞘氨醇。

犀牛角还可以包括以下总无机物含量:66-70%硫、15-19%钾、5-9%钙、0-3%铁、0.2-0.4%钛以及0-4%锌。因此,无机物含量可以包括66-70%硫;15-19%钾;5-9%钙;0-3%铁;0.2-0.4%钛;以及0-4%锌。

犀牛角的物理性质可以包括肖氏a硬度92-96、肖氏d硬度68-72以及密度1.122-2.222g/cm3

如本文所述的类似物包括以合成方式产生的物理上类似于天然犀牛角的物质。物理上类似意指以合成方式产生的物质匹配天然犀牛角的测量特征。如本领域的普通技术人员对特定特征和所采用的测量技术的了解,匹配不必是相同的,但必须是在测量误差或可接受的偏差内。可以测量的特征包括类似物的物理特征(例如,硬度、密度、表面形态、颜色、质地、分解率、脆性、拉伸强度以及光学表示)和类似物的化学特征(例如,有机组分的存在情况和百分比、无机组分的存在情况和百分比)。

在特定实施例中,关于任何指定特征测量,由合成类似物和天然犀牛角产生的测量结果将不会相差超过1%、超过5%、超过10%、超过15%或超过20%。

在特定实施例中,类似物将匹配天然犀牛角的至少一个、两个、三个、四个或五个物理特征和天然犀牛角的至少一个、两个、三个、四个或五个化学特征。举例来说,在特定实施例中,类似物将匹配硬度和密度特征并且将匹配氨基酸存在情况和百分比特征。在特定实施例中,类似物将匹配硬度和密度特征并且将匹配无机组分存在情况和百分比特征。在特定实施例中,类似物将匹配硬度和密度特征并且将匹配氨基酸存在情况和百分比特征以及无机组分存在情况和百分比特征。

虽然根据目视检查或特定物理特征,特定类似物类似于天然犀牛角,但是可以提供呈粉末形式的其他类似物。以粉末形式提供的类似物一般将通过测量有机组分和无机组分的存在情况和百分比而不是例如硬度和密度等物理特征来评估。然而,在特定实施例中,可以包括例如粉末颜色等物理特征作为测量项目。粉末包括本文所述的类似物的粒子:(i)通过固体类似物的研磨、压碎或崩解产生;和/或(ii)在固体类似物形式形成之前。

可以使用分析方法测量各种特征,所述分析方法例如物理性质测试、傅里叶变换红外(ftir)光谱分析、x射线荧光(xrf)、短串联重复(str)基因分型以及物理性质分析。

在一些实施例中,为了重现人们所相信的在食用犀牛角时所产生的药物作用,可以在犀牛角类似物中包括额外添加剂。这类添加剂的存在不会破坏如上文关于类似物所述的先前“匹配”。这类额外添加剂包括咖啡因、阿司匹灵(aspirin)、醋氨酚(acetaminophen)、布洛芬(ibuprofen)、西地那非(sildenafil)、他达拉非(tadalafil)、其组合等。

在一些实施例中,为了模拟真正的角的其它特征,可以在犀牛角类似物中包括额外添加剂。这类额外添加剂包括色氨酸、组氨酸、天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、胱氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、羧甲基半胱氨酸、乙醇胺、硫代乳酸、黑色素、纤维角蛋白、遗传物质(dna或rna)、微量元素、微量元素的同位素、犀牛细胞、其组合等。

在制造类似物时采用的特定添加剂以及其相对百分比可以随实施例而变,并且一般需要实验进行优化。本文任何内容都不打算限制在类似物中包括添加剂的点。

在包括遗传物质的实施例中,推荐一组已知可在犀牛中扩增的法医基因座。这样的一组在文献(哈珀(harper)等人“从犀牛角中提取细胞核dna并且表征白(白犀)和黑(黑犀)犀牛的dna图谱分析系统(extractionofnucleardnafromrhinoceroshornandcharacterizationofdnaprofilingsystemsforwhite(ceratotheriumsimum)andblack(dicerosbicornis)rhinoceros),”国际法医学:遗传学(forensicsci.int.-gen.)2013;7:428-433)中有所描述。其包括22个str基因座和2个性别基因座。表面上,这组被用于产生在比勒陀利亚大学的犀牛dna索引系统(universityofpretoria'srhinodnaindexsystem;rhodis)中所发现的dna图谱。这组的某些方面详细显示于图5中。

看图5的510列,示出了seqidno:1-22,表示上述那组22个str基因座的例示性dna序列。seqidno:23和seqidno:24表示性别基因座的例示性dna序列。例示性dna序列本身就包含在列520中。seqidno:1-23来自由博德研究所(broadinstitute)(cersimsim1.0)产生的白犀牛基因组的2012年5月组装。seqidno:24来自基因库(登录号dq520645)。适当时,列530含有列520中的例示性dna序列所需的等位基因。最后一列540含有在367种白犀牛样品所观察到等位基因和在圆括号中的其相应的频率。

现在参看图5的seqidno:6,举例来说,看到了在列530中,例示性dna序列的等位基因判读(allelecall)是6.1。这意味着,相对于基因库参考序列来说,所述序列可能具有6个二核苷酸重复序列(12bp)加1个不完全重复序列(1bp)。这里,基元含有ca重复序列并且为了清楚起见加下划线。相比之下,在白犀牛中通常所观察到的唯一等位基因是10,如在列540中所发现。如果序列具有列530中的等位基因但不具有列540中的匹配值,那么差异可能归因于自然变异或不同等位基因判读方法的影响。无论如何,图5中所呈现的信息应该足够本领域的普通技术人员伪造dna图谱。

