一种绿色木霉突变株的培养方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及微生物培养技术领域，具体是一种绿色木霉突变株的培养方法。
【背景技术】
[0002] 绿色木霉(Trichoderma viride)为半知菌，属一类广布型真菌口半知菌亚口、丝 抱菌纲、丝抱目、粘抱菌类、木霉属。该菌类常腐生于木材、种子和植物残体上，能产生多种 具有生活性物质（如纤维素酶、几下质酶等物质），通过产生并分泌于胞外，杀死±壤中的有 害菌物。
[0003] 由于绿色木霉可在多种营养基质上快速生长，对多种植物病原菌又重寄生作用， 能有效地竞争营养和生存空间，还可W产生抗生素和攻击多种病原所需要的酶，所W被认 为是一种很有开发潜力的生防菌。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种绿色木霉突变株的培养方法，利用化学诱变对从腐烂 的木材残体上混合菌物筛选的绿色木霉进行化学诱变，诱导出的绿色木霉突变株具有高效 抗小麦赤霉病、草替和番茄灰霉病等±传病的作用。
[0005] 为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
[0006] -种绿色木霉突变株的培养方法，包括W下步骤：
[0007] (1)绿色木霉菌株的培养与纯化:先从野外植物腐烂残体的水溶液取样，于26 °C接 种于PDA固体培养基上培养3~5天，筛选并鉴定出绿色木霉菌株，经二代连续培养出纯化绿 色木霉困株；
[000引（2)纯化绿色木霉菌株的扩大培养:纯化绿色木霉菌株再经液态PDA培养基中扩大 培养，离屯、去清液，测定活性，再用二级纯水洗涂，W8000r/min离屯、15min，取沉淀并重复一 次扩大培养，离屯、去清液，测定活性，再用二级纯水洗涂，WSOOOr/min离屯、15min，取沉淀吹 干后保存于冰箱暗处；
[0009] (3)纯化绿色木霉菌株的诱变:将步骤(2)中离屯、后的清液放入PDA培养基中，再 W几下质或者结晶簇酸纤维素钢为反应底物，W秋水仙碱或者硫酸二乙醋作为诱变剂，进 行诱变，诱变终止后，经离屯、取沉淀物，置于暗处稳定4~化，即得绿色木霉突变株;其中诱 变剂的浓度为0.005~0.0 Swt % ;诱变时间为6~12化。
[0010] 作为本发明进一步的方案:所述步骤(2)中，按照重量百分比，液态PDA培养基由W 下物质配置而成：马铃馨2~3%;鱼蛋白粉0.5~3.3% ;FeS〇4〇.〇l~〇.〇3%;K也P040.02~ 0.20% ;MgS〇4〇.05~0.35% ;Na2B2〇7 ? 10出0 0.025~0.05% ;Na2Se〇3〇.025~0.05%， aiS〇4〇.〇l ~0.02%，余量为水。
[0011] 作为本发明进一步的方案:所述液态PDA培养基的pH值调至5.8~6.5，培养溫度为 27 ±1. (TC,培养时间为5天。
[0012] 作为本发明进一步的方案:所述步骤(3)中，按照反应底物与发酵物的质量体积比 为lOg/L，添加反应底物。
[0013] 作为本发明进一步的方案:所述步骤(3)中，诱变剂的浓度为0.01~0.05wt %，诱 变时间为30~SOh。
[0014] 作为本发明进一步的方案:所述步骤(3)中，诱变剂的浓度为0.03wt %，诱变时间 为48~6化。
[0015] 作为本发明进一步的方案:所述步骤(3)中，诱变剂的浓度为0.03wt %，诱变时间 为4她。
[0016] 作为本发明进一步的方案:还包括(4)绿色木霉突变株的鉴定，加入浓度为0.5~ 1.5wt%的薦糖作引子，启动抱子的萌发。
[0017] 与现有技术相比，本发明的有益效果是：
[0018] 本发明利用化学诱变对从腐烂的木材残体上混合菌物筛选的绿色木霉进行化学 诱变，诱导出的绿色木霉突变株具有高效抗小麦赤霉病、草替和番茄灰霉病等±传病的作 用，可代替化学农药运用于农作物的种植，防治由±壤所产生的病害，实现作物增产。
【具体实施方式】
[0019] 下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述， 显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中 的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例， 都属于本发明保护的范围。
[0020] 实施例1
[0021] 本发明实施例中，一种绿色木霉突变株的培养方法，包括W下步骤：
