基于kiss-1基因的猪繁殖性状相关的分子标记及其检测方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及动物分子育种领域，尤其设及一种基于KISS-I基因的猪繁殖性状相关 的分子标记及其检测方法和应用。
【背景技术】
[0002] 分子标记辅助选择是基因工程在现代家畜育种中的一项重要应用，利用与育种性 状相关的各种标记代替W表型为基础的选择，从分子水平上分析个体的遗传组成，从而实 现对基因型的直接选择，可克服直接选择的弊端，提高选择的准确性和缩短世代间隔。
[0003] 总产仔数、产活仔数等猪的繁殖性状是重要的经济性状，直接关系到养猪业的经 济效益。
[0004] KISS-I基因是Lee JH等于1996年利用消减杂交的方法研究人黑瘤素细胞不同转 移能力时发现并命名，具有抑制肿瘤转移作用。人KISS-I基因被定位于lq32-41，包含4个外 显子和3个内含子，前2个外显子不翻译。KISS-I基因的编码产物为kissp邱tin,是G蛋白偶 联受体54(G protein-coupled receptor 54,GPR54)的配体，并组成KISS-1/GPR54系统。越 来越多的研究表明，KI S S -1 / G P R 5 4系统在哺乳动物初情期的启动中起关键作用， kissp邱tin对下丘脑-垂体-性腺轴具有重要调控作用。目前，尚未见KISS-I基因与猪繁殖 性能关联分析的报道。
【发明内容】
[0005] 发明目的：针对现有技术中存在的问题，本发明提供了一种基于KISS-I基因的猪 繁殖性状相关的分子标记，为猪的分子育种提供新的思路，本发明的另一个目的是提供所 述分子标记的检测方法和应用。
[0006] 技术方案:本发明所述的一种基于KISS-I基因的猪繁殖性状相关的分子标记，它 为猪KISS-I基因片段，所述的猪KISS-I基因片段含有多态性位点，所述的多态性位点位于 猪KISS-I基因的核巧酸序列中第41位，所述的多态性位点具有G/T碱基的变异。
[0007] 猪KISS-I基因序列的核巧酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述的多态性位点，与猪总 产仔数、产活仔数紧密相关，可利用该位点开发与猪繁殖性状相关的分子标记。本发明中， 描述多态性位点的位置时，W基因的转录起始点核巧酸位置为Ibp，上游为负，下游为正J员 次记数，第4化P位是指KISS-I基因的转录起始点开始的第4化P位，该位点处于SEQ ID NO.4 所示序列的第34化P位。
[000引本发明所述的猪KISS-I基因片段如SEQ ID NO. 1所示。当然，本发明所述的猪 KISS-I基因片段也可W为包含如SEQ ID NO. 1所示的核巧酸序列的DNA片段。根据检测方 法，可W选择合适长度的能够包含多态性位点的DNA片段。
[0009] 本发明还提供了所述分子标记的检测方法，包括：
[0010] (1)根据所述的分子标记的核巧酸序列设计引物；
[0011] (2) W待检测猪的基因组DNA为模板进行PCR扩增；
[001 ^ (3)判断PCR扩增产物中多态性位点的类型。
[0013] 步骤(3)中，可对PCR产物进行测序或电泳分析，判断多态性位点的碱基类型。
[0014] 优选的，步骤(1)中，上游引物的核巧酸序列如SEQ ID NO.2所示，下游引物的核巧 酸序列如SEQ ID NO.3所示。利用该引物，可采用PCR-SSCP的方法准确方便的检测多态性位 点的类型。
[0015] 本发明还提供了所述的分子标记在猪繁殖性状选择中的应用。
[0016] 具体的，猪可W为小梅山猪、枫径猪或大白猪。繁殖性状为总产仔数或产活仔数。
[0017] 与现有技术相比，本发明的有益效果为：
[0018] 本发明研究发现，猪KISS-I基因第1外显子存在一个突变位点（即多态性位点），该 位点位于猪KISS-I基因的核巧酸序列中第41位，该突变位点与猪的繁殖性状尤其是总产仔 数或产活仔数相关，且容易检测，从而本发明根据该突变位点提供了一种基于KISS-I基因 的猪繁殖性状相关的分子标记，并提供了该分子标记的检测方法及在猪繁殖性状选择中的 应用，为猪分子育种、研究猪繁殖生理机制提供基础。
【附图说明】
[0019]图1为实施例1中PCR-SSCP检测结果；
[0020] 图2为实施例1中AA和BB基因型个体PCR产物测序结果；
[0021] 图3为实施例1中AA和BB基因型个体的氨基酸比对结果。
【具体实施方式】
[0022] 下面结合具体实施例，进一步阐明本发明。
[0023] 实施例1
[0024] 2013年采集106头小梅山猪、42头枫径猪和70头大白猪的耳样；同时整理了江苏农 林职业技术学院小梅山猪育种中屯、2004年~2012年期间上述106头小梅山母猪的生产档 案，共有698窝仔猪记录，主要收集产仔年份、胎次、TNB、NBA等指标。耳样(约0.15g)用耳号 错采集，-20°C冻存。用常规的酪氯仿抽提法提取猪基因组DNA，对基因组DNA进行OD值测定， 计算其浓度，并用d地2〇稀释至终浓度为10化g/化，原液-20°C保存，稀释液4°C保存，稀释液 作为PCR扩增的模板。
[00巧]第一步:根据GenBank公布的猪KISS-I基因全序列(登录号:NC_010451.2)，确定猪 KISS-I基因第1外显子区域。
[0026] 第二步：采用Primers. 0软件设计1对引物，扩增第1外显子区域。引物为：KISS-1. 1。上游引物序列为：5'-gggctgttcacctcttgtct-3'（SEQ ID N0.2)，下游引物序列为：5'-邑邑。。。日日日旨日日日旨日日。日1。日-3'（沈9 10側.3)，扩增区域为-10769-7369(569 10側.1)，扩增 产物长度18化P。
[0027] 第S步:PCR-SSCP 检测。
