本发明涉及一类stat3蛋白抑制剂的三元环类化合物。该化合物为式i化合物及其药学上可接受的盐、前药和溶剂合物，及包含所述化合物的药物组合物，并涉及其合成方法。此外，本发明涉及包含所述化合物的药物组合物，可用于预防或治疗与stat3蛋白相关疾病的stat3蛋白抑制剂。
背景技术：
：蛋白激酶(pk)的抑制是目前一类治疗肿瘤的小分子靶点药物，stat蛋白是蛋白激酶(pk)之一。信号转导及转录活化因子（signaltransducerandactivatoroftranscription，stat)蛋白家族主要成员有stat1（α/β)、stat2、stat3（α/β/γ)、stat4、stat5(a/b)和stat6等。其中stat1与心血管疾病紧密相关，stat3、stat5在肿瘤的发生、发展过程中起重要作用，stat2、stat4、stat6的作用机制目前尚不完全清楚。已知在人类多种癌症中，包括实体瘤、白血病和淋巴瘤，如头颈癌、脑肿瘤、乳腺癌、胰腺癌、结肠癌、非小细胞性肺癌、卵巢癌、前列腺癌、恶性黑色素瘤、多发性骨髓瘤、肉瘤和各种白血病等，stat3起着至关重要的调控作用。stat3是一类具有信号转导和转录活化双重功能的蛋白，其生物学特征与其蛋白结构有着密切关系。stat3蛋白由750〜800个氨基酸组成，通常分子质量在86〜91kda，p-stat3α的分子质量是91kda，p-stat3β的分子质量是86kda。stats家族成员共享一套保守的结构和功能区域，包括氨基端、卷曲螺旋区、连接区、sh2酪氨酸多肽臂和羧酸端的转录激活区。氨基端是stat3最为保守的区域，含130个氨基酸，有4个α螺旋，为转录因子和调节蛋白提供作用位点，辅助dna的结合。β片层和连接区与dna的特异性结合直接相关。β片层具有特异性针对活性γ-干扰素（ifn-γ)回文序列(gas)元件的结合序列；连接区则有稳定dna结合域的作用。stat3蛋白sh2区的3d结构与stat家族其他蛋白的3d结构十分类似，含有三股平行排列的β片层，用于stat3蛋白的二聚化。stat3蛋白既可以同源聚合成二聚体也可以异源聚合成二聚体，例如，stat3-stat3、stat1-stat3、stat5-stat3二聚体等。酪氨酸（tyr705)多肽臂位于sh2区域和竣酸端区域之间，可与sh2区域结合形成二聚体。羧酸端区域可调节dna的转录活化、转录激活区内的丝氨酸（ser727)的磷酸化和接近羧酸端的酪氨酸（tyr705)的磷酸化，从而调节stat3蛋白的激活，调控靶基因转录。stat3的信号调控可概括为以下4阶段。阶段1:膜受体的活化。stat3蛋白膜上的受体，包括细胞因子受体、生长因子受体、toll样受体、肾上腺素受体和烟碱受体，可被内源性或外源性途径磷酸化后活化。内源性途径系指致癌基因活化后所释放的癌症因子和炎症因子刺激生长因子受体和细胞因子受体，使其活化。外源性途径包括：细胞因子受体被外源性致癌物、uv射线或阳光等激活；toll样受体被炎症介质激活；肾上腺素受体被外部压力或激素激活；烟碱受体因吸烟而激活等。阶段2:stat3蛋白的活化。各种膜受体激活后，首先激活附近的jak激酶，活化后的jak激酶进一步磷酸化膜受体本身，膜受体的磷酸化酪氨酸多肽臂可以与stat3蛋白的保守sh2结构域结合。其后，激活的jak激酶第二次作用，磷酸化stat3的酪氨酸（tyr705)多肽臂。阶段3:stat3蛋白的二聚化。