本发明属于医药
技术领域：
，尤其涉及取代的二氨基嘧啶类化合物及包含该化合物的组合物及其用途。
背景技术：
：表皮生长因子受体即EGFR、ErbB-1、HER1是ErbB受体家族的成员，ErbB受体家族是四种密切相关的受体酪氨酸激酶EGFR(ErbB-1)，HER2/c-neu(ErbB-2)，Her3(ErbB-3)和Her4(ErbB-4)的亚家族。EGFR是胞外蛋白配体表皮生长因子家族(EGF家族)成员的细胞表面受体。影响EGFR表达或活性的突变可能导致癌症。据报道，在大多数实体瘤如肺癌、乳腺癌和脑瘤中EGFR处于无管制状态。据估计30％的上皮癌与EGFR或家族成员的突变、扩增或失调有关联。基于通过抗体药或小分子抑制剂药物，例如吉非替尼和厄洛替尼，对EGFR的抑制的治疗方法已被研发出来。非小细胞肺癌的情况下，吉非替尼和厄洛替尼对10％～40％的病人有益处。然而，治疗一段时间后对吉非替尼或厄洛替尼的获得性耐药性成为主要的临床问题。研究证实，产生耐药性的一个主要原因是由于T790M的新突变，T790M是EGFR的“门卫”。然后，研发人员又研发了能T790M的抑制剂，如BIBW2992，并在临床试验中表现出优势。但是，这些以EGFR抑制剂为靶标的T790M对野生型EGFR也具有相对的抑制活性，这就限制了临床应用。所以，有必要进一步研发出更多仅靶向突变蛋白而非野生型蛋白的EGFR抑制剂的有效类型。另外，吉非替尼、厄洛替尼等EGFR抑制剂(EGFR-TKI)针对EGFR突变晚期NSCLC虽然取得了令人瞩目的疗效，但是随后发现EGFR-TKI在治疗NSCLC时的原发性耐药或继发性耐药，是我们在治疗晚期NSCLC面临新的挑战，继而开展新的探索，寻找对策。技术实现要素：针对以上技术问题，本发明公开了一种取代的二氨基嘧啶类化合物及包含该化合物的组合物及其用途，其具有更好的EGFR激酶抑制活性和/或具有更好药效学/药代动力学性能，可用于治疗、预防以及缓解由对EGFR激酶介导的疾病。对此，本发明的技术方案为：一种取代的二氨基嘧啶类化合物，如式(I)所示的二氨基嘧啶化合物，或其晶型、药学上可接受的盐、水合物或溶剂化合物，其中，R1a、R1b、R1c、R2a、R2b、R3a、R3b、R4a、R4b、R5a、R5b、R6、R7、R8、R9a、R9b、R9c、R10、R11、R12、R13、R14、R15、R16、R17a和R17b各自独立地为氢、氘、卤素或三氟甲基；附加条件为：R1a、R1b、R1c、R2a、R2b、R3a、R3b、R4a、R4b、R5a、R5b、R6、R7、R8、R9a、R9b、R9c、R10、R11、R12、R13、R14、R15、R16、R17a和R17b中至少一个是氘代的或氘。作为本发明的进一步改进，R11为三氟甲基。作为本发明的进一步改进，所述化合物选自下组化合物或其药学上可接受的盐：作为本发明的进一步改进，所述取代的二氨基嘧啶类化合物采用反应路线一或反应路线二制备得到，所述反应路线一为：2,4-二卤代嘧啶类化合物和间-N-Boc苯胺在碱性条件下反应生2-卤代嘧啶化合物，2-卤代嘧啶化合物经Boc保护得到氨基化合物，所述氨基化合物与氘代或未氘代丙烯酸、或氘代或未氘代丙烯酰卤反应得到酰胺合物VI；酚类化合物在碱性条件下与烷基卤反应得到烷氧代化合物，所述烷氧代化合物在碱性条件下，4-F被脂肪胺取代得硝基化合物，所述硝基化合物被还原成苯胺，苯胺与所述2-卤代嘧啶类化合物反应得到式(1)所述的取代的二氨基嘧啶类化合物；所述反应路线二为：烷氧代化合物与N-Boc保护的哌嗪类化合物在碱性条件下反应得到XI，硝基被还原成胺基成化合物XII，并与2-卤代嘧啶类化合物VI反应得到对接化合物XIII，该化合物在酸性条件下脱Boc得到哌嗪类化合物XIV，并与酸酐反应得到式(1)所述的取代的二氨基嘧啶类化合物。作为本发明的进一步改进，所述反应路线一或者反应路线二所用的溶剂为二氯甲烷、二氯乙烷、乙酸乙酯、乙酸甲酯、乙酸异丙酯、正己烷、正庚烷、石油醚、正丁醇、乙醇、异丁醇、叔丁醇、异丙醇、正丙醇、正戊醇、异戊醇、丙酮、乙腈、正己烷、甲苯、四氢呋喃、2-甲基四氢呋喃、1,4-二氧六环、乙二醇单甲醚、乙二醇双甲醚、N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺或二甲基亚砜中的至少一种；所述反应路线一或者反应路线二的碱性条件所用的碱为碳酸钾、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸铯、氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化锂、三乙胺、二异丙基乙基胺、4-N，N-二甲基吡啶或吡啶中的至少一种；所述反应路线二的酸性条件所用的酸为三氟醋酸、醋酸、浓盐酸、稀盐酸、浓硫酸、稀硫酸、浓硝酸、稀硝酸、盐酸二氧六环溶液、盐酸乙醇溶液、对甲苯磺酸或苯磺酸中的至少一种。