2‑(4‑(4‑乙氧基‑6‑氧代‑1,6‑二氢吡啶‑3‑基)‑2‑氟苯基)‑N‑(5‑(1,1,1‑三氟‑2‑甲基丙‑2‑基)异噁唑‑3‑基)乙酰胺的晶型的制作方法

发明背景

在寻求固体、口服给药的药用化合物的可开发形式时，发现了许多具体特征。虽然可以开发药用化合物的无定形形式，但是通常优选具有高结晶度的化合物。

国际专利申请号pct/ib2014/059817公开了一系列化合物，其为转染重排(rearrangedduringtransfection,ret)激酶的抑制剂，并且其可用于治疗ret-介导的病症。在本申请中具体公开的是化合物2-(4-(4-乙氧基-6-氧代-1,6-二氢吡啶-3-基)-2-氟苯基)-n-(5-(1,1,1-三氟-2-甲基丙-2-基)异噁唑-3-基)乙酰胺(下文称为“化合物a”)。鉴定具有用于口服给药的合适性质的这种化合物的稳定晶型对于治疗ret-介导的疾病是非常需要的。

发明概述

本发明涉及2-(4-(4-乙氧基-6-氧代-1,6-二氢吡啶-3-基)-2-氟苯基)-n-(5-(1,1,1-三氟-2-甲基丙-2-基)异噁唑-3-基)乙酰胺的新晶型。本发明化合物表示为式(i)：

本发明化合物可用于抑制转染重排(ret)激酶，并用于正常化胃肠道敏感性、活动性和/或分泌和/或腹部病症或疾病，和/或用于治疗与ret障碍相关的或其中调节ret活性具有治疗益处的疾病，包括但不局限于所有类型的肠易激综合征(ibs)(包括腹泻型、便秘型或交替粪便型)、功能性胃气胀、功能性便秘、功能性腹泻、非特异性功能性肠病、功能性腹痛综合征、慢性特发性便秘、功能性食管病症、功能性胃十二指肠病症、功能性肛门直肠疼痛、炎性肠病、增殖性疾病(例如非小细胞肺癌)、肝细胞癌、结肠直肠癌、甲状腺髓样癌、滤泡性甲状腺癌、甲状腺未分化癌、甲状腺乳头状癌、脑瘤、腹腔癌、实体瘤、其它肺癌、头颈癌、神经胶质瘤、成神经细胞瘤、希佩尔·林道综合征和肾肿瘤、乳腺癌、输卵管癌、卵巢癌、移行细胞癌、前列腺癌、食管和胃食管连接癌、胆管癌和腺癌，以及ret激酶活性增加的任何恶性肿瘤。

附图说明

图1显示了化合物a一水合物的x-射线粉晶衍射图。

图2显示了化合物a一水合物的拉曼光谱。

图3显示了化合物a一水合物的差示扫描热量法曲线。

图4显示了化合物a一水合物的热重量分析曲线。

图5显示了化合物a非溶剂合物形式1的x-射线粉晶衍射图。

图6显示了化合物a非溶剂合物形式1的拉曼光谱。

图7显示了化合物a非溶剂合物形式1的差示扫描热量法曲线。

图8显示了化合物a非溶剂合物形式1的热重量分析曲线。

图9显示了化合物a非溶剂合物形式2的x-射线粉晶衍射图。

图10显示了化合物a非溶剂合物形式2的拉曼光谱。

图11显示了化合物a非溶剂合物形式2的差示扫描热量法曲线。

图12显示了化合物a非溶剂合物形式3的x-射线粉晶衍射图。

图13显示了化合物a非溶剂合物形式3的拉曼光谱。

图14显示了化合物a非溶剂合物形式3的差示扫描热量法曲线。

图15显示了化合物a非溶剂合物形式3的热重量分析曲线。

发明详述

本发明涉及2-(4-(4-乙氧基-6-氧代-1,6-二氢吡啶-3-基)-2-氟苯基)-n-(5-(1,1,1-三氟-2-甲基丙-2-基)异噁唑-3-基)乙酰胺的晶型。

在一些实施方案中，2-(4-(4-乙氧基-6-氧代-1,6-二氢吡啶-3-基)-2-氟苯基)-n-(5-(1,1,1-三氟-2-甲基丙-2-基)异噁唑-3-基)乙酰胺的晶型(化合物a一水合物)特征在于当使用cukα辐射测量时，具有包括至少九个以下衍射角的x-射线粉晶衍射(xrpd)图，所述衍射角选自大约10.1、10.7、11.5、13.2、13.9、14.3、16.7、17.1、17.6、18.3、18.4、18.9、20.3、20.7、21.4、21.6、22.0、23.2、23.9、24.9、25.2、26.3、26.6、27.4、28.6、29.3、30.0、30.7、31.2、32.6、34.3、35.9、38.5和39.4度2θ。在另一实施方案中，化合物a一水合物特征在于当使用cukα辐射测量时，具有包括至少八个以下衍射角或至少七个以下衍射角或至少六个以下衍射角或至少五个以下衍射角或至少四个以下衍射角的x-射线粉晶衍射(xrpd)图，所述衍射角选自大约10.1、10.7、11.5、13.2、13.9、14.3、16.7、17.1、17.6、18.3、18.4、18.9、20.3、20.7、21.4、21.6、22.0、23.2、23.9、24.9、25.2、26.3、26.6、27.4、28.6、29.3、30.0、30.7、31.2、32.6、34.3、35.9、38.5和39.4度2θ。在另一实施方案中，化合物a一水合物特征在于当使用cukα辐射测量时，具有包括至少三个以下衍射角的x-射线粉晶衍射(xrpd)图，所述衍射角选自大约10.1、10.7、11.5、13.2、13.9、14.3、16.7、17.1、17.6、18.3、18.4、18.9、20.3、20.7、21.4、21.6、22.0、23.2、23.9、24.9、25.2、26.3、26.6、27.4、28.6、29.3、30.0、30.7、31.2、32.6、34.3、35.9、38.5和39.4度2θ。

在另一实施方案中，化合物a一水合物特征在于当使用cukα辐射测量时，具有包括至少九个以下衍射角的x-射线粉晶衍射(xrpd)图，所述衍射角选自大约10.1、10.7、11.5、13.9、17.1、18.3、18.4、20.3、20.7、21.4、21.6、22.0、23.2、23.9、24.9、25.2、26.3、26.6、28.6、30.0和32.6度2θ。在另一实施方案中，化合物a一水合物特征在于当使用cukα辐射测量时，具有包括至少八个以下衍射角或至少七个以下衍射角或至少六个以下衍射角或至少五个以下衍射角或至少四个以下衍射角的x-射线粉晶衍射(xrpd)图，所述衍射角选自大约10.1、10.7、11.5、13.9、17.1、18.3、18.4、20.3、20.7、21.4、21.6、22.0、23.2、23.9、24.9、25.2、26.3、26.6、28.6、30.0和32.6度2θ。在另一实施方案中，化合物a一水合物特征在于当使用cukα辐射测量时，具有包括至少三个以下衍射角的x-射线粉晶衍射(xrpd)图，所述衍射角选自大约10.1、10.7、11.5、13.9、17.1、18.3、18.4、20.3、20.7、21.4、21.6、22.0、23.2、23.9、24.9、25.2、26.3、26.6、28.6、30.0和32.6度2θ。

在另一实施方案中，化合物a一水合物特征在于当使用cukα辐射测量时，具有包括至少九个以下衍射角的x-射线粉晶衍射(xrpd)图，所述衍射角选自大约10.1、10.7、11.5、13.9、17.1、18.3、18.4、20.3、20.7、21.4、21.6、22.0、23.2、23.9、24.9和26.6度2θ。在另一实施方案中，化合物a一水合物特征在于当使用cukα辐射测量时，具有包括至少八个以下衍射角或至少七个以下衍射角或至少六个以下衍射角或至少五个以下衍射角或至少四个以下衍射角的x-射线粉晶衍射(xrpd)图，所述衍射角选自大约10.1、10.7、11.5、13.9、17.1、18.3、18.4、20.3、20.7、21.4、21.6、22.0、23.2、23.9、24.9和26.6度2θ。在另一实施方案中，化合物a一水合物特征在于当使用cukα辐射测量时，具有包括至少三个以下衍射角的x-射线粉晶衍射(xrpd)图，所述衍射角选自大约10.1、10.7、11.5、13.9、17.1、18.3、18.4、20.3、20.7、21.4、21.6、22.0、23.2、23.9、24.9和26.6度2θ。

在又一实施方案中，化合物a一水合物特征在于当使用cukα辐射测量时，具有包括以下衍射角的x-射线粉晶衍射(xrpd)图：大约13.9、17.1、18.3、18.4、21.4、21.6和23.9度2θ。在又一实施方案中，化合物a一水合物特征在于具有基本上符合图1的x-射线粉晶衍射(xrpd)图。

在其它实施方案中，化合物a一水合物特征在于包括至少九个在以下位置的峰的拉曼光谱，其中所述峰在大约422、450、489、516、545、575、669、700、716、733、774、818、894、918、963、989、1032、1112、1174、1241、1296、1334、1428、1463、1484、1506、1532、1566、1629、1645、1721、2930、2990和3087cm^-1。在另一实施方案中，化合物a一水合物特征在于包括至少八个在以下位置的峰或至少七个在以下位置的峰或至少六个在以下位置的峰或至少五个在以下位置的峰或至少四个在以下位置的峰或至少三个在以下位置的峰的拉曼光谱，其中所述峰在大约422、450、489、516、545、575、669、700、716、733、774、818、894、918、963、989、1032、1112、1174、1241、1296、1334、1428、1463、1484、1506、1532、1566、1629、1645、1721、2930、2990和3087cm^-1。在另一实施方案中，化合物a一水合物特征在于包括至少三个在以下位置的峰的拉曼光谱，其中所述峰在大约422、450、489、516、545、575、669、700、716、733、774、818、894、918、963、989、1032、1112、1174、1241、1296、1334、1428、1463、1484、1506、1532、1566、1629、1645、1721、2930、2990和3087cm^-1。

在一个实施方案中，化合物a一水合物特征在于包括至少三个在以下位置的峰的拉曼光谱，其中所述峰在大约422、450、733、774、963、989、1032、1112、1174、1241、1296、1334、1428、1463、1484、1506、1532、1566、1629、1645、1721、2930、2990和3087cm^-1。在另一实施方案中，化合物a一水合物特征在于包括至少三个在以下位置的峰的拉曼光谱，其中所述峰在大约733、774、963、1032、1241、1296、1334、1428、1463、1484、1532、1629、1645、2930和3087cm^-1。在又一实施方案中，化合物a一水合物特征在于包括在以下位置的峰的拉曼光谱：大约774、1032、1241、1296、1334、1428、1484、1532、1629、2930和3087cm^-1。在又一实施方案中，化合物a一水合物特征在于具有基本上符合图2的拉曼光谱。

在进一步实施方案中，化合物a一水合物特征在于具有基本上符合图3的差示扫描热量法曲线和/或基本上符合图4的热重量分析曲线。

在更进一步实施方案中，如本领域技术人员将理解，化合物a一水合物特征在于表征上述实施方案的分析数据的任意组合。例如，在一个实施方案中，化合物a一水合物特征在于具有基本上符合图1的x-射线粉晶衍射(xrpd)图和基本上符合图2的拉曼光谱和基本上符合图3的差示扫描热量法曲线和基本上符合图4的热重量分析曲线。在另一实施方案中，化合物a一水合物特征在于具有基本上符合图1的x-射线粉晶衍射(xrpd)图和基本上符合图2的拉曼光谱。在另一实施方案中，化合物a一水合物特征在于具有基本上符合图1的x-射线粉晶衍射(xrpd)图和基本上符合图3的差示扫描热量法曲线。在另一实施方案中，化合物a一水合物特征在于具有基本上符合图1的x-射线粉晶衍射(xrpd)图和基本上符合图4的热重量分析曲线。在另一实施方案中，化合物a一水合物特征在于当使用cukα辐射测量时，具有包括以下衍射角的x-射线粉晶衍射(xrpd)图：大约13.9、17.1、18.3、18.4、21.4、21.6和23.9度2θ，以及包括在以下位置的峰的拉曼光谱：大约774、1032、1241、1296、1334、1428、1484、1532、1629、2930和3087cm^-1。在另一实施方案中，化合物a一水合物特征在于当使用cukα辐射测量时，具有包括以下衍射角的x-射线粉晶衍射(xrpd)图：大约13.9、17.1、18.3、18.4、21.4、21.6和23.9度2θ，以及基本上符合图3的差示扫描热量法曲线。在另一实施方案中，化合物a一水合物特征在于当使用cukα辐射测量时，具有包括以下衍射角的x-射线粉晶衍射(xrpd)图：大约13.9、17.1、18.3、18.4、21.4、21.6和23.9度2θ，以及基本上符合图4的热重量分析曲线。