被磷酸化的stat3从膜受体上脱离，其磷酸化酪氨酸多肽臂与另一个活化的stat3蛋白的sh2区的精氨酸（arg609)结。与此同时，其sh2区以相同方式被另一个stat3蛋白伸出的多肽臂结合，从而形成stat3同源二聚体。stat3蛋白也可与stat家族的其他成员，比如stat1、stat5等，结合形成异源二聚体。阶段4:启动细胞转录。stat3蛋白的偶联物形成后，可通过细胞核膜进入细胞核，然后与dna的启动子区域结合，开启基因的转录，进一步被翻译成蛋白。此过程可以激活一系列致癌基因的表达，使得癌细胞大量增殖，并防止其凋亡。stat3蛋白的持续性激活状态广泛存在于肿瘤发生、发展过程中，是肿瘤不断复制、繁殖的“阀门”。根据stat3的信号通路，可以设计一系列不同靶点的抑制剂来关闭“阀门”。目前研究主要集中在以下四个方面：寻找能抑制stat3蛋白磷酸化的分子，寻找能抑制stat3蛋白偶联化的分子，寻找能抑制stat3二聚体与dna结合的分子和寻找能够直接抑制stat3蛋白表达的分子。阻断stat3蛋白功能的抑制剂的难点在于：无论抑制stat3蛋白的活化、二聚化、与dna分子的结合都是要抑制蛋白-蛋白的相互作用；另外，stat3蛋白的sh2结构域本身只具有较浅的结合口袋，但是研究发现其结构中有3个相对稳定的结合位点：py-x位点，py+0位点和py+1位点。化合物只要能与以上位点作用，就可以起到较明显的抑制效果。因此，发现能与这些位点作用的小分子或拟肽分子是当前的研究热点之一，并且此类抑制剂具有双重功能，既能抑制stat3蛋白磷酸化又能抑制stat3蛋白二聚化。此类分子与stat3自身原有的酪氨酸多肽臂进行竞争，结合于stat3蛋白的sh2结构域，占据了stat3蛋白的sh2结构域空间，使得stat3蛋白不能够被膜受体的磷酸化酪氨酸多肽臂结合，从而抑制了stat3蛋白的磷酸化。同理，磷酸化的stat3的sh2结构域也可被抑制剂占用，达到不能二聚化的目的。此类抑制剂虽然作用于相同的位点，但却兼有两种抑制效果。另一方面，通过与stat3蛋白的dna结合区域或其别构部位结合，可以抑制活化的stat3蛋白与dna的结合，从而阻断stat3蛋白调控的基因转录和翻译。而寻找能够直接抑制stat3蛋白表达的机制很明确，就是减少stat3蛋白的表达，从源头上降低stat3蛋白水平。此外，研究表明，stat3蛋白的丝氨酸（ser727)磷酸化水平也影响到stat3蛋白的二聚化的程度，赖氨酸（lys685)的乙酰化水平可以影响stat3蛋白二聚体的稳定性（摘自：信号转导与转录激话因子3(stat3)抑制剂及其抗肿瘤研究进展彭司勋等，药物化学进展，第10卷，化学工业出版社，2015.4）。stat3的抑制剂的研究最初主要依赖传统的生物学方法进行发现、筛选和验证一系列生物试剂、小分子多肽和天然化合物。随着对stat3信号通路的研究深入，尤其是当人stat3蛋白的三维晶体结构被x线衍射解析后，使得基于蛋白结构设计靶向性stat3抑制剂的研究成为可能。通过直接方式抑制stat3的磷酸化、二聚化、与dna的结合，或是通过间接方式抑制stat3上游膜受体、jak激酶活性或是使用反义寡核苷酸或sirna干扰直接抑制肿瘤细胞的stat3蛋白的转录和翻译，最终都能达到阻断stat3通路的目的，从而起到明显的抗肿瘤作用。目前stat3蛋白抑制剂还处于研究阶段，急需要开发更好药效和安全性的新化合物。本发明的一类stat3蛋白抑制剂的新化合物具有良好的生物活性和安全性。