2-亚胺-5-酮基-2,5-二氢-1-H-二吡啶并嘧啶类化合物的制作方法

本发明公开了具有如下通式(i)所示的2-亚胺-5-酮基-2,5-二氢-1-h-二吡啶并[3,4-c:1’,2’-f]嘧啶类化合物及其药学上可以接受的盐或药学上可以接受的溶剂合物，其作为以spop为靶点的抑制剂，可以治疗以spop为靶点的疾病，比如肾癌等。

背景技术：

肾细胞癌(renalcellcarcinoma，rcc)，简称肾癌，是泌尿系统常见的恶性肿瘤，约占成人恶性肿瘤的2-3％。根据病理类型不同，肾癌主要分为透明细胞癌，乳头状癌，嫌色细胞癌和集合管癌等，其中肾透明细胞癌(clearcellrenalcellcarcinoma,ccrcc)是肾癌最常见的病理类型，约占肾癌总发病数的80％。肾癌中高达30％的是转移瘤，而剩余的约有一半会逐渐发展成转移瘤，全世界每年肾癌的死亡病例超过10万例。

spop(speckle-typepozprotein)属于math/btb蛋白家族，作为e3泛素连接酶cul-3的接头分子，在调节底物蛋白质的泛素化和降解中发挥重要作用，比如daxx,pdx1,pipkiib,src-3等。目前研究发现多种肿瘤细胞中存在spop蛋白表达异常，表明spop在维持正常细胞的生长和发育起着重要作用。2009年刘江等揭示了spop在透明细胞癌细胞株中过量表达，引起人们以spop为治疗靶点，应用于靶向治疗透明细胞癌的兴趣。

缺氧诱导因子hif是具有转录活性的核蛋白，具有相当广泛的靶基因谱，对多种癌细胞加速生长起到重要作用。刘江等发现过度活化的缺氧诱导因子hif可以转录调控spop表达，并且使核蛋白spop在肾癌组织中过量表达并错误定位在细胞质里。与核定位spop的促凋亡功能不同，胞质型spop能加速细胞增殖。胞质型spop能与肿瘤抑制因子pten，erk磷酸酶，daxx和gli2相结合，并通过泛素化通路使其降解，从而导致肾癌产生。敲除spop后能特异性杀死肾透明细胞癌，但对正常细胞影响较小。

spop作为潜在分子探针或药物靶标提供线索，同时也为肾癌诊断和治疗提供新的理论依据。综上所述，本领域尚需要开发具有spop抑制活性的化合物。

技术实现要素：

为了解决上述技术问题，本发明的一个目的是提供一种2-亚胺-5-酮基-2,5-二氢-1-h-二吡啶并[3,4-c:1’,2’-f]嘧啶类化合物及其药学上可以接受的盐或药学上可以接受的溶剂合物。

本发明的另一个目的是提供根据本发明的2-亚胺-5-酮基-2,5-二氢-1-h-二吡啶并[3,4-c:1’,2’-f]嘧啶类化合物及其药学上可以接受的盐或药学上可以接受的溶剂合物在制备spop抑制剂中的应用。

本发明的再一个目的是提供根据本发明的2-亚胺-5-酮基-2,5-二氢-1-h-二吡啶并[3,4-c:1’,2’-f]嘧啶类化合物及其药学上可以接受的盐或药学上可以接受的溶剂合物在制备用于治疗与spop相关的疾病的药物中的应用，尤其是在制备用于治疗肾癌的药物中的应用。

本发明的又一目的是提供包含治疗有效量的选自根据本发明的2-亚胺-5-酮基-2,5-二氢-1-h-二吡啶并[3,4-c:1’,2’-f]嘧啶类化合物、其药学上可以接受的盐或药学上可以接受的溶剂合物或者其混合物中的一种或多种作为活性成分的药物组合物。

本发明的又一目的是提供一种治疗与spop相关的疾病(肾癌等)的方法，所述方法包括向患者给药治疗有效量的选自根据本发明的2-亚胺-5-酮基-2,5-二氢-1-h-二吡啶并[3,4-c:1’,2’-f]嘧啶类化合物、其药学上可以接受的盐或药学上可以接受的溶剂合物或者其混合物中的一种或多种作为活性成分。

本发明的第一方面，提供了一种如下通式(i)所示的2-亚胺-5-酮基-2,5-二氢-1-h-二吡啶并[3,4-c:1',2'-f]嘧啶类化合物，或其药学上可以接受的盐或溶剂合物：

其中，

x和y各自独立地为无，或具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个碳原子的取代或未取代的亚烷基或亚烷基-o-；其中，所述的亚烷基为直链或支链的亚烷基；

r1为位于环上的一个或多个h或c1-c4烷基；

r2、r3各自独立地选自下组：氢，卤素，羟基，硝基，氨基，氰基，羰基，取代或未取代c2-c12烯基，取代或未取代c2-c12炔基，羧基，取代或未取代c1-c12烷氧基，取代或未取代c1-c12烷胺基，取代或未取代c3-c9环烷基，取代或未取代的c2-c9非杂芳基、取代或未取代的3～12元杂环，取代或未取代的c6-c12芳基，取代或未取代的c4-c12杂芳基；

m选自下组：nh、o或s；

其中，所述的取代指基团上的一个或多个氢原子被选自下组的取代基所取代：卤素，羟基，硝基，氨基，氰基，羰基，羧基，c1-c6烷基，c1-c6烷氧基，c1-c6烷胺基，羟基c1-c6烷基，氨基c1-c6烷基，羰基c1-c6烷基，c3-c9环烷基，c6-c12芳基，3～12元杂环、c4-c12杂芳基。