在包括遗传物质的一个实施例中,通过亚磷酰胺固相合成以及相关引物制成seqidno:1-24。接下来,通过聚合酶链反应(pcr)扩增这些合成序列。然后稀释pcr产物以便包含在最终的犀牛角类似物中。类似物的dna图谱中所有str基因座将是纯合的并且因为存在两种性别基因座(即,seqidno:23和seqidno:24),所以将把它描述为雄性的。在另一个实施例中,不包括seqidno:24,并且类似物将被描述为雌性的。

在包括遗传物质的更高等的实施例中,可以使用seqidno:1-22中的每个序列作为模板制造一个可能更改的序列(纯合基因座)或两个不同序列(杂合基因座)以便输入到pcr中。可以通过插入或缺失单核苷酸或二核苷酸重复序列来更改模板,在其基元内产生新等位基因。在更改模板时使用如列540中所发现的已知等位基因清单作为引导是可取的。在甚至更高等的实施例中,可以使用计算机程序或设备在假定哈迪-温伯格平衡(hardy-weinbergequilibrium)下在所有str基因座随机产生基因型。按此方式,合成角的每轮制造将具有独特的dna图谱,从而使其看起来像是来自不同犀牛的不同轮次。

其它包括遗传物质的实施例可以基于上述dna图谱分析系统,但是等位基因频率从黑犀牛收集。另外其它实施例可以基于完全不同的dna图谱分析系统。任何采用定位于粒线体或细胞核dna上的基因座并且具有str、单核苷酸多态性(snp)、其它形式的遗传变异或其组合的dna图谱分析系统都能够进行伪造。

在dna图谱分析系统不含公开引物的情况下,仍然可以产生假dna图谱。在这类实施例中,可以给引物测序并且使用所述引物寻找cersimsim1.0中的例示性dna序列。或者,如果犀牛细胞可用,那么可以通过pcr使用未公开引物或通过全基因组扩增(wholegenomeamplification;wga)扩增其dna,然后将其包括在最终类似物中。

在特定实施例中,可以将粉末状类似物调配成组合物,并且在特定实施例中,可以将粉末状类似物与添加剂一起调配成组合物。既定向活的动物个体(例如,人类)投与的组合物可以包括至少一种药学上可接受的载剂。药学上可接受的载剂包括不产生显著不良反应、过敏反应或其它胜过投药益处的不当反应的载剂。例示性药学上可接受的载剂和相关调配物披露于特洛伊d.b.(troy,d.b.)和贝林格p.(beringer,p.)(编)雷明顿:医药科学和实践(remington:thescienceandpracticeofpharmacy),利平科特(lippincott);费城(philadelphia),2006.第21版中。制备组合物时需满足如相关监管机构所要求的无菌性、产热原性和/或一般安全性和纯度标准。

例示性常用药学上可接受的载剂包括任何和所有吸收延迟剂、抗氧化剂、粘合剂、缓冲剂、膨胀剂、螯合剂、共溶剂、包衣、着色剂、崩解剂、分散介质、乳化剂、填充剂、调味剂、凝胶、等张剂、润滑剂、芳香剂、防腐剂、释放剂、盐、溶剂、稳定剂、甜味剂、表面活性剂、润湿剂等。

在特定实施例中,局部组合物包括类似物和皮肤学基础,如石油膏;石蜡;合成甘油酯、单酸甘油酯、二酸甘油酯和三酸甘油酯、蜡、膨润土、卡波姆(carbomer)、植物油、动物脂肪、羊毛脂、羊毛脂醇、脱水山梨糖醇酯、脂肪醇、硫酸化脂肪醇、聚山梨醇酯和/或聚乙二醇(peg)。局部组合物可以被调配成乳膏、洗剂、药膏、软膏、凝胶、粉剂、糊剂、喷雾剂、喷雾、气雾剂等。

关于包括亲水性和疏水性试剂的皮肤学碱基,可以使用乳化剂。例示性阴离子乳化剂包括硬脂酸钠、硬脂酸铝和十二烷基硫酸钠。例示性阳离子乳化剂包括十六烷基三甲基溴化铵、苯扎溴铵(benzalkoniumbromide)和十六烷基氯化吡啶。例示性两性离子乳化剂包括磷脂酰胆碱和甜菜碱单水合物。例示性非离子乳化剂包括peg-30硬脂酸酯、单硬脂酸甘油酯和单异硬脂酸甘油酯。

例示性胶凝剂包括合成聚丙烯酸(卡波姆)、半合成纤维素衍生物(例如,羧甲基纤维素钠)和黄原胶。例示性防腐剂包括烷基-4-羟基苯甲酸酯、山梨酸和苯甲酸。例示性抗氧化剂包括α-生育酚、没食子酸乙酯和没食子酸丙酯。例示性缓冲剂包括柠檬酸盐缓冲剂、丁二酸盐缓冲剂和酒石酸盐缓冲剂。例示性增溶剂包括聚山梨醇酯、羟丙基-β-环糊精和中链三酸甘油酯。

