一种制备稻瘟病菌促分裂原活化蛋白激酶MoMps1晶体的方法与流程

本发明涉及蛋白质晶体的制备，具体说来，涉及一种稻瘟病菌促分裂原活化蛋白激酶momps1晶体的制备方法。

背景技术：

蛋白质是生命的物质基础，没有蛋白质就没有生命的存在，而蛋白质的三维结构往往决定了其功能，所以确定蛋白质的三维结构对了解与阐释生命现象与生命活动有着重要的意义。目前，利用x射线技术来确定和解析蛋白质的三维结构是公认的最为可靠的方法，尤其是近年来，利用结构生物学手段来研究蛋白质与蛋白质、蛋白质与转录因子相互作用，进而回答相关蛋白质的互作机制已发挥着非常重要的作用。但是蛋白质晶体的生长，尤其是高分辨率、重复性好的晶体生长方法一直是此领域研究的“瓶颈”，这对利用结构生物学的手段来阐释上述机制具有很大的限制。具体说来，主要表现在，蛋白质不稳定、易降解或沉淀；蛋白质样品不结晶；蛋白质样品能够结晶但是衍射数据差，分辨率低等方面。

水稻是世界的主要粮食作物之一，世界上约有50％的人口以稻米作为主食。由稻瘟病菌(magnaportheoryzae)侵染水稻引起的稻瘟病是世界各水稻产区普遍发生、危害极大的真菌性病害，也是制约水稻安全生产和粮食安全供给的重要威胁之一。据报道，每年由稻瘟病菌引起的水稻产量损失约在10％～30％，对世界粮食安全产生了巨大的影响(kato,2001)。正是由于稻瘟病菌在科学研究和经济上的重要性，稻瘟病菌被列为十大病原真菌之首(deanetal.,2012)，是开展相关科学研究的重要模式真菌。

已有的研究(hameletal.,2012)表明，在稻瘟病菌中主要存在3 条由mapkkk，mapkk和mapk组成的信号通路，其自上而下形成级联反应，通过与下游的转录因子相互作用而调控致病力，影响稻瘟病菌的致病性。momps1是一种对稻瘟病菌的生长发育起重要调控作用的促分裂原活化蛋白激酶。在稻瘟病菌中，momps1参与的功能主要包括调节细胞壁的完整性、应对不良环境条件的反应以及调控致病性等方面，其中，momps1对细胞壁的完整性、孢子的侵入生长是必需的(xuetal.,1998)；moswi6是位于momps1下游的转录因子之一，受momps1的调控与制约，缺失moswi6能够影响稻瘟病菌细胞壁的完整性，胞外酶的活性和以及转录水平显著减少，同时对来自外界的氧化压力的抵抗能力显著降低。基于已有的研究报道(qietal.,2012)，无论是体内还是体外，momps1与moswi6均存在相互作用，且momps1主要是通过与其下游的转录因子如moswi6等的相互作用而调控致病性，但是其与下游的转录因子的互作机制目前尚不清楚，需要进一步研究。因此，亟需针对稻瘟菌促分裂原活化蛋白激酶momps1提供一种蛋白质晶体的生长方法，用以制备momps1蛋白质的晶体，为上述研究提供基础。

已有技术中，公开号为cn102675412a的中国专利申请公开了一种制备蛋白质晶体的方法。该方法包括如下步骤：将晶体生长试剂、所述蛋白质的水溶液和高分子添加剂的水溶液进行混合得到晶体生长试剂；采用悬滴法将所述晶体生长试剂置于培养箱中进行培养即可得到所述的蛋白质晶体；所述的晶体生长试剂由沉淀剂和缓冲液组成。所述蛋白质为溶菌酶或甜味蛋白。利用上述方法进行蛋白质晶体生长，在不同条件下可以得到不同晶型的晶体，成功调控了该蛋白质晶体的晶型。并且结晶条件明显放宽，单晶衍射强度高，结果重复性好，但其仅适用于溶菌酶或甜味蛋白。而本研究小组在前期研究发现，由于在植物病原真菌中的蛋白激酶，包括稻瘟病菌中的momps1蛋白质均存在蛋白质不稳定、易降解或沉淀，蛋白质样品不结晶等方面的 特性，使其不能应用上述方法进行蛋白质晶体的制备。且经实验证明，上述方法无法制备出单晶衍射强度高，结果重复性好的稻瘟病菌促分裂原活化蛋白激酶momps1的蛋白质晶体。

技术实现要素：

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是针对稻瘟病菌促分裂原活化蛋白激酶momps1蛋白质提供一种蛋白质晶体制备的方法。

为了实现本发明目的，本发明实施如下技术方案：

本发明通过结合前期用鸟枪法、九孔格法对蛋白质晶体生长条件进行大量筛选与优化，提供一种制备稻瘟病菌促分裂原活化蛋白激酶momps1蛋白质晶体的方法，包括如下步骤：

1)将稻瘟病菌促分裂原活化蛋白激酶momps1溶于hepes或pbsbuffer中获得终浓度约为8～10mg/ml的momps1蛋白质，将所述的momps1蛋白与晶体生长试剂按10％～80％的体积比混合，得到0.3～0.8μl的液滴；