在另一优选例中，x和y各自独立地为无，或具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个碳原子的未取代的直链亚烷基；

r2、r3各自独立地选自下组：氢，氟，氯，溴，碘，羟基，硝基，氰基，羰基，羧基，氨基，或取代或未取代的选自下组的基团：甲氧基、乙氧基、丙氧基、异氧丙基、正丁氧基、叔丁氧基、n-(n,n-二甲基)取代基、n-(n,n-二乙基)取代基、n-(n,n-二丙基)取代基、n-(n,n-二丁基)取代基、n-(n-甲基-n-乙基)取代基、n-(n-甲基-n-丙基)取代基、n-(n-甲基-n-丁基)取代基、n-(n-乙基基-n-丙基)取代基、n-(n-乙基-n-丁基)取代基、n-(n-丙基-n-丁基)取代基、环丙基、环丁基、环戊基、环己基、四氢呋喃基、四氢噻吩基、四氢吡咯基、四氢吡喃基、哌啶基、吗啉基、哌嗪基、苯基、萘基、吡啶基、呋喃基、吡咯基、噻吩基、吲哚基、喹啉基、咪唑基，或苯并咪唑基。

在另一优选例中，x和y各自独立地为无，或具有1、2、3或4个碳原子的取代或未取代的亚烷基或亚烷基-o-；

r1选自氢，甲基，乙基，丙基，异丙基，环丙基，正丁基或者叔丁基；

r2选自下组：氢，氟，氯，溴，碘，羟基，乙炔基、硝基，氰基，羧基，甲氧基、乙氧基、丙氧基、环己基氧基，n-(n,n-二甲基)取代基，n-(n,n-二乙基)取代基，n-(n,n-二丙基)取代基，n-(n,n-二丁基)取代基，n-(n-甲基-n-乙基)取代基，n-(n-甲基-n-丙基)取代基，n-(n-甲基-n-丁基)取代基，n-(n-乙基-n-丙基)取代基，n-(n-乙基-n-丁基)取代基，n-(n-丙基-n-丁基)取代基，环丙基，环丁基，环戊基，环己基，环庚基，2,3或4-甲基环己基，2,3或4-乙基环己基，2,3或4-羟基环己基，2,3或4-羧基环己基，2,3或4-氰基环己基，2,3或4-氨基环己基，2或3-四氢呋喃基，2或3-四氢噻吩基，n,2或3-四氢吡咯基，2,3或4-四氢吡喃基，n,2,3或4-哌啶基，n,2或3-吗啉基，n或2-哌嗪基，n,2或3-(n-甲基哌嗪基)，n,2或3-(n-苄基哌嗪基)苯基，2,3或4-甲基苯基、2,3或4-甲氧基苯基，2,3或4-氨基苯基，2,3或4-氰基苯基，2,3或4-羧基苯基，2,3或4-硝基苯基，2,3或4-羟基苯基，萘基，2或3-呋喃基，2或3-噻吩基，n,2或3-吡咯基，2,3或4-吡啶基、n,2或3-(n-吗啉基)苯基、吲哚基。

在另一优选例中，所述的x、y、r1、r2、r3和m各自独立地为实施例中具体化合物所对应的基团。

在另一优选例中，所述的r1选自氢或甲基。

在另一优选例中，所述的r1为甲基。

在另一优选例中，所述的r1为位于环上的一个甲基。

在另一优选例中，r2-x-为选自下组的基团：甲基、乙基、丙基、环己基、或n,2或3-(n-吗啉基)苯基；

或x为具有1、2、3个碳原子的亚烷基，且r2为选自下组的基团：n-(n,n-二乙基)取代基，n,2或3-吗啉基，苯基，2,3或4-甲基苯基、2,3或4-氟苯基、2,3或4-甲氧基苯基，2,3或4-羟基苯基，2或3-呋喃基，2或3-噻吩基，吲哚基。

本发明的第二方面，提供了一种如本发明第一方面所述的式(i)化合物，或其药学上可以接受的盐或溶剂合物的用途，用于制备spop靶点抑制剂，或用于制备治疗和/或预防以spop为靶点的疾病。

在另一优选例中，所述的式(i)化合物被用于抑制spop活性。

在另一优选例中，所述的抑制为竞争性抑制。

本发明的第三方面，提供了一种如本发明第一方面所述的式(i)化合物，或其药学上可以接受的盐或溶剂合物的用途，用于抑制肾癌细胞的增殖活性。

在另一优选例中，所述的疾病选自下组：肾癌、子宫内膜癌、生殖细胞肿瘤。

本发明的第四方面，提供了一种药物组合物，所述的药物组合物包括治疗有效量的如本发明第一方面所述的化合物，和/或其药学上可以接受的盐或药学上可以接受的溶剂合物作为活性成分，和药学上可接受的载体。

本发明的第五方面，提供了一种如本发明第一方面所述的式(i)化合物的制备方法，所述方法包括步骤：

在惰性溶剂中，用式ia化合物和式ib化合物反应，得到式i化合物。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

