一个受温度调控水稻叶色基因及其检测方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及农业和植物生物技术等领域，尤其是在分子水平进行水稻遗传育种以及生理、基因功能等基础研究。
技术背景
[0002]叶片是植物进行光合作用的主要器官，类型丰富且易于鉴别，所以叶色是辨别植物突变最直观的标准之一。在实际应用中，叶色不仅可用于观赏植物新特品种的选育，还可以作为很多农作物如水稻、小麦、玉米等的最理想的形态学标记，还可用于植物的遗传、生理及其相关基因的克隆和功能研究。目前，研究工作者们利用物理、化学、生物等技术已创制大量水稻叶色突变体，根据它们是否受温度调控，又分为高温表达型、低温表达型和温度钝感型等的叶色突变体。本研究利用6t3Co γ射线诱变处理创制的受低温度调控水稻叶色的突变株，并通过图位克隆技术定位到一个受温度调控水稻叶色新基因。
【发明内容】
[0003]本发明的目的在于提供一个受温度调控水稻叶色的基因、该基因编码的蛋白质及这种基因的检测方法和应用。
[0004]受温度调控叶色变化的水稻来源于经6t3Coγ射线处理的粳稻嘉花I号的诱变产生的群体后代，经多次自交繁殖和选择，该水稻性状和各种农艺性状均已稳定。以该水稻材料与籼稻9311杂交的F2代分离群体作为定位群体，利用DNA分子标记将受温度调控水稻叶色的基因定位在水稻第I号染色体上。
[0005]携带该受温度调控叶色的基因水稻植株在27.5°C以下生长的条件下表现出苗色黄化。该基因，具有SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列。所述的基因编码的蛋白质，具有SEQ IDN0.2所示的氨基酸序列。
[0006]—对用于检测上述基因的特异性dCAPs引物，序列为:
上游:5 ’ -CTTGGCTACTTGCTGATAGGTAACTTACCCCCTG-3 ’
下游:5 ’ -CAGGCCTCCATAGAAGGAGGCCAAA-3，
即SEQ ID N0.3 和SEQ ID N0.4
检测该受温度调控水稻叶色基因的方法为，采用上述特异性(SEQ ID N0.3和SEQ IDN0.4)对水稻提取DNA进行扩增，得到208bp核苷酸序列。SEQ ID N0.5和SEQ ID N0.6的序列分为野生型水稻(嘉花I号)和携带受温度调控叶色基因水稻的所示。由携带受温度调控叶色基因的水稻DNA扩增得到的208bp片段不含Ec0RII酶的内切位点，不被Ec0RII切断，而由野生型水稻扩增所得到的208bp片段能切成30bp和178bp的两个特异性片段。
[0007]在本发明中，发明人设计了在受温度调控叶色该基因片段与野生型嘉花I号相差一个碱基的特异性dCAPs引物，引入的错配碱基可以引入的限制性酶切位点，从而可以在此208bp核苷酸序列中Ec0RII酶切野生型(嘉花I号)水稻，但不切断携带受温度调控叶色基因的水稻，根据酶切带型能快速检测到含有此基因的水稻品种，其检测精确度高，操作方便， 成本低廉。
【附图说明】
[0008]图1为本发明野生型水稻(左)与具有受温度调控叶色的基因水稻(右)在27.5°C苗期表型；
图2为本发明对PCR的dCAPs引物扩增产物进行EcoRII酶切检查结果。
【具体实施方式】
[0009]实施例1水稻DNA提取
1.取新鲜的苗期水稻叶片，将叶片剪成0.5cm长的小段，放入预冷的研钵中，加入液氮将其研磨至粉末状，转入2ml离心管中加入lml60°C预热的2乂0^8(破坏细胞膜)，轻轻震荡后60 0C水浴45min，期间多次震荡。
[0010]2.取出离心管，冷却至室温，12000r/min 20°C条件下离心5min，吸取600μ1上清液，并加入等体积的氯仿-异戊醇(24:1)混合液，充分混匀。
[0011]3.将含有溶液的离心管进行平衡，12000r/min 20°C离心5min，吸取600μ1上清液，加入其2/3体积(400μ1)异丙醇，轻轻混匀使核酸析出。
[0012]4.12000r/min 20°C离心3min,使核酸沉淀，弃上清。
[0013]5.加入70%乙醇洗涤，12000r/min20°C离心5min，弃上清。
[0014]6.重复步骤5。
[0015]7.室温干燥后溶于10μ1的无菌水中。
[0016]8.取2μ1用于后续的PCR扩增反应。
[0017]实施例2
(一)获得受温度调控水稻叶色的基因及其氨基酸序列
1.25μ1 PCR反应体系如下:10MmTris-HCl pH9.0; 10mM KCl; 20mM MgSO4;80mM(NH4)SO4; 2.5Mm Dntp; ΙΟμΜ引物，5U/yl Taq酶，Ιμ?模板DNA。
[0018]引物序列为:
上游:5 ’ -CACCGCCTGCCCACCGACGACGATG-3 ’
下游:5 ’ -GAAGATGCCATTTCAGTCAC-3 ’
PCR扩增反应反应条件:
PCR扩增产物长度为3446bp,用B1xm软件与http: //rice.plantb1logy.msu.edu/网页下载得到的基因序列与测序结果比对，舍去其它片段结果如SEQ ID N0.1。
[0019]参照KOME网站上获得的ORF序列，设计特异性RT-PCI^I物，上游端和下游端分别为:
5，-ATGGAGCTTCGACATAAAACGGGGA-3，
5’- AGTTCAATTCTCCAACATCACTTCC-3’