[0022] (1)绿色木霉菌株的培养与纯化:先从野外植物腐烂残体的水溶液取样，于26°C接 种于PDA固体培养基上培养3~5天，对照国家微生物菌库所公布图样M1、M2进行筛选鉴定 后，经二代连续培养出纯化绿色木霉菌株；
[0023] (2)纯化绿色木霉菌株的扩大培养:步骤（1)制得的纯化绿色木霉菌株再经液态 PDA培养基中扩大培养，离屯、去清液(保留冰箱4°C)，测定活性（目的在于鉴别菌物特征功能 强弱，W供开发应用参考），再用二级纯水洗涂，W8000r/min离屯、15min，取沉淀并重复一次 扩大培养，离屯、去清液(保留冰箱4°C)，测定活性，再用二级纯水洗涂，W8000r/min离屯、 15min，取沉淀吹干后保存于冰箱暗处，W保障菌物优良特征改变较小；
[0024] 其中，液态PDA培养基，按照重量百分比由W下物质配置而成：马铃馨2~3% ;鱼蛋 白粉0.5~3.3% ;FeS〇4〇.01 ~0.03% ;K出P040.02~0.20% ;MgS〇4〇.05~0.35% ;Na2B2〇7 ? 10此00.025~0.05 % ;Na2Se〇3〇. 025~0.05 %，ZnS〇4〇. 01 ~0.02 %，余量为水。所述液态PDA 培养基的pH值调至5.8~6.5，培养溫度为27 ± 1. (TC，培养时间为5天。
[0025] (3)纯化绿色木霉菌株的诱变:将步骤(2)中离屯、后的清液放入PDA培养基中，W几 下质或者结晶簇酸纤维素钢为反应底物(其中几下质的添加量是单独按照发酵物体积容量 配制（lOg/L)加入发酵容器内，结晶簇酸纤维素钢的加入也是单独按照发酵物体积容量配 审iJ(l〇g/L)加入发酵容器内），W化学诱变剂一一秋水仙碱或者硫酸二乙醋作为诱变剂，进 行诱变，其中诱变剂的浓度为0.005~0.0 Swt % ;诱变时间为6~12化，诱变终止后，经离屯、 取沉淀物，即为绿色木霉突变株，置于暗处稳定4~化，避免遇光恢复突变而导致失败；
[0026] (4)绿色木霉突变株的鉴定:鉴定检测菌物时加薦糖(浓度0.5~1.5wt%)作引子， 启动抱子的萌发。
[0027] 本发明实施例中，按照诱变剂的浓度依设计六个水平（0.005wt %、0.0 Iwt %、 0.02wt %、0.04wt %、0.06wt %、0.0 Swt % )，分水平加入PDA培养基中，诱导基因发生，密码 缺陷，导致相关主要功能酶信息不能表达;诱变时间长短按所设计的9个因素(6h、12h、24h、 3化、4化、6化、7化、9化、120h)控制，具体的设计如表1所示。
[00%]其中，PDA培养基的具体制备步骤为:去皮马铃馨600g，切碎加水200ml煮沸30分钟 后趁热用240目滤布过滤去滤渣留汁;碎米慷45g，加水150ml煮沸40分钟，用前述滤布过滤 去渣留汁，与前滤液合并量体积，加薦糖60g，蜂蜜(最佳槐蜜或向日葵蜜)90g，酵母粉15g， 按照几下质与发酵物的质量体积比为lOg/L的比例添加胶态几下质，注入粉针剂青霉素1 瓶，再加水至化，灭菌。
[0029] 表1诱变剂的浓度和诱变时间的设计
[0030]
[0031] 经过化学诱变剂的诱变后，W绿色木霉细胞增加为特征进行检测。因微生物很小， 它生长过程计数是W细胞的分裂数"1个变2个，2个变4个，呈规律增加及细胞外表色泽 确定吸收波长，外表是绿色，选择吸光度A645nm，然后根据下面公式计算：
[0032] A = QCL (1)
[0033] 式中，a为比例常数;C为单位面积细胞数(或溶液中细胞存在产生透光率）；L为计 算后的面积(一般为1而忽略）。
[0034] 在口出％7.2、0.05111〇1几的憐酸缓冲液中的吸收光系数为82.04，即可列出上述式 (1)。
[0035] A663 = 16.75XaC (2)
[0036] 根据式（1)列出的A，代入上式(2)求出表2中各水平的抱子数或产生的透光率如表 2,其中Wb5为最佳，结合表1，诱变时间为4她最佳。
[0037] 表2木霉抱子(即细胞每cm2)增加的方差分析结果
[00；3 引
[0039] 本发明利用化学诱变对从腐烂的木材残体上混合菌物筛选的绿色木霉进行化学 诱变，诱导出的绿色木霉突变株具有高效抗小麦赤霉病、草替和番茄灰霉病等±传病的作 用，可代替化学农药运用于农作物的种植，防治由±壤所产生的病害，实现作物增产。