在一些实施方案中，2-(4-(4-乙氧基-6-氧代-1,6-二氢吡啶-3-基)-2-氟苯基)-n-(5-(1,1,1-三氟-2-甲基丙-2-基)异噁唑-3-基)乙酰胺的晶型(化合物a非溶剂合物形式1)特征在于当使用cukα辐射测量时，具有包括至少九个以下衍射角的x-射线粉晶衍射(xrpd)图，所述衍射角选自大约4.5、5.0、6.0、7.9、9.3、10.0、11.2、13.1、13.3、13.8、15.0、15.5、16.6、17.1、18.2、18.7、19.0、19.7、20.2、20.7、21.6、22.6、23.3、23.8、24.3、26.0、26.6、27.2、28.1、28.7、29.1、30.3、31.3和35.6度2θ。在另一实施方案中，化合物a非溶剂合物形式1特征在于当使用cukα辐射测量时，具有包括至少八个以下衍射角或至少七个以下衍射角或至少六个以下衍射角或至少五个以下衍射角或至少四个以下衍射角的x-射线粉晶衍射(xrpd)图，所述衍射角选自大约4.5、5.0、6.0、7.9、9.3、10.0、11.2、13.1、13.3、13.8、15.0、15.5、16.6、17.1、18.2、18.7、19.0、19.7、20.2、20.7、21.6、22.6、23.3、23.8、24.3、26.0、26.6、27.2、28.1、28.7、29.1、30.3、31.3和35.6度2θ。在另一实施方案中，化合物a非溶剂合物形式1特征在于当使用cukα辐射测量时，具有包括至少三个以下衍射角的x-射线粉晶衍射(xrpd)图，所述衍射角选自大约4.5、5.0、6.0、7.9、9.3、10.0、11.2、13.1、13.3、13.8、15.0、15.5、16.6、17.1、18.2、18.7、19.0、19.7、20.2、20.7、21.6、22.6、23.3、23.8、24.3、26.0、26.6、27.2、28.1、28.7、29.1、30.3、31.3和35.6度2θ。

在另一实施方案中，化合物a非溶剂合物形式1特征在于当使用cukα辐射测量时，具有包括至少九个以下衍射角的x-射线粉晶衍射(xrpd)图，所述衍射角选自大约4.5、6.0、7.9、9.3、10.0、13.1、13.3、13.8、15.0、15.5、16.6、17.1、18.2、18.7、19.0、19.7、20.2、20.7、21.6、22.6、23.3、23.8、24.3、26.0、26.6、27.2和28.7度2θ。在另一实施方案中，化合物a非溶剂合物形式1特征在于当使用cukα辐射测量时，具有包括至少八个以下衍射角或至少七个以下衍射角或至少六个以下衍射角或至少五个以下衍射角或至少四个以下衍射角的x-射线粉晶衍射(xrpd)图，所述衍射角选自大约4.5、6.0、7.9、9.3、10.0、13.1、13.3、13.8、15.0、15.5、16.6、17.1、18.2、18.7、19.0、19.7、20.2、20.7、21.6、22.6、23.3、23.8、24.3、26.0、26.6、27.2和28.7度2θ。在另一实施方案中，化合物a非溶剂合物形式1特征在于当使用cukα辐射测量时，具有包括至少三个以下衍射角的x-射线粉晶衍射(xrpd)图，所述衍射角选自大约4.5、6.0、7.9、9.3、10.0、13.1、13.3、13.8、15.0、15.5、16.6、17.1、18.2、18.7、19.0、19.7、20.2、20.7、21.6、22.6、23.3、23.8、24.3、26.0、26.6、27.2和28.7度2θ。

在另一实施方案中，化合物a非溶剂合物形式1特征在于当使用cukα辐射测量时，具有包括至少九个以下衍射角的x-射线粉晶衍射(xrpd)图，所述衍射角选自大约4.5、9.3、13.1、13.3、13.8、15.0、17.1、18.2、18.7、19.7、21.6、22.6、23.3、23.8、24.3、26.0、26.6和28.7度2θ。在另一实施方案中，化合物a非溶剂合物形式1特征在于当使用cukα辐射测量时，具有包括至少八个以下衍射角或至少七个以下衍射角或至少六个以下衍射角或至少五个以下衍射角或至少四个以下衍射角的x-射线粉晶衍射(xrpd)图，所述衍射角选自大约4.5、9.3、13.1、13.3、13.8、15.0、17.1、18.2、18.7、19.7、21.6、22.6、23.3、23.8、24.3、26.0、26.6和28.7度2θ。在另一实施方案中，化合物a非溶剂合物形式1特征在于当使用cukα辐射测量时，具有包括至少三个以下衍射角的x-射线粉晶衍射(xrpd)图，所述衍射角选自大约4.5、9.3、13.1、13.3、13.8、15.0、17.1、18.2、18.7、19.7、21.6、22.6、23.3、23.8、24.3、26.0、26.6和28.7度2θ。

在又一实施方案中，化合物a非溶剂合物形式1特征在于当使用cukα辐射测量时，具有包括以下衍射角的x-射线粉晶衍射(xrpd)图：大约13.1、13.3、17.1、18.2、21.6、23.3和23.8度2θ。在又一实施方案中，化合物a非溶剂合物形式1特征在于具有基本上符合图5的x-射线粉晶衍射(xrpd)图。

在其它实施方案中，化合物a非溶剂合物形式1特征在于包括至少九个在以下位置的峰的拉曼光谱，其中所述峰在大约450、544、566、668、726、771、819、898、978、1035、1110、1176、1242、1273、1329、1424、1470、1484、1511、1534、1626、1681、2930、2999和3093cm^-1。在另一实施方案中，化合物a非溶剂合物形式1特征在于包括至少八个在以下位置的峰或至少七个在以下位置的峰或至少六个在以下位置的峰或至少五个在以下位置的峰或至少四个在以下位置的峰或至少三个在以下位置的峰的拉曼光谱，其中所述峰在大约450、544、566、668、726、771、819、898、978、1035、1110、1176、1242、1273、1329、1424、1470、1484、1511、1534、1626、1681、2930、2999和3093cm^-1。在另一实施方案中，化合物a非溶剂合物形式1特征在于包括至少三个在以下位置的峰的拉曼光谱，其中所述峰在大约450、544、566、668、726、771、819、898、978、1035、1110、1176、1242、1273、1329、1424、1470、1484、1511、1534、1626、1681、2930、2999和3093cm^-1。

在一个实施方案中，化合物a非溶剂合物形式1特征在于包括至少三个在以下位置的峰的拉曼光谱，其中所述峰在大约726、771、819、978、1035、1110、1176、1242、1273、1329、1424、1470、1484、1511、1534、1626、1681、2930、2999和3093cm^-1。在另一实施方案中，化合物a非溶剂合物形式1特征在于包括至少三个在以下位置的峰的拉曼光谱，其中所述峰在大约771、978、1035、1176、1242、1273、1329、1424、1470、1511、1534、1626、2930和2999cm^-1。在又一实施方案中，化合物a非溶剂合物形式1特征在于包括在以下位置的峰的拉曼光谱：大约1242、1329、1470、1626、2930和2999cm^-1。在又一实施方案中，化合物a非溶剂合物形式1特征在于具有基本上符合图6的拉曼光谱。

在进一步实施方案中，化合物a非溶剂合物形式1特征在于具有基本上符合图7的差示扫描热量法曲线和/或基本上符合图8的热重量分析曲线。

在更进一步实施方案中，如本领域技术人员将理解，化合物a非溶剂合物形式1特征在于表征上述实施方案的分析数据的任意组合。例如，在一个实施方案中，化合物a非溶剂合物形式1特征在于具有基本上符合图5的x-射线粉晶衍射(xrpd)图和基本上符合图6的拉曼光谱和基本上符合图7的差示扫描热量法曲线和基本上符合图8的热重量分析曲线。在另一实施方案中，化合物a非溶剂合物形式1特征在于具有基本上符合图5的x-射线粉晶衍射(xrpd)图和基本上符合图6的拉曼光谱。在另一实施方案中，化合物a非溶剂合物形式1特征在于具有基本上符合图5的x-射线粉晶衍射(xrpd)图和基本上符合图7的差示扫描热量法曲线。在另一实施方案中，化合物a非溶剂合物形式1特征在于具有基本上符合图5的x-射线粉晶衍射(xrpd)图和基本上符合图8的热重量分析曲线。在另一实施方案中，化合物a非溶剂合物形式1特征在于当使用cukα辐射测量时，具有包括以下衍射角的x-射线粉晶衍射(xrpd)图：大约13.1、13.3、17.1、18.2、21.6、23.3和23.8度2θ，以及包括在以下位置的峰的拉曼光谱：大约1242、1329、1470、1626、2930和2999cm^-1。在另一实施方案中，化合物a非溶剂合物形式1特征在于当使用cukα辐射测量时，具有包括以下衍射角的x-射线粉晶衍射(xrpd)图：大约13.1、13.3、17.1、18.2、21.6、23.3和23.8度2θ，以及基本上符合图7的差示扫描热量法曲线。在另一实施方案中，化合物a非溶剂合物形式1特征在于当使用cukα辐射测量时，具有包括以下衍射角的x-射线粉晶衍射(xrpd)图：大约13.1、13.3、17.1、18.2、21.6、23.3和23.8度2θ，以及基本上符合图8的热重量分析曲线。

在一些实施方案中，2-(4-(4-乙氧基-6-氧代-1,6-二氢吡啶-3-基)-2-氟苯基)-n-(5-(1,1,1-三氟-2-甲基丙-2-基)异噁唑-3-基)乙酰胺的晶型(化合物a非溶剂合物形式2)特征在于当使用cukα辐射测量时，具有包括至少九个以下衍射角的x-射线粉晶衍射(xrpd)图，所述衍射角选自大约6.4、12.7、14.2、15.4、16.1、17.2、17.9、18.9、19.6、20.1、21.2、21.9、22.8、23.7、24.7、25.6、26.6、28.7、29.5、32.3和34.9度2θ。在另一实施方案中，化合物a非溶剂合物形式2特征在于当使用cukα辐射测量时，具有包括至少八个以下衍射角或至少七个以下衍射角或至少六个以下衍射角或至少五个以下衍射角或至少四个以下衍射角的x-射线粉晶衍射(xrpd)图，所述衍射角选自大约6.4、12.7、14.2、15.4、16.1、17.2、17.9、18.9、19.6、20.1、21.2、21.9、22.8、23.7、24.7、25.6、26.6、28.7、29.5、32.3和34.9度2θ。在另一实施方案中，化合物a非溶剂合物形式2特征在于当使用cukα辐射测量时，具有包括至少三个以下衍射角的x-射线粉晶衍射(xrpd)图，所述衍射角选自大约6.4、12.7、14.2、15.4、16.1、17.2、17.9、18.9、19.6、20.1、21.2、21.9、22.8、23.7、24.7、25.6、26.6、28.7、29.5、32.3和34.9度2θ。

在另一实施方案中，化合物a非溶剂合物形式2特征在于当使用cukα辐射测量时，具有包括至少九个以下衍射角的x-射线粉晶衍射(xrpd)图，所述衍射角选自大约6.4、12.7、14.2、15.4、16.1、17.2、17.9、18.9、19.6、20.1、21.2、23.7、24.7、25.6、26.6和28.7度2θ。在另一实施方案中，化合物a非溶剂合物形式2特征在于当使用cukα辐射测量时，具有包括至少八个以下衍射角或至少七个以下衍射角或至少六个以下衍射角或至少五个以下衍射角或至少四个以下衍射角的x-射线粉晶衍射(xrpd)图，所述衍射角选自大约6.4、12.7、14.2、15.4、16.1、17.2、17.9、18.9、19.6、20.1、21.2、23.7、24.7、25.6、26.6和28.7度2θ。在另一实施方案中，化合物a非溶剂合物形式2特征在于当使用cukα辐射测量时，具有包括至少三个以下衍射角的x-射线粉晶衍射(xrpd)图，所述衍射角选自大约6.4、12.7、14.2、15.4、16.1、17.2、17.9、18.9、19.6、20.1、21.2、23.7、24.7、25.6、26.6和28.7度2θ。

在另一实施方案中，化合物a非溶剂合物形式2特征在于当使用cukα辐射测量时，具有包括至少九个以下衍射角的x-射线粉晶衍射(xrpd)图，所述衍射角选自大约6.4、12.7、14.2、15.4、17.2、17.9、18.9、20.1、21.2、25.6和26.6度2θ。在另一实施方案中，化合物a非溶剂合物形式2特征在于当使用cukα辐射测量时，具有包括至少八个以下衍射角或至少七个以下衍射角或至少六个以下衍射角或至少五个以下衍射角或至少四个以下衍射角的x-射线粉晶衍射(xrpd)图，所述衍射角选自大约6.4、12.7、14.2、15.4、17.2、17.9、18.9、20.1、21.2、25.6和26.6度2θ。在另一实施方案中，化合物a非溶剂合物形式2特征在于当使用cukα辐射测量时，具有包括至少三个以下衍射角的x-射线粉晶衍射(xrpd)图，所述衍射角选自大约6.4、12.7、14.2、15.4、17.2、17.9、18.9、20.1、21.2、25.6和26.6度2θ。