附图1显示细胞增殖实验验证2-亚胺-5-酮基-2,5-二氢-1-h-二吡啶并[3,4-c:1’,2’-f]嘧啶类化合物对肾癌细胞a498的抑制活性；

附图2显示细胞增殖实验验证2-亚胺-5-酮基-2,5-二氢-1-h-二吡啶并[3,4-c:1’,2’-f]嘧啶类化合物对6株肾癌细胞系和1株正常肾小管上皮细胞系的抑制活性；

附图3显示蛋白质免疫印迹实验(westernblot)验证2-亚胺-5-酮基-2,5-二氢-1-h-二吡啶并[3,4-c:1’,2’-f]嘧啶类化合物对spop下游信号通路的抑制活性；

附图4显示免疫共沉淀实验(co-ip)验证2-亚胺-5-酮基-2,5-二氢-1-h-二吡啶并[3,4-c:1’,2’-f]嘧啶类化合物细胞内竞争性抑制spop与底物相互作用；

附图5显示体内泛素化实验(invivoubiquitinationassay)验证2-亚胺-5-酮基-2,5-二氢-1-h-二吡啶并[3,4-c:1’,2’-f]嘧啶类化合物细胞内抑制spop对底物的泛素化作用；

附图6显示表面等离子共振实验(spr)验证2-亚胺-5-酮基-2,5-二氢-1-h-二吡啶并[3,4-c:1’,2’-f]嘧啶类化合物与spop蛋白相互作用；

附图7显示荧光偏振实验(fp)验证2-亚胺-5-酮基-2,5-二氢-1-h-二吡啶并[3,4-c:1’,2’-f]嘧啶类化合物与spop蛋白相互作用；

附图8显示正常裸鼠体重和器官重量及器官切片染色实验验证2-亚胺-5-酮基-2,5-二氢-1-h-二吡啶并[3,4-c:1’,2’-f]嘧啶类化合物对正常裸鼠的体重及器官影响较小。

附图9显示化合物血浆内代谢实验验证2-亚胺-5-酮基-2,5-二氢-1-h-二吡啶并[3,4-c:1’,2’-f]嘧啶类化合物具有良好的代谢稳定性。

附图10显示体内裸鼠成瘤实验验证2-亚胺-5-酮基-2,5-二氢-1-h-二吡啶并[3,4-c:1’,2’-f]嘧啶类化合物对裸鼠皮下肿瘤生长的抑制作用。

具体实施方式

本发明人经过长期而深入的研究，制备了一类具有式i所示结构的化合物，并发现其具有spop抑制活性。且所述的化合物在极低浓度(ic50值可低至≤50nmol/l)下，即对spop活性产生抑制作用，抑制活性相当优异，因而可以用于治疗与spop活性或表达量相关的疾病，如肾癌等。基于上述发现，发明人完成了本发明。

术语

如本文所用，术语“c1-6烷基”指具有1～6个碳原子的直链或支链烷基，例如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基，或类似基团。形如“c1-c6”的表述意在包括具有1个、2个、3个、4个、5个、或6个碳原子的相应基团，例如，“c1-6烷基”指具有1个、2个、3个、4个、5个或6个碳原子的烷基，“c2-9非杂芳基”指具有2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个碳原子的非杂芳基。

如本文所用，术语“c1-c6烷氧基”指形如“具有1～6个碳原子的直链或支链烷基-氧基”结构的取代基，如乙氧基、丙氧基、丁氧基，或类似基团。

如本文所用，术语“c1-c6烷胺基”指形如“具有1～6个碳原子的直链或支链烷基-胺基”结构的取代基，如乙胺基、丙胺基、二甲胺基，或类似基团。

术语“亚烷基”指如上文所述的烷基失去一个氢原子之后形成的基团，例如-ch2-、-ch2-ch2-，或类似基团。

术语“c2-c12烯基”指具有2-12个碳原子的烯烃失去一个氢原子形成的基团，包括乙烯基、丙烯基、正丁烯基，或类似基团。

术语“c3-c9环烷基”指具有3-9个碳原子的环烷基，如环丙烷、环己烷等。

术语“c6-c12芳基”指具有6-12个碳原子，且骨架上不有杂原子的芳香取代基，如苯基，或类似基团。

术语“c4-c12杂芳基”指具有4-12个碳原子，且具有一个或多个选自o、s、n或p的杂原子的非饱和环系取代基，如吡啶基、噻吩基，或类似基团。

术语“3～12元杂环”指具有3-12元的环系上具有一个或多个选自o、s、n或p的杂原子的饱和环系取代基，如哌啶基，吡咯基，或类似基团。

术语“卤素”指f、cl、br和i。

本发明中，术语“含有”、“包含”或“包括”表示各种成分可一起应用于本发明的混合物或组合物中。因此，术语“主要由...组成”和“由...组成”包含在术语“含有”中。

本发明中，术语“药学上可接受的”成分是指适用于人和/或动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)，即有合理的效益/风险比的物质。

本发明中，术语“有效量”指治疗剂治疗、缓解或预防目标疾病或状况的量，或是表现出可检测的治疗或预防效果的量。对于某一对象的精确有效量取决于该对象的体型和健康状况、病症的性质和程度、以及选择给予的治疗剂和/或治疗剂的组合。因此，预先指定准确的有效量是没用的。然而，对于某给定的状况而言，可以用常规实验来确定该有效量，临床医师是能够判断出来的。