[0040] 对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在 不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够W其他的具体形式实现本发明。因此，无论 从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权 利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有 变化囊括在本发明内。
[0041] 此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加 W描述，但并非每个实施方式仅包 含一个独立的技术方案，说明书的运种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当 将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可W经适当组合，形成本领域技术人员 可W理解的其他实施方式。
【主权项】
1. 一种绿色木霉突变株的培养方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 绿色木霉菌株的培养与纯化:先从野外植物腐烂残体的水溶液取样，于26 °C接种于 roA固体培养基上培养3~5天，筛选并鉴定出绿色木霉菌株，经二代连续培养出纯化绿色木 霉菌株； (2) 纯化绿色木霉菌株的扩大培养:纯化绿色木霉菌株再经液态PDA培养基中扩大培 养，离心去清液，测定活性，再用二级纯水洗涤，以8000r/min离心15min，取沉淀并重复一次 扩大培养，离心去清液，测定活性，再用二级纯水洗涤，以8000r/min离心15min，取沉淀吹干 后保存于冰箱暗处； (3) 纯化绿色木霉菌株的诱变:将步骤(2)中离心后的清液放入TOA培养基中，再以几丁 质或者结晶羧酸纤维素钠为反应底物，以秋水仙碱或者硫酸二乙酯作为诱变剂，进行诱变， 诱变终止后，经离心取沉淀物，置于暗处稳定4~6h，即得绿色木霉突变株;其中诱变剂的浓 度为0 · 005~0 · 08wt % ;诱变时间为6~120h。2. 根据权利要求1所述的绿色木霉突变株的培养方法，其特征在于，所述步骤(2)中，按 照重量百分比，液态PDA培养基由以下物质配置而成：马铃薯2~3%;鱼蛋白粉0.5~3.3%; FeS04 0.01~0.03%;KH2P04 0.02~0.20%;MgS04 0.05~0.35%;Na2B207 *10H20 0.025~ 0.05% ;Na2Se〇3 0.025~0.05%，ZnS〇4 0.01 ~0.02%，余量为水。3. 根据权利要求2所述的绿色木霉突变株的培养方法，其特征在于，所述液态PDA培养 基的pH值调至5.8~6.5，培养温度为27 ± 1.0°C，培养时间为5天。4. 根据权利要求1所述的绿色木霉突变株的培养方法，其特征在于，所述步骤(3)中，按 照反应底物与发酵物的质量体积比为1 〇g/L，添加反应底物。5. 根据权利要求1所述的绿色木霉突变株的培养方法，其特征在于，所述步骤(3)中，诱 变剂的浓度为〇. 01~〇. 〇5wt%，诱变时间为30~80h。6. 根据权利要求5所述的绿色木霉突变株的培养方法，其特征在于，所述步骤(3)中，诱 变剂的浓度为〇.〇3wt%，诱变时间为48~60h。7. 根据权利要求6所述的绿色木霉突变株的培养方法，其特征在于，所述步骤(3)中，诱 变剂的浓度为〇.〇3wt%，诱变时间为48h。8. 根据权利要求1~7任一所述的绿色木霉突变株的培养方法，其特征在于，还包括(4) 绿色木霉突变株的鉴定，加入浓度为0.5~1.5wt %的蔗糖作引子，启动孢子的萌发。
【专利摘要】本发明公开了一种绿色木霉突变株的培养方法，包括：先从野外植物腐烂残体的水溶液取样，于26℃接种于PDA固体培养基上培养3～5天，筛选并鉴定出绿色木霉菌株，经二代连续培养出纯化绿色木霉菌株；再经液态PDA培养基中扩大培养，离心去清液，测定活性，再用二级纯水洗涤，离心，取沉淀并重复一次，吹干后保存于冰箱暗处；将离心后的清液放入PDA培养基中，再以几丁质或者结晶羧酸纤维素钠为反应底物，以秋水仙碱或者硫酸二乙酯作为诱变剂，进行诱变，诱变终止后，经离心取沉淀物，置于暗处稳定4～6h，即得绿色木霉突变株。该绿色木霉突变株可代替化学农药运用于农作物的种植，防治由土壤所产生的病害，实现作物增产。
【IPC分类】C12N15/01, C12N1/14, C12R1/885
【公开号】CN105713894
【申请号】CN201610049069
【发明人】李晓白, 蒋立科
【申请人】李晓白