在又一实施方案中，化合物a非溶剂合物形式2特征在于当使用cukα辐射测量时，具有包括以下衍射角的x-射线粉晶衍射(xrpd)图：大约6.4、12.7、14.2、17.2、18.9、20.1和21.2度2θ。在又一实施方案中，化合物a非溶剂合物形式2特征在于具有基本上符合图9的x-射线粉晶衍射(xrpd)图。

在其它实施方案中，化合物a非溶剂合物形式2特征在于包括至少九个在以下位置的峰的拉曼光谱，其中所述峰在大约417、451、486、544、576、669、697、716、730、771、821、900、964、986、1035、1109、1175、1243、1265、1300、1336、1430、1465、1487、1527、1631、1640、1726、2919、2949、2997和3082cm^-1。在另一实施方案中，化合物a非溶剂合物形式2特征在于包括至少八个在以下位置的峰或至少七个在以下位置的峰或至少六个在以下位置的峰或至少五个在以下位置的峰或至少四个在以下位置的峰或至少三个在以下位置的峰的拉曼光谱，其中所述峰在大约417、451、486、544、576、669、697、716、730、771、821、900、964、986、1035、1109、1175、1243、1265、1300、1336、1430、1465、1487、1527、1631、1640、1726、2919、2949、2997和3082cm^-1。在另一实施方案中，化合物a非溶剂合物形式2特征在于包括至少三个在以下位置的峰的拉曼光谱，其中所述峰在大约417、451、486、544、576、669、697、716、730、771、821、900、964、986、1035、1109、1175、1243、1265、1300、1336、1430、1465、1487、1527、1631、1640、1726、2919、2949、2997和3082cm^-1。

在一个实施方案中，化合物a非溶剂合物形式2特征在于包括至少三个在以下位置的峰的拉曼光谱，其中所述峰在大约451、730、771、964、1035、1243、1265、1300、1336、1430、1465、1487、1527、1631、1640、1726、2919、2949、2997和3082cm^-1。在另一实施方案中，化合物a非溶剂合物形式2特征在于包括至少三个在以下位置的峰的拉曼光谱，其中所述峰在大约730、771、1243、1300、1336、1465、1527、1631、1726、2919和3082cm^-1。在又一实施方案中，化合物a非溶剂合物形式2特征在于包括在以下位置的峰的拉曼光谱：大约771、1300、1336、1465、1527、1631、2919和3082cm^-1。在又一实施方案中，化合物a非溶剂合物形式2特征在于具有基本上符合图10的拉曼光谱。

在进一步实施方案中，化合物a非溶剂合物形式2特征在于具有基本上符合图11的差示扫描热量法曲线。

在更进一步实施方案中，如本领域技术人员将理解，化合物a非溶剂合物形式2特征在于表征上述实施方案的分析数据的任意组合。例如，在一个实施方案中，化合物a非溶剂合物形式2特征在于具有基本上符合图9的x-射线粉晶衍射(xrpd)图和基本上符合图10的拉曼光谱和基本上符合图11的差示扫描热量法曲线。在另一实施方案中，化合物a非溶剂合物形式2特征在于具有基本上符合图9的x-射线粉晶衍射(xrpd)图和基本上符合图10的拉曼光谱。在另一实施方案中，化合物a非溶剂合物形式2特征在于具有基本上符合图9的x-射线粉晶衍射(xrpd)图和基本上符合图11的差示扫描热量法曲线。在另一实施方案中，化合物a非溶剂合物形式2特征在于当使用cukα辐射测量时，具有包括以下衍射角x-射线粉晶衍射(xrpd)图：大约6.4、12.7、14.2、17.2、18.9、20.1和21.2度2θ，以及包括在以下位置的峰的拉曼光谱：大约771、1300、1336、1465、1527、1631、2919和3082cm^-1。在另一实施方案中，化合物a非溶剂合物形式2特征在于当使用cukα辐射测量时，具有包括以下衍射角的x-射线粉晶衍射(xrpd)图：大约6.4、12.7、14.2、17.2、18.9、20.1和21.2度2θ，以及基本上符合图11的差示扫描热量法曲线。

在一些实施方案中，2-(4-(4-乙氧基-6-氧代-1,6-二氢吡啶-3-基)-2-氟苯基)-n-(5-(1,1,1-三氟-2-甲基丙-2-基)异噁唑-3-基)乙酰胺的晶型(化合物a非溶剂合物形式3)特征在于当使用cukα辐射测量时，具有包括至少九个以下衍射角的x-射线粉晶衍射(xrpd)图，所述衍射角选自大约9.6、11.0、11.7、13.8、14.3、15.3、16.6、17.2、17.5、18.8、19.3、20.3、21.1、21.4、22.0、23.0、23.6、24.5、25.8、26.2、27.4、27.7、28.6、29.6、30.8、31.0、31.4、32.3、33.3、35.9和39.2度2θ。在另一实施方案中，化合物a非溶剂合物形式3特征在于当使用cukα辐射测量时，具有包括至少八个以下衍射角或至少七个以下衍射角或至少六个以下衍射角或至少五个以下衍射角或至少四个以下衍射角的x-射线粉晶衍射(xrpd)图，所述衍射角选自大约9.6、11.0、11.7、13.8、14.3、15.3、16.6、17.2、17.5、18.8、19.3、20.3、21.1、21.4、22.0、23.0、23.6、24.5、25.8、26.2、27.4、27.7、28.6、29.6、30.8、31.0、31.4、32.3、33.3、35.9和39.2度2θ。在另一实施方案中，化合物a非溶剂合物形式3特征在于当使用cukα辐射测量时，具有包括至少三个以下衍射角的x-射线粉晶衍射(xrpd)图，所述衍射角选自大约9.6、11.0、11.7、13.8、14.3、15.3、16.6、17.2、17.5、18.8、19.3、20.3、21.1、21.4、22.0、23.0、23.6、24.5、25.8、26.2、27.4、27.7、28.6、29.6、30.8、31.0、31.4、32.3、33.3、35.9和39.2度2θ。

在另一实施方案中，化合物a非溶剂合物形式3特征在于当使用cukα辐射测量时，具有包括至少九个以下衍射角的x-射线粉晶衍射(xrpd)图，所述衍射角选自大约9.6、11.0、13.8、14.3、15.3、16.6、17.5、18.8、19.3、20.3、21.1、21.4、22.0、24.5、26.2、27.4、27.7、28.6、29.6、31.0、31.4、32.3和33.3度2θ。在另一实施方案中，化合物a非溶剂合物形式3特征在于当使用cukα辐射测量时，具有包括至少八个以下衍射角或至少七个以下衍射角或至少六个以下衍射角或至少五个以下衍射角或至少四个以下衍射角的x-射线粉晶衍射(xrpd)图，所述衍射角选自大约9.6、11.0、13.8、14.3、15.3、16.6、17.5、18.8、19.3、20.3、21.1、21.4、22.0、24.5、26.2、27.4、27.7、28.6、29.6、31.0、31.4、32.3和33.3度2θ。在另一实施方案中，化合物a非溶剂合物形式3特征在于当使用cukα辐射测量时，具有包括至少三个以下衍射角x-射线粉晶衍射(xrpd)图，所述衍射角选自大约9.6、11.0、13.8、14.3、15.3、16.6、17.5、18.8、19.3、20.3、21.1、21.4、22.0、24.5、26.2、27.4、27.7、28.6、29.6、31.0、31.4、32.3和33.3度2θ。

在另一实施方案中，化合物a非溶剂合物形式3特征在于当使用cukα辐射测量时，具有包括至少九个以下衍射角的x-射线粉晶衍射(xrpd)图，所述衍射角选自大约9.6、11.0、13.8、15.3、17.5、20.3、21.4、22.0、24.5、26.2和27.4度2θ。在另一实施方案中，化合物a非溶剂合物形式3特征在于当使用cukα辐射测量时，具有包括至少八个以下衍射角或至少七个以下衍射角或至少六个以下衍射角或至少五个以下衍射角或至少四个以下衍射角x-射线粉晶衍射(xrpd)图，所述衍射角选自大约9.6、11.0、13.8、15.3、17.5、20.3、21.4、22.0、24.5、26.2和27.4度2θ。在另一实施方案中，化合物a非溶剂合物形式3特征在于当使用cukα辐射测量时，具有包括至少三个以下衍射角的x-射线粉晶衍射(xrpd)图，所述衍射角选自大约9.6、11.0、13.8、15.3、17.5、20.3、21.4、22.0、24.5、26.2和27.4度2θ。

在又一实施方案中，化合物a非溶剂合物形式3特征在于当使用cukα辐射测量时，具有包括以下衍射角的x-射线粉晶衍射(xrpd)图：大约9.6、13.8、20.3、21.4、22.0、24.5和26.2度2θ。在又一实施方案中，化合物a非溶剂合物形式3特征在于具有基本上符合图12的x-射线粉晶衍射(xrpd)图。

在其它实施方案中，化合物a非溶剂合物形式3特征在于包括至少九个在以下位置的峰的拉曼光谱，其中所述峰在大约454、493、572、639、728、769、819、841、923、978、1037、1109、1190、1239、1287、1331、1429、1464、1485、1509、1542、1631、1714、2951、2994、3078和3093cm^-1。在另一实施方案中，化合物a非溶剂合物形式3特征在于包括至少八个在以下位置的峰或至少七个在以下位置的峰或至少六个在以下位置的峰或至少五个在以下位置的峰或至少四个在以下位置的峰或至少三个在以下位置的峰的拉曼光谱，其中所述峰在大约454、493、572、639、728、769、819、841、923、978、1037、1109、1190、1239、1287、1331、1429、1464、1485、1509、1542、1631、1714、2951、2994、3078和3093cm^-1。在另一实施方案中，化合物a非溶剂合物形式3特征在于包括至少三个在以下位置的峰的拉曼光谱，其中所述峰在大约454、493、572、639、728、769、819、841、923、978、1037、1109、1190、1239、1287、1331、1429、1464、1485、1509、1542、1631、1714、2951、2994、3078和3093cm^-1。

在一个实施方案中，化合物a非溶剂合物形式3特征在于包括至少三个在以下位置的峰的拉曼光谱，其中所述峰在大约572、728、769、978、1037、1109、1239、1287、1331、1429、1464、1485、1509、1542、1631、1714、2951、2994、3078和3093cm^-1。在另一实施方案中，化合物a非溶剂合物形式3特征在于包括至少三个在以下位置的峰的拉曼光谱，其中所述峰在大约769、978、1239、1331、1429、1464、1485、1509、1542、1631、2951和2994cm^-1。在又一实施方案中，化合物a非溶剂合物形式3特征在于包括在以下位置的峰的拉曼光谱：大约769、1239、1331、1464、1485、1631、2951和2994cm^-1。在又一实施方案中，化合物a非溶剂合物形式3特征在于具有基本上符合图13的拉曼光谱。

在进一步实施方案中，化合物a非溶剂合物形式3特征在于具有基本上符合图14的差示扫描热量法曲线和/或基本上符合图15的热重量分析曲线。

在更进一步实施方案中，如本领域技术人员将理解，化合物a非溶剂合物形式3特征在于表征上述实施方案的分析数据的任意组合。例如，在一个实施方案中，化合物a非溶剂合物形式3特征在于具有基本上符合图12的x-射线粉晶衍射(xrpd)图和基本上符合图13的拉曼光谱和基本上符合图14的差示扫描热量法曲线和基本上符合图15的热重量分析曲线。在另一实施方案中，化合物a非溶剂合物形式3特征在于具有基本上符合图12的x-射线粉晶衍射(xrpd)图和基本上符合图13的拉曼光谱。在另一实施方案中，化合物a非溶剂合物形式3特征在于具有基本上符合图12的x-射线粉晶衍射(xrpd)图和基本上符合图14的差示扫描热量法曲线。在另一实施方案中，化合物a非溶剂合物形式3特征在于具有基本上符合图12的x-射线粉晶衍射(xrpd)图和基本上符合图15的热重量分析曲线。在另一实施方案中，化合物a非溶剂合物形式3特征在于当使用cukα辐射测量时，具有包括以下衍射角的x-射线粉晶衍射(xrpd)图：大约9.6、13.8、20.3、21.4、22.0、24.5和26.2度2θ，以及包括在以下位置的峰的拉曼光谱：大约769、1239、1331、1464、1485、1631、2951和2994cm^-1。在另一实施方案中，化合物a非溶剂合物形式3特征在于当使用cukα辐射测量时，具有包括以下衍射角的x-射线粉晶衍射(xrpd)图：大约9.6、13.8、20.3、21.4、22.0、24.5和26.2度2θ，以及基本上符合图14的差示扫描热量法曲线。在另一实施方案中，化合物a非溶剂合物形式3特征在于当使用cukα辐射测量时，具有包括以下衍射角的x-射线粉晶衍射(xrpd)图：大约9.6、13.8、20.3、21.4、22.0、24.5和26.2度2θ，以及基本上符合图15的热重量分析曲线。

