一种菌数测试培养液、测试瓶及其制备方法、菌数测试方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物检测技术领域，特别是设及一种菌数测试培养液、测试瓶及其 制备方法、菌数测试方法。
【背景技术】
[0002] 在科研和生产实际工作中，常常需要对微生物的数量进行测定。如对水体、空气、 ±壤等环境中的微生物的测定有利于监测和评价其污染程度;对饮用水中和工业循环冷却 水中的微生物的测定可评价其是否达标;对油田污水注水中微生物数量的测定则有助于评 价污水注水的水质;对油井采出液和微生物采油菌剂中的微生物数量进行测定有助于分析 微生物分布状况和产品质量等。因此，微生物数量的测定对科研和生产实际工作具有十分 重要的指导作用和现实意义。
[0003] 微生物数量测定常用的方法有平板菌落计数法和绝迹稀释法。平板菌落计数法是 根据每个活的微生物能长出一个菌落的原理设计，取一定容量的菌悬液，作一系列的倍比 稀释，然后将定量的稀释液进行平板培养，根据培养出的菌落数及稀释倍数，计算出培养物 中的活菌数;而绝迹稀释法是将待测定的水样逐级注入到试管中进行接种稀释，直到最后 一个试管中无菌生长为止，然后根据微生物生长情况和稀释倍数，计算出水样中微生物的 数量。运两种方法都有明显的不足，平板菌落计数法测定结果误差较大，绝迹稀释法操作极 为繁琐、费时。
[0004] 在微生物采油过程中产表面活性剂菌是重要的采油功能菌。产表面活性剂菌普遍 存在于采油菌剂和油藏环境中。在微生物采油过程中，产表面活性剂菌是一群能W原油为 碳源产生生物表面活性剂、使原油分散乳化进而改善原油流动性提高石油采收率的细菌的 统称。因此，在油藏微生物生态分布分析、微生物采油菌剂等实验和现场检测、产品质量监 控过程中，常常需对产表面活性剂菌菌数进行准确测定。目前，国内外普遍采用绝迹稀释法 测定水体中的产表面活性剂菌菌数，测定结果误差较大，并繁琐、费时。因此，传统检测技术 存在明显缺陷，亟待研究开发产表面活性剂菌检测的新方法、新工具。因此，研制用于水体 中产表面活性剂菌菌数的测试瓶具有重要的实际意义。
【发明内容】
[0005] 有鉴于此，本发明提供了一种菌数测试培养液、测试瓶及其制备方法、菌数测试方 法，使所生产的针对产表面活性剂菌的菌数测试瓶能够快速准确地测定水样中的产表面活 性剂菌菌量，可用于油藏微生物生态分布分析和微生物采油等工作领域，具有生长指示明 显、操作简单、提高工作效率的特点。
[0006] 本发明第一方面提供了一种菌数测试培养液，所述培养液组分包括:氯化钢、硝酸 锭、憐酸氨二钟、硫酸儀、酵母膏、水、原油。
[0007] 本发明第二方面提供了一种菌数测试瓶，包括上述菌数测试培养液及瓶体。
[000引本发明第=方面提供了上述菌数测试瓶的制备方法，其步骤包括：
[0009] a、配制培养液：W重量百分比计，氯化钢0.3-0.6 %，硝酸锭0.1-0.3 %，憐酸氨二 钟0.05-0.15%，硫酸儀0.0 l-0.03%，酵母膏0.03-0.07%，余量为水，再滴加原油至水溶液 中，即得培养液；
[0010] b、将培养液加至瓶体中后密封，110-130°C下灭菌10-20min，即得菌数现聯瓶。
[0011] 本发明第四方面提供了采用上述菌数测试培养液的菌数测试方法，其步骤包括： 将待测样品注入到菌数测试培养液内，根据原油分散乳化、振荡后培养液变黑色来判断微 生物存在情况，采用绝迹稀释法计算菌数。
[0012] 本发明的有益效果是：
[0013] 1、本发明所生产的针对产表面活性剂的菌数测试瓶，能够快速准确地测定水样中 的产表面活性剂菌的菌数，根据原油分散乳化情况、培养液颜色变化来判断微生物存在情 况，生长指示明显、操作简单、可大大提高工作效率，方便判断，大大降低测试误差，提高准 确率。
[0014] 2、培养液为产表面活性剂菌专用培养液，只适合产表面活性剂菌生长，所培养出 的微生物只是产表面活性剂菌，测试工作不会受其它微生物的干扰，结果准确、特异性高。
[0015] 3、本发明可准确测定水样中的产表面活性剂菌数，可用于油藏微生物生态分布分 析和微生物采油等工作领域，在油藏水质检测和微生物采油现场检测监控等方面具有广泛 的应用前景。
【具体实施方式】
[0016] 本发明第一方面提供了一种菌数测试培养液，所述培养液组分包括:氯化钢、硝酸 锭、憐酸氨二钟、硫酸儀、酵母膏、水、原油。