关于摄取,组合物可以呈按常规方式调配的片剂、丸剂、口含片、喷雾剂、液体以及胶囊形式。可摄取组合物可以使用药物领域所知的常规方法和材料制备。举例来说,第5,215,754号和第4,374,082号美国专利涉及可吞咽组合物的制备方法。第6,495,177号美国专利涉及口感改良的可咀嚼补充剂的制备方法。第5,965,162号美国专利涉及用于制备在口中快速崩解的可食用单元的组合物和方法。

可摄取组合物的形状可以不含锐利边缘,并且含有光滑的、均匀的并且基本上无气泡的外涂层。可摄取组合物的包衣可以源自聚合物膜。这种膜包衣降低了组合物与口腔内表面的粘附性并且可以帮助掩蔽可能不良的味道。包衣还可以保护组合物免于空气降解。例示性聚合物膜包括乙烯基聚合物、纤维素材料、丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯、天然树胶和树脂,如玉米蛋白、明胶、虫胶和阿拉伯树胶。可摄取组合物中所用的其它常见赋形剂包括蔗糖、果糖、乳糖、葡萄糖、来卡生(lycasin)、木糖醇、乳糖醇、赤藓糖醇、甘露糖醇、异麦芽糖、右旋糖、聚葡萄糖、糊精、可压缩纤维素、可压缩蜂蜜、可压缩糖蜜、翻糖(fondant)或树胶、植物油、动物油、烷基聚硅氧烷、玉米淀粉、马铃薯淀粉、预胶凝淀粉、硬脂酸、硬脂酸钙、硬脂酸镁、硬脂酸锌、苯甲酸以及着色剂。

关于通过吸入(例如,经鼻或经肺)投药,可以将组合物调配成用于加压包装或雾化器的气雾型喷雾剂,且使用合适的推进剂,例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷或二氯四氟乙烷。

填充剂和赋形剂可购自公司,如奥德里奇化学公司(aldrichchemicalco.)、fmc公司、拜耳(bayer)、巴斯夫(basf)、阿列克斯弗雷斯(alexifres)、威特科(witco)、马林克罗特(mallinckrodt)、罗地亚(rhodia)、isp以及其它公司。

组合物中类似物的量和浓度可以基于相关因素来选择,如类似物于载剂中的溶解度、类似物的效能和活性以及组合物的投与方式。按总组合物的重量计,组合物一般将包括0.0001到99重量%的类似物。

包括安全且有效的量的类似物并且任选地含有添加剂的本发明组合物可以包装到各种容器中。在特定实施例中,组合物包装在2015年6月10日提交的第29/529,808号美国设计专利申请中所描述和要求的容器内。

实例1.使1份从羊毛获得的ph为5-5.5且分子量为3,500-4,500道尔顿的已水解角蛋白与3份氢氧化钙在40-50℃下在氮气氛围下反应12-48小时(塞亚加拉杰(thyagarajan)“家禽废物利用范围(scopeofpoultrywasteutilization).”iosr-javs.2013;第6期,第5卷:29-35)。这么做是为了阻止因为与空气反应而过早形成二硫键。在反应过程中,产生氨气副产物并且氨气逸出。应注意,可以使用源自遗传修饰酵母的角蛋白代替从羊毛获得的已水解角蛋白。

然后从氮气氛围中移走所得浆料,其含有富含如图1中所示的β-折叠100的聚合角蛋白。随后在干燥烘箱中在70-90℃下干燥浆料,直到如通过卡尔费休滴定仪(karlfischertitrator)所测量,水分含量低于1%。在本实施例中选择β-折叠100作为基础结构,因为关键蛋白质会被截留在β-折叠100之间,从而与真正的角实现更大的组成匹配。

然后将干燥后的粉末溶解于磷酸钾缓冲溶液中并且按质量计添加以下各项(应注意,这是北白犀牛角中所存在的天然组成):2%精氨酸;5%赖氨酸;9%胆固醇;3%牛磺酸;0.2%己糖胺(果糖胺和葡糖胺);以及0.2%鞘氨醇。以上百分比的偏差可以高达报告值的±20%,因为野生犀牛角的值会根据饮食变化。

在如图2中所示的以上添加剂210与角蛋白基底充分混合后,添加1/2份20-50%过氧化氢以促使在β-折叠100中形成二硫键/氢键220,从而截留以上添加剂210。在这个步骤之前,β-折叠100的大小相对较小并且二硫键的数量有限。然后再次在干燥烘箱中在70-90℃下干燥粉末,直到如所通过卡尔费休滴定仪测量,水分含量低于1%。

应注意,在本实施例中,可用任何碱性溶液替换氢氧化钙,如氢氧化钠;然而,然后为了匹配真正的角中的钙含量,所述钙含量在所存在的总有机物的6%-8%之间变化,需要添加另一个钙源。此外,可以使用除氮气之外的其它非反应性氛围,如氩气,并且可以使用其它改变分子大小的角蛋白源,如经过消化的鸟的羽毛。可以使用其它溶液代替过氧化氢,如硝酸,只要所述溶液有助于氧化角蛋白巯基即可。