在本文中，除特别说明之处，术语“取代”指基团上的一个或多个氢原子被选自下组的取代基取代：卤素、未取代或卤代的c1-c6烷基、未取代或卤代的c2-c6酰基、未取代或卤代的c1-c6烷基-羟基。

除非特别说明，本发明中，所有出现的化合物均意在包括所有可能的光学异构体，如单一手性的化合物，或各种不同手性化合物的混合物(即外消旋体)。本发明的所有化合物之中，各手性碳原子可以任选地为r构型或s构型，或r构型和s构型的混合物。

如本文所用，术语“本发明化合物”指式i所示的化合物。该术语还包括及式i化合物的各种晶型形式、药学上可接受的盐、水合物或溶剂合物。

如本文所用，术语“药学上可接受的盐”指本发明化合物与酸或碱所形成的适合用作药物的盐。药学上可接受的盐包括无机盐和有机盐。一类优选的盐是本发明化合物与酸形成的盐。适合形成盐的酸包括但并不限于：盐酸、氢溴酸、氢氟酸、硫酸、硝酸、磷酸等无机酸，甲酸、乙酸、丙酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、马来酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、苦味酸、甲磺酸、苯甲磺酸，苯磺酸等有机酸；以及天冬氨酸、谷氨酸等酸性氨基酸。

式i化合物及其制备

本发明提供了一种如下通式(i)所示的2-亚胺-5-酮基-2,5-二氢-1-h-二吡啶并[3,4-c:1',2'-f]嘧啶类化合物，或其药学上可以接受的盐或溶剂合物：

其中，各基团的定义如上文中所述。

优选的所述化合物为选自下列化合物中的一种化合物：

药物组合物和施用方法

由于本发明化合物具有优异的对spop的抑制活性，因此本发明化合物及其各种晶型，药学上可接受的无机或有机盐，水合物或溶剂合物，以及含有本发明化合物为主要活性成分的药物组合物可用于治疗、预防以及缓解由与spop活性或表达量相关的疾病。根据现有技术，本发明化合物可用于治疗以下疾病：肾癌、透明细胞癌等等。

本发明的药物组合物包含安全有效量范围内的本发明化合物或其药理上可接受的盐及药理上可以接受的赋形剂或载体。其中“安全有效量”指的是：化合物的量足以明显改善病情，而不至于产生严重的副作用。通常，药物组合物含有1-2000mg本发明化合物/剂，更佳地，含有5-200mg本发明化合物/剂。较佳地，所述的“一剂”为一个胶囊或药片。

“药学上可以接受的载体”指的是：一种或多种相容性固体或液体填料或凝胶物质，它们适合于人使用，而且必须有足够的纯度和足够低的毒性。“相容性”在此指的是组合物中各组份能和本发明的化合物以及它们之间相互掺和，而不明显降低化合物的药效。药学上可以接受的载体部分例子有纤维素及其衍生物(如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素钠、纤维素乙酸酯等)、明胶、滑石、固体润滑剂(如硬脂酸、硬脂酸镁)、硫酸钙、植物油(如豆油、芝麻油、花生油、橄榄油等)、多元醇(如丙二醇、甘油、甘露醇、山梨醇等)、乳化剂()、润湿剂(如十二烷基硫酸钠)、着色剂、调味剂、稳定剂、抗氧化剂、防腐剂、无热原水等。

本发明化合物或药物组合物的施用方式没有特别限制，代表性的施用方式包括(但并不限于)：口服、瘤内、直肠、肠胃外(静脉内、肌肉内或皮下)、和局部给药。

用于口服给药的固体剂型包括胶囊剂、片剂、丸剂、散剂和颗粒剂。在这些固体剂型中，活性化合物与至少一种常规惰性赋形剂(或载体)混合，如柠檬酸钠或磷酸二钙，或与下述成分混合：(a)填料或增容剂，例如，淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸；(b)粘合剂，例如，羟甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯基吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶；(c)保湿剂，例如，甘油；(d)崩解剂，例如，琼脂、碳酸钙、马铃薯淀粉或木薯淀粉、藻酸、某些复合硅酸盐、和碳酸钠；(e)缓溶剂，例如石蜡；(f)吸收加速剂，例如，季胺化合物；(g)润湿剂，例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；(h)吸附剂，例如，高岭土；和(i)润滑剂，例如，滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠，或其混合物。胶囊剂、片剂和丸剂中，剂型也可包含缓冲剂。

固体剂型如片剂、糖丸、胶囊剂、丸剂和颗粒剂可采用包衣和壳材制备，如肠衣和其它本领域公知的材料。它们可包含不透明剂，并且，这种组合物中活性化合物或化合物的释放可以延迟的方式在消化道内的某一部分中释放。可采用的包埋组分的实例是聚合物质和蜡类物质。必要时，活性化合物也可与上述赋形剂中的一种或多种形成微胶囊形式。

用于口服给药的液体剂型包括药学上可接受的乳液、溶液、悬浮液、糖浆或酊剂。除了活性化合物外，液体剂型可包含本领域中常规采用的惰性稀释剂，如水或其它溶剂，增溶剂和乳化剂，例知，乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺以及油，特别是棉籽油、花生油、玉米胚油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油或这些物质的混合物等。