其中，上述反应温度为-30℃-200℃，更佳地为-10℃-100℃。其中，上述反应时间为0-48h，更佳地0-24h，更佳地为0-6h。作为本发明的进一步改进，氘在氘代位置的氘同位素含量至少是大于天然氘同位素含量0.015％，较佳地大于30％，更佳地大于50％，更佳地大于75％，更佳地大于95％，更佳地大于99％。在另一优选例中，氘在各氘代位置的氘同位素含量至少是大于天然氘同位素含量(0.015％)，较佳地大于30％，更佳地大于50％，更佳地大于75％，更佳地大于95％，更佳地大于99％。具体地说，在本发明中R1a、R1b、R1c、R2a、R2b、R3a、R3b、R4a、R4b、R5a、R5b、R6、R7、R8、R9a、R9b、R9c、R10、R11、R12、R13、R14、R15、R16、R17a和R17b各氘代位置中氘同位素含量至少是5％，较佳地大于10％，更佳地大于15％，更佳地大于20％，更佳地大于25％，更佳地大于30％，更佳地大于35％，更佳地大于40％，更佳地大于45％，更佳地大于50％，更佳地大于55％，更佳地大于60％，更佳地大于65％，更佳地大于70％，更佳地大于75％，更佳地大于80％，更佳地大于85％，更佳地大于90％，更佳地大于95％，更佳地大于99％。在另一选例中，式(I)中化合物的R1a、R1b、R1c、R2a、R2b、R3a、R3b、R4a、R4b、R5a、R5b、R6、R7、R8、R9a、R9b、R9c、R10、R11、R12、R13、R14、R15、R16、R17a和R17b，至少其中一个R含氘，更佳地两个R含氘，更佳地三个R含氘，更佳地四个R含氘，更佳地五个R含氘，更佳地六个R含氘，更佳地七个R含氘，更佳地八个R含氘，更佳地九个R含氘，更佳地十个R含氘，更佳地十一个R含氘，更佳地十二个R含氘，更佳地十三个R含氘，更佳地十四个R含氘，更佳地十五个R含氘，更佳地十六个R含氘，更佳地十七个R含氘，更佳地十八个R含氘，更佳地十九个R含氘，更佳地二十个R含氘，更佳地二十一个R含氘，更佳地二十二个R含氘，更佳地二十三个R含氘，更佳地二十四个R含氘，更佳地二十五个R含氘，更佳地二十六个R含氘。本发明还包括同位素标记的化合物，等同于原始化合物在此公开。可以列为本发明的化合物同位素的例子包括氢，碳，氮，氧，磷，硫，氟和氯同位素，分别如2H，3H，13C，14C，15N，17O，18O，31P，32P，35S，18F以及36Cl。本发明中的化合物，或对映体，非对映体，异构体，或药学上可接受的盐或溶剂化物，其中含有上述化合物的同位素或其他其他同位素原子都在本发明的范围之内。本发明中某些同位素标记化合物，例如3H和14C的放射性同位素也在其中，在药物和底物的组织分布实验中是有用的。氚，即3H和碳-14，即14C，它们的制备和检测比较容易，是同位素中的首选。同位素标记的化合物可以用一般的方法，通过用易得的同位素标记试剂替换为非同位素的试剂，用示例中的方案可以制备。作为本发明的进一步改进，将药学上可接受的载体与如上所述的取代的二氨基嘧啶类化合物，或其晶型、药学上可接受的盐、前药，立体异构体、同位素变体水合物或溶剂合物进行混合，从而形成药物组合物。本发明还公开了一种药物组合物，其含有药学上可接受的载体和如上所述的取代的二氨基嘧啶化合物，或其晶型、药学上可接受的盐、水合物或溶剂合物、立体异构体、前药或同位素变体的药物组合物。作为本发明的进一步改进，所述药物组合物还包含其他治疗药物，所述治疗药物为癌症、细胞增殖性疾病、炎症、感染、免疫性疾病、器官移植、病毒性疾病、心血管疾病或代谢性疾病的药物。本发明的药物组合物包含安全有效量范围内的本发明化合物或其药理上可接受的盐及药理上可以接受的赋形剂或载体。其中“安全有效量”指的是：化合物的量足以明显改善病情，而不至于产生严重的副作用。通常，药物组合物含有1-2000mg本发明化合物/剂，更佳地，含有10-1000mg本发明化合物/剂。较佳地，所述的“一剂”为一个胶囊或药片。本发明还公开了如上所述的取代的二氨基嘧啶化合物，或其晶型、药学上可接受的盐、水合物或溶剂化合物的用途，用于制备治疗、预防以及缓解由对蛋白激酶介导的疾病的药物组合物。由于本发明化合物具有优异的对蛋白激酶(Kinase)的抑制活性，特别是针对EGFR激酶具有很好的抑制活性，因此本发明化合物及其各种晶型，药学上可接受的无机或有机盐，水合物或溶剂合物，以及含有本发明化合物为主要活性成分的药物组合物可用于治疗、预防以及缓解由对蛋白激酶(Kinase)，特别是针对EGFR激酶介导的疾病。根据现有技术，本发明化合物可用于治疗以下疾病：癌症、细胞增殖性疾病、炎症、感染、免疫性疾病、器官移植、病毒性疾病、心血管疾病或代谢性疾病等。