现在转向图3,显示了根据本发明实施例合成的犀牛角类似物的样品光谱310。以下特征值得注意:

a.在3250cm-1处的315,属于胆固醇的o-h伸缩振动;

b.在3050cm-1处的320,属于伯胺的n-h伸缩振动;

c.在2900cm-1处的325,属于烃的c-h不对称伸缩振动;

d.在2850cm-1处的330,属于烃的c-h对称伸缩振动;

e.在2300cm-1处的335,属于磷脂的p-h伸缩振动;

f.在1650cm-1处的340,属于氨基酸的c=o伸缩振动;

g.在1550cm-1处的345,属于伯胺的n-h弯曲振动;

h.在1400cm-1处的350,属于烃的c-h弯曲振动;

i.在1200cm-1处的355,属于磷脂的p=o伸缩振动;

j.在1050cm-1处的360,属于牛磺酸的s=o伸缩振动;

k.在880cm-1处的365,属于牛磺酸的s-o伸缩振动。

因为仪器校准和采样方法,所以以上值得注意的特征可以具有高达40cm-1的峰差异。

现在参看图4,显示了别处所报告的牛角402、山羊角404、绵羊角406、牦牛角408以及犀牛角410的参考光谱(沈清(shengqing)等人“鉴别犀牛角和其替代物(identificationofrhinoceroshornanditssubstitutes).”先进材料研究(adv.mat.res.)2011;第177卷:636-639)。仍旧参看图4,如同参看图3一样,315与415、320与420、325与425、330与430、335与435、340与440、345与445、350与450、355与455、360与460以及365与465存在对应关系。光谱之间的差异最可能归因于以下事实:在产生样品谱310时使用了衰减全反射(atr),但参考谱410没有,衰减全反射是能够不用特殊准备就能检查样品的采样技术。一般来说,atr允许较高的空间分辨率成像。这就解释了为何样品谱310中的峰更尖锐些,尤其是在较低波长处。同样地,样品谱310中在2000cm-1周围的峰簇是来自芳香族化合物的振动,并且在钻石atr下更显著得多。尽管如此,但是样品谱310具有牛磺酸峰360和磷脂峰335二者。具体来说,所存在的牛磺酸峰和磷脂峰是区分犀牛角与其它角的定义峰。值得注意的是,因为仪器之间的分辨率差异和采样方法,所以所存在的峰与以上列出的峰之间可以具有高达±1-40cm-1的差异。

在一些实施例中,角蛋白基底主要可以包括α-螺旋。这些实施例不同于上述实施例,不同之处在于用氢氧化钙进行的初始消化将在空气中而不是氮气中进行。

就物理性质来说,犀牛角类似物具有肖氏a硬度92-96、肖氏d硬度68-72以及密度1.122-2.222g/cm3。这匹配野生犀牛的物理性质。此外,犀牛角类似物的总无机物含量匹配野生犀牛角的总无机物含量,含有:66-70%硫;15-19%钾;5-9%钙;0-3%铁;0.2-0.4%钛;以及0-4%锌。

在一些实施例中,犀牛角类似物中所用的角蛋白可以源自除羊毛之外的其它来源。一个此类来源是由遗传修饰酵母分泌的重组蛋白。可以使用的例示性角蛋白蛋白质显示于图6中,其中610是seqidno,并且620是硬角蛋白的氨基酸序列。

本发明不限于本文所披露的特定核苷酸和蛋白质序列(例如,seqidno.1-43),但确实包括这些序列的变异体和修饰。“变异体”包括相比于本文其它地方披露的序列具有一或多个添加、缺失、停止位置或取代的序列。

核苷酸序列内所包括的变异体解释了遗传密码的简并、等位基因变异体以及物种之间的同源序列。

蛋白质序列内所包括的变异体解释了保守或非保守氨基酸取代。“保守取代”或“保守氨基酸取代”涉及以下保守取代基中的一个中所发现的取代:第1组:丙氨酸(ala;a)、甘氨酸(gly;g)、丝氨酸(ser;s)、苏氨酸(thr;t);第2组:天冬氨酸(asp;d)、谷氨酸(glu;e);第3组:天冬酰胺(asn;n)、谷氨酰胺(gln;q);第4组:精氨酸(arg;r)、赖氨酸(lys;k)、组氨酸(his;h);第5组:异亮氨酸(ile;i)、亮氨酸(leu;l)、蛋氨酸(met;m)、缬氨酸(val;v);以及第6组:苯丙氨酸(phe;f)、酪氨酸(tyr;y)、色氨酸(trp;w)。

另外,氨基酸可以根据类似功能、化学结构或组成(例如酸性、碱性、脂肪族、芳香族或含硫)分到保守取代基组中。举例来说,出于取代的目的,脂肪族分组可以包括g、a、v、l和i。包括被视为彼此的保守取代的氨基酸的其它组包括:含硫:m和c;酸性:d、e、n和q;小脂肪族、非极性或微极性残基:a、s、t、p和g;极性、带负电残基和其酰胺:d、n、e和q;极性、带正电残基:h、r和k;大脂肪族、非极性残基:m、l、i、v和c;以及大芳香族残基:f、y和w。