除了这些惰性稀释剂外，组合物也可包含助剂，如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、娇味剂和香料。

除了活性化合物外，悬浮液可包含悬浮剂，例如，乙氧基化异十八烷醇、聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨醇酯、微晶纤维素、甲醇铝和琼脂或这些物质的混合物等。

用于肠胃外注射的组合物可包含生理上可接受的无菌含水或无水溶液、分散液、悬浮液或乳液，和用于重新溶解成无菌的可注射溶液或分散液的无菌粉末。适宜的含水和非水载体、稀释剂、溶剂或赋形剂包括水、乙醇、多元醇及其适宜的混合物。

用于局部给药的本发明化合物的剂型包括软膏剂、散剂、贴剂、喷射剂和吸入剂。活性成分在无菌条件下与生理上可接受的载体及任何防腐剂、缓冲剂，或必要时可能需要的推进剂一起混合。

本发明化合物可以单独给药，或者与其他药学上可接受的化合物联合给药。

使用药物组合物时，是将安全有效量的本发明化合物适用于需要治疗的哺乳动物(如人)，其中施用时剂量为药学上认为的有效给药剂量，对于60kg体重的人而言，日给药剂量通常为1～2000mg，优选5～500mg。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

本发明的主要优点包括：

1.提供了一种如式i所示的化合物。

2.提供了一种结构新颖的spop抑制剂及其制备和应用，所述的抑制剂在极低浓度下即可抑制各类spop的活性。

3.提供了一类治疗与spop活性相关疾病的药物组合物。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述。这些实施例仅是出于解释说明的目的，而不是限制本发明的范围和实质。

以下实施例药品的来源:dmem/hg培养基购自gibco，10％胎牛血清购自lifetechnology，青霉素，链霉素和噻唑蓝购自上海生工生物工程有限公司，制备实施例中试剂购自国药集团化学试剂有限公司和百灵威科技有限公司。spf级bald/cnull雌性裸鼠购至上海斯莱克实验动物有限公司并在上海药物所spf级动物房饲养，动物管理和使用遵循了中科院上海药物所iacuc政策和指导原则。

制备实施例

本发明所述的2-亚胺-5-酮基-2,5-二氢-1-h-二吡啶并[3,4-c:1’,2’-f]嘧啶类化合物及其药学上可以接受的盐或药学上可以接受的溶剂合物可以通过如下路线制备：

下面以化合物n-(3-(4-吗啉基)丙基)-1-(2-苯基乙基)-2-亚胺-10-甲基-5-酮基二吡啶[4,3-b:1’,2’-f]并嘧啶-3-甲酰胺为例简要说明2-亚胺-5-酮基-2,5-二氢-1-h-二吡啶并[3,4-c:1’,2’-f]嘧啶类化合物的合成。

步骤1:将10.81g(100mmol)2-氨基-3-甲基吡啶和24.03g(150mmol)丙二酸二乙酯加入250ml茄型瓶，200℃反应2h，反应过程中有大量固体产物生成。反应结束后冷却至室温，加入200ml乙醇回流过夜，冷却至室温，过滤，得到13g产物，产率76％。

¹hnmr(400mhz,dmso)δ8.79(dd,j＝7.2,1.6hz,1h),7.83(d,j＝6.9hz,1h),7.17(t,j＝7.0hz,1h),5.40(s,1h),2.42(s,3h).

步骤2:将200ml(氢化钙除水)n,n-二甲基甲酰胺(dmf)加入500ml茄型瓶，冰浴冷却，随后缓慢滴加13ml(140mmol)三氯氧磷(p(o)cl3)，冰浴下继续反应1h，分批加入7.05g(40mmol)2-羟基-4-羟基-9-甲基吡啶[1,2-α]-吡啶胺，加完后冰浴反应1h，室温反应2h，随后95℃反应2h，反应结束后加入200ml冰水中，反应1h，过滤，固体用乙醇打浆，过滤，干燥，得到6.2g产物，产率70％。

¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ10.43(s,1h),9.12(ddd,j＝7.0,1.6,0.8hz,1h),7.94(ddd,j＝7.1,1.7,0.9hz,1h),7.35(t,j＝7.0hz,1h),2.66(s,3h).

步骤3:将222.6mg(1mmol)2-氯-3-醛基-4-羰基-4h-9-甲基吡啶[1,2-α]嘧啶加入5ml无水乙醇中，滴加484.7mg(4mmol)苯乙胺，室温反应12h，反应结束后过滤，固体用乙醇充分洗涤，得到320.2mg淡黄色固体，产率78％。

¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ10.69(s,1h),8.86(s,1h),8.79(d,j＝7.0hz,1h),7.47(d,j＝6.7hz,1h),7.43–7.05(m,10h),6.77(t,j＝7.0hz,1h),3.90–3.71(m,4h),2.91(t,j＝7.4hz,2h),2.86(t,j＝7.3hz,2h),2.47(s,3h).

步骤4：将1.44g(10mmol)n-(2-氨基丙基)吗啉和1.36g(1.2mmol)氰基乙酸乙酯加入25ml茄形瓶中，反应48h，反应结束后用无水乙醚洗涤三次，干燥，放入-20℃冰箱中，得到1.7g淡黄色固体，产率80％。

¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ7.90(s,1h),3.78–3.75(m,4h),3.40(dd,j＝11.5,5.8hz,2h),3.35(s,2h),2.52–2.48(m,6h),1.72(ddd,j＝12.2,7.6,3.7hz,2h).