技术实现要素：本发明的目的在于：合成一类stat3蛋白抑制剂的三元环类化合物。本发明的另一目的是提供一种本发明所述一类stat3蛋白抑制剂新化合物的合成方法。本发明的另一目的是一类stat3蛋白抑制剂新化合物在治疗肿瘤作用中的应用。本发明的一类stat3蛋白抑制剂三元环类新化合物结构为：一种式（i）的新化合物：（i）包括其药学上可接受的盐、前药和溶剂合物，其中：x选自chr、nhr、so、so2、o。r选自h,卤素、cn、no2、cf3、cho、cooh、coor1、conr2r2’、sonr3r3’、cor4、r5oh、c1-6烷基、c2-6烯基、c2-6炔基，其中c1-6烷基、c2-6烯基、c2-6炔基任选被一个或多个相同或不同的r1取代；c3-7环烷基、c5-7芳香环基、c5-7芳香杂环基、c7-11芳香双环基、c7-11芳香杂双环基，其中这些环上任选被一个或多个相同或不同的r2取代。a选自c3-7环烷基、c5-7芳香环基、c5-7芳香杂环基、c7-11芳香双环基、c7-11芳香杂双环基，其中这些环上任选被一个或多个相同或不同的r1取代。r1选自h,卤素、cn、no2、cf3、cho、cooh、coor1、conr2r2’、sonr3r3’、cor4、r5oh、c1-6烷基、c2-6烯基、c2-6炔基，其中c1-6烷基、c2-6烯基、c2-6炔基任选被一个或多个相同或不同的r1取代；c3-7环烷基、c5-7芳香环基、c5-7芳香杂环基、c7-11芳香双环基、c7-11芳香杂双环基，其中这些环上任选被一个或多个相同或不同的r2取代。r2选自h、c1-6烷基、c2-6烯基、c2-6炔基，其中c1-6烷基、c2-6烯基、c2-6炔基、c3-7环烷基、c5-7芳香环基、c5-7芳香杂环基、c7-11芳香双环基、c7-11芳香杂双环基，其中这些环上任选被一个或多个相同或不同的r1取代。本发明的含义内，如下使用术语：“卤素”是指f、cl、br、i。“cl-6烷基”是指具有1-8个碳原子的烷基链，例如：甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基等。“c2-6烯基”是指具有2-8个碳原子的烯基链，例如：乙烯、丙烯、丁烯、丁二烯、戊烯、戊二烯等。“c2-6炔基”是指具有2-8个碳原子的炔基链，例如：乙炔、丙炔、丁炔、戊炔等。“c3-7环烷基”是指具有3-7个碳原子的环烷基链，例如环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环己烯基、环庚基等。“c5-7芳香杂环基”是指具有具有5-7个碳原子的芳香杂环基，例如咪唑、噻唑、吡唑、吡啶、嘧啶等“c7-11芳香双环基”是指具有具有7-11个碳原子的芳香双环基，例如萘、茚等。“c7-11芳香杂双环基”是指具有具有7-11个碳原子的芳香杂双环基，例如喹啉、异喹啉、苯并噻唑等。芳香杂双环基的每个氢可被进一步规定的取代基替换。“前药”是指通过与酶、胃酸等在生理条件下在活体内例如通过各自在酶催化下进行的氧化、还原、水解等反应转化为本发明化合物的衍生物。“溶剂合物”是指通常通过溶剂分解反应与溶剂物理结合的化合物形式。