非保守取代包括显著影响以下的取代:更改区域的蛋白质主链结构(例如,α-螺旋或β-折叠结构);目标位点分子的电荷或疏水性;或侧链的体积。预期通常产生蛋白质性质的最大改变的非保守取代是如下取代:其中(i)亲水性残基(例如s或t)可以取代(或被后者取代)疏水性残基(例如l、i、f、v或a);(ii)c或p可以取代(或被后者取代)任何其它残基;(iii)具有正电性侧链的残基(例如k、r或h)可以取代(或被后者取代)负电性残基(例如q或d);或(iv)具有庞大侧链的残基(例如f)可以取代(或被后者取代)不具有庞大侧链的残基(例如g)。额外信息见于克赖顿(creighton)(1984)蛋白质(proteins),w.h.弗里曼公司(w.h.freemanandcompany)。

本文所披露的序列的变异体还包括与本文所披露的序列具有至少70%序列一致性、至少80%序列一致性、至少85%序列一致性、至少90%序列一致性、至少95%序列一致性、至少96%序列一致性、至少97%序列一致性、至少98%序列一致性、或至少99%序列一致性的序列。

“序列一致性百分比(%)”就本文所鉴别的序列来说定义为在比对序列并且必要时引入空隙以实现最大的序列一致性百分比之后,候选序列中与参考序列中的核苷酸或氨基酸残基相同的核苷酸或氨基酸残基的百分比。为了确定氨基酸序列一致性百分比而进行的比对可以按本领域技能内的各种方式实现,例如使用公开可用的计算机软件,如blast、blast-2、align、align-2或megalign(dnastar)软件。本领域的普通技术人员可以确定用于测量比对的适当参数,包括在所比较的序列全长内实现最大比对所需的任何算法。举例来说,使用wu-blast-2计算机程序(奥特查尔(altschul)等人,酶学方法(methodsinenzymology),266:460-480(1996))产生的氨基酸序列一致性%值使用若干搜索参数,其中大部分设置为默认值。不是设置为默认值的参数(即,可调参数)按以下值设置:重叠跨度=1,重叠分率=0.125,单词阈值(t)=11以及评分矩阵blosum62。

变异体通常将展现与参考序列相同的定性生物活性,但是可以视需要选择变异体来修饰参考序列的特征。变异体的筛选可以使用本领域普通技术人员已知的分析进行。

在本发明的范围内还包括蛋白质的共价修饰。一种类型的共价修饰包括使所靶向的蛋白质的氨基酸残基与能够与蛋白质的所选侧链或n端或c端残基反应的有机衍生试剂反应。用双官能试剂衍生化可以适用于例如使蛋白质交联到水不溶性载体基质或表面上或适用于稳定性。常用交联剂包括1,1-双(重氮乙酰基)-2-苯乙烷、戊二醛、n-羟基丁二酰亚胺酯(例如,用4-叠氮基水杨酸所成的酯)、同型双官能酰亚胺酯,包括二丁二酰亚胺酯(例如,3,3'-二硫代双(丁二酰亚胺丙酸酯)、双官能顺丁烯二酰亚胺(例如,双-n-顺丁烯二酰亚胺基-1,8-辛烷)以及例如甲基-3-((对叠氮苯基)二硫基)丙酰亚胺酯和1-乙基-3-(-3-二甲氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐等试剂。

其它修饰包括谷酰胺酰基和天冬酰胺酰基残基分别脱酰胺为相应谷氨酰基和天冬氨酰基残基;p和l的羟基化;s或t残基的羟基的磷酸化;l、r和h侧链的氨基的甲基化(参见例如t.e.克赖顿,蛋白质:结构和分子性质(proteins:structureandmolecularproperties),w.h.弗里曼公司,旧金山(sanfrancisco),第79-86页(1983));n端胺的乙酰化和/或任何c端羧基的酰胺化。另外,还包括例如用聚乙二醇(和其它二醇)衍生化进行修饰以提高稳定性。

本发明范围内的另一种修饰是采用糖基化氨基酸残基(例如s、t或n残基),单独采用或以组合形式采用。糖基化可以使用标准条件进行,可以用来增强溶解度、更改药物动力学和药效学或者增强经由涉及糖苷部分的特异性或非特异性相互作用达成的结合。在另一种方法中,可以在手动或自动化固相蛋白质合成或者手动或自动化溶液相蛋白质合成期间,把例如o-(2-乙酰胺基-2-脱氧-3,4,6-三-o-乙酰基-β-d-吡喃葡萄糖基)s或类似的t衍生物(d-或l-氨基酸)等糖基化氨基酸并入到蛋白质中。类似地,可以采用d-或l-nγ-(2-乙酰胺基-2-脱氧-3,4,6-三-o-乙酰基-β-d-吡喃葡萄糖基)-n。期望使用借助于可以用于糖基化的经过适当官能化和活化的碳水化合物部分在侧接氧、氮或硫官能团上糖基化的氨基酸。这类碳水化合物官能团可以是单糖、二糖或寡糖的甚至更大的集合(吉伯格(kihlberg),1月(2000年)糖肽合成(glycopeptidesynthesis).fmoc固相肽合成的实用方法(fmocsolidphasepeptidesynthesis--apracticalapproach)(陈w.c.(chan,w.c.)和怀特p.d.(white,p.d.)编)牛津大学出版社(oxforduniversitypress),纽约州纽约(newyork,n.y.)第8章,第195-213页)。

还期望通过除糖基化以外的手段,经由异头碳(anomericcarbon)处的离去基的活化,将碳水化合物官能团附接到氨基酸上。氨基酸与糖苷的连接不限于与碳水化合物官能团的异头碳成键。实际上,碳水化合物部分与氨基酸的连接可以通过碳水化合物官能团的任何合适的反应性足够的氧原子、氮原子、碳原子或其它侧接原子,经由本领域中已知用于形成c-杂原子、c--c或杂原子-杂原子(实例是s--s、o--n、n--n、p--o、p--n)键所采用的方法。