步骤5:将108mg(0.5mmol)9-甲基-2-(2-苯基乙胺基)-3-(2-苯乙基亚胺甲基)吡啶[1,2-a]并嘧啶-4-酮和103.5mg(0.55mmol)2-氰基-n-(3-(4-吗啉基)丙基)乙酰胺加入2ml氯仿中，回流反应8h，反应结束后加入乙醚，过滤，固体用无水乙醇重结晶，得到约60mg产物，产率32％。

¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.88(d,j＝6.8hz,1h),7.65(dt,j＝6.9,1.4hz,1h),7.35–7.27(m,4h),7.24(d,j＝4.8hz,1h),7.01(t,j＝7.0hz,1h),4.62(s,2h),3.72(t,j＝4.7hz,4h),3.52(q,j＝6.2hz,2h),3.05(t,j＝8.1hz,2h),2.59(s,3h),2.49(d,j＝6.6hz,5h),1.82(q,j＝6.7hz,3h).

其他式i化合物可以通过类似的方法，使用相应的原料进行制备。

2-亚胺-5-酮基-2,5-二氢-1-h-二吡啶并[3,4-c:1’,2’-f]嘧啶类类化合物核磁数据列于下表。

以下为通式(i)所示的2-亚胺-5-酮基-2,5-二氢-1-h-二吡啶并[3,4-c:1’,2’-f]嘧啶类化合物抑制spop活性实验。

实验实施例一：细胞增殖实验(mtt)对2-亚胺-5-酮基-2,5-二氢-1-h-二吡啶并[3,4-c:1’,2’-f]嘧啶类化合物抑制spop活性评价

肾癌细胞株a498用含有10％胎牛血清的培养液(dmem/hg培养基，100u青霉素，100u链霉素，10％胎牛血清)配成浓度为5×10⁴-1×10⁵个/ml细胞悬液。96孔细胞培养板中每孔接种100μl细胞悬液，37℃和5％co2条件下培养过夜至贴壁生长，随后加入浓度梯度表1中的化合物，继续培养68h后，每孔加入10μl噻唑蓝溶液(5mg/ml)，再继续培养4h。培养结束后，完全吸弃孔内培养基，每孔加150μl二甲亚砜(dmso)，振荡10min，使结晶物充分融解。酶标仪测定490nm波长的吸光值，记录结果并计算细胞存活率。以化合物浓度为横坐标，细胞存活率为纵坐标作图，通过graphpadprism5.0软件非线性回归拟合曲线得到ic50值。2-亚胺-5-酮基-2,5-二氢-1-h-二吡啶并[3,4-c:1’,2’-f]嘧啶类化合物ic50值列于表1。从表1中可以看到，2-亚胺-5-酮基-2,5-二氢-1-h-二吡啶并[3,4-c:1’,2’-f]嘧啶类化合物可以抑制spop活性。

表12-亚胺-5-酮基-2,5-二氢-1-h-二吡啶并[3,4-c:1’,2’-f]嘧啶类化合物ic50值

实验实施例二：细胞增殖实验验证2-亚胺-5-酮基-2,5-二氢-1-h-二吡啶并[3,4-c:1’,2’-f]嘧啶类化合物对6株肾癌细胞系和1株正常肾小管上皮细胞系的抑制活性

实验以2-亚胺-5-酮基-2,5-二氢-1-h-二吡啶并[3,4-c:1’,2’-f]嘧啶类化合物中的spop-b-30和spop-b-88为例。

本实验选用的肾癌细胞系包括a498、caki-2、ketr-3，769-p，os-rc-2和786-o，正常肾小管上皮细胞为hk-2细胞。细胞在含10％(vol/vol)胎牛血清，100u/ml青霉素和100ng/ml链霉素的dmem/hg培养基(a498、ketr-3)或mccoy’s5a培养基(caki-2)或rpmi1640培养基(786-o、769-p、os-rc-2)或dmem/f121:1培养基(hk-2)中培养。细胞增殖实验实施方法如实验实施例一。从附图2中可以看出，spop-b-30和spop-b-8可以显著抑制肾癌细胞的增殖活性，但对正常肾小管上皮细胞hk-2(非肿瘤细胞)抑制活性不明显。

实验实施例三：蛋白质免疫印迹法实验(westernblot)验证2-亚胺-5-酮基-2,5-二氢-1-h-二吡啶并[3,4-c:1’,2’-f]嘧啶类化合物对spop下游信号通路的抑制活性