式（i）的化合物选自：（1）(e,e)-1,7-双(4-羟基-3-甲氧基苯基)-4-(2-环丙磺基氨基-4-乙烯基吡啶)-1,6-庚二烯-3,5-二酮;（2）(e,e)-1,7-双(4-羟基-3-甲氧基苯基)-4-[5-(5’-对氟苯基氨甲酰-3’-环丙氨基甲酰基氨基)-3甲硫基-5-乙烯基嘧啶]-1,6-庚二烯-3,5-二酮;（3）(e,e)-1,7-双(4-羟基-3-甲氧基苯基)-4-[5-(5’-对氟苯基氨甲酰-3’-环丙氨基甲酰基氨基)-5-乙烯基嘧啶)]-1,6-庚二烯-3,5-二酮;（4）(e,e)-1,7-双(4-羟基-3-甲氧基苯基)-4-[1,1-二氟-苯并二茂-5-环丙烷甲酰基氨基-4-乙烯基吡嗪)]-1,6-庚二烯-3,5-二酮;（5）(e,e)-1,7-双(4-羟基-3-甲氧基苯基)-4-(3-环丙氨甲酰基氨基-4-乙烯基吡嗪)-1,6-庚二烯-3,5-二酮;（6）(e,e)-1,7-双(4-羟基-3-甲氧基苯基)-4-[3-环丙氨甲酰基氨基-4-(2’,6’-二氯乙烯基嘧啶]-1,6-庚二烯-3,5-二酮;（7）(e,e)-1,7-双(4-羟基-3-甲氧基苯基)-4-(2-环丙磺基氨基-4-乙烯基嘧啶)-1,6-庚二烯-3,5-二酮;（8）(e,e)-1,7-双(4-羟基-3-甲氧基苯基)-4-[3-(5’-对氟苯基氨甲酰-3’-环丙氨基甲酰基氨基)-4-乙烯基吡啶)]-1,6-庚二烯-3,5-二酮;（9）(e,e)-1,7-双(4-羟基-3-甲氧基苯基)-4-[6-(5’-对氟苯基氨甲酰-3’-环丙氨基甲酰基氨基)-5-(4-氯-乙烯基吡啶)]-1,6-庚二烯-3,5-二酮;（10）(e,e)-1,7-双(4-羟基-3-甲氧基苯基)-4-[6-(5’-对氟苯基氨甲酰-3’-环丙氨基甲酰基氨基)-5-乙烯基噻吩]-1,6-庚二烯-3,5-二酮。式(i)化合物的药学可接受的盐，包含一个或多个碱性或酸性基团，本发明还包括其相应的药学上或毒理学上可接受的盐，特别是其药学上可利用的盐。因此，包含酸性基团的式(i)化合物能根据本发明使用，例如作为碱金属盐、碱土金属盐或作为铵盐。这样的盐的更精确的实例包括钠盐、钾盐、钙盐、镁盐或与氨或有机胺如乙胺、乙醇胺、三乙醇胺或氨基酸的盐。可存在并可根据本发明以其与无机酸或有机酸的加成盐的形式使用包含一个或多个碱性基团，即能被质子化的基团的式(i)化合物。适当酸的实例包括盐酸、硫酸、磷酸、硝酸、甲磺酸、乳酸、苹果酸、马来酸、苯甲酸、酒石酸、草酸、对甲苯磺酸等以及本领域技术人员已知的其他酸。本发明中stat3蛋白抑制剂相关的疾病和病症为实体瘤、白血病和淋巴瘤，如头颈癌、脑肿瘤、乳腺癌、胰腺癌、结肠癌、非小细胞性肺癌、卵巢癌、前列腺癌、恶性黑色素瘤、多发性骨髓瘤、肉瘤和各种白血病等。具体实施方式实施例1：(e,e)-1,7-双(4-羟基-3-甲氧基苯基)-4-[5-(5’-对氟苯基氨甲酰-3’-环丙氨基甲酰基氨基)-3-甲硫基-5-乙烯基嘧啶]-1,6-庚二烯-3,5-二酮;化合物结构：合成路线：合成方法：取一定量的姜黄素于三口烧瓶中，加2-5倍量的三氯甲烷，搅拌均匀，将4-氨基-2-甲巯基嘧啶-5-甲醛溶于2-10被量的三氯甲烷溶液，然后慢慢加入到三口烧瓶中，加完后，-10度至80度反应24-48小时，放至是问，蒸馏去除三氯甲烷至固体，正己烷重结晶，得棕色产物(e,e)-1,7-双(4-羟基-3-甲氧基苯基)-4-[5-(3’-甲硫基-4-氨基)乙烯基嘧啶]-1,6-庚二烯-3,5-二酮。