将理解，当xrpd图包括在指定值±0.3度2θ范围内的衍射角时，xrpd图将包括“大约”为本发明指定值的衍射角(表示为度2θ)。此外，本领域技术人员熟知并理解，获取x-射线粉晶衍射(xrpd)图时包括的所用装置、湿度、温度、粉晶定向和其它参数可能导致衍射图的外形、强度、和峰线位置出现变化。“基本上符合”本发明提供的图1、5、9或12的x-射线粉晶衍射图是本领域技术人员认为代表了与提供图1、5、9或12的xrpd图的化合物具有相同晶型的化合物的xrpd图。即，xrpd图可以与图1、5、9或12相同，或者更可能地有一定程度不同。该xrpd图不必出现本发明所示衍射图的每一条峰线，和/或可能在外形、强度存在少许变化，或在所述峰线位置存在位移，这是因为获取数据的条件存在差异。本领域技术人员通过对比xrpd图，能够确定是否结晶化合物的样品与本发明公开的形式具有相同形式或不同形式。例如，本领域技术人员可以将2-(4-(4-乙氧基-6-氧代-1,6-二氢吡啶-3-基)-2-氟苯基)-n-(5-(1,1,1-三氟-2-甲基丙-2-基)异噁唑-3-基)乙酰胺的样品的xrpd图与图1重叠，并使用本领域的专业经验和知识，容易地确定是否样品的xrpd图基本上符合化合物a一水合物的xrpd图。如果xrpd图基本上符合图1，那么该样品形式可以容易地和准确地确定为与化合物a一水合物具有相同形式。相似地，如果2-(4-(4-乙氧基-6-氧代-1,6-二氢吡啶-3-基)-2-氟苯基)-n-(5-(1,1,1-三氟-2-甲基丙-2-基)异噁唑-3-基)乙酰胺的样品的xrpd图基本上符合图5，那么该样品形式可以容易地和准确地确定为与化合物a非溶剂合物形式1具有相同形式。相似地，如果2-(4-(4-乙氧基-6-氧代-1,6-二氢吡啶-3-基)-2-氟苯基)-n-(5-(1,1,1-三氟-2-甲基丙-2-基)异噁唑-3-基)乙酰胺的样品的xrpd图基本上符合图9，该样品形式可以容易地和准确地确定为与化合物a非溶剂合物形式2具有相同形式。相似地，如果2-(4-(4-乙氧基-6-氧代-1,6-二氢吡啶-3-基)-2-氟苯基)-n-(5-(1,1,1-三氟-2-甲基丙-2-基)异噁唑-3-基)乙酰胺的样品的xrpd图基本上符合图12，那么该样品形式可以容易地和准确地确定为化合物a非溶剂合物形式3具有相同形式。

将理解，当拉曼光谱包括指定值±5.0cm^-1范围内的峰时，拉曼光谱将包括“大约”本发明指定值的峰(表示为cm^-1)。此外，本领域技术人员也熟知和理解，获取拉曼光谱时包括的所用装置、湿度、温度、粉晶定向和其它参数可能导致光谱的外形、强度、和峰位置出现变化。“基本上符合”本发明提供的图2、6、10或13的拉曼光谱是本领域技术人员认为代表了与提供图2、6、10或13的拉曼光谱的化合物具有相同晶型的化合物的拉曼光谱。即，拉曼光谱可以与图2、6、10或13相同，或者更可能地有一定程度不同。该拉曼光谱不必出现本发明所示谱图的每一条峰，和/或可能在外形、强度存在少许变化，或在所述峰位置存在位移，这是因为获取数据的条件存在差异。本领域技术人员通过对比拉曼光谱，能够确定是否结晶化合物的样品与本发明公开的形式具有相同形式或不同形式。例如，本领域技术人员可以将2-(4-(4-乙氧基-6-氧代-1,6-二氢吡啶-3-基)-2-氟苯基)-n-(5-(1,1,1-三氟-2-甲基丙-2-基)异噁唑-3-基)乙酰胺的样品的拉曼光谱与图2重叠，并使用本领域的专业经验和知识，容易地确定是否该样品的拉曼光谱基本上符合化合物a一水合物的拉曼光谱。如果拉曼光谱基本上符合图6，那么该样品形式可以容易地和准确地确定为与化合物a非溶剂合物形式1具有相同形式。相似地，如果拉曼光谱基本上符合图10，那么该样品形式可以容易地和准确地确定为与化合物a非溶剂合物形式2具有相同形式。相似地，如果拉曼光谱基本上符合图13，那么该样品形式可以容易地和准确地确定为与化合物a非溶剂合物形式3具有相同形式。

“本发明化合物”是指2-(4-(4-乙氧基-6-氧代-1,6-二氢吡啶-3-基)-2-氟苯基)-n-(5-(1,1,1-三氟-2-甲基丙-2-基)异噁唑-3-基)乙酰胺，并且在一些实施方案中，本发明限定的晶型具体为化合物a一水合物，或在一些实施方案中，本发明限定的晶型具体为化合物a非溶剂合物形式1，或在一些实施方案中，本发明限定的晶型具体为化合物a非溶剂合物形式2，或在一些实施方案中，本发明限定的晶型具体为化合物a非溶剂合物形式3。

本发明包括在需要的人中治疗或改善ret-介导的病症的治疗方法，包括向需要的人给药有效量的本发明化合物或包含有效量的本发明化合物和任选的药学上可接受的载体的组合物。在具体实施方案中，所述ret-介导的病症为肠易激综合征(ibs)(包括腹泻型、便秘型或交替粪便型)、功能性胃气胀、功能性便秘、功能性腹泻、非特异性功能性肠病、功能性腹痛综合征、慢性特发性便秘、功能性食管病症、功能性胃十二指肠病症、功能性肛门直肠疼痛、炎性肠病、增殖性疾病，例如非小细胞肺癌、肝细胞癌、结肠直肠癌、甲状腺髓样癌、滤泡性甲状腺癌、甲状腺未分化癌、甲状腺乳头状癌、脑瘤、腹腔癌、实体瘤、其它肺癌、头颈癌、神经胶质瘤、成神经细胞瘤、希佩尔·林道综合征和肾肿瘤、乳腺癌、输卵管癌、卵巢癌、移行细胞癌、前列腺癌、食管和胃食管连接癌、胆管癌和腺癌。在具体实施方案中，本发明所述的化合物有用于治疗肠易激综合征。在具体实施方案中，本发明所述的化合物有用于治疗癌症。

在另一个方面，本发明涉及本发明化合物，其用于治疗肠易激综合征(ibs)(包括腹泻型、便秘型或交替粪便型)、功能性胃气胀、功能性便秘、功能性腹泻、非特异性功能性肠病、功能性腹痛综合征、慢性特发性便秘、功能性食管病症、功能性胃十二指肠病症、功能性肛门直肠疼痛、炎性肠病、非小细胞肺癌、肝细胞癌、结肠直肠癌、甲状腺髓样癌、滤泡性甲状腺癌、甲状腺未分化癌、甲状腺乳头状癌、脑瘤、腹腔癌、实体瘤、其它肺癌、头颈癌、神经胶质瘤、成神经细胞瘤、希佩尔·林道综合征和肾肿瘤、乳腺癌、输卵管癌、卵巢癌、移行细胞癌、前列腺癌、食管和胃食管连接癌、胆管癌和腺癌。

在另一个方面，本发明包括本发明化合物在治疗中的用途，尤其是，用于其中受试者为人的治疗。本发明还包括本发明化合物作为活性治疗物质的用途，尤其治疗ret-介导的病症。尤其是，本发明包括本发明化合物在治疗以下疾病中的用途：肠易激综合征(ibs)(包括腹泻型、便秘型或交替粪便型)、功能性胃气胀、功能性便秘、功能性腹泻、非特异性功能性肠病、功能性腹痛综合征、慢性特发性便秘、功能性食管病症、功能性胃十二指肠病症、功能性肛门直肠疼痛、炎性肠病、非小细胞肺癌、肝细胞癌、结肠直肠癌、甲状腺髓样癌、滤泡性甲状腺癌、甲状腺未分化癌、甲状腺乳头状癌、脑瘤、腹腔癌、实体瘤、其它肺癌、头颈癌、神经胶质瘤、成神经细胞瘤、希佩尔·林道综合征和肾肿瘤、乳腺癌、输卵管癌、卵巢癌、移行细胞癌、前列腺癌、食管和胃食管连接癌、胆管癌和腺癌。在另一个方面，本发明包括本发明化合物在治疗肠易激综合征中的用途。在另一个方面，本发明包括本发明化合物在治疗癌症中的用途。

在另一个方面，本发明包括本发明化合物在制备用于治疗上述病症的药物中的用途。在另一个方面，本发明包括本发明化合物在制备用于治疗肠易激综合征的药物中的用途。在另一个方面，本发明包括在制备用于治疗癌症的药物中的用途。

如本发明所用，术语“ret-介导的病症”是指任何疾病、病症或其它病理状态，其中已知转染重排(ret)激酶起作用。因此，在一些实施方案中，本发明涉及治疗或减轻一种或多种疾病(其中已知ret起作用)的严重性。

如本发明所用，术语“治疗”是指在预先罹患或诊断的患者或受试者中缓解指定的病症，消除或减轻该病症的一种或多种症状，减慢或消除该病症的进展，以及预防或延迟该病症的复发。

如本发明所用，术语"有效量"是指药物或药剂的量，其为例如研究者或医生正寻求的将引发组织、系统、动物或人的生物或医学响应的量。本发明化合物在该治疗方法中的有效量为大约0.1至100mg每天每千克患者体重，其可以单剂量或多剂量给予。在一些实施方案中，所述剂量水平将为大约0.1至大约25mg/kg每天。在一些实施方案中，所述剂量水平将为大约0.1至大约10mg/kg每天。合适的剂量水平可为大约0.1至25mg/kg每天、大约0.1至10mg/kg每天、或大约0.1至5mg/kg每天。在该范围内，所述剂量可为0.1至0.5、0.5至1.0、1.0至5.0、5.0至10.0、或10至25mg/kg每天。对于口服给药，所述组合物优选以片剂形式提供，其含有1.0至1000毫克的活性成份，具体为1.0、5.0、10.0、15.0、20.0、25.0、50.0、75.0、100.0、150.0、200.0、250.0、300.0、400.0、500.0、600.0、750.0、800.0、900.0和1000.0毫克活性成份，根据症状调节待给予治疗患者的剂量。化合物可以每天给药1至4次，优选每天一次或两次。在一些实施方案中，本发明化合物每天给药一次或多次，持续多天。在一些实施方案中，所述给药持续数天、数周、数月，或数年。

然而，将理解，用于任何具体患者的具体剂量水平和给药频率可以变化并将取决于多种因素，包括年龄、体重、遗传特征、基本健康状况、性别、饮食、给药方式和时间、排泄率、药物组合，和所治疗的具体病症的性质和严重性。

给药方法包括在治疗过程中的不同时间给药有效量的本发明的化合物或组合物，或以组合形式同时给药。本发明的方法包括所有已知的治疗方案。

本发明的化合物和组合物可以与具有相关用途的其它化合物和组合物组合以预防和治疗感兴趣的病症或疾病，例如增殖性疾病。本领域技术人员可以选择用于组合疗法的合适药剂。治疗剂的组合可以以协同作用实现各种疾病的治疗或预防。使用这种方法，可能能够以较低剂量的每种药剂获得治疗功效，从而降低不良副作用的可能性。在具体实施方案中，本发明提供的化合物或组合物与一种或多种其它治疗活性剂组合给药，所述其它治疗活性剂提高本发明提供的化合物或组合物的生物利用度，减少和/或改变其代谢，抑制其排泄，和/或改变其在体内的分布。还应当理解，所用的治疗可以对相同病症实现期望效果，和/或可以实现不同效果。

组合治疗包括共同给药本发明化合物和所述其它药剂，依次给药本发明化合物和其它药剂，给药含有本发明化合物和其它药剂的组合物，或同时给药含有本发明化合物的组合物和其它药剂的组合物。

示例性的其它治疗活性剂包括但不限于小的有机分子，例如药物化合物(例如，由美国食品和药物管理局批准的化合物，如联邦管理法规(cfr)中提供的)、肽、蛋白质、碳水化合物、单糖、寡糖、多糖、核蛋白、粘蛋白、脂蛋白、合成多肽或蛋白质、与蛋白质连接的小分子、糖蛋白、甾体化合物、核酸、dna、rna、核苷酸、核苷、寡核苷酸、反义寡核苷酸、脂质、激素、维生素和细胞。

本发明还涉及包含本发明化合物和药学上可接受的载体的药物组合物。本发明还涉及制备药物组合物的方法，其包括混合本发明化合物和药学上可接受的载体。

“药学上可接受的载体”是指任何用于本发明化合物的制剂中的一种或多种具有足够纯度和品质的化合物和/或组合物，当适当给药于人时，其不产生不良反应，并且用作原料药(即本发明化合物)的载剂。载体可以包括赋形剂、稀释剂、制粒和/或分散剂、表面活性剂和/或乳化剂、粘合剂、防腐剂、缓冲剂、润滑剂和天然油。