2)置于4～22℃的恒温箱中培养10～20天，即可得到所述蛋白质晶体；

其中，所述的晶体生长试剂的组分包括：10％～60％v/vtacsimate；0.001～0.5m二甲砷酸钠；0.01～10.0mm精胺；ph为3.0～9.5。溶剂为无菌去离子水。

所述试剂tacsimate、二甲砷酸钠和精胺均为市售可购商品。tacsimate购自hamptonresearch公司，其主要成分为丙二酸钠、醋酸钠、柠檬酸三铵、琥珀酸、dl-苹果酸、甲酸钠和酒石酸二胺。二甲砷酸钠和精胺均购自sigmaaldrich公司。

实验证明，满足上述条件的制备方法均能够得到稻瘟病菌促分裂原活化蛋白激酶momps1的蛋白质晶体。

作为优选，所述的晶体生长试剂其组分包括15％～40％v/v tacsimate；0.03～0.3mm二甲砷酸钠；0.05～5.0mm精胺；ph为4.0～8.5。满足该条件的生长试剂，能够较容易地获得稻瘟病菌促分裂原活化蛋白激酶momps1蛋白质的单晶以及较好衍射数据的晶体。

更为优选，所述的晶体生长试剂的组分包括：26％v/vtacsimate；0.05m二甲砷酸钠；1.0mm精胺；ph为6.5。满足该条件的晶体生长试剂，能够更容易地获得单晶，衍射数据更好，是本发明筛选得到的最佳生长试剂配方。

本发明针对所述稻瘟病菌促分裂原活化蛋白激酶momps1蛋白质与晶体生长试剂的混合比例进一步提供优选方案：所述稻瘟菌促分裂原活化蛋白激酶momps1溶液与生长试剂按30％～40％的体积比混合。

进一步地，所述momps1蛋白质与晶体生长试剂按照上述比例混合成0.5μl的液滴，将对晶体生长的观察和晶体的打捞更为有利。

作为优选，将上述液滴置于16℃的恒温箱中培养，能够使momps1蛋白质的晶体更好地生长。

进一步地，为了减少和防止液滴蒸发，最好将混合得到的液滴及时用清晰度较高的胶带密封，放入恒温箱中，期间应尽量减少震动。

可选的，所述的稻瘟病菌促分裂原活化蛋白激酶momps1蛋白质与晶体生长试剂采用座滴式蒸汽扩散法混合。

综合上述优选条件或参数，本发明提供一个最佳的实施方案如下：

1)将稻瘟病菌促分裂原活化蛋白激酶momps1溶于hepes或pbsbuffer中，获得终浓度约为8～10mg/ml的momps1蛋白质样品，将所述的momps1蛋白质与晶体生长试剂按30％～40％的体积比混合，得到0.5μl的液滴；

2)密封后置于16℃的恒温箱中培养10～20天，即可得到所述蛋白质晶体；

其中，所述生长试剂的组分包括：26％v/vtacsimate；0.05m二甲砷酸钠；1.0mm精胺；ph为6.5。

本发明的有益效果在于：

本发明开展了稻瘟病菌促分裂原活化蛋白激酶momps1蛋白质晶体生长方法的探索，并通过一系列的筛选，获得了晶体质量高、衍射数据好、重复性好的蛋白质晶体生长方法。通过利用x射线衍射收集到的蛋白质晶体数据，成功地解析了稻瘟病菌促分裂原活化蛋白激酶momps1的蛋白质三维空间结构，这对开展稻瘟病菌促分裂原活化蛋白激酶momps1相关的功能研究，尤其是运用结构生物学的手段来开展其与相关蛋白质的晶体学研究，以及与蛋白质有关的研究均具有非常重要的意义。

附图说明

图1为本发明实验例1中通过体视显微镜观察到的实施例1中稻瘟病菌促分裂原活化蛋白激酶momps1蛋白质晶体的图片。

图2为本发明实验例1中对实施例1中的稻瘟病菌促分裂原活化蛋白激酶momps1的晶体进行x-射线衍射得到的衍射数据图片。

图3为本发明实验例2中通过体视显微镜观察的实施例1蛋白激酶momps1蛋白质晶体的图片。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要说明的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。相关技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径可购得。

实施例1

本实施例用于说明本发明所述稻瘟病菌促分裂原活化蛋白激酶momps1蛋白质晶体的最佳制备方法，具体包括如下内容：

1、生长试剂的配制：

1.1试剂

100％tacsimate，98.0％二甲砷酸钠，99.0％精胺，无菌去离子水。

1.2配制生长试剂

配制500mm的二甲砷酸钠水溶液、10mm的精胺水溶液。

量取500μl500mm的二甲砷酸钠水溶液、1.3ml100％tacsimate溶液和50μl10mm的精胺水溶液，补加无菌去离子水定容至5.0ml，将ph调至6.5。所述生长试剂中，tacsimate所占体积分数为26％，二甲砷酸钠的浓度为0.05m，精胺的浓度为1.0mm。