对所提取的正常植株总cDNA进行扩增，其目的片段长度为1146bp，并进行测序。将测序得到的DNA序列即0RF，利用B1xm软件翻译成381个氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0020](二)检测受温度调控水稻叶色的基因1.25μ1 PCR 反应体系如下:10MmTris-HCl pH9.0; 10mM KCl; 20mM MgSO4 ;80mM(NH4)SO4; 2.5Mm Dntp; ΙΟμΜ引物，5U/yl Taq酶，Ιμ?模板DNA。
[0021]特异性PCR引物序列如下:
上游:5 ’ -CTTGGCTACTTGCTGATAGGTAACTTACCCCCTG-3 ’
下游:5 ’ -CAGGCCTCCATAGAAGGAGGCCAAA-3，
2.PCR扩增反应。反应条件:
得到的扩增产物，经溴酚蓝染色，上样于经溴化乙锭染色的2%的琼脂糖凝胶上并电泳，在UVP凝胶成像仪上成像，结果如图2所示，出现208bp条带，序列如SEQ ID N0.3所示，是SEQID N0.1中的一段。
[0022]3.酶切反应体系
34μ1 无菌水，5μ1 10XEcoRIIBuffer，1μ1 lOU/μΙ EcoRII^PlOyl PCR扩增产物。
[0023]4.酶切处理
将酶切反应体系混匀后，放入37 V恒温水浴中，温水浴2小时，每管加入Iy I 1XLoading buffer终止酶切反应，将扩增产物，经溴酸蓝染色，上样于经溴化乙锭染色的5%琼脂糖凝胶上并电泳，在UVP凝胶成像仪上成像。结果如图2所示。其酶切带型为出现两个特异性片段，长度为30bp和178bp，由于30bp带较小，已经跑出凝胶。
[0024]实施例4功能基因验证
受温度调控叶色的水稻来源于经6t3Co γ射线处理的粳稻嘉花I号的诱变产生的群体后代，经多次自交繁殖和选择，该突变性状和各种农艺性状均已稳定。该突变株低于27.5°C突变体叶片呈黄色，当温度高于27.5°C时，突变体表现为正常绿色，具有明显的温度调控。
[0025]经过6t3Coy射线处理后，测序结果表明该基因发生了碱基的替换如SEQID N0.1的碱基序列所示(第2157个碱基)。
[0026]将含有水稻自身启动子SEQID N0.7的核苷酸序列农杆菌表达载体PCambial301S上，并经过酶切、测序验证为该目的基因序列。
[0027]利用农杆菌介导技术，将上述重组载体转化受体，受体是含有温度调控叶色基因水稻的愈伤组织，通过鉴定获得阳性第一代转基因株，其叶色在27.5°C以下呈绿色。
[0028]将第一代转基因植株的种子在低温下播种，其苗期叶色出现分离，具有绿色和黄化的表现，并符合孟德尔遗传分离定律即3:1。
[0029]携带温度调控叶色基因水稻在高于27.5°C叶色表现为绿色，而低于27.5°C时，植株苗期叶色呈黄化表型，因此可通过此表型变化来鉴别水稻品种真伪，提高杂交水稻种子纯度。
【主权项】
1.一个受温度调控水稻叶色基因，其特征在于其核苷酸序列如SEQID N0.1所示。2.根据权利要求1所述的一个受温度调控水稻叶色基因，其特征在于所述的基因序列所编码的蛋白质为SEQ ID N0.2所示的381个氨基酸序列。3.—种用于检测权利要求1所述的受温度调控水稻叶色基因的特异性dCAPs PCR引物，其特征在于，其核苷酸序列为: 上游:5’-CTTGGCTACTTGCTGATAGGTAACTTACCCCCTG-3'(SEQ ID N0.3) 下游:5 ’ -CAGGCCTCCATAGAAGGAGGCCAAA-3 '(SEQ ID N0.4)。4.一种用于检测权利要求1所述的受温度调控水稻叶色基因的方法，其特征在于，用权利要求所述的特异性dCAPs PCR引物对野生型水稻和携带受温度调控叶色基因水稻苗期所提取的DNA进行PCR扩增反应，得到208bp核苷酸序列。5.根据权利要求4所述的受温度调控水稻叶色基因的检测方法，其特征在于所述的野生型水稻208bp核苷序列如SEQ ID N0.5所示，所述的携带受温度调控叶色基因水稻208bp核苷序列如SEQ ID N0.6所示。6.根据权利要求4或5所述的受温度调控水稻叶色基因的检测方法，鉴别是否含有温度调控基因的步骤为，将野生型水稻如嘉花I号的DNA扩增所得到的208bp片段用Ec0RII酶切出现30bp和178bp的特异性片段，而由携带受温度调控叶色基因水稻植株DNA扩增得到的208bp片段用EcoRH酶切后仍是208bp，说明含有温度调控水稻叶色基因。
【专利摘要】本发明涉及一个受温度调控水稻叶色的基因及其检测方法和应用。本发明公开了一个受温度调控水稻叶色的基因，具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，该基因编码的蛋白质具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。利用设计一对SEQ ID No.3和SEQ ID No.4特异性PCR引物，对水稻中所提取的DNA进行PCR扩增后，经EcoRII酶切后再经过琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，即可快速有效的检测到含有该基因的水稻植株，具有检测精确度高，操作方便，成本低廉等特点。携带该基因的水稻植株在低温下表现黄化苗。本发明得到的受温度调控水稻叶色基因可应用到杂交水稻制种，可提高杂交水稻不育系本身及其它配制杂交水稻的纯度。
【IPC分类】C12Q1/68, C07K14/415, C12N15/11, C12N15/29
【公开号】CN105713910
【申请号】CN201610110381
【发明人】赵怀玉, 江泉, 陈佳颖, 林琛, 林冬芝, 董彦君
【申请人】上海师范大学