实验以2-亚胺-5-酮基-2,5-二氢-1-h-二吡啶并[3,4-c:1’,2’-f]嘧啶类化合物中的spop-b-30和spop-b-88为例。

将2mla498细胞株重悬液(5×10⁴-1×10⁵个/ml)加入6孔细胞培养板中，过夜培养至细胞贴壁状态。加入浓度梯度spop-b-30和spop-b-88，继续培养10h。培养结束后，吸弃培养基，磷酸缓冲液洗涤3次，加入150μlripa细胞裂解液和1mm苯甲基磺酰氟(pmsf)，置冰上裂解30min。用细胞刮刮取裂解物至1.5ml离心管，4℃下15000g离心20min，上清液转移至1.5ml离心管，用bca法测定上清液蛋白浓度。取100μl上清液加入25μl5×上样缓冲液，100℃加热10min，12000g离心1min。根据测定浓度调整上样量，进行聚丙烯酰胺变性电泳(sds-page)。分离的蛋白条带通过转移电泳转至硝酸纤维膜(nc膜)，然后通过5％脱脂牛奶封闭，孵育一抗(兔源pten抗体)，tbst缓冲液洗涤，孵育二抗(辣根过氧化物酶hrp标记的羊抗兔抗体)，tbst缓冲液洗涤，最后通过增强化学发光法(ecl)发光显影步骤来检测蛋白量。从附图3中可以明显的看出，随着spop-b-30和spop-b-8浓度增加，spop底物pten和dusp7含量增加，下游信号通路活性分子akt和erk1/2磷酸化作用减弱，说明spop-b-30和spop-b-8可以抑制spop活性，进而增加抑癌底物蛋白pten和dusp7含量。

实验实施例四：免疫共沉淀实验(co-ip)验证2-亚胺-5-酮基-2,5-二氢-1-h-二吡啶并[3,4-c:1’,2’-f]嘧啶类化合物细胞内竞争性抑制spop与底物相互作用

实验以2-亚胺-5-酮基-2,5-二氢-1-h-二吡啶并[3,4-c:1’,2’-f]嘧啶类化合物中的spop-b-30和spop-b-88为例。

在60mm培养皿中种植hek293细胞，密度约30％-50％。次日转染相应质粒myc-pten，flag-spop。转染40h，各组加入对应量小分子化合物，8h后吸去培养基，用预冷的pbs洗涤两次。吸干残余的pbs后在每皿细胞加入预冷的200μlripa细胞裂解液，用预冷的细胞刮将细胞从培养皿上刮下来，吸取悬液到ep管中，冰上放置10-30min。4℃条件下，12000rpm离心10min，将上清转移到新的ep管，bca法定量蛋白浓度。调平蛋白浓度后预留30μl总蛋白，加入5×上样缓冲液，沸水煮5分钟变性。每个样品取20μl抗体偶联的琼脂糖beads悬液，用pbst洗涤三次，最后按体积进行1:1重悬。每个样品中加30μlbeads重悬液，再加300μlripa裂解液，4℃旋转孵育4h或过夜。4℃下5000g离心1分钟，去上清。加入500μlpbst缓冲液，4℃旋转洗涤10分钟，4℃下5000g离心1分钟，去上清。重复洗三次。最后一次离心去上清后，尽量吸干净参与的上清，然后加入30μl2×蛋白上样缓冲液，沸水中变性5分钟。变性后的样品室温下8000g离心，吸取上清进行sds-page电泳，注意不要吸到beads。从附图4可以明显看出，spop-b-30和spop-b-88可以在细胞内抑制spop与底物pten相互结合。

实验实施例五：体内泛素化实验(invivoubiquitinationassay)验证2-亚胺-5-酮基-2,5-二氢-1-h-二吡啶并[3,4-c:1’,2’-f]嘧啶类化合物细胞内抑制spop对底物的泛素化作用

实验以2-亚胺-5-酮基-2,5-二氢-1-h-二吡啶并[3,4-c:1’,2’-f]嘧啶类化合物中的spop-b-30和spop-b-88为例。

在60mm培养皿中种植hek293细胞，密度约30％-50％。次日将myc-pten，flag-spop以及ha-ub分别共转染hek细胞。转染后40h，各组加入对应量小分子化合物，4h后加入10μmmg132的培养基继续培养4h。培养结束后，去除培养基，将培养皿置于冰盒上，用预冷的pbs洗一次后加入100μl预冷的变性裂解液(1％sds；0.5mmedta；1mmdtt；50mmtris,ph7.5)。快速用细胞刮将细胞从培养皿刮至1.5mlep管中，随即在100℃变性5min。变性结束后将裂解液置于冰上冷却，最后加入900μl的ripa裂解液进行稀释。稀释完后用超声处理，超声条件为：振幅10％，间歇10s开关，总超声时间1分钟。4℃下12000g离心5min，将上清转移到新的ep管中。依据蛋白定量结果调平样品间蛋白浓度。预留100μl作为input，加蛋白上样缓冲液100℃变性5min。其余裂解液用myc抗体偶联的琼脂糖beads进行免疫沉淀，最后的洗脱产物用ha抗体进行免疫印迹。附图5结果可以明显看出，spop-b-30和spop-b-88可以在细胞内抑制spop对底物pten的泛素化作用。

实验实施例六：表面等离子共振实验(spr)验证2-亚胺-5-酮基-2,5-二氢-1-h-二吡啶并[3,4-c:1’,2’-f]嘧啶类化合物与spop蛋白相互作用

实验以2-亚胺-5-酮基-2,5-二氢-1-h-二吡啶并[3,4-c:1’,2’-f]嘧啶类化合物中的spop-b-30和spop-b-88为例。

新鲜纯化的spop^math蛋白(纯度＞95％，浓度5mg/ml)用10mm乙酸钠溶液(ph4.5)稀释至0.1mg/ml。通过biacoret200(ge公司)采用标准的氨基偶联程序将spop^math蛋白偶联至cm5芯片上。实验前cm5芯片用hbs-ep缓冲液平衡2h。spop-b-30和spop-b-88用hbs-ep缓冲液梯度稀释，以30μl/min流速平衡60s，结合120s，接着冲洗120s。所得的相应曲线通过bia数据分析软件(ge公司)拟合，得到相应kd值。从附图6中可以明显看出，spop-b-30和spop-b-88与spop^math蛋白有一定的结合作用。