2、蛋白质与生长试剂的混合

将稻瘟病菌促分裂原活化蛋白激酶momps1溶于hepes或pbsbuffer中获得终浓度约为8～10mg/ml的momps1蛋白质。

采用座滴式蒸汽扩散法对稻瘟病菌促分裂原活化蛋白激酶momps1进行机械点样，所述momps1蛋白质与晶体生长试剂按30％～40％的体积比混合成大小为0.5μl的液滴。

3、晶体生长

为了减少和防止液滴蒸发，及时用清晰度较高的胶带密封，尽量减少震动，然后存放在16℃的恒温箱中生长、保存。

实验例1

本实验例对实施例1培养得到的蛋白质晶体进行观察和晶体打捞与数据收集。

1、晶体观察

通过在体视显微镜上观察实施例1培养得到的蛋白质晶体，相关晶体图片见图1。

2、晶体打捞与数据收集

本操作需要在较低温度下进行，4～22℃均可以操作，但以16℃为最优。对生长出来的单晶，采用专用的loop对其进行打捞，然后，在低温条件下将其在防冻液(实施例1所述生长试剂中加入体积比为10％～25％的甘油)中浸泡0.5～1min，然后迅速放到液氮中冻存，在x射线下衍射，即可得到较高分辨率的衍射数据(一般为左右的分辨率)，最后，利用相关的专业软件对所收集到的数据进行处理与分析，即可得到该蛋白质的晶体结构。相关的衍射数据图片见图2。

由此可见，实施例1所述方法能够获得单一的稻瘟病菌促分裂原活化蛋白激酶momps1的蛋白晶体，并收到衍射质量高的数据。

实施例2

本实施例用于说明本发明所述稻瘟病菌促分裂原活化蛋白激酶momps1蛋白质晶体的制备方法，具体包括如下内容：

1、生长试剂的配制

1.1试剂

同实施例1。

1.2配制生长试剂

量取1ml500mm的二甲砷酸钠水溶液，1.95ml100％tacsimate溶液，150μl10mm的精胺水溶液，补加无菌去离子水定容至5.0ml，将ph调至6.0。所述生长试剂中，tacsimate所占体积分数为39.0％，二甲砷酸钠的浓度为0.1m，精胺的浓度为3.0mm。

2、蛋白质与生长试剂的混合

同实施例1

3、晶体生长

同实施例1。

实验例2

本实验例对实施例2培养得到的蛋白质晶体进行观察和晶体打 捞与数据收集。

1、晶体观察

通过在体视显微镜下观察实施例2培养得到的蛋白质晶体，相关晶体图片见图3。

2、晶体打捞与数据收集

本操作需要在较低温度下进行，4～22℃均可以操作，但以16℃为最优。对生长出来的单晶，采用专用的loop对其进行打捞，然后，在低温条件下将其在防冻液(实施例2所述生长试剂中加入体积比为10％～25％的甘油)中浸泡0.5～1min，然后迅速放到液氮中冻存，在x-射线下衍射，即可得到较高分辨率的衍射数据(一般为左右的分辨率)，最后，利用相关的专业软件对所收集到的数据进行处理与分析，即可得到该蛋白质的晶体结构。

由此可见，实施例2所述方法能够获得较高质量的稻瘟病菌促分裂原活化蛋白激酶momps1的蛋白质晶体，并收到衍射质量较高的数据。但相较实施例1得到的蛋白质晶体，实施例2中所得到的蛋白质晶体数量较少。

实施例3

本实施例与实施例1的区别在于：

1、晶体生长试剂的配制不同：

量取2.5ml1.0m的二甲砷酸钠水溶液，0.5ml100％tacsimate溶液，5μl10mm的精胺水溶液，补加无菌去离子水定容至5.0ml，将ph调至6.5。所述生长试剂中，tacsimate所占体积分数为10％，二甲砷酸钠的浓度为0.5m，精胺的浓度为0.1mm。

2、蛋白质与生长试剂的混合比例不同

将稻瘟病菌促分裂原活化蛋白激酶momps1溶于hepes或pbsbuffer中，获得终浓度约为8～10mg/ml的momps1蛋白质。

采用座滴式蒸汽扩散法对稻瘟病菌促分裂原活化蛋白激酶 momps1蛋白质进行机械点样，所述momps1蛋白质与晶体生长试剂按70％～80％的体积比混合成0.8μl左右的液滴。

3、晶体生长温度不同

存放在8℃的恒温箱中生长、保存。

实施例4

本实施例与实施例1的区别在于：

1、蛋白质与晶体生长试剂的混合比例不同

所述稻瘟病菌促分裂原活化蛋白激酶momps1蛋白质与生长试剂按10％～20％的体积比混合成0.3μl左右的液滴。

2、晶体生长温度不同

存放在4℃的恒温箱中生长、保存。

实施例3和实施例4也可得到稻瘟病菌促分裂原活化蛋白激酶momps1的蛋白质晶体，但在晶体大小和衍射质量方面不如实施例1和实施例2。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明的基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。