本发明的有益效果为：本发明公开的取代的二氨基嘧啶类化合物及包含该化合物的组合物对EGFR激酶具有优异的抑制性，同时具有更好的药代动力学参数特性，能够提高化合物在动物体内的药物浓度，以提高药物疗效和安全性；本发明公开的取代的二氨基嘧啶类化合物及包含该化合物的组合物可用于治疗、预防以及缓解由对蛋白激酶(Kinase)，特别是针对EGFR激酶介导的疾病。具体实施方式下面结合本发明的较优的实施例作进一步的详细说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则份数和百分比为重量份和重量百分比。实施例1按照以下合成路线制备N-(3-(2-(4-乙酰哌嗪-1-基)2-d3-甲氧基苯胺基)-5-三氟甲基嘧啶基-4胺基)苯基丙烯酰胺，即以下合成路线中的化合物11，即合成式(2)的化合物；采用以下步骤：步骤1：制备3-(2-氯-5-三氟甲基)嘧啶-4-氨基苯基叔丁酯(化合物3)；向配有磁力搅拌、N2球、温度计的50mL三口瓶中加入正丁醇(9mL)，冰水浴冷却，保持内温不超过5℃，加入3-N-Boc-苯胺(0.96g，4.6mmol)，缓慢滴加入2，4-二氯-5-三氟甲基嘧啶(1.0g,4.6mmol)，然后N，N-二异丙基乙基胺(0.67g，5.5mmol)缓慢滴入反应液，加毕，混合液冰水浴搅拌1h，常温下搅拌4h，生成的大量白色固体过滤，正丁醇(2mL)洗涤，抽干，50℃真空干燥得该白色固体1.4g，收率78.3％。1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ(ppm):9.53(s，1H)，9.46(s，1H)，8.57(s，1H)，7.58(s，1H)，7.28-7.26(m，2H)，7.04-7.01(m，1H)，1.48(s，9H)，LC-MS(APCI):m/z＝389.1(M+1)+，purity:97％。步骤2：制备3-(2-氯-5-三氟甲基)嘧啶-4-氨基苯基丙烯酰胺(化合物5)；向100mL三口烧瓶中加入二氯甲烷(15mL)，搅拌下加入3-(2-氯-5-三氟甲基)嘧啶-4-氨基苯基叔丁酯(1.0g，2.57mmol)，冰水浴冷却，滴加入三氟醋酸(3mL)，拆去冰浴，N2氛下常温搅拌反应1h。再次加入二氯甲烷(50mL)，冰盐浴冷却下滴加入三乙胺(5.6mL，40.4mmol)中和三氟醋酸，混合物冷却到-10℃，N2氛下缓慢滴加入丙烯酰氯(0.27g，3mmol)，保温搅拌5min。加入H2O(100mL)淬灭反应，分出有机层，依次用水(100mLx2)、0.5MHCl(aq.,15mL)、饱和碳酸氢钠水液(15mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液浓缩，残留物过硅胶柱(100-200目，石油醚：乙酸乙酯＝3:1)得标题化合物0.6g，两步收率68.1％。1HNMR(300MHz,DMSO-d6)δ(ppm):10.25(s,1H),9.59(s,1H),8.59(s,1H),7.80-1.79(m,1H),7.51(d,J＝7.8Hz,1H),7.36(t,J＝7.8Hz,1H),7.14(d,J＝7.8Hz,1H),6.50-6.41(m,1H),6.30-6.23(m,1H),5.77(dd,J＝9.3Hz,2.1Hz,1H).LC-MS(APCI):m/z＝343.1(M+1)+,purity:98％。步骤3：制备4-氟-2-d3-甲氧基硝基苯(化合物7)；向100mL单口瓶中加入丙酮(30mL)，搅拌下依次加入5-氟-2-硝基苯酚(2.0g，12.7mmol)、无水碳酸钾(3.5g，25.4mmol)、氘代碘甲烷(2.4g，16.5mmol)，升温到60℃并保温搅拌2h。冷却到室温，旋转蒸发掉丙酮，残留物加入水(20mL)，乙酸乙酯萃取(30mLx3)，合并有机层，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液浓缩得白色固体2.0g，收率90％。1HNMR(CDCl3,300MHz)δ(ppm):8.00-7.95(m,1H),6.83-6.71(m,2H)，LC-MS(APCI):m/z＝175.2(M+1)+；95％。步骤4：制备1-[4-(3-d3-甲氧基-4-硝基苯基)]乙酰哌嗪(化合物9)；向25mL单口烧瓶中加入N，N-二甲基甲酰胺(4mL)，搅拌下依次加入4-氟-2-d3-甲氧基硝基苯(0.4g，2.3mmol)、无水碳酸钾(0.64g，4.6mmol)、1-乙酰哌嗪(0.38g，3.0mmol)，反应混合物升温到80℃，N2酚下反应过夜。冷却到室温，加入水(20mL)，乙酸乙酯萃取(30mLx2)，有机层水洗(40mLx3)、饱和食盐水洗(20mL)，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液浓缩得黄色固体0.5g，收率77.0％。