本发明涉及一种改在的sgRNA及及染色体标记方面的应用。属于基因工程领域。
背景技术：
研究细胞中染色体及基因的位置信息对理解基因表达调控有着重要意义，要研究清楚基因在细胞核内的空间位置与其功能性输出的关系，需对细胞内特异的基因位点进行标记以获得空间信息。同时还要获得基因表达过程中的基因位置的动态信息，所以发展活细胞染色质DNA的荧光标记技术和方法对解决基因组结构和功能的关系非常重要。近几十年荧光显微镜技术的发展使得在单细胞水平研究基因位点动态，染色体的大区段粗略结构，染色体的小位点精细结构成为比较常规的手段。
常见的传统标记方法包括：荧光原位杂交(FISH)，荧光核苷酸类似物，标记常见DNA结合蛋白，荧光阻遏蛋白操纵子系统(FROS)，可编辑人工核酸酶标记系统等。
最为传统的直接DNA标记方法是在固定细胞内进行荧光原位杂交(FISH)。DNA-FISH依赖于特异的荧光标记的短核酸探针与特定DNA片段的互补配对，达到将荧光基团带到特异DNA位点进行富集放大信号的目的。此种方法依赖于核苷酸碱基之间的互补配对，特异性好，且可以对任意的DNA序列进行标记，可扩展性好，精度较高，但由于需要对细胞进行固定并加热使双链DNA变性解链，对活细胞不兼容，所以无法对基因位置的动态变化过程进行观察和追踪。
直接标记DNA本身要比标记DNA结合蛋白更加困难。一般可以通过常见DNA的结合染料来实现，如可以嵌入DNA大沟或者小沟的DAPI，Hoechst，SYBRGreen，TOTO-1，YOYO-1，SYTO等。这些染料一般较暗，无序列特异性，光转化性质不好，无法做超分辨成像，难追踪动态过程等限制了广泛应用。另一个较好的方法是使用特殊的核苷酸类似物，如Edu，EdC，BrdU等。这些小分子核苷酸类似物可以和正常的核苷酸一样，在DNA复制过程中掺入DNA，然后通过免疫荧光或者光点击化学反应将荧光染料加载到核苷酸类似物上实现对复制过程中的染色质的标记。此种标记方法无序列特异性，且需要固定细胞，对活细胞不兼容，无法获得动态信息。
为了标记染色质，可以通过标记染色质的结合蛋白来实现活细胞染色质动态成像。可以通过荧光蛋白连接的组蛋白非特异性的将所有的染色质全部标记，也可以标记特殊的染色质结构，如TRF标记端粒，CenpA标记着丝粒。限制是荧光蛋白-组蛋白标记主要是通过瞬时过表达外源的蛋白实现的，不可避免会引入人为的假象，例如影响基因组核小体的密度故改变原始状态的染色质结构，过量的外源蛋白游离不结合染色质并导致错误定位，染色质被有荧光蛋白标记外源和无荧光蛋白标记内源组蛋白共同占据导致成像低采样频率。此技术最大的缺点是应用范围有限，不能对任意DNA序列的实现自由标记。
FROS主要是通过是在目的片段处人工插入一段外源正交的重复序列利用识别插入序列的蛋白融合荧光蛋白来实现对插入位置染色质片段的特异性荧光标记。最为常用的FROS正交系统是来自大肠杆菌乳糖操纵子的LacO、大肠杆菌四环素转座子TetO、λ噬菌体阻遏子。FROS一般都是用多重重复序列使得染色体插入位点局部区域上结合上百个荧光蛋白，使荧光信号得到放大，形成远远高于背景荧光的亮点，极高的信噪比对于目的片段的精确定位和长时间追踪都非常有效。
虽然这种方法可以实现活细胞内染色质DNA的动态观察，但其有明显的不足。其一，通量低操作繁琐，建成稳定细胞系耗时长。FROS系统在细菌和酵母中得到了非常广泛的应用，主要得益于细菌和酵母的遗传学操作工具成熟，可以快速高通量构建菌株。而哺乳动物细胞的相应实验几乎都是通过随机整合实现重复序列的插入，几乎不能控制位置及重复次数，少数通过胚胎干细胞打靶实现，但操作周期较长，不适合高通量完成。其二，引入的较大外源序列(～10kb)对目的片段及其周围的染色质构象改变也可能比较显著。尚不清楚这种高度重复的外源序列是否会形成现在仍无法检测的高级结构干扰附近染色质的结构和功能，故用这种方法所研究的DNA断点修复动力学过程有可能与体内内源性的修复过程有所不同。用这种方法追踪不同位点染色体的运动得到的运动方式和扩散系数可能与内源真实情况存在偏差。综上所述，FROS系统也不适于广泛应用在基因组特异位点的活体标记。