[002引 PCR扩增。PCR扩增反应体系为20化，包括：10 X Buffer 2.0化，25mM Mg2+2.2化， IOmM dNTPs 0.如L，10yM上、下游引物各化L，DNA模板化L(lOOng)，抓?化-iTaq酶0.2化， d地20 11.如UPCR扩增反应程序：94°C预变性5min;31个循环（94°C变性lmin，55°C退火 30s，72°C延伸lmin);最后72°C延伸10min，4°C保存产物。
[00巧]SSCP检测程序为：2.5化PCR扩增产物和7.扣L上样缓冲液混匀，98°C变性IOmin， 然后冰浴lOmin。变性后的PCR产物用10%的聚丙締酷胺凝胶120V电泳12h，银染，拍照保存。 基因型分型结果见图1，图1中，泳道1、2、4的基因型为AA，泳道3、5、10、13的基因型为BB，泳 道6-9,11，12的基因型为AB。
[0030] 第四步:将AA和BB基因型个体的PCR扩增产物送上海生工生物公司进行测序，测序 结果见图2。氨基酸比对结果显示:G41T导致鄉氨酸(Val)变为苯丙氨酸(Phe),即V5F，见图 3。
[0031] 第五步:分析该位点在不同猪群中的分布情况。结果参见表1，3个猪群中共检测到 3种基因型与2个等位基因，小梅山猪与枫径猪中等位基因 B为优势基因，基因频率分别为 0.675、0.905，大白猪中，等位基因 A为优势基因，基因频率为O . 843;经^检验，小梅山猪在 KISS1-3位点上偏离哈代-溫伯格平衡状态(P = O.006)，而枫径猪与大白猪则处于哈代-溫 伯格平衡状态(P〉〇.〇5)。
[0032] 表1 3个猪群KISS-I基因 G41T位点的基因型频率与等位基因型频率
[0033]
[0034] 第六步:SPSS软件关联分析该突变位点与繁殖性状间的关系。结果参见表2,1~2 胎小梅山母猪中，AB型个体的TNB与NBA最高，分别为11.68头、11.10头，比AA与BB型个体分 别高0.68头与0.39头(P〉0.05)、0.50头与0.45头(P〉0.05)。2胎W上小梅山母猪中，AB型个 体的TNB为12.62头、比AA型个体高2.74头(P<0.0 l)，比BB型个体高0.27头(P〉0.05);AB型个 体的NBA为11.93头，比44、88型个体分别高2.58头。<0.01)、0.40头。〉0.05)。所有胎次的 小梅山母猪中，AB型个体的TNB为12.39头、比AA型个体高2.18头(P<0.01)，比BB型个体高 0.31头(P〉0.05);AB型个体的NBA为11.72头，比AA、BB型个体分别高1.97头(P<0.01)、0.40 头(P<0.05)d3个阶段中，3种基因型个体的TNB与NBA均表现出相同的趋势:AB〉BB〉AA。
[0035] 表2 KISS-I基因 G41T位点与小梅山猪繁殖性状的关联分析
[0036]
[0037] 注:N为窝数;TNB为总产仔数;NBA为产活仔数
[0038] 结果提示:猪KISS-I基因 G41T位点杂合子繁殖性能优于纯合子，在选种时应加强 杂合子的选留。
【主权项】
1. 一种基于KISS-1基因的猪繁殖性状相关的分子标记，其特征在于，它为猪KISS-1基 因片段，所述的猪Kiss-ι基因片段含有多态性位点，所述的多态性位点位于猪KISS-1基因 的核苷酸序列中第41位，所述的多态性位点具有G/T碱基的变异。2. 根据权利要求1所述的分子标记，其特征在于，所述的猪KISS-1基因片段包含如SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列。3. 根据权利要求2所述的分子标记，其特征在于，所述的猪KISS-1基因片段如SEQ ID NO. 1所示。4. 一种根据权利要求1~3任一项所述的基于KISS-1基因的猪繁殖性状相关的分子标 记的检测方法，其特征在于，包括： (1) 根据权利要求1~3任一项所述的分子标记的核苷酸序列设计引物； (2) 以待检测猪的基因组DNA为模板进行PCR扩增； (3) 判断PCR扩增产物中多态性位点的类型。5. 根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)中，上游引物的核苷酸序列如 SEQ ID NO.2所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。6. -种根据权利要求1~3任一项所述的分子标记在猪繁殖性状选择中的应用。7. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于，猪为小梅山猪、楓泾猪或大白猪。8. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于，繁殖性状为总产仔数或产活仔数。
【专利摘要】本发明公开了一种基于KISS?1基因的猪繁殖性状相关的分子标记及其检测方法和应用。所述的分子标记为猪KISS?1基因片段，所述的猪KISS?1基因片段含有多态性位点，所述的多态性位点位于猪KISS?1基因的核苷酸序列中第41位，所述的多态性位点具有G/T碱基的变异。本发明猪KISS?1基因第1外显子存在一个突变位点，该位点位于猪KISS?1基因的核苷酸序列中第41位，该突变位点与猪的繁殖性状尤其是总产仔数或产活仔数相关，且容易检测，从而本发明根据该突变位点提供了一种分子标记，并提供了该分子标记的检测方法及在猪繁殖性状选择中的应用，为猪分子育种、研究猪繁殖生理机制提供基础。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/68
【公开号】CN105713970
【申请号】CN201610144943
【发明人】吴井生, 陈永霞, 郭苹, 陈超
【申请人】江苏农林职业技术学院