1HNMR(300MHz,CDCl3)δ(ppm):8.01(d,J＝9.6Hz,1H),6.43(dd,J＝9.6Hz,2.7Hz,1H),6.31(d,J＝2.4Hz,1H),3.83-3.80(m,2H),3.70-3.67(m,2H),3.49-3.41(m,4H),2.17(s,3H)，LC-MS(APCI):m/z＝283.2(M+1)+，purity:97％。步骤5：制备1-[4-(3-d3-甲氧基-4-胺基苯基)]乙酰哌嗪(化合物10)；向25mL单口瓶中加入乙醇(6mL)和水(2mL)，搅拌下依次加入1-[4-(3-d3-甲氧基-4-硝基苯基)]乙酰哌嗪(0.2g，0.71mmol)、还原铁粉(0.24g，4.26mmol)、氯化铵(19mg，0.35mmol)，反应混合物N2氛下升温到85℃，并保温搅拌反应1h。冷却到室温，滤掉固体物质，滤液浓缩，残留物中加入水(5mL)，二氯甲烷萃取(15mLx2)，合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩得棕色固体0.15g，收率84.1％，直接投于下一步。步骤6：制备N-(3-(2-(4-乙酰哌嗪-1-基)2-d3-甲氧基苯胺基)-5-三氟甲基嘧啶基-4胺基)苯基丙烯酰胺(化合物11)；向25mL单口烧瓶中加入1-[4-(3-d3-甲氧基-4-硝基苯基)]乙酰哌嗪(0.15g，0.59mmol)、1,4-二氧六环(4mL)，搅拌下加入3-(2-氯-5-三氟甲基)嘧啶-4-氨基苯基丙烯酰胺(0.2g，0.59mmol)，滴入三滴三氟醋酸，N2氛下60℃搅拌反应3h。冷却到室温，滴入五滴三乙胺中和三氟醋酸，旋干，残留物硅胶柱层析得到类白色固体180mg，收率54％。1HNMR(300MHz,DMSO-d6)δ(ppm):10.22(s,1H),8.65(brs,1H),8.29(s,1H),8.10(s,1H),7.76(brs,1H),7.54(d,J＝8.4Hz,1H),7.50(d,J＝8.4Hz,1H),7.26(t,J＝8.1Hz,1H),7.17-7.14(m,1H),6.60(d,J＝2.7Hz,1H),6.51-6.42(m,1H),6.29-6.21(m,2H),5.78-5.74(m,1H),3.57-3.55(m,4H),3.08-3.00(m,4H),2.05(s,3H).LC-MS(APCI):m/z＝559.2(M+1)+,purity:97.5％。实施例2采用以下合成路线制备N-(3-(2-(4-d3-乙酰基哌嗪-1-基)2-甲氧基苯胺基)-5-三氟甲基嘧啶基-4胺基)苯基丙烯酰胺(化合物15)，即合成式(3)的化合物；采用以下步骤：步骤1：化合物12、13、14的合成参照实施例1的化合物9、10、11合成，其中化合物14的谱图为：1HNMR(300MHz,DMSO-d6)δ(ppm):10.16(s,1H),8.65(brs,1H),8.29(s,1H),8.08(s,1H),7.76(brs,1H),7.55-7.48(m,2H),7.27(t,J＝8.1Hz,1H),7.17-7.14(m,1H),6.60(d,J＝2.7Hz,1H),6.49-6.40(m,1H),6.28-6.21(m,2H),5.78-5.74(m,1H),3.77(s,3H),3.44(t,J＝4.8Hz,4H),3.00(t,J＝4.8Hz,4H),1.43(s,9H).LC-MS(APCI):m/z＝614.2(M+1)+,purity:96.1％。步骤2：制备N-(3-(2-(4-d3-乙酰基哌嗪-1-基)2-甲氧基苯胺基)-5-三氟甲基嘧啶基-4胺基)苯基丙烯酰胺(化合物15)向25mL单口烧瓶中加入叔丁基-4-(4-(4-(3-丙烯酰胺苯基胺基)-5-三氟甲基嘧啶基-2-胺)-3-甲氧苯基)哌嗪-1-碳酸酯(100mg)及二氯甲烷(10mL)，搅拌溶清，缓慢滴加入三氟醋酸(1mL)，氮气氛下搅拌反应1h，监测脱Boc反应完全，冰水浴冷却下缓慢滴加入三乙胺(2mL)中和三氟醋酸，并缓慢滴加入氘代醋酸酐(0.1mL)，冰水浴下搅拌反应10分钟，反应完毕，加入水(10mL)淬灭反应，分出有机层，依次用水(10mL)、1MHCl(5mL)、饱和碳酸氢钠(5mL)洗涤，干燥，过滤，浓缩并过硅胶柱得白色粉末70mg。