最近五年来，基因组靶向编辑技术的快速发展，使得围绕可编辑的DNA结合蛋白的相关外围技术也得到快速的开发与应用，主要用于基因表达调控和成像研究。TALE(transcriptionactivator-likeeffector)和CRISPR/Cas9(CIusteredregularlyinterspersedshortpalindromicrepeat/CRISPR-associatedprotein9)技术的出现为活细胞染色质DNA的标记打开了一扇新的大门。因为可以识别并结合特异DNA片段并且可以在细胞内持续表达，所以TALE和CRISPR都可以用来标记活细胞染色质DNA。
虽然基于TALE和CRISPR的活细胞染色质DNA标记方法有一系列优点，但也存在不少问题亟需解决和改进。
TALE系统所存在的问题：虽然TALE系统因为荧光蛋白直接融合在TALE蛋白上，因此多位点标记只需对不同位点设计相应的TALE并融合不同颜色的荧光蛋白就可以实现，但是TALE的模块化组装过程仍比较繁琐，通量很低，只能设计组装数量有限的TALE。针对非重复序列而言，增强信号需要针对靶序列设计多条TALE，这几乎是不可行的，迄今为止尚无用TALE进行非重复基因位点标记的报道。
CRISPR系统所存在的问题，现有的基于一种Cas9标记技术不能做多色同时成像。因为其特异性是由sgRNA决定的，而荧光蛋白是融合在dCas9上，因此做多色同时标记很困难。虽然近期Ma等人用正交CRISPR系统实现了双色标记，但多色非重复单基因位点标记需要同时导入的sgRNA数量更多，因此目前CRISPR多色标记上只实现了在重复序列的标记，非重复序列的标记尚未开发成功。另外，NMCas9和ST1Cas9对PAM位点的要求要比常用的SPCas9苛刻，在较小的DNA长度范围内不易找到足够数量的PAM位点，可设计的sgRNA数量有限。而且NMCas9和ST1Cas9的PAM序列简并性较强，很容易出现脱靶效应。这些给非重复单基因位点标记时sgRNA的选取带来不便。
有鉴于此，目前需要开发新的活细胞兼容的同时又具有对任意染色质DNA序列特异标记的普适性基因位点标记方法。本发明克服了荧光原位杂交和荧光核苷酸类似物等方法只能做固定样品不能做活细胞的缺点，发展非入侵性的活细胞基因位置标记技术。同时克服了标记常见DNA结合蛋白普适性不强的缺点，发展了可以对基因组内任意位置进行标记的方法。针对荧光阻遏蛋白操纵子系统和TALE的操作通量不高的缺点，我们发展了基于CRISPR系统的高通量办法。针对原始的Cas9标记不能实现多色以及正交的Cas9不能实现多色非重复序列的标记等缺点，我们开发了基于sgRNA的可以实现多色非重组序列的标记方法。综上所述，本发明所提供的基因位点标记方法是迄今为止唯一一种可以兼容活细胞的，非入侵性的，高通量，抗漂白，多色多位点，可以实现非重复序列标记的一种染色质位点标记方法。具有非常广阔的应用前景。
因为CRISPR系统的靶向特异性是由sgRNA决定的，而不是由Cas9，因此将荧光蛋白连接在sgRNA就能实位置特异性的不同位点不同颜色的标记。本发明是改造原来的sgRNA实现活细胞多基因位点的多色标记。根据晶体结构改造针对sgRNA与Cas9形成的复合物中伸出Cas9外面的sgRNA进行，连上可以和某些外源蛋白结合的RNA适配子，如MS2，PP7，Spinach等。将这些适配子的结合蛋白融合上荧光蛋白即可标记sgRNA识别的靶序列。
技术实现要素：
针对传统的染色体位点标记技术中存在的操作复杂，通量低，等问题，我们发展了新型活细胞染色质DNA特异位点荧光标记方法，为研究染色质DNA上功能模块的空间位置与其功能性输出之间的关系提供研究工具。