称取一定量的(e,e)-1,7-双(4-羟基-3-甲氧基苯基)-4-[5-(3’-甲硫基-4-氨基)乙烯基嘧啶]-1,6-庚二烯-3,5-二酮与对2-氟苯胺甲酰环丙乙酰氯在0度至80度反应1-10小时，用二氯甲烷与甲醇在一定比例纯化得(e,e)-1,7-双(4-羟基-3-甲氧基苯基)-4-[5-(5’-对氟苯基氨甲酰-3’-环丙氨基甲酰基氨基)-3-甲硫基-5-乙烯基嘧啶]-1,6-庚二烯-3,5-二酮，产率40%-60%。1h-nmr(400mhz,cdcl3,tms,ppm):δ6.57(1h)，δ6.69(1h)，δ6.64(1h)，δ6.69(1h)，δ6.57(1h)，δ6.64(1h)，δ5.0(1-0h)，δ5.0(1-0h)，δ2.5(2h)，δ2.9(2h)，δ3.73(3h)，δ3.73(3h)，δ7.66(1h)，δ7.03(1h)，δ7.03(1h)，δ7.66(1h)，δ7.30(1h)，δ8.0(nh)实施例2：(e,e)-1,7-双(4-羟基-3-甲氧基苯基)-4-(2-环丙磺基氨基-4-乙烯基吡啶)-1,6-庚二烯-3,5-二酮;化合物结构：合成方法参照实施例11h-nmr(400mhz,cdcl3,tms,ppm):δ6.57(1h)，δ6.69(1h)，δ6.64(1h)，δ6.69(1h)，δ6.57(1h)，δ6.64(1h)，δ5.0(1-0h)，δ5.0(1-0h)，δ2.5(2h)，δ2.9(2h)，δ3.73(3h)，δ3.73(3h)，δ7.66(1h)，δ7.03(1h)，δ7.03(1h)，δ7.66(1h)，δ7.30(1h),δ4.0(nh)实施例3：(e,e)-1,7-双(4-羟基-3-甲氧基苯基)-4-[5-(5’-对氟苯基氨甲酰-3’-环丙氨基甲酰基氨基)-5-乙烯基嘧啶)]-1,6-庚二烯-3,5-二酮;化合物结构：合成方法参照实施例11h-nmr(400mhz,cdcl3,tms,ppm):δ6.57(1h)，δ6.69(1h)，δ6.64(1h)，δ6.69(1h)，δ6.57(1-h);δ6.64(1h)，δ5.0(1-0h)，δ5.0(1-0h)，δ3.30(1h)，δ3.08(2h)，δ3.73(3h)，δ3.73(3h)，δ7.66(1h)，δ7.03(1h)，δ7.03(1h)，δ7.66(1h)，δ5.66(1h)，δ7.31(1h),δ8.0(nh)实施例4：(e,e)-1,7-双(4-羟基-3-甲氧基苯基)-4-[1,1-二氟-苯并二茂-5-环丙烷甲酰基氨基-4-乙烯基吡嗪)]-1,6-庚二烯-3,5-二酮;化合物结构：合成方法参照实施例11h-nmr(400mhz,cdcl3,tms,ppm):δ6.57(1h)，δ6.69(1h)，δ6.64(1h)，δ6.69(1h)，δ6.57(1h)，δ6.64(1h)，δ5.0(1-0h)，δ5.0(1-0h)，δ2.30(1h)，δ3.6(2h)，δ0.9(3h)，δ3.73(3h)，δ3.73(3h)，δ7.66(1h)，δ7.03(1h)，δ7.03(1h)，δ7.66(1h)，δ7.30(1h),δ8.0(nh)实施例5：(e,e)-1,7-双(4-羟基-3-甲氧基苯基)-4-(3-环丙氨甲酰基氨基-4-乙烯基吡嗪)-1,6-庚二烯-3,5-二酮;化合物结构：合成方法参照实施例11h-nmr(400mhz,cdcl3,tms,ppm):δ6.57(1h)，δ6.69(1h)，δ6.64(1h)，δ6.69(1h)，δ6.57(1h)，δ6.64(1h)，δ5.0(1-0h)，δ5.0(1-0h),δ3.69(1h)δ4.0(1