本发明还包括制备组合物的方法，包括将本发明化合物和任选的药学上可接受的载体混合；并且包括由这种方法得到的那些组合物，该方法包括常规的制药技术。例如，本发明化合物可以在配制之前进行纳米研磨。本发明化合物也可以通过本领域已知的研磨、微粉化或其它粒径减小方法制备。该方法包括但不限于美国专利号4,826,689、5,145,684、5,298,262、5,302,401、5,336,507、5,340,564、5,346,702、5,352,459、5,354,560、5,384,124、5,429,824、5,503,723、5,510,118、5,518,187、5,518,738、5,534,270、5,536,508、5,552,160、5,560,931、5,560,932、5,565,188、5,569,448、5,571,536、5,573,783、5,580,579、5,585,108、5,587,143、5,591,456、5,622,938、5,662,883、5,665,331、5,718,919、5,747,001、pct申请wo93/25190、wo96/24336和wo98/35666中公开的那些，将它们每篇引入本文作为参考。本发明的药物组合物可以使用本领域技术人员已知的技术和方法来制备。在remington'spharmaceuticalsciences(mackpublishingcompany)中描述了本领域通常使用的一些方法，其全部教导引入本文作为参考。

本发明组合物包括眼内、口服、鼻腔、经皮、局部带或不带封闭、静脉注射(推注和输注)和注射(腹膜内、皮下、肌内、肿瘤内或肠胃外)。组合物可以是单位剂量，例如片剂、丸剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、脂质体、离子交换树脂、无菌眼用溶液或眼内递送装置(例如促进立即释放、定时释放和持续释放的接触镜片等)、肠胃外溶液或悬浮液、计量气雾剂或液体喷雾剂、滴剂、安瓿、自动注射器装置或栓剂；用于眼内、口服、鼻内、舌下、肠胃外或直肠给药，或通过吸入或吹入给药。

适用于口服给药的本发明组合物包括固体形式，例如丸剂、片剂、囊片剂、胶囊剂(各自包括立即释放、定时释放和持续释放制剂)、颗粒剂和粉剂。

口服组合物优选配制成均匀的组合物，其中原料药(即本发明化合物)均匀地分散在整个混合物中，其可以容易地分成含有等量的本发明化合物的剂量单位。优选地，组合物通过将本发明化合物与一种或多种任选存在的药物载体(例如淀粉、糖、稀释剂、制粒剂、润滑剂、助流剂、结合剂和崩解剂)、一种或多种任选存在的惰性药物赋形剂(例如水、二醇、油、醇、调味剂、防腐剂、着色剂和糖浆)、一种或多种任选存在的常规压片成分(例如玉米淀粉、乳糖、蔗糖、山梨醇、滑石、硬脂酸、硬脂酸镁、磷酸二钙和各种树胶中的任何一种)和任选的稀释剂(例如水)混合来制备。

示例性的稀释剂包括碳酸钙、碳酸钠、磷酸钙、磷酸二钙、硫酸钙、磷酸氢钙、磷酸钠、乳糖、蔗糖、纤维素、微晶纤维素、高岭土、甘露糖醇、山梨醇、肌醇、氯化钠、干淀粉、玉米淀粉、糖粉及其混合物。

示例性的制粒和/或分散剂包括马铃薯淀粉、玉米淀粉、木薯淀粉、淀粉羟乙酸钠、粘土、海藻酸、瓜尔胶、柑橘浆、琼脂、膨润土、纤维素和木制品、天然海绵、阳离子交换树脂、碳酸钙、硅酸盐、碳酸钠、交联聚(乙烯基-吡咯烷酮)(交聚维酮)、羧甲基淀粉钠(羟乙酸淀粉钠)、羧甲基纤维素、交联羧甲基纤维素钠(交联羧甲基纤维素)、甲基纤维素、预胶化淀粉(淀粉1500)、微晶淀粉、水不溶性淀粉、羧甲基纤维素钙、硅酸镁铝(veegum)、月桂基硫酸钠、季铵化合物及其混合物。

示例性的表面活性剂和/或乳化剂包括天然乳化剂(例如阿拉伯胶、琼脂、海藻酸、海藻酸钠、黄蓍胶、软骨素、胆固醇、黄原胶、果胶、明胶、蛋黄、酪蛋白、羊毛脂、胆固醇、蜡和卵磷脂)、胶体粘土(例如膨润土(硅酸铝)和veegum(硅酸镁铝))、长链氨基酸衍生物、高分子量醇(例如硬脂醇、鲸蜡醇、油醇、三醋汀单硬脂酸酯、乙二醇二硬脂酸酯、甘油单硬脂酸酯和丙二醇单硬脂酸酯、聚乙烯醇)、卡波姆(例如羧基聚亚甲基、聚丙烯酸、丙烯酸聚合物和羧基乙烯基聚合物)、角叉菜胶、纤维素衍生物(例如羧甲基纤维素钠、粉末状纤维素、羟甲基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、甲基纤维素)、脱水山梨糖醇脂肪酸酯(例如、聚氧乙烯脱水山梨糖醇单月桂酸酯(tween20)、聚氧乙烯脱水山梨糖醇(tween60)、聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯(tween80)、脱水山梨糖醇单棕榈酸酯(span40)、脱水山梨糖醇单硬脂酸酯(span60)、脱水山梨醇三硬脂酸酯(span65)、甘油单油酸酯、脱水山梨糖醇单油酸酯(span80)、聚氧乙烯酯(例如聚氧乙烯单硬脂酸酯(myrj45)、聚氧乙烯氢化蓖麻油、聚乙氧基化蓖麻油、聚氧甲烯硬脂酸酯和solutol)、蔗糖脂肪酸酯、聚乙二醇脂肪酸酯(例如cremophor^tm)、聚氧乙烯醚(例如聚氧乙烯月桂基醚(brij30))、聚(乙烯基-吡咯烷酮)、二乙二醇单月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯、油酸钠、油酸钾、油酸乙酯、油酸、月桂酸乙酯、月桂基硫酸钠、pluronicf68、poloxamer188、西曲溴铵、西吡氯铵、苯扎氯铵、多库酯钠，和/或其混合物。

示例性的粘合剂包括淀粉(例如玉米淀粉和淀粉糊)、明胶、糖(例如蔗糖、葡萄糖、右旋糖、糊精、糖蜜、乳糖、拉克替醇、甘露醇等)、天然和合成的胶质(例如阿拉伯胶、海藻酸钠、角叉菜提取物、攀瓦胶、印度树胶、isapol壳的粘液、羧甲基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、微晶纤维素、乙酸纤维素、聚(乙烯基-吡咯烷酮)、硅酸镁铝(veegum)和落叶松阿拉伯半乳聚糖)、海藻酸盐、聚环氧乙烷、聚乙二醇、无机钙盐、硅酸、聚甲基丙烯酸酯、蜡、水、醇和/或其混合物。

示例性的防腐剂包括抗氧化剂、螯合剂、抗微生物防腐剂、抗真菌防腐剂、醇防腐剂、酸性防腐剂和其它防腐剂。

示例性的抗氧化剂包括α-生育酚、抗坏血酸、抗坏血酸棕榈酸酯、丁羟茴醚、丁羟甲苯、一硫代甘油、偏亚硫酸氢钾、丙酸、没食子酸丙酯、抗坏血酸钠、亚硫酸氢钠、偏亚硫酸氢钠和亚硫酸钠。

示例性的螯合剂包括乙二胺四乙酸(edta)及其盐和水合物(例如，依地酸钠、依地酸二钠、依地酸三钠、依地酸钙二钠、依地酸二钾等)、柠檬酸及其盐和水合物(例如柠檬酸一水合物)、富马酸及其盐和水合物、苹果酸及其盐和水合物、磷酸及其盐和水合物、以及酒石酸及其盐和水合物。示例性的抗微生物防腐剂包括苯扎氯铵、苄索氯铵、苯甲醇、布洛芬醇、西曲溴铵、西吡氯铵、氯己定、氯丁醇、氯甲酚、氯甲苯醇、甲酚、乙醇、甘油、海克替啶、咪脲、苯酚、苯氧基乙醇、苯乙醇、硝酸苯汞、丙二醇和硫柳汞。

示例性的抗真菌防腐剂包括对羟基苯甲酸丁酯、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯甲酸、羟基苯甲酸、苯甲酸钾、山梨酸钾、苯甲酸钠、丙酸钠和山梨酸。

示例性的醇防腐剂包括乙醇、聚乙二醇、苯酚、酚类化合物、双酚、氯丁醇、羟基苯甲酸酯和苯乙醇。示例性的酸性防腐剂包括维生素a、维生素c、维生素e、β-胡萝卜素、柠檬酸、乙酸、脱氢乙酸、抗坏血酸、山梨酸和植酸。

其他防腐剂包括生育酚、醋酸生育酚、甲磺酸去甲肟酸、十六烷基三甲基溴化铵、丁羟茴醚(bha)、丁羟甲苯(bht)、乙二胺、月桂基硫酸钠(sls)、月桂基乙醚硫酸钠(sles)、亚硫酸氢钠、偏亚硫酸氢钠、亚硫酸钾、偏亚硫酸氢钾、glydantplus、phenonip、对羟基苯甲酸甲酯、germall115、germabenii、neolone、kathon和euxyl。在具体实施方案中，防腐剂是抗氧化剂。在其它实施方案中，防腐剂是螯合剂。

示例性的缓冲剂包括柠檬酸盐缓冲溶液、乙酸盐缓冲溶液、磷酸盐缓冲溶液、氯化铵、碳酸钙、氯化钙、柠檬酸钙、葡乳醛酸钙、葡庚糖酸钙、葡萄糖酸钙、d-葡萄糖酸、甘油磷酸钙、乳酸钙、丙酸、乙酰丙酸钙、戊酸、磷酸氢钙、磷酸、磷酸三钙、碱式磷酸钙、乙酸钾、氯化钾、葡萄糖酸钾、钾混合物、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、磷酸钾混合物、乙酸钠、碳酸氢钠、氯化钠、柠檬酸钠、乳酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸钠混合物、氨基丁三醇、氢氧化镁、氢氧化铝、海藻酸、无热原水、等渗盐水、林格氏溶液、乙醇及其混合物。

示例性的润滑剂包括硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酸、二氧化硅、滑石、麦芽、山嵛酸甘油酯、氢化植物油、聚乙二醇、苯甲酸钠、乙酸钠、氯化钠、亮氨酸、月桂基硫酸镁、月桂基硫酸钠及其混合物。

示例性的天然油包括杏仁、苦杏仁、鳄梨、巴巴苏、佛手柑、黑加仑种子、琉璃苣、刺桧、甘菊、芸苔、香菜、腊棕榈、蓖麻、肉桂、可可脂、椰子、鳕鱼肝、咖啡、玉米、棉籽、鸸鹋、桉树、月见草、鱼、亚麻籽、香叶醇、葫芦、葡萄籽、榛子、海索草、肉豆蔻酸异丙酯、霍霍巴(jojoba)、夏威夷核果、醒目薰衣草(lavandin)、薰衣草、柠檬、山苍子、澳大利亚坚果(macademianut)、锦葵、芒果种子、绣线菊种子、貂、肉豆蔻、橄榄、橙、橙鲷鱼、棕榈、棕榈仁、桃仁、花生、罂粟籽、南瓜籽、油菜籽、米糠、迷迭香、红花、檀香、茶花、savoury、沙棘、芝麻、牛油树脂、二甲硅油、大豆、向日葵、茶树、蓟、椿本(tsubaki)、岩石草、核桃和小麦胚芽油。示例性的合成油包括但不限于硬脂酸丁酯、辛酸甘油三酯、癸酸甘油三酯、环甲硅油、癸二酸二乙酯、二甲硅油360、肉豆蔻酸异丙酯、矿物油、辛基十二烷醇、油醇、硅油及其混合物。

本发明化合物还可以通过延迟释放组合物给药，其中所述组合物包括本发明化合物和可生物降解的缓释载体(例如聚合物载体)或药学上可接受的不可生物降解的缓释载体(例如离子交换载体)。

可生物降解和不可生物降解的延迟释放载体是本领域公知的。可生物降解的载体用于形成保留原料药(即本发明化合物)并在合适的环境(例如水性、酸性、碱性等)中缓慢降解/溶解的颗粒或基质，以释放原料药。这种颗粒降解/溶解在体液中以释放其中的原料药(即本发明化合物)。颗粒优选为纳米颗粒(例如直径在约1至500nm的范围内，优选直径在约50-200nm，最优选直径在约100nm)。在制备缓释组合物的方法中，首先将缓释载体和本发明化合物溶解或分散在有机溶剂中。将所得混合物加入到含有任选的表面活性剂的水溶液中以产生乳液。然后从乳液中蒸发有机溶剂，以提供含有缓释载体和本发明化合物的颗粒的胶态悬浮液。