本发明涉及一种基于改造sgRNA的染色体标记方法，其特征在于，在sgRNA的环2和/或环4的位置，插入RNA适配子，通过相应的可以识别适配子的蛋白质，将荧光蛋白连接到可以识别适配子的蛋白质上，从而将荧光蛋白招募到特定的染色体基因位点上。
根据优选的技术方案，所述sgRNA的LOOP4的位置插入数量2-6个碱基，优选插入4个碱基；并在相应配对位置做出适应性修改。
根据优选的技术方案，所述sgRNA的起始部分的四个U中的其中一个换成A，并在相应配对位置做出适应性的修改。
根据优选的技术方案，所述的RNA适配子是MS2或者PP7或者Spinach或者COM或者λN等，可以识别MS2的蛋白质是MCP，可以识别PP7的蛋白质是PCP。
根据优选的技术方案，不同适配子识别蛋白上连接不同的荧光蛋白，从而实现对特定的基因位点进行多色标记。
根据优选的技术方案，还包括将改造后的sgRNA和dCas9蛋白以及靶序列DNA形成复合物。
根据优选的技术方案，改造sgRNA的染色体标记方法可以用于高度重复位点的双色标记与长时间追踪、单基因位点标记、细胞分裂过程中染色体动态行为的观察、sgRNA定位等方面。
本发明涉及一种改造的sgRNA，其特征在于，由以下步骤制备：
在sgRNA的环2和/或环4的位置，插入RNA适配子，通过相应的可以识别适配子的蛋白质，将荧光蛋白和可以识别适配子的蛋白质连接起来。
所述改造的sgRNA可用于活细胞染色、高度重复位点的双色标记与长时间追踪、单基因位点标记、细胞分裂过程中染色体动态行为的观察、sgRNA定位等方面。
根据优选的技术方案，所述sgRNA的LOOP4的位置插入数量2-6个碱基，优选插入4个碱基；并在相应配对位置做出适应性修改。
根据优选的技术方案，所述sgRNA的起始部分的四个U中的其中一个换成A，并在相应配对位置做出适应性的修改。
根据优选的技术方案，所述的RNA适配子是MS2或者PP7或者Spinach或者COM或者λN等，可以识别MS2的蛋白质是MCP，可以识别PP7的蛋白质是PCP。
根据优选的技术方案，不同适配子识别蛋白上连接不同的荧光蛋白，从而实现对特定的基因位点进行多色标记。
根据优选的技术方案，还包括将改造后的sgRNA和dCas9蛋白以及靶序列DNA形成复合物。
我们通过对基因组中的端粒和中心粒同时成像证明了我们的系统在双色标记上的表现。新的基于改造sgRNA的标记方法与传统法的基于dCas9和TALE的基因位点标记方法有如下几个方面的优点。其一，虽然基于TALE的标记方法天然上就是一个多色的体系，但是因为TALE模块构建过程的复杂性，限制了其在非重复基因位点标记方面的应用。因为CRISPR/Cas9系统可以改变识别的靶位点序列，因此在非重复位点标记方面有更为有用。其二，仅就多色标记而言，虽然不同菌种来源的正交Cas9系统可以较为容易的实现多色，但是现阶段所用的Cas9特异性和效率不高，且PAM序列要求较为复杂，在要标记的基因组中出现的概率低，很难找到足够数量的位点。因此也不容易实现任意非重组位点的标记。其三，我们发现改造sgRNA的非特异核仁定位较直接用Cas9标记要少。最后，基于改造sgRNA的方法提供了更加快速交换的动力学，可以抵抗光漂白的影响，尤其适合长时间动态追踪基因位点的运动过程。
最重要的是，我们的发明使得基因位点标记的调色板更加多样化。现存的几种活细胞的基因位点标记方法都是互相兼容的，未来的一个发展方向就是将它们互相结合，取长补短，建立能提供更高信噪比、灵敏度的或者更高标记通量的方法。例如，将dCas9和改造的sgRNA连接相同的荧光蛋白，这样用不变数量的sgRNA能招募到基因位点的荧光蛋白的数量会更多，可以显著提高信噪比。或者将正交系统和改造sgRNA结合可以实现高通量的同时标记。使dCas9和sgRNA同时携带不同荧光白蛋白可以实现不用的排列组合。这样可以对超过十个基因位点同时成像，大大提高标记通量，使得同时检测某一个通路中所有的基因位点称为可能。将基因标记方法用好，对于理解基因位置与基因表达调控具有重要的意义。