例示性实施例

1.一种合成的犀牛角类似物,其中所述合成的犀牛角类似物匹配天然犀牛角的至少两个特征,所述特征选自:

a.具有在1050cm-1±1-40cm-1处的牛磺酸峰和在2300cm-1±1-40cm-1处的磷脂峰的衰减全反射(atr)光谱;

b.具有以下的衰减全反射(atr)光谱:在3250cm-1±1-40cm-1处的胆固醇峰;在3050cm-1±1-40cm-1处的伯胺峰;在2900cm-1±1-40cm-1处的烃峰;在2850cm-1±1-40cm-1处的烃峰;在2300cm-1±1-40cm-1处的磷脂峰;在1650cm-1±1-40cm-1处的氨基酸峰;在1550cm-1±1-40cm-1处的伯胺峰;在1400cm-1±1-40cm-1处的烃峰;在1200cm-1±1-40cm-1处的磷脂峰;在1050cm-1±1-40cm-1处的牛磺酸峰;以及在880cm-1±1-40cm-1处的牛磺酸峰;

c.肖氏a硬度92-96;

d.肖氏d硬度68-72;

e.密度1.122-2.222g/cm3

f.无机物含量:66-70%硫;15-19%钾;5-9%钙;0-3%铁;0.2-0.4%钛;以及0-4%锌;以及

g.有机物含量:1.6%-2.4%精氨酸;4-6%赖氨酸;7.2-10.8%胆固醇;2.75-3.25%牛磺酸;0%-1.25%己糖胺;以及0.1%-0.3%鞘氨醇。

2.根据实施例1所述的合成的犀牛角类似物,其匹配所有特征a.、b.、c.、d.、e.、f.以及g.。

3.根据实施例1所述的合成的犀牛角类似物,其匹配特征(i)a.、f.和g.或者(ii)a.、b.、f.和g.。

4.根据实施例1到3中任一实施例所述的合成的犀牛角类似物,其呈固体形式。

5.根据实施例1或3所述的合成的犀牛角类似物,其呈粉末形式。

6.根据实施例1到5中任一实施例所述的合成的犀牛角类似物,其被调配成组合物。

7.根据实施例6所述的合成的犀牛角类似物,其中所述组合物被调配成用于局部施用。

8.根据实施例1、3或5到7中任一实施例所述的合成的犀牛角类似物,其呈粉末形式,包装在2015年6月10日提交的第29/529,808号美国设计专利申请中所描绘的容器中。

9.根据实施例1到8中任一实施例所述的合成的犀牛角类似物,其被调配成组合物并且包装在2015年6月10日提交的第29/529,808号美国设计专利申请中所描绘的容器中。

10.根据实施例1到9中任一实施例所述的合成的犀牛角类似物,其包含药物添加剂或遗传添加剂。

11.根据实施例10所述的合成的犀牛角类似物,其中所述添加剂是选自咖啡因、阿司匹灵、醋氨酚、布洛芬、西地那非、他达拉非或其组合的药物添加剂。

12.根据实施例10或11所述的合成的犀牛角类似物,其中所述添加剂是选自seqidno.1-24的遗传添加剂。

13.根据实施例1到12中任一实施例所述的合成的犀牛角类似物,其中所述合成的犀牛角类似物具有角蛋白基底。

14.根据实施例13所述的合成的犀牛角类似物,其中所述角蛋白基底的角蛋白是从羊毛、鸟羽毛或遗传修饰酵母获得的。

15.根据实施例13或14所述的合成的犀牛角类似物,其中所述角蛋白基底的角蛋白具有选自seqidno.25-43的序列。

16.一种组合物,其包含合成的犀牛角类似物。

17.根据实施例16所述的组合物,其中所述组合物被调配成用于局部施用、摄入或吸入。

18.一种合成合成的犀牛角类似物的方法,其包含在角蛋白基底中捕获有机化合物。

19.根据实施例18所述的方法,其中捕获包含:

a.将聚合角蛋白与所述有机化合物混合于缓冲溶液中;

b.向所述经过混合的聚合角蛋白和有机化合物中添加第二溶液以帮助角蛋白巯基氧化;并且

c.将所述混合物干燥到水分含量低于1%,如通过卡尔费休滴定仪所测量。

20.根据实施例19所述的方法,其中所述聚合角蛋白包含β-折叠。

21.根据实施例19或20所述的方法,其中所述缓冲溶液是磷酸钾缓冲溶液。

22.根据实施例19到21中任一实施例所述的方法,其中所述第二溶液是过氧化氢或硝酸。

23.根据实施例18到22中任一实施例所述的方法,其中所述有机化合物包括精氨酸;赖氨酸;胆固醇;牛磺酸;己糖胺以及鞘氨醇。

24.根据实施例23所述的方法,其中所述有机化合物包括1.6%-2.4%精氨酸;4-6%赖氨酸;7.2-10.8%胆固醇;2.75-3.25%牛磺酸;0.1%-1.25%己糖胺;以及0.1%-0.3%鞘氨醇。