片剂和胶囊代表有利的口服剂量单位形式。可以使用标准技术将片剂糖衣包衣或薄膜包衣。片剂也可以被包衣或以其它方式复合以提供延长的控制释放治疗效果。剂型可以包含内部剂量和外部剂量组分，其中所述外部组分为包封在所述内部组件上的形式。两个组分还可以通过抵抗胃中的崩解的层(例如肠溶层)分开，并允许内部组分完整地进入十二指肠，或延缓或维持释放的层。可以使用多种肠溶和非肠溶层或包衣材料(例如聚合酸、虫胶、乙酰醇和醋酸纤维素或其组合)。

在具体实施方案中，本发明涉及包含化合物a的药物组合物。在另一实施方案中，本发明涉及包含化合物a的药物组合物，其中至少10重量％的化合物a以化合物a一水合物存在。在另一实施方案中，本发明涉及包含化合物a的药物组合物，其中至少20重量％、或至少30重量％、或至少40重量％、或至少50重量％、或至少60重量％、或至少70重量％、或至少80重量％、或至少90重量％的化合物a以化合物a一水合物存在。在另一实施方案中，本发明涉及包含化合物a的药物组合物，其中至少95重量％、或至少96重量％、或至少97重量％、或至少98重量％、或至少99重量％、或至少99.5重量％、或至少99.8重量％、或至少99.9重量％的化合物a以化合物a一水合物存在。

在另一实施方案中，本发明涉及包含化合物a的药物组合物，其中至少10重量％的化合物a以化合物a非溶剂合物形式1存在。在另一实施方案中，本发明涉及包含化合物a的药物组合物，其中至少20重量％、或至少30重量％、或至少40重量％、或至少50重量％、或至少60重量％、或至少70重量％、或至少80重量％、或至少90重量％的化合物a以化合物a非溶剂合物形式1存在。在另一实施方案中，本发明涉及包含化合物a的药物组合物，其中至少95重量％、或至少96重量％、或至少97重量％、或至少98重量％、或至少99重量％、或至少99.5重量％、或至少99.8重量％、或至少99.9重量％的化合物a以化合物a非溶剂合物形式1存在。

在另一实施方案中，本发明涉及包含化合物a的药物组合物，其中至少10重量％的化合物a以化合物a非溶剂合物形式2存在。在另一实施方案中，本发明涉及包含化合物a的药物组合物，其中至少20重量％、或至少30重量％、或至少40重量％、或至少50重量％、或至少60重量％、或至少70重量％、或至少80重量％、或至少90重量％的化合物a以化合物a非溶剂合物形式2存在。在另一实施方案中，本发明涉及包含化合物a的药物组合物，其中至少95重量％、或至少96重量％、或至少97重量％、或至少98重量％、或至少99重量％、或至少99.5重量％、或至少99.8重量％、或至少99.9重量％的化合物a以化合物a非溶剂合物形式2存在。

在另一实施方案中，本发明涉及包含化合物a的药物组合物，其中至少10重量％的化合物a以化合物a非溶剂合物形式3存在。在另一实施方案中，本发明涉及包含化合物a的药物组合物，其中至少20重量％、或至少30重量％、或至少40重量％、或至少50重量％、或至少60重量％、或至少70重量％、或至少80重量％、或至少90重量％的化合物a以化合物a非溶剂合物形式3存在。在另一实施方案中，本发明涉及包含化合物a的药物组合物，其中至少95重量％、或至少96重量％、或至少97重量％、或至少98重量％、或至少99重量％、或至少99.5重量％、或至少99.8重量％、或至少99.9重量％的化合物a以化合物a非溶剂合物形式3存在。

在另一实施方案中，本发明涉及包含化合物a的药物组合物，其中不超过90重量％的化合物a为无定形。在另一实施方案中，本发明涉及包含化合物a的药物组合物，其中不超过80重量％、或不超过70重量％、或不超过60重量％、或不超过50重量％、或不超过40重量％、或不超过30重量％、或不超过20重量％、或不超过10重量％的化合物a为无定形。在另一实施方案中，本发明涉及包含化合物a的药物组合物，其中不超过5重量％、或不超过4重量％、或不超过3重量％、或不超过2重量％、或不超过1重量％、或不超过0.5重量％、或不超过0.2重量％、或不超过0.1重量％的化合物a为无定形。

在另一实施方案中，本发明涉及包含化合物a的药物组合物，其中不超过90重量％的化合物a以化合物a一水合物以外的形式存在。在另一实施方案中，本发明涉及包含化合物a的药物组合物，其中不超过80重量％、或不超过70重量％、或不超过60重量％、或不超过50重量％、或不超过40重量％、或不超过30重量％、或不超过20重量％、或不超过10重量％的化合物a以化合物a一水合物以外的形式存在。在另一实施方案中，本发明涉及包含化合物a的药物组合物，其中不超过5重量％、或不超过4重量％、或不超过3重量％、或不超过2重量％、或不超过1重量％、或不超过0.5重量％、或不超过0.2重量％、或不超过0.1重量％的化合物a以化合物a一水合物以外的形式存在。

在另一实施方案中，本发明涉及包含化合物a的药物组合物，其中不超过90重量％的化合物a以化合物a非溶剂合物形式1以外的形式存在。在另一实施方案中，本发明涉及包含化合物a的药物组合物，其中不超过80重量％、或不超过70重量％、或不超过60重量％、或不超过50重量％、或不超过40重量％、或不超过30重量％、或不超过20重量％、或不超过10重量％的化合物a以化合物a非溶剂合物形式1以外的形式存在。在另一实施方案中，本发明涉及包含化合物a的药物组合物，其中不超过5重量％、或不超过4重量％、或不超过3重量％、或不超过2重量％、或不超过1重量％、或不超过0.5重量％、或不超过0.2重量％、或不超过0.1重量％的化合物a以化合物a非溶剂合物形式1以外的形式存在。

在另一实施方案中，本发明涉及包含化合物a的药物组合物，其中不超过90重量％的化合物a以化合物a非溶剂合物形式2以外的形式存在。在另一实施方案中，本发明涉及包含化合物a的药物组合物，其中不超过80重量％、或不超过70重量％、或不超过60重量％、或不超过50重量％、或不超过40重量％、或不超过30重量％、或不超过20重量％、或不超过10重量％的化合物a以化合物a非溶剂合物形式2以外的形式存在。在另一实施方案中，本发明涉及包含化合物a的药物组合物，其中不超过5重量％、或不超过4重量％、或不超过3重量％、或不超过2重量％、或不超过1重量％、或不超过0.5重量％、或不超过0.2重量％、或不超过0.1重量％的化合物a以化合物a非溶剂合物形式2以外的形式存在。

在另一实施方案中，本发明涉及包含化合物a的药物组合物，其中不超过90重量％的化合物a以化合物a非溶剂合物形式3以外的形式存在。在另一实施方案中，本发明涉及包含化合物a的药物组合物，其中不超过80重量％、或不超过70重量％、或不超过60重量％、或不超过50重量％、或不超过40重量％、或不超过30重量％、或不超过20重量％、或不超过10重量％的化合物a以化合物a非溶剂合物形式3以外的形式存在。在另一实施方案中，本发明涉及包含化合物a的药物组合物，其中不超过5重量％、或不超过4重量％、或不超过3重量％、或不超过2重量％、或不超过1重量％、或不超过0.5重量％、或不超过0.2重量％、或不超过0.1重量％的化合物a以化合物a非溶剂合物形式3以外的形式存在。

实验

以下实施例阐明了本发明。这些实施例并非旨在限定本发明的范围，而是为本领域技术人员制备和使用本发明的化合物、组合物和方法提供指导。虽然描述了本发明的具体实施方案，但是本领域技术人员将理解，在不背离本发明的精神和范围的情形下可以做出多种变化和改进。除非另外指出，否则试剂是市售可得的或根据文献中的操作制备。方法、方案和实施例的描述中使用的符号和惯例符合现代科学文献(例如，journaloftheamericanchemicalsociety或journalofbiologicalchemistry)中使用的那些。

在实施例中：

化学位移表示为百万分率(ppm)单位。偶合常数(j)的单位是赫兹(hz)。峰型图描述表观的多重性，并指定为s(单峰)、d(双重峰)、t(三重峰)、q(四重峰)、dd(两组双重峰)、dt(两组三重峰)、dq(两组四重峰)、m(多重峰)、br(宽峰)。

快速柱色谱在硅胶上进行。

使用的命名程序为ultra12.0。

缩写

18-冠-61,4,7,10,13,16-六氧杂环十八烷

n-buli正丁基锂

cdcl3氯仿-d

cd3od甲醇-d4

cs2co3碳酸铯

dcm二氯甲烷

ea乙酸乙酯

es-lcms电喷雾液相色谱-质谱

etoh乙醇

g克

h小时

hcl盐酸

h2so4硫酸

h2o水

koac乙酸钾

koh氢氧化钾

lcms液相色谱-质谱

lioh·h2o氢氧化锂水合物

mecn乙腈

meoh甲醇

mg毫克

mgso4硫酸镁

min分钟

ml毫升

mmol毫摩尔

n2氮气

nacn氰化钠

nahco3碳酸氢钠

naoh氢氧化钠

na2so4硫酸钠

nbsn-溴代琥珀酰亚胺

nh4cl氯化铵

nmr核磁共振

pdcl2(dppf)1,1'-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯(ii)

pe石油醚

pmbp-甲氧基苄基

rt室温

tbme叔丁基甲基醚

tfa三氟乙酸

thf四氢呋喃

tlc薄层色谱

丙基磷酸环酐

实施例1

制备：

2-(4-(4-乙氧基-6-氧代-1,6-二氢吡啶-3-基)-2-氟苯基)-n-(5-(1,1,1-三氟-2-甲基丙-2-基)异噁唑-3-基)乙酰胺(化合物a)

步骤1：5,5,5-三氟-4,4-二甲基-3-氧代戊腈

向冷却至-78℃的mecn(13.9ml，264mmol)在thf(500ml)中的混合物中加入n-buli(106ml，264mmol)。将混合物在-30℃搅拌0.5h。然后向混合物中滴加3,3,3-三氟-2,2-二甲基丙酸甲酯(30g，176mmol)。将混合物在25℃搅拌10h。将混合物用nh4cl水溶液(50ml)淬灭，用ea(300mlx3)萃取。将有机层经na2so4干燥，过滤和浓缩，得到黄色油状物的粗产物：5,5,5-三氟-4,4-二甲基-3-氧代戊腈(22g，122.9mmol，70％)：¹hnmr(400mhz，cdcl3)δ3.75(s，2h)，1.41(s，6h)。

步骤2：5-(1,1,1-三氟-2-甲基丙-2-基)异噁唑-3-胺

向冷却至0℃的盐酸羟胺(23.2g，336mmol)在水(300ml)中的溶液中加入nahco3(30g，351mmol)，并调节ph＝7.5。然后向混合物中加入5,5,5-三氟-4,4-二甲基-3-氧代戊腈(30g，167.4mmol)在meoh(40ml)中的溶液。将混合物在65℃搅拌15h。冷却后，将混合物用浓hcl酸化至ph＝1，然后回流2h。冷却至室温后，将混合物用4mnaoh中和至ph＝8。将混合物用ea(300mlx2)萃取。将有机层经na2so4干燥，过滤和浓缩。将粗品通过硅胶柱色谱(pe/ea＝8:1～3:1)纯化。通过tlc(pe/ea＝2:1，rf＝0.6)发现所有级分含有产物，将其合并和浓缩，得到红色固体的5-(1,1,1-三氟-2-甲基丙-2-基)异噁唑-3-胺(19.5g，100.5mmol，60％)：¹hnmr(400mhz，cdcl3)δ5.79(s，1h)，3.96(s.，2h)，1.53(s，6h)；es-lcmsm/z：195(m+h)。

步骤3：2-氯-4-乙氧基吡啶

在0℃，向2-氯-4-硝基吡啶(170g，1070mmol)在thf(2l)中的混合物中缓慢加入乙醇钠(109.45g，1610mmol)。将混合物在25℃搅拌12h。lcms和tlc分析(pe/ea＝5:1，rf＝0.6)显示反应完成。将混合物过滤，并将大多数滤液减压除去溶剂。将混合物用水淬灭，并用ea萃取，将有机层用饱和食盐水洗涤，然后浓缩。按照相同操作制备另外六个批次，得到2-氯-4-乙氧基吡啶(1100g，7.01mol，92.4％)：¹hnmr(400mhz，cd3od)δ8.15(d，j＝6.0hz，1h)，6.99(d，j＝2.0hz，1h)，6.91-6.89(m，1h)，4.16-4.14(m，2h)，1.41-1.38(m，3h)；es-lcmsm/z：158.1(m+h)。

步骤4：5-溴-2-氯-4-乙氧基吡啶

将2-氯-4-乙氧基吡啶(100g，634.5mmol)缓慢加入h2so4(500ml)中。然后在室温将nbs(124.2g，698.0mmol)加入上述反应混合物中。将混合物在80℃搅拌3h。tlc分析(pe/ea＝10:1，rf＝0.5)显示反应完成。将反应混合物倒入冰水(2000ml)中，用ea萃取，然后浓缩。按照相同操作制备另外十个批次。将合并的粗产物通过快速柱色谱纯化，得到5-溴-2-氯-4-乙氧基吡啶(670g，2.84mol，40.0％)：¹hnmr(400mhz，cd3od)：δ8.31(s，1h)，7.14(s，1h)，4.32-4.10(m，2h)，1.58-1.35(m，3h)；es-lcmsm/z：236.0，238.0(m，m+2h)。