表1.1TALE和CRISPR在染色质DNA荧光标记中的性能比较
++表示效果较好；+表示可以实现，但有一定难度和限制；-表示实现难度很大。
基于FISH和FROS系统的基因位点标记方法因为活细胞不兼容或者操作复杂，通量低等问题无法在活细胞中进行广泛应用。直接基于Cas9的标记方法无法实现多色多位点同时标记。我们改造了传统的基于Cas9的CRISPR系统标记方法，将标记带到sgRNA上。因为CRISPR系统的标记特异性是由sgRNA决定的，而不是由Cas9决定的，因此我们将颜色特异性的标记带到sgRNA上，实现多位点多色的同时成像。
我们根据Cas9，DNA，sgRNA三元复合物形成的晶体结构改造针对sgRNA与Cas9形成的复合物中伸出Cas9外面的sgRNA进行，连上可以和某些外源蛋白结合的RNA适配子，如MS2，PP7，Spinach等。将这些适配子的结合蛋白融合上荧光蛋白即可标记sgRNA识别的靶序列。将RNA适配子的结合蛋白tdMCP，tdPCP等带上不同颜色的荧光标记，就可以对特定的基因位点进行多色标记成像。
本发明不需要使用多种复杂的CRISPR系统，仅使用一种最为常用的研究背景最为清楚的一种CRISPR系统，就可以在活细胞中实现多色的多染色体位点的同时标记。我们分别使用红色和绿色荧光蛋白非入侵地标记了细胞核内的重复序列端丝和着丝粒序列，并且长时间持续追踪它们的运动。因为我们引入了RNA适配子及其结合蛋白，而这二者之间的相互作用非常迅速，这就引起标记位点的快速交换动力学的产生。在靶位点的快速交换使在成像过程中发生光漂白的荧光蛋白分子可以迅速脱离标记位点，而细胞核质中未漂白的游离的荧光分子可以通过交换补充到靶位点，部分恢复因为光漂白损失的荧光强度，提高了成像后期的图像信噪比，增加了持续追踪的时间。这提供了一种对染色质位点的多色长时间持续成像观察的有力工具。
本发明所提供的基于sgRNA多色多基因位点同时标记的方法与现存的几种活细胞的基因位点标记方法都是互相兼容的，可以将它们互相结合，取长补短，建立能提供更高信噪比、灵敏度的或者更高标记通量的方法。如果将改造的sgRNA和三个正交的Cas9系统结合起来进行基因位点的barcoding标记，则可以进一步提高通量。如果有4个可选的荧光蛋白，理论上可以实现15个基因位点的标记。
附图说明
图1传统的基于Cas9的CRISPR成像原理示意图。(A)将荧光蛋白连接在Cas9上，利用sgNRA与基因组位点识别的互补配对特异性，实现将荧光蛋白招募到染色质靶位点的目的。(B)利用不同细菌种属来源的正交dCas9和其相应的共轭sgRNA实现对基因位点的多色标记。
图2基于改造sgRNA的CRISPR多色成像原理示意。(A)改造后的sgRNA与dCas9蛋白，靶序列DNA形成复合物。在sgRNA中插入的RNA适配子可以招募荧光蛋白。(B)改造sgRNA功能分区，深色显示了RNA适配子的插入位点。(C)多色成像系统的组成。dCas9蛋白使用TRE3G启动子控制表达。tdPCP、tdMCP由CMV启动子控制，sgRNA通过U6启动子控制。
图3基于改造sgRNA的CRISPR多色成像系统的性能表征。(A)基于改造sgRNA和基于dCas9的成像方法对核仁和细胞核背景的信噪比比较。R/B：传统的标记方法信号点对背景的信噪比；G/B：新的标记方法信号点对背景的信噪比；R/N：传统的标记方法信号点对核仁的信噪比；G/N：新的标记方法信号点对核仁的信噪比；(B)对传统标记方法dCas9-mCherry(下)和新的标记方法sgRNA-EGFP(上)两通道着丝粒长时间跟踪计算荧光强度衰减曲线。(C)传统标记方法dCas9-mCherry标记的着丝粒在光漂白之后的恢复曲线。(D)新的标记方法sgRNA-EGFP标记的着丝粒在光漂白之后的恢复曲线。
具体实施方式
为了更清楚的阐述本发明的方法内容，现将本发明所涉及的产品和方法更进一步的总结如下，所涉及的实验数据、步骤或者合成方法等，属于本领域的常规技术，其并不对本专利的保护范围造成限制。