实验实施例七：荧光偏振实验(fp)验证2-亚胺-5-酮基-2,5-二氢-1-h-二吡啶并[3,4-c:1’,2’-f]嘧啶类化合物与spop蛋白相互作用

实验以2-亚胺-5-酮基-2,5-二氢-1-h-二吡啶并[3,4-c:1’,2’-f]嘧啶类化合物中的spop-b-30和spop-b-88为例。

荧光偏振(fluorescencepolarization,fp)实验在多功能酶标仪(perkinelmer公司)上完成。仪器型号为envisionmultilabelplatereader。实验用异硫氰酸荧光素(fitc)标记的多肽作为示踪底物，序列为fitc-lacdevtsttsssta(吉尔生化公司合成)。在100μl羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液(50mm，ph7.5)缓冲液中加入2μmspop^math、20nm多肽底物，浓度梯度spop-b-30和spop-b-88，4℃孵育1h，检测其荧光偏振值。所用激发光和发射光分别为480nm和535nm。实验重复三次，所用实验数据采用graphpadprism5.0软件分析。从附图7中可以看出，spop-b-30和spop-b-88与与spop蛋白相互作用。

实验实施例八：小鼠动物实验验证2-亚胺-5-酮基-2,5-二氢-1-h-二吡啶并[3,4-c:1’,2’-f]嘧啶类化合物毒性

实验以2-亚胺-5-酮基-2,5-二氢-1-h-二吡啶并[3,4-c:1’,2’-f]嘧啶类化合物中的spop-b-30和spop-b-88为例。

化合物体内毒性实验所用6至8周龄balb/c和icr小鼠分别购自上海斯莱克实验动物有限公司(slac)和上海西普尔必凯实验动物有限公司。随机分组，每组3只。每天一次腹腔注射溶剂、80mg/kg，120mg/kg化合物，并称量体重和检查活动状态。6-7天后眼眶采血，进行血液学分析和血浆生化检测。小鼠麻醉猝死后取内脏(心脏，肝脏、脾脏，肺和肾脏)进行he染色和病理切片检测。附图8可以看出，化合物注射浓度为80mg/kg为安全浓度。

实验实施例九：小鼠动物实验检测2-亚胺-5-酮基-2,5-二氢-1-h-二吡啶并[3,4-c:1’,2’-f]嘧啶类化合物体内代谢

实验以2-亚胺-5-酮基-2,5-二氢-1-h-二吡啶并[3,4-c:1’,2’-f]嘧啶类化合物中的spop-b-30为例。

4-6周龄balb/c小鼠随机分组，每组3只。化合物使用生理盐水，0.5％2-苯乙醇，1.5％吐温-80作为溶剂配制悬浊液进行腹腔注射，给化合物浓度为10mg/kg。分别在给化合物后0.25，0.5，1，2，4，6，10和24小时时间点进行尾静脉采血，每只采血0.15ml。血样采用edta抗凝，离心取上清进行lc-ms/ms方法检测血清中spop-b-30化合物含量。从附图9中可以计算出血药浓度最高出现在给药0.5小时后，为1070ng/ml，半衰期为6.25小时。

实验实施例十：小鼠动物实验验证2-亚胺-5-酮基-2,5-二氢-1-h-二吡啶并[3,4-c:1’,2’-f]嘧啶类化合物活性

a498细胞用dmem/hg+10％胎牛血清培养基在5％co2、37℃条件培养。收集胰酶消化后的a498细胞，用无胎牛血清培养基制备细胞悬液，细胞数至10⁸细胞/毫升浓度。取-20℃保存的基质胶(martrigel，bd公司)在4℃自然溶化，细胞悬液：基质胶martrigel3:1(v/v)混合后即刻注射100μl(10⁷个细胞)至6周龄裸鼠右前肢腋窝皮下。观察肿瘤生长状况并用游标卡尺测量肿瘤长度(a毫米)和宽度(b毫米)，按照v＝a*b²/2计算肿瘤体积，待肿瘤体积大约125mm³时进行分组，40只实验裸鼠分4组，每组10只。化合物spop-b-30用溶剂(生理盐水，0.5％2-苯乙醇，1.5％吐温-80)至5mg/ml，spop-b-88用生理盐水溶解至5mg/ml。每天按照0，40，60，80mg/kg量进行腹腔注射，并每3天进行一次体重称量和肿瘤测量，进行相应护理和记录。观察对照组和实验组肿瘤生长情况，25天左右停止给药，对裸鼠进行麻醉猝死并进行解剖，每组分别取2只裸鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏进行组织he染色观察。同时分离出肿瘤进行称重、拍照和液氮冻存，保存的肿瘤组织用于蛋白免疫印迹检测组织pten量。

从附图10中可以看出，给药spop-b-30和spop-b-88的小鼠的肿瘤体积明显小于只注射溶剂的小鼠，从肿瘤组织的的蛋白免疫印迹检测中，同样可以观测到组织中spop含量明显降低。动物实验表明spop-b-30和spop-b-88可以通过抑制spop来减缓肿瘤的生长。

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