步骤5：5-溴-4-乙氧基-2-((4-甲氧基苄基)氧基)吡啶

在室温，向5-溴-2-氯-4-乙氧基吡啶(75g，317.1mmol)在甲苯(500ml)中的混合物中加入(4-甲氧基苯基)甲醇(52.6g，380.6mmol)、koh(35.6g，634.3mmol)和18-冠-6(8.4g，31.2mmol)。将反应混合物在120℃搅拌2h。将混合物用tbme萃取，用饱和食盐水洗涤，并浓缩。按照相同操作制备另外八个批次。将合并的粗产物通过快速柱色谱(pe/ea＝10:1，rf＝0.5)纯化，得到5-溴-4-乙氧基-2-((4-甲氧基苄基)氧基)吡啶(650g，1.99mol，70.0％)：¹hnmr(400mhz，cd3od)δ8.05(s，1h)，7.33(d，j＝8.6hz，2h)，6.90-6.84(m，2h)，6.38(s，1h)，5.20(s，2h)，4.16-4.05(m，2h)，3.77(s，3h)，1.43(q，j＝6.8hz，3h)；es-lcmsm/z：338.3(m+2h)。

步骤6：2-(4-溴-2-氟苯基)乙腈

在n2下，在20℃，向4-溴-1-(溴甲基)-2-氟苯(500g，1.87mol)在etoh(2.2l)中的溶液中一次性加入nacn(93g，1.90mmol)。将反应混合物在60℃搅拌12h。然后将溶液浓缩并在dcm(2000ml)和饱和nahco3溶液(1800ml)之间分布。按照相同操作制备另一批次。然后将两个批次合并。将合并的有机萃取液用饱和食盐水洗涤，用mgso4干燥，过滤和浓缩，得到2-(4-溴-2-氟苯基)乙腈(794g，99％)：¹hnmr(400mhz，cdcl3)δ7.38-7.27(m，3h)，3.72(s，2h)。

步骤7：2-(4-溴-2-氟苯基)乙酸

在n2下，在20℃，向搅拌的2-(4-溴-2-氟苯基)乙腈(397g，1.82mol)在meoh(500ml)中的溶液中一次性加入naoh溶液(2.22l，2.5m，5.56mol)。将反应混合物在80℃搅拌5h。然后将溶液浓缩，并伴随搅拌用浓hcl中和至ph＝5。然后将溶液用ea(1.5lx2)萃取。按照相同操作制备另外两个批次。然后将三个批次合并。将合并的有机萃取液用饱和食盐水洗涤，用na2so4干燥，过滤和在真空中进行浓缩，得到纯的2-(4-溴-2-氟苯基)乙酸(1200g，92％)：tlc(pe/ea＝5:1，rf＝0.2)；¹hnmr(400mhz，cdcl3)δ7.24(宽s，1h)，7.12(t，j＝7.9hz，1h)，3.65(s，2h)。

步骤8：2-(4-溴-2-氟苯基)乙酸甲酯

在室温，向2-(4-溴-2-氟苯基)乙酸(260g，1.13mol)在meoh(2l)中的溶液中加入h2so4(30ml)。将溶液加热回流过夜。然后将溶剂浓缩，并将残余物在ea和饱和nahco3溶液之间分布。将有机萃取液用饱和食盐水洗涤，经na2so4干燥，过滤和浓缩。按照相同操作制备另一批次。然后将两个批次合并，得到2-(4-溴-2-氟苯基)乙酸甲酯(520g，94％).tlc(pe/ea＝10:1，rf＝0.7).¹hnmr(400mhz，cdcl3)δ7.25-7.20(m，2h)，7.14(t，j＝8.0hz，1h)，3.70(s，3h)，3.62(s，2h)。

步骤9：2-(2-氟-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)苯基)乙酸甲酯

在室温，向2-(4-溴-2-氟苯基)乙酸甲酯(260g,1.05mol)和4,4,4',4',5,5,5',5'-八甲基-2,2'-二(1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷)(320g，1.26mol)在1,4-二噁烷(2l)中的溶液中加入koac(206g，2.10mol)和pdcl2(dppf)(23g，0.03mol)。将溶液在n2下加热回流4h。然后将溶液过滤，并将滤液在真空中进行浓缩，得到粗产物。按照相同操作制备另一批次。然后将两个批次合并，并通过快速柱色谱(pe/ea＝30:1至10:1)纯化。通过tlc(pe/ea＝10:1，rf＝0.5)发现所有级分含有产物，将它们合并和浓缩，得到2-(2-氟-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)苯基)乙酸甲酯(560g，90％)，其为淡黄色油状物：¹hnmr(400mhz，cdcl3)δ7.54(d，j＝7.5hz，1h)，7.49(d，j＝10.0hz，1h)，7.31-7.26(m，1h)，3.73(s，2h)，1.34(s，12h)，1.27(s，3h)；es-lcmsm/z295.2(m+h)。

步骤10：2-(4-(4-乙氧基-6-((4-甲氧基苄基)氧基)吡啶-3-基)-2-氟苯基)乙酸甲酯

在n2气氛下，向5-溴-4-乙氧基-2-((4-甲氧基苄基)氧基)吡啶(175g，519mmol)在1,4-二噁烷(1200ml)和h2o(300ml)中的溶液中加入2-(2-氟-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)苯基)乙酸甲酯(167g，569mmol)、pdcl2(dppf)(25g，5.19mmol)和cs2co3(337g，1038mmol)。将混合物回流2h。tlc分析(pe/ea＝5:1，rf＝0.3)显示反应完成。将混合物用ea/h2o(2l)萃取，得到油状物层，将其经na2so4干燥，过滤，浓缩。按照相同操作制备另外两个批次。将合并的粗产物通过快速柱色谱(pe/ea＝5:1，rf＝0.3)纯化，得到5-溴-4-乙氧基-2-((4-甲氧基苄基)氧基)吡啶(630g，1.48mol，90.0％)：¹hnmr(400mhz，cd3od)δ7.94(s，1h)，7.36(d，j＝8.8hz，2h)，7.32-7.22(m，3h)，6.90(d，j＝8.8hz，2h)，6.43(s，1h)，5.26(s，2h)，4.11(d，j＝6.8hz，2h)，3.78(s，3h)，3.72(s，2h)，3.70(s，3h)，1.36(t，j＝7.0hz，3h)；es-lcmsm/z：426.1(m+h)。

步骤11：2-(4-(4-乙氧基-6-((4-甲氧基苄基)氧基)吡啶-3-基)-2-氟苯基)乙酸

向2-(4-(4-乙氧基-6-((4-甲氧基苄基)氧基)吡啶-3-基)-2-氟苯基)乙酸甲酯(210g，519mmol)在thf(500ml)中的溶液中加入lioh·h2o(52g，1230mmol)在h2o(700ml)中的溶液。将混合物在60℃搅拌过夜。tlc分析(pe/ea＝5:1，rf＝0.3)显示反应完成。将混合物浓缩，并用hcl(1n)调节至ph＝7。按照相同操作制备另外两个批次。然后将合并的粗产物过滤，将固体用水洗涤，干燥，得到2-(4-(4-乙氧基-6-((4-甲氧基苄基)氧基)吡啶-3-基)-2-氟苯基)乙酸(550g，1.34mol，93.0％)：¹hnmr(400mhz，cd3od)：δ7.94(s，1h)，7.41-7.28(m，3h)，7.24(d，j＝9.5hz，2h)，6.91(d，j＝8.6hz，2h)，6.44(s，1h)，5.26(s，2h)，4.11(q，j＝6.9hz，2h)，3.78(s，3h)，3.67(s，2h)，1.36(t，j＝7.0hz，3h)；es-lcmsm/z：412.1(m+h)。

步骤12：2-(4-(4-乙氧基-6-((4-甲氧基苄基)氧基)吡啶-3-基)-2-氟苯基)-n-(5-(1,1,1-三氟-2-甲基丙-2-基)异噁唑-3-基)乙酰胺

向2-(4-(4-乙氧基-6-((4-甲氧基苄基)氧基)吡啶-3-基)-2-氟苯基)乙酸(55.1g，134mmol)和5-(1,1,1-三氟-2-甲基丙-2-基)异噁唑-3-胺(26g，134mmol)在吡啶(500ml)中的混合物中滴加(137.5ml，134mmol)，并在25℃搅拌1h。tlc分析显示起始原料完全消耗后，将混合物倒入搅拌的冷水(1l)中。将混合物搅拌0.5h，然后静置10h。将固体过滤，用h2o(200mlx3)和tbme(200mlx2)洗涤，并在真空中干燥，得到米色固体的2-(4-(4-乙氧基-6-((4-甲氧基苄基)氧基)吡啶-3-基)-2-氟苯基)-n-(5-(1,1,1-三氟-2-甲基丙-2-基)异噁唑-3-基)乙酰胺(65g，100mmol，74％)：¹hnmr(400mhz，cd3od)δ7.94(s，1h)，7.40-7.32(m，3h)，7.26(d，j＝9.6hz，2h)，6.90(d，j＝8.8hz，3h)，6.43(s，1h)，5.26(s，2h)，4.11(q，j＝7.2hz，2h)，3.81(s，2h)，3.78(s，3h)，1.56(s，6h)，1.35(t，j＝7.2hz，3h)；es-lcmsm/z：588(m+h)。

步骤13：2-(4-(4-乙氧基-6-氧代-1,6-二氢吡啶-3-基)-2-氟苯基)-n-(5-(1,1,1-三氟-2-甲基丙-2-基)异噁唑-3-基)乙酰胺

向2-(4-(4-乙氧基-6-((4-甲氧基苄基)氧基)吡啶-3-基)-2-氟苯基)-n-(5-(1,1,1-三氟-2-甲基丙-2-基)异噁唑-3-基)乙酰胺(100g，170mmol)在dcm(1l)中的悬浮液中滴加tfa(80ml，1077mmol)。将混合物在25℃搅拌2h。然后将混合物浓缩。向残余物中滴加h2o(500ml)，然后用饱和na2co3溶液中和，调节ph＝7.5。将沉淀过滤，用h2o(350mlx3)洗涤，并在真空中干燥。向固体中加入pe/ea(3:1，v/v，300ml)，并搅拌0.5h。将固体过滤，并用pe/ea(3:1，v/v，100mlx2)洗涤。将固体再次溶于dcm/meoh(20:1，v/v，1.5l)，然后在真空中浓缩至最少量的溶剂(大约150ml)。将固体过滤，用mecn(50mlx2)洗涤，并在真空中干燥。将残留固体加入etoh(2.5l)，并加热至80℃。固体完全溶解后，将混合物在真空中进行浓缩，得到白色固体的2-(4-(4-乙氧基-6-氧代-1,6-二氢吡啶-3-基)-2-氟苯基)-n-(5-(1,1,1-三氟-2-甲基丙-2-基)异噁唑-3-基)乙酰胺(61.4g，131mmol，77％)：¹hnmr(400mhz，cd3od)δ7.40-7.30(m，2h)，7.25-7.18(m，2h)，6.88(s，1h)，5.98(s，1h)，4.11(q，j＝7.2hz，2h)，3.81(s，2h)，1.56(s，6h)，1.37(t，j＝7.2hz，3h)；es-lcmsm/z：468(m+h)。

实施例2

制备：

2-(4-(4-乙氧基-6-氧代-1,6-二氢吡啶-3-基)-2-氟苯基)-n-(5-(1,1,1-三氟-2-甲基丙-2-基)异噁唑-3-基)乙酰胺的结晶一水合物(化合物a一水合物)

将2-(4-(4-乙氧基-6-氧代-1,6-二氢吡啶-3-基)-2-氟苯基)-n-(5-(1,1,1-三氟-2-甲基丙-2-基)异噁唑-3-基)乙酰胺(407mg)加入至20ml瓶，然后加入水(8.1ml)。将悬浮液加热至40℃，并伴随搅拌在1h内由40℃循环至5℃，结块过夜。将固体过滤并空气干燥20min。结晶产物的产率为373mg(91.6％)。

该物质(化合物a一水合物)的x-射线粉晶衍射(xrpd)图示于图1中，且衍射角和d-间距的概况示于下表i。在pananalyticalx’pertpro衍射仪上在si零背景晶片上进行xrpd分析。采集条件包括：cukα辐射，发电机电压：45kv，发电机电流：40ma，步长：0.02°2θ。

表i

在nicoletnxr9650ft-拉曼光谱仪上，以4cm^-1分辨率，用来自nd:yvo4激光(λ＝1064nm)的激发记录标题化合物的拉曼光谱。该物质的拉曼光谱示于图2中，观察到的主峰在422、450、489、516、545、575、669、700、716、733、774、818、894、918、963、989、1032、1112、1174、1241、1296、1334、1428、1463、1484、1506、1532、1566、1629、1645、1721、2930、2990和3087cm^-1。