改造sgRNA的设计和优化：
对sgRNA的修改需要考虑对原始复合物结构及功能的影响最小。根据sgRNA，DNA和Cas9形成的三元复合物的结构，发现sgRNA有两个环状结构以及尾部都是伸出复合物以外的14，据此推测这些位置应该不负责和Cas9蛋白的相互作用，仅仅起到结构上的连接作用。因此对这些位置的修改只要不影响sgRNA的折叠，由sgRNA介导的Cas9对基因组DNA的识别特异性不会受到影响(图2A)。
我们将MS2和PP7这两种广泛使用的茎环结构RNA适配子分别独立的插入到sgRNA的外露茎环中(图2A)。可选的插入位点有Tetraloop(环4)和Loop2(环2)，以及尾部。因此可以产生三种改造的sgRNA，分别称为sgRNA1.0(尾部插入)，sgRNA1.1(Tetraloop单插入)，sgRNA1.2(Loop2单插入)，sgRNA2.0(Tetraloop和Loop2双插入)(下面附有详细的最终改造的sgRNA序列)。根据以前研究发现，对sgRNA的Tetraloop做一个A-U翻转和茎环延长能够提高标记效率。推测的原因是A-U翻转能够防止依靠RNA聚合酶III驱动的U6启动子的提前终止(U6启动子的终止需要连续的五个U，而正常的sgRNA起始部分含有四个连续的U，故有可能引起转录终止。A-U翻转而不是直接删除U可以保证sgRNA长度不变，和后面的配对方式不变)；茎环延长使得Cas9蛋白和sgRNA的结合亲和力更高。因此我们进一步将这种优化运用到在改造的sgRNA上，又产生四个sgRNA，分别称为sgRNA1.02(尾部插入)，sgRNA1.12(Tetraloop单插入)，sgRNA1.22(Loop2单插入)，sgRNA2.02(Tetraloop和Loop2双插入)。以sgRNA2.02(Tetraloop和Loop2双插入)为例，如果插入的是MS2，则称为sgRNA2.02-MS2(图2B)。因此，对于插入的适配子为MS2或者PP7，改造和优化后各产生八种sgRNA。
表达体系的设计和优化：
在标记实验中，为了防止对基因组DNA的切割，我们使用内切酶失活(D10A，H840A)的SPCas9蛋白(以下简称dCas9)。为了使dCas9进核，分别在其N端和C端加上两个SV40的核定位信号肽序列(NLSSV40)。同时为了降低其表达量，我们使用紧密控制的可诱导启动子TetOn3G，并在实验过程中不共表达rtTA，不提供Dox，只使用渗漏表达(图2C)。MS2的结合蛋白MCP，PP7的结合蛋白PCP，使用串联二聚体的形式，tdMCP，tdPCP，可以提高它们与相应的RNA的适配子的结合亲和力。为了使tdMCP，tdPCP进核，在其N端加入NLSSV40。将tdMCP融合红色荧光蛋白mCherry，tdPCP融合绿色荧光蛋白EGFP得到NLSSV40-tdMCP-mCherry，NLSSV40-tdPCP-EGFP(图2C)。
基于改造sgRNA的成像系统性能表征
特异性：
为了验证我们开发的基于改造sgRNA的多色成像系统在多位点标记中的应用，我们使用人源癌细胞系MDA-MB-231细胞中高度重复的着丝粒中的α卫星序列以及端粒为靶位点，研究dCas9蛋白和改造后的sgRNA在靶位点附近的聚集。这样只要使用一条sgRNA就能利用原始的重复放大荧光信号实现高信噪比的分辨。我们使用双色荧光共定位的实验来验证改造后的sgRNA对dCas9的结合与定向是否有影响以及能否正确招募相应的RNA适配子结合蛋白tdPCP和tdMCP到特定的基因位点。通过dCas9-mCherry的直接标记能够说明改造的sgRNA并不影响dCas9的结合，能将dCas9正确的导向所标记的靶基因位点；通过改造后的sgRNA通道的荧光分布情况能说明改造后的sgRNA是否能够招募tdM(P)CP-EGFP来标记基因位点。我们发现尾部插入的sgRNA1.0(2)-MS2/PP7，不能实现着丝粒的正确标记。大约60％的细胞中，dCas9-mCherry能正确的标记端粒，100％细胞中，sgRNA1.0(2)-MS2-EGFP都不能正确的定位到所标记的基因位点。