1HNMR(300MHz,DMSO-d6)δ(ppm):10.22(s,1H),8.65(brs,1H),8.29(s,1H),8.10(s,1H),7.76(brs,1H),7.54(d,J＝8.4Hz,1H),7.50(d,J＝8.4Hz,1H),7.26(t,J＝8.1Hz,1H),7.17-7.14(m,1H),6.60(d,J＝2.7Hz,1H),6.51-6.42(m,1H),6.29-6.21(m,2H),5.78-5.74(m,1H),3.77(s,3H),3.57-3.55(m,4H),3.08-3.00(m,4H).LC-MS(APCI):m/z＝559.2(M+1)+,purity:98.0％。实施例3采用以下合成路线制备N-(3-(2-(4-乙酰基-d8-哌嗪-1-基)2-甲氧基苯胺基)-5-三氟甲基嘧啶基-4胺基)苯基丙烯酰胺(化合物19)，即合成式(4)的化合物；按实施案例1所述方法，不同点在于，本例使用N-乙酰-d8-哌嗪代替N-乙酰哌嗪，从而制得目标化合物19，1HNMR(300MHz,DMSO-D6)δ(ppm):10.52(s,1H),9.79(brs,1H),9.33(brs,1H),8.51(brs,1H),7.85(s,1H),7.62(d,J＝8.1Hz,1H),7.45-7.42(m,1H),7.36(t,J＝8.1Hz,1H),7.13-7.10(m,1H),6.77(s,1H),6.58-6.49(m,1H),6.47-6.22(m,2H),5.78-5.74(m,1H),3.80(s,3H),2.06(s,3H).LC-MS(APCI):m/z＝564.2(M+1)+,purity:97.2％。实施例4采用以下合成路线制备N-(3-(2-(4-乙酰基哌嗪-1-基)2-甲氧基-3，5，6-d3-苯胺基)-5-三氟甲基嘧啶基-4胺基)苯基丙烯酰胺(化合物24)，即合成式(16)的化合物；采用以下步骤：步骤1按实施案例1步骤4、步骤5所述方法，不同点在于，本例使用4-氟-2-甲氧基硝基苯代替4-氟-2-d3-甲氧基硝基苯，从而制得1-[4-(3-甲氧基-4-胺基苯基)]乙酰哌嗪(化合物22)，LC-MS(APCI):m/z＝253.3(M+1)+,purity:96.2％。步骤2将氘代盐酸(122mmL,1.47mmol)溶液加入至1-[4-(3-甲氧基-4-胺基苯基)]乙酰哌嗪(400mg,1.61mmol)的氘水(5mL)溶液中，在140℃下微波反应50分钟。待反应液冷却至室温后，加入2M氢氧化钠溶液调节pH至10。依次加入丙酮，乙酸酐，在室温下搅拌10分钟，移除丙酮，用乙酸乙酯萃取，收集有机相并用饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥后过滤，干燥得目标产物1-[4-(3-甲氧基-4-胺基-2,5,6-d3-苯基)]乙酰哌嗪100mg,收率为54.1％。1HNMR(300MHz,DMSO-d6)δ(ppm):4.26(brs,2H),3.73(s,3H),3.58-3.51(m,4H),2.94-2.84(m,4H),2.03(s,3H).LC-MS(APCI):m/z＝507.3(M+1)+,purity:97.8％。步骤3按实施案例1步骤6所述方法，不同点在于，本例使用1-[4-(3-甲氧基-4-胺基-2,5,6-d3-苯基)]乙酰哌嗪代替1-[4-(3-d3-甲氧基-4-硝基苯基)]乙酰哌嗪，从而值得目标化合物24，1HNMR(300MHz,DMSO-d6)δ(ppm):10.14(s,1H),8.65(brs,1H),8.27(s,1H),8.07(s,1H),7.76(brs,1H),7.53(d,J＝7.8Hz,2H),7.25(t,J＝8.1Hz,1H),7.14(brs,1H),6.48-6.39(m,1H),6.28-6.21(m,1H),5.74(dd,J＝9.9Hz,2.1Hz,1H),3.76(s,3H),3.56-3.50(m,4H),3.05-2.95(m,4H),2.03(s,3H).LC-MS(APCI):m/z＝559.4(M+1)+,purity:97.5％。实施例5采用以下合成路线制备N-(3-(2-(4-乙酰基哌嗪-1-基)2-甲氧基苯胺基)-5-三氟甲基嘧啶基-4胺基)-2,4,6-d3-苯基丙烯酰胺(化合物30)，即合成式(15)的化合物；采用以下步骤：步骤1依次将2,4,6-d3-1,3-苯二胺(111mg,11mmol)、MeOD(5ml)、二氯甲烷(40ml)加入至一个250mL的两颈烧瓶中，在加入三乙胺(1.8g,18mmol)和2,2-二羟甲基丁酸(0.22g,1.8mmol)，在氮气氛围下用冰水冷却反应液，将二碳酸二叔丁酯的二氯甲烷溶液在冰浴下逐滴加入，室温下搅拌4小时。加水淬灭反应，用二氯甲烷萃取，无水硫酸钠干燥，收集有机相，残留物过柱分离得黄色固体产物(化合物28)910mg，收率为48％。1HNMR(300MHz，DMSO-d6)δ(ppm):8.98(s，1H)，6.82(m，1H),4.95(s，2H)，1.44(s,9H).LC-MS(APCI):m/z＝112(M+1)+,purity:93.5％。