-nh),δ3.39(1h),δ6.90(1h),δ6.53(1h),δ6.86(1h),δ6.38(1h),δ3.73(3h),δ3.73(3h)δ7.66(1h),δ7.03(1h),δ7.03(1h),δ7.66(1h),δ7.90(1h),δ6.0(nh)实施例6：(e,e)-1,7-双(4-羟基-3-甲氧基苯基)-4-[3-环丙氨甲酰基氨基-4-(2’,6’-二氯乙烯基嘧啶]-1,6-庚二烯-3,5-二酮;化合物结构：合成方法参照实施例11h-nmr(400mhz,cdcl3,tms,ppm):δ6.57(1h),δ6.69(1h),δ6.64(1h),δ6.69(1h),δ6.57(1h),δ6.64(1h),δ5.0(1-0h),δ5.0(1-0h),δ3.9(1h),δ8.11(1h),δ5.49(1h),δ7.15(1h),δ7.24(1h),δ7.11(1h),δ7.57(1h),δ3.73(3h),δ3.73(3h),δ7.66(1h),δ7.03(1h),δ7.03(1h),δ7.66(1h),δ7.90(1h),δ6.0(nh)实施例7：(e,e)-1,7-双(4-羟基-3-甲氧基苯基)-4-(2-环丙磺基氨基-4-乙烯基嘧啶)-1,6-庚二烯-3,5-二酮;化合物结构：合成方法参照实施例11h-nmr(400mhz,cdcl3,tms,ppm):δ6.57(1h),δ6.69(1h),δ6.64(1h),δ6.69(1h),δ6.57(1h),δ6.64(1h),δ5.0(1-0h),δ5.0(1-0h),δ3.5(1h),δ8.11(1h),δ4.55(1h),δ7.15(1h),δ7.24(1h),δ7.11(1h),δ7.57(1h),δ3.73(3h),δ3.73(3h),δ7.66(1h),δ7.03(1h),δ7.03(1h),δ7.66(1h)，δ7.90(1h),δ4.0(nh)实施例8：(e,e)-1,7-双(4-羟基-3-甲氧基苯基)-4-[3-(5’-对氟苯基氨甲酰-3’-环丙氨基甲酰基氨基)-4-乙烯基吡啶)]-1,6-庚二烯-3,5-二酮;化合物结构：合成方法参照实施例11h-nmr(400mhz,cdcl3,tms,ppm):δ6.57(1h),6.69(1h),δ6.64(1h)δ6.69(1h),δ6.57(1h),δ6.64(1h),δ5.0(1-0h),δ5.0(1-0h),δ2.9(1h)δ1.4(2-h),δ3.73(3h),δ3.73(3h),δ7.66(1h),δ7.03(1h),δ7.03(1h),δ7.66(1h),δ5.7(1h),δ4.9(1h),δ7.31(1h),δ8.0(nh)实施例9：(e,e)-1,7-双(4-羟基-3-甲氧基苯基)-4-[6-(5’-对氟苯基氨甲酰-3’-环丙氨基甲酰基氨基)-5-(4-氯-乙烯基吡啶)]-1,6-庚二烯-3,5-二酮;化合物结构：合成方法参照实施例11h-nmr(400mhz,cdcl3,tms,ppm):δ6.57(1h),δ6.69(1h),δ6.64(1h),δ6.69(1h),δ6.57(1h),δ6.64(1h),δ5.0(1-0h),δ5.0(1-0h),δ2.8(1h),δ7.50(1h),δ1.7(1h),δ1.0(3h),δ3.73(3h),δ3.73(3h),δ7.66(1h),δ7.03(1h),δ7.03(1h),δ7.66(1h),δ5.7