而对于中间茎环部分的插入sgRNA1.1(2)，sgRNA1.2(2)，sgRNA2.0(2)的成像结果表明改造后的sgRNA并不会影响该系统相应的功能。双色共定位的实验说明dCas9-mCherry和sgRNA-MS2-EGFP都能正确定位在靶位置。dCas9-mCherry除了在着丝粒有定位外，还非特异地分布在核仁中，而sgRNA-MS2-EGFP主要分布在着丝粒上，核仁里也有少量的分布，但核仁的非特异性分布要比dCas9-mCherry少。通过像素相关分析，可以发现两个通道的荧光有很好的共定位分布。但是dCas9-mCherry通道在横轴方向有很长的拖尾，这一部分的像素指的是在dCas9-mCherry通道中核仁的部分。通过计算信噪比(目标荧光/背景荧光的标准偏差)可得，无论相对于细胞中背景(40和36)还是相对于核仁(32和12)，sgRNA-MS2-EGFP通道都要比dCas9-mCherry通道高(图3A)。然后我们比较了这几种改造的sgRNA在对着丝粒成像上性能的差别。主要通过两个参数来评价标记效率和性能，分别是每个细胞中能检测到着丝粒的个数和信噪比。我们发现，当使用多价标记(sgRNA2.0(2))可以比单价标记(sgRNA1.1(2)，sgRNA1.2(2))获得更高分信噪比和更多的可检测的着丝粒个数。同时还发现做了A-U翻转和茎环延长的修饰sgRNA(sgRNA1.12，sgRNA1.22，sgRNA2.02)比未优化的修饰sgRNA(sgRNA1.1，sgRNA1.2，sgRNA2.0)可以提供更高分信噪比和更多的可检测的着丝粒个数。我们还通对着丝粒的结合蛋白CENP-A和CREST的免疫荧光与新开发的标记技术共定位验证了基sgRNA的染色质标记方法的特异性。综上，中间插入的sgRNA不会影响sgRNA结构和功能，完全可以用来做基因位点的成像，且我们利用改造sgRNA比传统的直接用dCas9成像能提供更高的信噪比，针对靶位点有非常高的特异性。
快速交换动力学：
通过固定细胞的DAPI染色发现Cas9和DNA的结合非常紧密，因此我们想要探究在靶位点附近Cas9的动态。尽管高的亲和力能保证高的特异性，但是高亲和力会导致标记荧光分子与靶位点的结合非常紧密，不易解离。当靶位点处的分子发生漂白，背景中未漂白的分子不能进行交换补充，因此限制了观察时间。因为做基因组编辑时，考虑更多是Cas9对靶位点的切割的效率和脱靶效应，不关心Cas9的在靶位点的结合动态过程，而成像比较关注靶位置处标记分子的动态。
因此我们使用光漂白后荧光恢复实验(FRAP)分别验证sgRNA-MS2-EGFP和dCas9-mCherry在所标记位点(端粒)附近的动态交换过程。FRAP是使用强激光在极短的时间内将一个选定的区域荧光分子漂白掉，然后追踪选定区域的荧光恢复情况，此时荧光的恢复是由于邻近未漂白区域的荧光分子向漂白区域的扩散。由此可以推算出所标记蛋白的扩散速率及结合亲和力。为了降低漂白区域的相互干扰和保证较大的取样量，我们在多个细胞中分别进行了光漂白实验，每个细胞中只取两个相距较远的端粒。其他的未漂白的端粒区域作为对照以矫正采样过程中激光功率的波动和光漂白影响。实验结果表明，dCas9-mCherry通道的恢复速度要比sgRNA-MS2-EGFP通道慢将近四十倍(t1/2＝12min和t1/2＝19s)。此外，dCas9-mCherry通道的紧密结合部分(Fi＝0.55)要比sgRNA-MS2-EGFP通道(Fi＝0.22)大很多。dCas9-mCherry通道是由于新的游离在细胞质的未漂白的dCas9-mCherry补充上去造成的，是一个单一的动力学过程。而所观察的sgRNA-MS2-EGFP通道的快速恢复动力学主要是由于tdPCP-EGFP从sgRNA茎环上的快速解离造成的(图3C和D)。总之，我们的基于改造sgRNA的基因位点成像系统具有更强的抗漂白能力，提供了更长的持续观察时间，特别对于一些需要连续采样的快速的基因动态过程或者对于较长的时间尺度下的过程都非常有用。