步骤2按实施案例1所述方法，不同点在于，本例使用2,4,6-d3-3-N-Boc-苯胺代替3-N-Boc-苯胺，从而制得目标产物(化合物30)80mg，收率为37％。1HNMR(300MHz，DMSO-d6)δ(ppm):10.16(s,1H),8.65(br,1H)，8.27(s,1H),8.09(s,1H),7.49(d,J＝2.7Hz,1H),7.25(s,1H),6.59(d,J＝2.7Hz,1H),6.39-6.44(m,1H),6.25(dd,J＝16.8Hz,2.1Hz,2H),5.73-5.77(m,1H)，3.76(s,3H)，3.56(s,4H),3.05(d,J＝18.9Hz,4H),2.04(s,3H).LC-MS(APCI):m/z＝559.2(M+1)+,purity:97.5％。实施例6采用以下合成路线制备N-(3-(2-(4-乙酰基-d8-哌嗪-1-基)2-d3-甲氧基苯胺基)-5-三氟甲基嘧啶基-4胺基)-苯基丙烯酰胺(化合物34)，即合成式(8)的化合物；采用以下步骤：步骤1将N-(3-d3-甲氧基-硝基苯基)-2,2,3,3,5,5,6,6-d8-哌嗪、三乙胺溶于二氯甲烷溶液中，加入乙酸酐，在室温下搅拌10分钟，旋干过柱得黄色产物(化合物32)330mg，收率为94％。1HNMR(300MHz,DMSO-d6)δ(ppm):7.89(d,J＝9.3Hz,1H),6.56(dd,J＝9.3Hz,2.7Hz,1H),6.50(d,J＝2.7Hz,1H),2.03(s,3H).LC-MS(APCI):m/z＝291.5(M+1)+,purity:94.1％。步骤2按实施案例1所述方法，不同点在于，本例使用N-(3-d3-甲氧基-硝基苯基)-2,2,3,3,5,5,6,6-d8-乙酰基哌嗪代替N-乙酰哌嗪，从而制得目标产物(化合物34)150mg，收率为41.9％。1HNMR(300MHz,DMSO-D6)δ(ppm):10.15(s,1H),8.63(br,1H),8.27(s,1H),8.08(s,1H),7.74(brs,1H),7.53-7.46(m,2H),7.25(t,J＝8.1Hz,1H),7.14(br,1H),6.58(d,J＝2.1Hz,1H),6.48-6.39(m,1H),6.27-6.18(m,2H),5.75(dd,J＝9.9Hz,1.5Hz,1H).LC-MS(APCI):m/z＝570.5(M+1)+,purity:97.5％。实施例7采用以下合成路线制备N-(3-(2-(4-乙酰基-d8-哌嗪-1-基)2-d3-甲氧基-3,5-d2-苯胺基)-5-三氟甲基嘧啶基-4胺基)苯基丙烯酰胺(化合物38)，即合成式(23)的化合物；采用以下步骤：步骤1将氘代盐酸溶液加入至N-(3-d3-甲氧基-硝基苯基)-2,2,3,3,5,5,6,6-d8-哌嗪的氘水溶液中，在140℃下微波反应50分钟，冷却至室温后，加入2M氢氧化钠溶液中和至pH为10，用乙酸乙酯萃取，收集有机相，得目标产物(化合物35)380mg，收率为94.3％。1HNMR(300MHz,DMSO-d6)δ(ppm):7.87(s,1H).LC-MS(APCI):m/z＝251.3(M+1)+,purity:94.6％。步骤2按实施案例1所述方法，不同点在于，本例使用N-(3-d3-甲氧基-硝基-2,6-d2-苯基)-2,2,3,3,5,5,6,6-d8-乙酰基哌嗪代替N-(3-d3-甲氧基-硝基苯基)-2,2,3,3,5,5,6,6-d8-乙酰基哌嗪，从未得到目标产物(化合物38)155mg，收率为51.2％。1HNMR(300MHz,DMSO-D6)δ(ppm):10.15(s,1H),8.65(brs,1H),8.27(s,1H),8.08(s,1H),7.74(br,1H),7.53-7.47(m,2H),7.25(t,J＝8.4Hz,1H),7.14(brs,1H),6.48-6.39(m,1H),6.28-6.21(m,1H),5.74(dd,J＝9.9Hz,1.8Hz,1H),2.03(s,3H).LC-MS(APCI):m/z＝570.5(M+1)+,purity:97.5.0％。实施例8采用以下合成路线制备N-(3-(2-(4-d3-乙酰基-d8-哌嗪-1-基)2-d3-甲氧基-3,5-d2-苯胺基)-5-三氟甲基嘧啶基-4胺基)苯基丙烯酰胺(化合物48)，即合成式(24)的化合物；按实施案例7所述方法，不同点在于，本例使用N-(3-d3-甲氧基-硝基-2,6-d2-苯基)-d3-乙酰基-2,2,3,3,5,5,6,6-d8-哌嗪代替N-(3-d3-甲氧基-硝基-2,6-d2-苯基)-2,2,3,3,5,5,6,6-d8-乙酰基哌嗪，从未得到目标产物(化合物40)190mg，收率为54.8％。