25.根据实施例19到24中任一实施例所述的方法,其进一步包含在步骤a.或步骤b.中添加药物添加剂、遗传添加剂或药物添加剂和遗传添加剂。

26.根据实施例25所述的方法,其中所述添加剂是选自咖啡因、阿司匹灵、醋氨酚、布洛芬、西地那非、他达拉非或其组合的药物添加剂。

27.根据实施例25或26所述的方法,其中所述添加剂是选自seqidno.1-24的遗传添加剂。

28.根据实施例19到27中任一实施例所述的方法,其进一步包含在所述混合之前,将碱性溶液中的角蛋白放置在非反应性氛围下。

29.根据实施例28所述的方法,其中所述碱性溶液是氢氧化钙或氢氧化钠。

30.根据实施例28或29所述的方法,其中所述非反应性氛围是氮气氛围或氩气氛围。

31.根据实施例28到30中任一实施例所述的方法,其中所述角蛋白在所述碱性溶液中在40-50℃下保持12-48小时。

32.根据实施例28到31中任一实施例所述的方法,其中所述角蛋白的ph为5-5.5。

33.根据实施例28到32中任一实施例所述的方法,其中所述角蛋白的分子量为3,500-4,500道尔顿。

34.一种合成的犀牛角类似物,其中所述合成的犀牛角类似物匹配天然犀牛角的至少三个特征,所述特征选自硬度、密度、表面形态、颜色、质地、分解率、脆性、拉伸强度、光学表示、有机组分的存在情况和百分比以及无机组分的存在情况和百分比,其中匹配定义为所述合成的犀牛角类似物与所述天然犀牛角之间的特征测量差异为20%或更小。

35.根据实施例34所述的合成的犀牛角类似物,其中所述合成的犀牛角类似物与所述天然犀牛角之间的所述特征测量差异为15%或更小、10%或更小、5%或更小、3%或更小或1%或更小。

36.根据实施例34或35所述的合成的犀牛角类似物,其呈固体形式。

37.根据实施例34或35所述的合成的犀牛角类似物,其呈粉末形式。

38.根据实施例34到37中任一实施例所述的合成的犀牛角类似物,其被调配成组合物。

39.根据实施例38所述的合成的犀牛角类似物,其中所述组合物被调配成用于局部施用。

40.根据实施例34、35或37到39中任一实施例所述的合成的犀牛角类似物,其呈粉末形式,包装在2015年6月10日提交的第29/529,808号美国设计专利申请中所描绘的容器中。

41.根据实施例34到40中任一实施例所述的合成的犀牛角类似物,其被调配成组合物并且包装在2015年6月10日提交的第29/529,808号美国设计专利申请中所描绘的容器中。

42.根据实施例34到41中任一实施例所述的合成的犀牛角类似物,其包含药物添加剂或遗传添加剂。

43.根据实施例42所述的合成的犀牛角类似物,其中所述添加剂是选自咖啡因、阿司匹灵、醋氨酚、布洛芬、西地那非、他达拉非或其组合的药物添加剂。

44.根据实施例42或43所述的合成的犀牛角类似物,其中所述添加剂是选自seqidno.1-24的遗传添加剂。

45.根据实施例34到44中任一实施例所述的合成的犀牛角类似物,其中所述合成的犀牛角类似物具有角蛋白基底。

46.根据实施例45所述的合成的犀牛角类似物,其中所述角蛋白基底的角蛋白是从羊毛、鸟羽毛或遗传修饰酵母获得的。

47.根据实施例45或46所述的合成的犀牛角类似物,其中所述角蛋白基底的角蛋白具有选自seqidno.25-43的序列。

48.根据实施例34所述的合成的犀牛角类似物,其中所测量的特征反映以下中的至少两个:

a.具有在1050cm-1±1-40cm-1处的牛磺酸峰和在2300cm-1±1-40cm-1处的磷脂峰的衰减全反射(atr)光谱;

b.具有以下的衰减全反射(atr)光谱:在3250cm-1±1-40cm-1处的胆固醇峰;在3050cm-1±1-40cm-1处的伯胺峰;在2900cm-1±1-40cm-1处的烃峰;在2850cm-1±1-40cm-1处的烃峰;在2300cm-1±1-40cm-1处的磷脂峰;在1650cm-1±1-40cm-1处的氨基酸峰;在1550cm-1±1-40cm-1处的伯胺峰;在1400cm-1±1-40cm-1处的烃峰;在1200cm-1±1-40cm-1处的磷脂峰;在1050cm-1±1-40cm-1处的牛磺酸峰;以及在880cm-1±1-40cm-1处的牛磺酸峰;

c.肖氏a硬度92-96;

d.肖氏d硬度68-72;

e.密度1.122-1.222g/cm3

f.无机物含量:66-70%硫;15-19%钾;5-9%钙;0-3%铁;0.2-0.4%钛;以及0-4%锌;以及

g.有机物含量:1.6%-2.4%精氨酸;4-6%赖氨酸;7.2-10.8%胆固醇;2.75-3.25%牛磺酸;0%-1.25%己糖胺;以及0.1%-0.3%鞘氨醇。