因为我们发现通过改造的sgRNA对基因位点的标记在靶位点处荧光分子具有更快的交换过程，因此我们接下来证明这种快速交换是否能转化为持续长的时间追踪。为了缩短实验时间、更加凸显新方法的抗漂白性能，我们使用最强的激光功率密度，连续无间歇曝光，观察基因位点的漂白过程并追踪该点的荧光强度随时间的变化。结果显示，无论对高度重复的区域(端粒、着丝粒)还是非重复区域(MUC4-E3，约90次重复，基于改造sgRNA的成像方法比基于dCas9的成像方法稳定十几倍(图3B)。
正交性：
为了验证我们所开发的多基因位点多色标记同时成像，我们只用基于改造的sgRNA标记方法实现同一细胞中对端粒和着丝粒的双色同时成像，而dCas9上不带有任何荧光蛋白，没有标记作用，仅实现将结合荧光蛋白的sgRNA带到相应的靶位点。利用sgRNA2.02-MS2-mCherry标记着丝粒，利用sgRNA2.02-PP7-EGFP标记端粒，同时对这两各通道连续观察与追踪。
为了验证加载到改造sgRNA上的两个RNA适配体之间没有相互干扰，我们验证了基于改造成像系统的正交性。利用dCas9-mCherry显示出端粒，当sgRNA2.02-MS2和tdPCP-EGFP共转时，只有dCas9能正确定位于端粒，表示出sgRNA2.02-MS2已发挥功能，而tdPCP-EGFP呈弥散分布，表明tdPCP-EGFP不能结合MS2；对sgRNA2.02-PP7和tdMCP-EGFP共转也可得到相似的结果。这表示我们的基于改造sgRNA的成像系统是对RNA适配子正交的。正交性是实现多色标记的前提，也是该系统扩展到三色甚至三色以上的保证。
新开发的染色质位点标记方法的应用：
高度重复位点的双色标记与长时间追踪：为了验证我们开发的基于改造sgRNA的多色成像系统在多位点标记中的应用，我们只用基于改造的sgRNA标记方法实现同一细胞中对端粒和中心粒的双色同时成像，而dCas9上不带有任何荧光蛋白，没有标记作用，仅实现将结合荧光蛋白的sgRNA带到相应的靶位点。我们使用人源癌细胞系MDA-MB-231细胞中高度重复的着丝粒中的α卫星序列以及端粒为靶位点，研究dCas9蛋白和改造后的sgRNA在靶位点附近的聚集。利用sgRNA2.02-MS2-mCherry标记中心粒，利用sgRNA2.02-PP7-EGFP标记端粒，同时对这两各通道连续观察与追踪。因为α卫星序列以及端粒为高度重复序列，这样只要使用一条sgRNA就能利用原始的重复放大荧光信号实现高信噪比的分辨。我们通过免疫荧光证明了标记的特异性，标记着丝粒的sgRNA只分布在着丝粒上，而标记端粒的sgRNA只在端粒上分布。通过对这两个通道的持续追踪可以得到着丝粒和端粒的运动特征，可以从中抽取很多有用的参数，如运动轨迹的形状，运动速度，扩散系数，运动的偶联性等。
单基因位点标记：除了标记高度重复的DNA序列，我们还尝试单基因位点的标记。开始我们仍然以重复序列为主，因为这样只要一条sgRNA就能实现标记。人细胞基因MUC4是一个重复的基因，其内含子和外显子中均含有很多重复序列。我们选择其第二个外显子作为标记位点，含有约90个拷贝的串联重复序列。针对此序列设计了一个sgRNA，连入改造后的sgRNA中。通过和dCas9-mCherry双色共定位实验发现，我们的改造sgRNA也可以标记重复次数较少的单基因位点。基于改造sgRNA的基因位点标记方法未来的应用在于非重复单个基因位点的多色标记，对于理解很多细胞核的过程具有重要意义。如基因表达调控过程中的启动子与内含子相互作用，基因共定位，DNA修复动力学，转录工厂等问题。