1HNMR(300MHz,DMSO-D6)δ(ppm):10.14(s,1H),8.64(brs,1H),8.27(s,1H),8.07(s,1H),7.74(brs,1H),7.53-7.48(m,2H),7.25(t,J＝8.1Hz,1H),7.14(brs,1H),6.47-6.39(m,1H),6.28-6.21(m,1H),5.74(dd,J＝9.9Hz,2.1Hz,1H).LC-MS(APCI):m/z＝570.5(M+1)+,purity:97.5％。实施例9采用以下合成路线制备N-(3-(2-(4-乙酰基-d8-哌嗪-1-基)2-甲氧基苯胺基)-5-三氟甲基嘧啶基-4胺基)-2,4,6-d3-苯基丙烯酰胺(化合物41)，即所述式(27)的结构式；按实施案例3所述方法，不同点在于，本例使用化合物29代替化合物5，从而制得目标化合物41,83mg，收率为37％。1HNMR(300MHz，DMSO-d6)δ(ppm):10.15(s，1H),8.64(br,1H)，8.27(s,1H)，8.09(s，1H)，7.48(d,J＝3.0Hz,1H)，7.25(s,1H)，6.58(d,J＝1.2Hz,1H)，6.38-6.44(m,1H),6.25(dd,J＝17.1Hz,2.1Hz,2H),5.73-5.77(m,1H)，3.76(s,3H)，2.03(s,3H).LC-MS(APCI):m/z＝567.1(M+1)+,purity:95.6％。实施例10对实施例1～9得到的化合物进行化合物的生物活性测试。化合物的生物评价是采用将本发明的化合物在多个测试中进行评价以确定它们的生物学活性。例如，可测试本发明化合物抑制多种关注的蛋白激酶的能力。一些测试的化合物对EGFR激酶显示出强效的抑制活性。此外，在人A431皮肤癌细胞及人NCI-H1975和HCC827肺癌细胞细胞系中，筛选一些这些化合物中的抗增殖活性，且证明活性在1-50nM范围。评价所述化合物在关注的肿瘤细胞上的细胞毒性或生长抑制作用。(1)激酶抑制作用化合物配制：受试化合物溶于DMSO配成20mM母液。在DMSO中梯度稀释成100倍终浓度的稀释液。加药时用缓冲液稀释成10倍终浓度的稀释液。EGFR及EGFR[T790M/L858R]激酶检测：配制缓冲液后，将酶与预先稀释配制的不同浓度化合物混合10分钟，每个浓度双复孔。加入对应底物及ATP，室温反应20分钟(其中设置阴阳性对照)。反应完毕加入检测试剂，室温孵育30分钟后上机检测，采集数据。根据Graphpad5.0软件进行数据分析及拟图。EGFR[d746-750]激酶检测：配制缓冲液后，将酶和抗体的混合溶液与预先稀释配制的不同浓度化合物混合10分钟，每个浓度双复孔。加入Kinasetracer199，室温孵育60分钟(其中设置阴阳性对照)。反应完毕后上机检测，采集数据，按照下式进行分析及拟图。IC50＝[(ABS测试-ABS开始)/(ABS对照-ABS开始)]x100实施例1～9合成得到的取代的二氨基嘧啶类化合物的激酶抑制作用归纳于如下表1所示：表1实施例1～9的取代的二氨基嘧啶类化合物的激酶抑制作用分析表如表1所示，实施例1～9的取代的二氨基嘧啶类化合物与不良反应相关的EGFRWT表现出相对低的抑制活性(IC50大于60)，而对EGFRL858R/T790M突变体(其对可商购的EGFR抑制剂具有抗性)表现出优良的抑制活性(IC50小于10)，说明本发明化合物对EGFR具有较强的选择抑制能力。(2)细胞毒性实验细胞系：皮肤癌细胞A431；肺癌细胞HCC827；均用含10％胎牛血清、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素的RPMI1640培养基培养。化合物配制：受试化合物溶于DMSO配成20mM保存液，-20℃保存。用DMSO梯度稀释成200倍终浓度的保存液。加药时用再用细胞培养基稀释成4倍终浓度的工作液。MTS细胞活力检测：胰酶消化对数生长期细胞，按已优化的密度接种150μl于96孔板，24小时后加入培养基稀释的4倍浓度化合物50μl/孔(浓度设置见表2.)。以加入同样体积的0.5％DMSO的孔作为对照。细胞继续培养72小时后，MTS检测细胞活力。具体方法如下：贴壁细胞，弃去培养基，每孔加入含20μlMTS和100μl培养基的混合液。放入培养箱继续培养1-4小时后检测OD490，以OD650值作为参考。GraphPadPrism软件制作量效曲线并计算IC50，实施例1～9合成得到的取代的二氨基嘧啶类化合物的细胞毒性实验结果详见表2所示。