如本领域普通技术人员将理解,本文所披露的各实施例可包含其具体陈述的元件、步骤、成分或组分,基本上由其组成或由其组成。因此,术语“包括(include/including)”应解释为列举:“包含、由……组成或基本上由……组成”。过渡术语“包含(comprise/comprises)”意思是包括(但不限于),并且允许纳入甚至呈主要量的未指定元件、步骤、成分或组分。过渡短语“由……组成”不包括任何未指定的元件、步骤、成分或组分。过渡短语“基本上由……组成”将实施例的范围限制在指定元件、步骤、成分或组分以及不显著影响实施例的那些。材料效应将导致以合成方式产生的物质不匹配天然犀牛角的光谱,峰偏差范围为1-40cm-1

除非另外指示,否则本说明书和权利要求书中所用的表示成分量、性质(例如分子量)、反应条件等的所有数值应理解为在所有情况下都由术语“约”修饰。因此,除非指明为相反的,否则在说明书和所附权利要求书中所阐述的数值参数是可能取决于试图通过本发明获得的所需性质而变化的近似值。最低限度地,并且不试图限制等效物原则对权利要求书范围的应用,每一个数值参数都应至少根据所报告的有效数字的数量并且通过应用一般四舍五入技术来解释。当需要进一步阐明时,在结合所陈述数值或范围使用时,术语“约”具有由本领域的普通技术人员合理地归属至其的意义,即表示比所陈述值或范围略大或略小,在所陈述值的±20%的范围内;所陈述值的±19%的范围内;所陈述值的±18%的范围内;所陈述值的±17%的范围内;所陈述值的±16%的范围内;所陈述值的±15%的范围内;所陈述值的±14%的范围内;所陈述值的±13%的范围内;所陈述值的±12%的范围内;所陈述值的±11%的范围内;所陈述值的±10%的范围内;所陈述值的±9%的范围内;所陈述值的±8%的范围内;所陈述值的±7%的范围内;所陈述值的±6%的范围内;所陈述值的±5%的范围内;所陈述值的±4%的范围内;所陈述值的±3%的范围内;所陈述值的±2%的范围内或所陈述值的±1%的范围内。

尽管阐述本发明的广泛范围的数值范围和参数是近似值,但特定实例中所阐述的数值是尽可能精确报导的。但是,任何数值固有地含有某些由其相应测试测量值中所发现的标准偏差必然造成的误差。

除非本文另外指示或明显与上下文相矛盾,否则在描述本发明的情形下(尤其在所附权利要求书的情形下)所用的术语“一(a/an)”、“所述”和类似指示物应解释为涵盖单数和复数两者。本文中值的范围的叙述仅打算充当个别地提及处于所述范围内的每个单独值的简写方法。除非本文另外指示,否则每一个别值并入到本说明书中,如同其在本文中个别地列举一般。除非本文另外指出或另外明显与上下文相矛盾,否则本文中所描述的所有方法可以任何合适的顺序进行。本文提供的任何和所有实例或例示性语言(例如,“如”)的使用仅打算更好地阐明本发明,并且不对以其它方式所主张的本发明范围造成限制。本说明书中的任何语言都不应解释为指示任何未主张的要素对于实践本发明来说是必需的。

本文所公开的本发明的替代性要素或实施例的分组不应解释为限制。每一个群组成员都可以个别地或以与所述群组中其它成员或本文中所见其它要素的任何组合形式来提及和要求。预期群组中的一或多个成员可以出于便利性和/或专利性的原因而包括于群组中或从群组删除。当任何这类包括或删除发生时,本说明书被认为如所修改地含有群组,因此满足所附权利要求书中所用的所有马库西群组(markushgroup)的书面描述。

本文中描述了本发明的某些实施例,包括本发明人已知的用于实施本发明的最佳模式。当然,在阅读前述说明之后,这些所描述实施例的变化对于本领域的技术人员将变得显而易见。本发明人期望熟练的业内人士适当时采用此类变化,并且本发明人打算以不同于本文中特定描述的其它方式来实施本发明。因此,本发明包括适用法律所允许的随附权利要求书中所引述的主题的所有修改和等效物。此外,除非本文中另有说明或另外明显与内容相矛盾,否则本发明涵盖上述要素以其所有可能的变化形式的任何组合。

此外,在整个本说明书中已参考了很多专利、印刷出版物、期刊文章以及其它书面文本(本文所提到的材料)。所提到的材料各自关于其所提到的教示内容以全文引用的方式单独并入本文中。

最后,应理解本文所披露的本发明实施例说明本发明的原理。可以采用的其它修改在本发明的范围内。因此,举例来说,可以根据本文中的教示内容采用本发明的替代性配置。因此,本发明不限于如所精确展示和描述的内容。

本文中所示的细节是作为实例并且仅出于说明性论述本发明的优选实施例的目的,并且是为了提供被认为本发明的各个实施例的原理和概念方面的最有用且容易理解的描述而呈现。在这一方面,没有尝试比基础理解本发明所必需的程度更详细地展示本发明的结构细节,本说明书加上图式和/或实例使得本领域的技术人员很清楚如何在实际中实施本发明的几种形式。

除非实例中清晰且明确修改或当意义的应用显现无意义或基本上无意义的任何构造时,否则用于本发明中的定义和解释意思是并且打算控制任何未来构造。在术语构造将使其无意义或基本上无意义的情况下,定义应取自第3版韦氏词典或本领域普通技术人员已知的词典,如生物化学与分子生物学牛津词典(安东尼史密斯(anthonysmith)编,牛津大学出版社,牛津,2004)。

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