在安装有自动取样器和致冷冷却系统的tainstrumentsq100差示扫描热量计上，在40ml/minn2吹扫下记录标题化合物的差示扫描热量法(dsc)热分析图，并示于图3。使用15℃/min的加热速率在波纹铝盘中进行该实验。化合物a一水合物的dsc热分析图显示双吸热峰，开始温度为大约139℃，然后是单吸热峰，开始温度为大约241℃。本领域技术人员将理解，吸热峰的开始温度可以随实验条件变化。

在tainstrumentsq500热重分析仪上记录标题化合物的热重量分析(tga)热分析图，并示于图4中。用40ml/minn2气流和15℃/min的加热速率进行该实验。化合物a一水合物的tga热分析图显示在75-160℃大约3.7％的水丧失(1.0eq)。

在真空烘箱中在50℃用氮气流干燥化合物a一水合物大约17小时，未观察到水含量变化(tga)和形式变化(拉曼光谱或xrpd)。

实施例3

制备：

2-(4-(4-乙氧基-6-氧代-1,6-二氢吡啶-3-基)-2-氟苯基)-n-(5-(1,1,1-三氟-2-甲基丙-2-基)异噁唑-3-基)乙酰胺的结晶非溶剂合物形式(化合物a非溶剂合物形式1)

将2-(4-(4-乙氧基-6-氧代-1,6-二氢吡啶-3-基)-2-氟苯基)-n-(5-(1,1,1-三氟-2-甲基丙-2-基)异噁唑-3-基)乙酰胺(160mg)加入至4ml瓶中，然后加入mecn(3.2ml)。将悬浮液加热至40℃，并伴随搅拌在1h内由40℃循环至5℃，结块过夜。将固体过滤并空气干燥20min。将样品在50℃在真空烘箱中用氮气流干燥4h。结晶产物的产率为152mg(95.0％)。

该物质(化合物a非溶剂合物形式1)的x-射线粉晶衍射(xrpd)图示于图5中，且衍射角和d-间距的概况示于下表ii。在pananalyticalx’pertpro衍射仪上在si零背景晶片上进行xrpd分析。采集条件包括：cukα辐射，发电机电压：45kv，发电机电流：40ma，步长：0.02°2θ。

表ii

在nicoletnxr9650ft-拉曼光谱仪上，以4cm^-1分辨率，用来自nd:yvo4激光(λ＝1064nm)的激发记录标题化合物的拉曼光谱。该物质的拉曼光谱示于图6中，观察到的主峰在450、544、566、668、726、771、819、898、978、1035、1110、1176、1242、1273、1329、1424、1470、1484、1511、1534、1626、1681、2930、2999和3093cm^-1。

在安装有自动取样器和致冷冷却系统的tainstrumentsq100差示扫描热量计上，在40ml/minn2吹扫下记录标题化合物的差示扫描热量法(dsc)热分析图，并示于图7。使用15℃/min的加热速率在波纹铝盘中进行该实验。化合物a非溶剂合物形式1的dsc热分析图显示在大约130-160℃的小的热事件，然后是吸热峰，开始温度为大约236℃和大约241℃。本领域技术人员将理解，吸热峰的开始温度可以随实验条件变化。

在tainstrumentsq500热重分析仪上记录标题化合物的热重量分析(tga)热分析图，并示于图8中。用40ml/minn2气流和15℃/min的加热速率进行该实验。化合物a非溶剂合物形式1的tga热分析图显示在75-160℃大约0.6％的重量丧失。

实施例4

制备:

2-(4-(4-乙氧基-6-氧代-1,6-二氢吡啶-3-基)-2-氟苯基)-n-(5-(1,1,1-三氟-2-甲基丙-2-基)异噁唑-3-基)乙酰胺的结晶非溶剂合物形式(化合物a非溶剂合物形式2)

将2-(4-(4-乙氧基-6-氧代-1,6-二氢吡啶-3-基)-2-氟苯基)-n-(5-(1,1,1-三氟-2-甲基丙-2-基)异噁唑-3-基)乙酰胺(化合物a一水合物)通过加热至160℃并保持5min脱水。

该物质(化合物a非溶剂合物形式2)的x-射线粉晶衍射(xrpd)图示于图9中，且衍射角和d-间距的概况示于下表iii。在pananalyticalx’pertpro衍射仪上在si零背景晶片上进行xrpd分析。采集条件包括：cukα辐射，发电机电压：45kv，发电机电流：40ma，步长：0.02°2θ。

表iii

在nicoletnxr9650ft-拉曼光谱仪上，以4cm^-1分辨率，用来自nd:yvo4激光(λ＝1064nm)的激发记录标题化合物的拉曼光谱。该物质的拉曼光谱示于图10中，观察到的主峰在417、451、486、544、576、669、697、716、730、771、821、900、964、986、1035、1109、1175、1243、1265、1300、1336、1430、1465、1487、1527、1631、1640、1726、2919、2949、2997和3082cm^-1。

在安装有自动取样器和致冷冷却系统的tainstrumentsq100差示扫描热量计上，在40ml/minn2吹扫下记录标题化合物的差示扫描热量法(dsc)热分析图，并示于图11。使用15℃/min的加热速率在波纹铝盘中进行该实验。化合物a非溶剂合物形式2的dsc热分析图显示单吸热峰，开始温度为大约240℃。本领域技术人员将理解，吸热峰的开始温度可以随实验条件变化。

实施例5

制备：

2-(4-(4-乙氧基-6-氧代-1,6-二氢吡啶-3-基)-2-氟苯基)-n-(5-(1,1,1-三氟-2-甲基丙-2-基)异噁唑-3-基)乙酰胺的结晶非溶剂合物形式(化合物a非溶剂合物形式3)

将2-(4-(4-乙氧基-6-氧代-1,6-二氢吡啶-3-基)-2-氟苯基)-n-(5-(1,1,1-三氟-2-甲基丙-2-基)异噁唑-3-基)乙酰胺(508.9mg)加入至20ml瓶中，然后加入meoh(10.0ml)。将悬浮液加热至40℃，并伴随搅拌在1h内由40℃循环至5℃，结块过夜。将固体过滤并空气干燥20min。结晶产物的产率为337.8mg(66.4％)。

该物质(化合物a非溶剂合物形式3)的x-射线粉晶衍射(xrpd)图示于图12中，且衍射角和d-间距的概况示于下表iv。在pananalyticalx’pertpro衍射仪上在si零背景晶片上进行xrpd分析。采集条件包括：cukα辐射，发电机电压：45kv，发电机电流：40ma，步长：0.02°2θ。

表iv

在nicoletnxr9650ft-拉曼光谱仪上，以4cm^-1分辨率，用来自nd:yvo4激光(λ＝1064nm)的激发记录标题化合物的拉曼光谱。该物质的拉曼光谱示于图13中，观察到的主峰在454、493、572、639、728、769、819、841、923、978、1037、1109、1190、1239、1287、1331、1429、1464、1485、1509、1542、1631、1714、2951、2994、3078和3093cm^-1。

在安装有自动取样器和致冷冷却系统的tainstrumentsq100差示扫描热量计上，在40ml/minn2吹扫下记录标题化合物的差示扫描热量法(dsc)热分析图，并示于图14。使用15℃/min的加热速率在波纹铝盘中进行该实验。化合物a非溶剂合物形式3的dsc热分析图显示单吸热峰，开始温度为大约248℃。本领域技术人员将理解，吸热峰的开始温度可以随实验条件变化。

在tainstrumentsq500热重分析仪上记录标题化合物的热重量分析(tga)热分析图，并示于图15中。用40ml/minn2气流和15℃/min的加热速率进行该实验。

生物学测试

在ret激酶酶学测试、基于细胞的机理测试和基于细胞的增殖测试中测定了本发明化合物的ret激酶抑制活性。

ret激酶酶学测试

使用杆状病毒表达系统将人ret激酶胞浆区(登录号np_000314.1的氨基酸658-1114)表达为n-末端gst-融合蛋白。使用谷胱甘肽琼脂糖色谱纯化gst-ret。以10ul总体积，伴随增加浓度的ret激酶抑制剂作为单一试剂，在384孔板中进行ret激酶酶学测试，如下所述：通过加入100nl不同浓度的ret抑制剂至384孔板中制备ret抑制剂化合物板。将5μl/孔的2x酶混合物(50mmhepes(4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪乙磺酸)；1mmchaps(3-[(3-胆酰胺基丙基)二甲基铵基]-1-丙烷磺酸盐)；0.1mg/mlbsa(牛血清白蛋白)；1mmdtt(二硫苏糖醇)；0.2nmret激酶)加入至384孔板，并在23℃孵育30分钟。加入5μl/孔的2x底物混合物(50mmhepes；1mmchaps；0.1mg/mlbsa；20μm三磷酸腺苷；20mmmgcl2和1μm生物素化的肽底物)，并在23℃孵育1小时。加入10μl/孔的2x终止/检测混合物(50mmhepes；0.1％bsa；800mm氟化钾；50mmedta(乙二胺四乙酸)；200x铕穴状化合物标记的抗磷酸酪氨酸抗体的稀释液；62.5nm链亲和素-xl665)，在23℃孵育1小时，并在均相时间分辨荧光读数器上读数。使用graphpadprism拟合ic50为s形剂量响应。

ret激酶的基于细胞的机理测试

在基于细胞的测试中测定了本发明化合物抑制组成性ret激酶磷酸化能力的效力。在37℃，在5％二氧化碳中，将具有组成性激活的ret激酶的甲状腺髓样癌细胞系tt细胞(atcccrl-1803)维持在150cm²盘中的f12kaighn培养基、10％胎牛血清、1xglutamax、1x非必须氨基酸、1x青霉素/链霉素抗生素中。将1.0e5个tt细胞/孔在96孔细胞培养皿中铺板，并允许粘附过夜。在37℃，在5％二氧化碳中，将tt细胞用不同浓度的ret抑制剂化合物处理2h，用冰冷的pbs(磷酸盐缓冲盐水)洗涤，并通过加入200μl的25mmtrishclph7.5；2mmedta；150mmnacl；1％脱氧胆酸钠；1％tritonx-100；50mmβ-甘油磷酸钠；1mm原钒酸钠；1x磷酸酶抑制剂混合物#2(sigma#p5726)；1x磷酸酶抑制剂混合物#3(sigma#p0044)和1x完整迷你无edta蛋白酶抑制剂混合物(roche#4693159001)裂解，在-80℃孵育10分钟并在冰上解冻。将100μl的tt细胞裂解液加入至96孔板，在4℃过夜，所述板用兔抗ret抗体(cellsignaling#7032)的1:1,000稀释液在4℃包被过夜，用1xpbs；0.05％tween-20；1％牛血清白蛋白阻断。将板用200μl的1xpbs洗涤4次；加入0.05％tween-20，然后加入100μl的抗磷酸酪氨酸检测抗体(cellsignaling#7034)的1:1,000稀释液，并在37℃孵育1小时。将板用200μl的1xpbs洗涤4次；加入0.05％tween-20，然后加入100μl的抗鼠免疫球蛋白辣根过氧化物酶共轭抗体(cellsignaling#7034)的1:1,000稀释液，并在37℃孵育30分钟。将板用200μl的1xpbs洗涤4次；加入0.05％tween-20，加入100μl的tmb(3,3',5,5"-四甲基联苯胺)底物(cellsignaling#7004)，在37℃孵育10分钟，加入100μl终止溶液(cellsignaling#7002)，并在分光光度计上在450nm读取吸光度。使用graphpadprism拟合ic50为s形剂量响应。

ret激酶的基于细胞的增殖测试

测定了本发明化合物抑制细胞增殖和细胞生存的能力的效力。在37℃，在5％二氧化碳中，将具有组成性激活的ret激酶的甲状腺髓样癌细胞系tt细胞(atcccrl-1803)维持在150cm²盘中的f12kaighn培养基、10％胎牛血清、1xglutamax、1x非必须氨基酸、1x青霉素/链霉素抗生素中。将50μl培养基中的6.0e3个tt细胞/孔在96孔细胞培养皿中铺板，并允许粘附过夜。将50μl系列稀释的ret抑制剂化合物加入含有培养的tt细胞的96孔板，并在37℃，在5％二氧化碳中孵育8天。加入50μl的celltiter-glo(promega#g-7573)，在振摇器上将内容物混合1分钟，然后在暗处在23℃混合10分钟，并用envision(perkinelmer)读取发光。使用graphpadprism拟合ic50为s形剂量响应。

生物学数据

在上述ret测试中测定了实施例1化合物，发现其为ret的抑制剂。实施例1化合物的数据列于下表v中，如下所示：+＝10μm>ic50>100nm；++＝100nm≥ic50>10nm；+++＝ic50≤10nm。

表v

体内结肠超敏反应模型

可以在结肠超敏反应的体内模型(hoffman，j.m.等人，gastroenterology，2012，142:844-854)中评价ret激酶抑制剂化合物的有效性。