表2实施例1～9的取代的二氨基嘧啶类化合物的细胞毒性实验数据实施例编号皮肤癌细胞IC50(nM)肺癌细胞IC50(nM)实施例1>1000<60实施例2>1000<60实施例3>1000<60实施例4>1000<60实施例5>1000<60实施例6>1000<60实施例7>1000<60实施例8>1000<60实施例9>1000<60由表2可见，表明实施例1～9的化合物对癌细胞体外增殖的具有抑制效果；其中对肺癌细胞的体外增殖的抑制作用比皮肤癌细胞的体外增殖抑制作用强。(3)大鼠中的药代动力学评价8只雄性Sprague-Dawley大鼠，7-8周龄，体重约210g，分成2组，每组4只，单次口服给予5mg/kg剂量；(a)对照组：N-(3-(2-(4-乙酰哌嗪-1-基)2-甲氧基苯胺基)-5-三氟甲基嘧啶基-4胺基)苯基丙烯酰胺；(b)试验组：实施例1-9，比较其药代动力学差异。大鼠采用标准饲料饲养，给予水。试验前16小时开始禁食。药物用PEG400和二甲亚砜溶解。眼眶采血，采血的时间点为给药后0.083小时，0.25小时、0.5小时、1小时、2小时、4小时、6小时、8小时、12小时和24小时。大鼠吸入乙醚后短暂麻醉，眼眶采集300μL血样于试管。试管内有30μL1％肝素盐溶液。使用前，试管于60℃烘干过夜。在随后一个时间点血样采集完成之后，大鼠乙醚麻醉后处死。血样采集后，立即温和地颠倒试管至少5次，保证混合充分后放置于冰上。血样在4℃5000rpm离心5分钟，将血浆与红细胞分离。用移液器吸出100μL血浆到干净的塑料离心管中，表明化合物的名称和时间点。血浆在进行分析前保存在-80℃。用LC-MS/MS测定血浆中本发明化合物的浓度。药代动力学参数基于每只动物在不同时间点的血药浓度进计算。实验结果表明，相对于对照化合物，实施例1-9的化合物在动物体内具有更好的药物动力学，因而具有更好的药效学和治疗效果。(4)代谢稳定性评价微粒体实验：人肝微粒体：0.5mg/mL，Xenotech；大鼠肝微粒体：0.5mg/mL，Xenotech；辅酶(NADPH/NADH)：1mM，SigmaLifeScience；氯化镁：5mM，100mM磷酸盐缓冲剂(pH为7.4)。储备液的配制：精密称取一定量的化合物实施例的粉末，并用DMSO分别溶解至5mM。磷酸盐缓冲液(100mM，pH7.4)的配制：取预先配好的0.5M磷酸二氢钾150mL和700mL的0.5M磷酸氢二钾溶液混合，再用0.5M磷酸氢二钾溶液调节混合液pH值至7.4，使用前用超纯水稀释5倍，加入氯化镁，得到磷酸盐缓冲液(100mM)，其中含100mM磷酸钾，3.3mM氯化镁，pH为7.4。配制NADPH再生系统溶液(含有6.5mMNADP，16.5mMG-6-P，3U/mLG-6-PD，3.3mM氯化镁)，使用前置于湿冰上。配制终止液：含有50ng/mL盐酸普萘洛尔和200ng/mL甲苯磺丁脲(内标)的乙腈溶液。取25057.5μL磷酸盐缓冲液(pH7.4)至50mL离心管中，分别加入812.5μL人肝微粒体，混匀，得到蛋白浓度为0.625mg/mL的肝微粒体稀释液。取25057.5μL磷酸盐缓冲液(pH7.4)至50mL离心管中，分别加入812.5μLSD大鼠肝微粒体，混匀，得到蛋白浓度为0.625mg/mL的肝微粒体稀释液。样品的孵育：用含70％乙腈的水溶液将相应化合物的储备液分别稀释至0.25mM，作为工作液，备用。分别取398μL的人肝微粒体或者大鼠肝微粒体稀释液加入96孔孵育板中(N＝2)，分别加入2μL0.25mM的的工作液中，混匀。代谢稳定性的测定：在96孔深孔板的每孔中加入300μL预冷的终止液，并置于冰上，作为终止板。将96孔孵育板和NADPH再生系统置于37℃水浴箱中，100转/分钟震荡，预孵5min。从孵育板每孔取出80μL孵育液加入终止板，混匀，补充20μLNADPH再生系统溶液，作为0min样品。再向孵育板每孔加入80μL的NADPH再生系统溶液，启动反应，开始计时。相应化合物的反应浓度为1μM，蛋白浓度为0.5mg/mL。分别于反应10、30、90min时，各取100μL反应液，加入终止板中，涡旋3min终止反应。将终止板于5000×g，4℃条件下离心10min。取100μL上清液至预先加入100μL蒸馏水的96孔板中，混匀，采用LC-MS/MS进行样品分析。数据分析：通过LC-MS/MS系统检测相应化合物及内标的峰面积，计算化合物与内标峰面积比值。通过化合物剩余量的百分率的自然对数与时间作图测得斜率，并根据以下公式计算t1/2和CLint，其中V/M即等于1/蛋白浓度。CLint=0.693t1/2·VM]]>对实施例1-9的化合物按照上述步骤进行分析，结果如表3所示。表3实施例1～9的取代的二氨基嘧啶类化合物的代谢稳定性的实验结果如表3所示，通过与未经氘代的化合物CO-1686对照，实施例1～9的氘代的二氨基嘧啶类化合物可以改善代谢稳定性。以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。当前第1页1 2 3