(1h),δ4.9(1h),δ7.31(1h),δ8.0(nh)实施例10：(e,e)-1,7-双(4-羟基-3-甲氧基苯基)-4-[6-(5’-对氟苯基氨甲酰-3’-环丙氨基甲酰基氨基)-5-乙烯基噻吩]-1,6-庚二烯-3,5-二酮化合物结构：合成方法参照实施例11h-nmr(400mhz,cdcl3,tms,ppm):δ6.57(1h)，δ6.69(1h)，δ6.64(1h)，δ6.69(1h)，δ6.57(1h)，δ6.64(1h)，δ5.0(1-0h)，δ5.0(1-0h)，δ2.5(1h)，δ2.9(2h)，δ3.73(3h)，δ3.73(3h)，δ7.66(1h)，δ7.03(1h)，δ7.03(1h)，δ7.66(1h),δ7.30(1h),8.0(nh)实施例21：对stat3的结合作用应用stat3蛋白模型，通过libdock计算得到10个本发明的结构对stat3结合作用的效果。结果见表1。表1通过libdock计算对stat3的结合作用效果化合物对stat3的结合作用本发明实施例1化合物135本发明实施例2化合物125本发明实施例3化合物132本发明实施例4化合物131本发明实施例5化合物126本发明实施例6化合物129本发明实施例7化合物122本发明实施例8化合物131本发明实施例9化合物134本发明实施例10化合物128实施例22：对stat3蛋白的抑制作用研究化合物对纯化的重组stat3活性的影响,是从酶学水平研究化合物对stat3的抑制活性。其实验原理为采用一种发光法酶检测方法，用于检测stat3与底物poly(4:1glu,tyr)肽反应产生的adp含量：adp转化为atp后，atp即可作为ultra-glo萤光素酶催化反应的底物，产生光信号。发光信号与adp的量和酶活性正相关。因此，通过观察化合物对stat3与底物反应产生的发光信号来确定其对重组的stat3的抑制效果。实验方法：基本过程如下：选用取最低浓度0.0001递增为8um的10个浓度单位的化合物与stat3在37度孵育1小时，然后加入底物及atp混合,37度反应1小时后加入一定量的adp-glo混合2分钟，室温反应1小时。再加入检测试剂，室温孵育1小时，用化学发光仪检测。观察化合物对stat3的抑制作用，用ic50表示。结果见表2。表2对stat3的抑制作用实验结果化合物对stat3的抑制作用ic50（nm）本发明实施例1化合物<55本发明实施例2化合物<55本发明实施例3化合物<50本发明实施例4化合物<65本发明实施例5化合物<115本发明实施例6化合物<230本发明实施例7化合物<360本发明实施例8化合物<210本发明实施例9化合物<170本发明实施例10化合物<145实施例23：小鼠急性毒性试验取化合物，观察小鼠单次口服灌胃给药急性毒性，计算ld50。结果见表3。表3小鼠单次口服灌胃给药急性毒性实验结果化合物大鼠单次口服灌胃给药急性毒性ld50（mg/kg）本发明实施例1化合物<450本发明实施例2化合物<500本发明实施例3化合物<420本发明实施例4化合物<170本发明实施例5化合物<650本发明实施例6化合物<270本发明实施例7化合物<400本发明实施例8化合物<450本发明实施例9化合物<170本发明实施例10化合物<140以上所述仅是本发明的优选实施方式，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。当前第1页12