细胞分裂过程中染色体动态行为的观察：因为改造的sgRNA标记方法可以实现长时间观察，因此我们尝试利用双色追踪端粒和着丝粒在细胞分裂过程中的动态。我们利用thymidine两轮的同步化方法，将细胞同步化到G1/s期，然后通过一个10h时间的观察，捕捉到细胞分分裂过程。可以发现，在细胞分裂期的中期(0-46min)，细胞核中的染色体逐渐排列到中间的细胞板附近，几乎呈一种镜像分布。随后姐妹染色单体分开(46-76min)，向细胞核的两极移动。而且在移动的过程中，染色质持续压缩。当细胞进入分裂期的后期和末期，染色质才逐渐开始解压缩。这些结果说明虽然分裂期的染色质高度压缩，但这并不影响dCas9和sgRNA对靶序列的结合。这与用TALE标记的中心粒不同，在细胞分裂期染色质压缩过程中，标记信号会逐渐发生丢失，当细胞结束分裂染色质去压缩后，标记信号逐渐恢复。因此，就能否标记压缩状态的染色质而言，用CRISPR标记方法优于TALE方法。
sgRNA定位：我们的改造sgRNA对基因位点的标记方法是第一次实现了对sgRNA在细胞中定位的直接观测。我们发现有些情况下，sgRNA会进入细胞质中形成较大的斑块。尤其是对单基因位点MUC4的标记，因为此种情况下，靶位点所需要的sgRNA很少，多余的都是不需要的过量sgRNA，更容易进入细胞质中。为了验证这种推测，我们特意过量转染端粒的sgRNA，也得到了相似的结果。通过对细胞中降解废物RNA的细胞器P-bodies的标签蛋白Dcp1A的共染色发现细胞质中的斑块与P-bodies有较好的共定位，这表明些斑块就是P-bodies。据此可以推测，过量表达的sgRNA会从细胞核中转运到细胞质中进行降解。因此改造sgRNA的方法提供了对sgRNA直接标记追踪能力。
染色质构象与基因表达调控是目前表观遗传学领域一个刚刚兴起的方向，目前研究主要通过高通量测序，但受制于细胞的异质性和动态信息的缺失。本课题目标旨在利用最新的基因组编辑技术CRISPR，发展活细胞染色质DNA标记方法，特别是非重复序列单基因位点的荧光标记方法，将为染色质DNA相关动态过程和功能研究提供有力工具，是重大生物问题和新兴先进技术的完美结合。我们在总体研究思路上同时通过标记方法和成像方法的改进和创新实现活细胞多位点多色的荧光标记和成像。
本发明最关键的技术点在于我们在常规的sgRNA的基础上设计优化插入合适的RNA适配子位点，利用CRISPR/Cas9系统的靶向特异性由sgRNA决定而非dCas9决定这一特性，将不同颜色的荧光蛋白通过我们修饰的sgRNA招募到特异的基因靶位点。我们发现对原始的sgRNA做修改而不影响其功能的插入位点，RNA适配子只要插入Tetraloop和Loop2就不会影响其与dCas9形成复合物的结构与功能，而插在尾部会影响其功能。其次，A-U翻转和茎环延长能进一步调高改造sgRNA在基因位点标记方面的性能。最后，双插入比单插入可以提供更高的信噪比。
本发明除了提供多色多位点标记的优点以外，因其快速交换动力学导致的抗漂白能也是非常显著的一大特色。这是所有现存基因位点标记技术所不能提供的特性。对于活细胞内基因位点的运动进行追踪与观察，持续足够长的时间对于捕获重要生物学过程尤为重要。限制连续荧光观察最大的问题长时间强曝光所引起的光漂白效应。因此，现存的活细胞基因位点标记方法都不能克服这个问题，而我们新发明的基于sgRNA的染色质位点标记方法比传统方法的光稳定性提高了10倍，大大增加了对基因位点持续追踪的时间。
此技术最为直接的效果是可以对任意感兴趣的基因位点进行多色长时间的标记成像，这对于活细胞内染色质动态标记与追踪研究具有重要的意义。潜在的应用包括但并不限于利用双色成像系统研究DNA双链断裂修复过程中DNA断点的运动，研究不同基因在细胞中的位置改变与其表达量变化之间的关系，发展可以同时做转录调控和成像的多功能系统，动态操纵基因在细胞核内的位置，探究染色质不同位置的运动规律等方面。
本发明中所涉及的具体步骤为本领域的常用技术，其并不构成限制，也不会影响本发明的方法的实现。