[0017] 具体的，W占培养液的重量百分比计，所述氯化钢含量为0.3-0.6%，所述硝酸锭 含量为0.1-0.3%，所述憐酸氨二钟含量为0.05-0.15%，所述硫酸儀含量为0.0 l-0.03%， 所述酵母膏含量为0.03-0.07 %，所述原油含量为0.5-1.5%。培养液的组分及配比为产表 面活性剂菌专用，只适合产表面活性剂菌的生长，所培养出的微生物只是产表面活性剂菌， 有效排除测试工作中其它微生物的干扰，明显提高测试的准确度。
[0018] 更加具体的，所述培养液的pH值为7.2-7.5。
[0019] 上述菌数测试培养液用于测定产表面活性剂的微生物。
[0020] 本发明第二方面提供了一种菌数测试瓶，包括上述菌数测试培养液及瓶体。
[0021] 本发明第=方面提供了上述菌数测试瓶的制备方法，其步骤包括：
[00。] a、配制培养液：W重量百分比计，氯化钢0.3-0.6 %，硝酸锭0.1-0.3 %，憐酸氨二 钟0.05-0.15%，硫酸儀0.0 l-0.03%，酵母膏0.03-0.07%，余量为水，再滴加0.5-1.5 %原 油至水溶液中，即得培养液；
[0023] b、将培养液加至瓶体中后密封，110-130°C下灭菌10-20min，即得菌数测试瓶。
[0024] 具体的，步骤a所述培养液的配制过程中，将氯化钢、硝酸锭、憐酸氨二钟、硫酸儀 和酵母膏依次加入到蒸馈水中，充分溶解，再滴加原油。
[00巧]更加具体的，步骤a所得培养液采用0.5mol/L的化OH或0.5mol/L的HCl调节pH至 7.2-7.5。最佳的pH值有利于产表面活性剂菌的特异性生长。
[0026]本发明第四方面提供了采用上述菌数测试培养液的菌数测试方法，其步骤包括： 将待测样品注入到菌数测试培养液内，根据原油分散乳化、振荡后培养液变黑色来判断微 生物存在情况，采用绝迹稀释法计算菌数。
[0027] W绝迹稀释法为基本原理的产表面活性剂菌的菌数测试方法，在充分吸收绝迹稀 释法优点的基础上，操作极为简单，生长指示明显，结果准确可靠，操作不需专业人员即可 掌握，从而大大地改善了微生物的测定方法。
[0028] 下面将结合具体实施例对本发明提供的一种菌数测试瓶及其制备方法、菌数测试 方法予W进一步说明。
[0029] 实施例一
[0030] 在常溫下m配制IL培养液为例，W此类推），分别称取氯化钢5. Og、硝酸锭2. Og、 憐酸氨二钟l.Og、硫酸儀〇.2g和酵母膏0.5g，依次用蒸馈水溶解，并加入到IL容量瓶中混 合，测定其酸碱度，并用0.5mol/L的氨氧化钢或0.5mol/L的盐酸调节其pH值到7.2-7.5，再 用蒸馈水定容到IL刻度线，充分摇匀，即配制成制取产表面活性剂菌测试瓶所需的培养液；
[0031] 将12ml模制西林瓶清洗干净、干燥，用液体分装器将所配制的培养液按每瓶9.Oml 装入瓶中，并滴加原油10滴，使原油含量为0.5-1.5%，用A-13型药用胶塞加盖、用普通抗生 素玻璃瓶侣盖经专用封口器封口，最后将经加盖封口的测试瓶用高溫蒸汽灭菌锅在i2rc 条件下进行高溫灭菌15分钟，冷却后即制成产表面活性剂菌测试瓶。
[0032] 采用产表面活性剂菌测试瓶测定待测水样中的产表面活性剂菌的菌数时，采用绝 迹稀释法原理，将待测水样用无菌注射器逐级注入到测试瓶中稀释培养，直到最后一个测 试瓶无菌生长为止，可根据稀释的倍数计算出待测水样中产表面活性剂菌的菌数。
[0033] 实际测定操作可采用W下的方法和步骤：
[0034] (1)准备数支相同的Iml医用注射器，用蒸馈水清洗干净后高溫灭菌（高溫蒸汽灭 菌锅12rC、0.105MPa下灭菌15分钟），冷却备用；
[0035] (2)根据待测水样中产表面活性剂菌的大致多少，将数个相同的上述所制的产表 面活性剂菌测试瓶排成一组，并依次编上序号1、2、3、4……；
[0036] (3)用上述灭菌后的无菌注射器取1.OmL待测水样并注入到1号产表面活性剂菌测 试瓶内，充分震荡10秒；
[0037] (4)另取一支无菌注射器从摇匀后的1号产表面活性剂菌测试瓶内取出1.OmL液体 注入到2号产表面活性剂菌测试瓶内，充分震荡10秒；
[0038] (5)再另取一支无菌注射器从摇匀后的2号产表面活性剂菌测试瓶内取出1.OmL液 体注入到3号产表面活性剂菌测试瓶内，充分震荡10秒；
[0039] (6)依次重复上述操作程序，一直到最后一瓶为止；
[0040] (7)把上述加入待测水样后的一组产表面活性剂菌测试瓶放在30°C或现场溫度的 培养箱内培养，经过7天培养后观察测试瓶内的变化，判断产表面活性剂菌的生长情况；
[0041] (8)判断标准:在经过7天培养后的产表面活性剂菌测试瓶中，无产表面活性剂菌 存在的产表面活性剂菌测试瓶内的培养液无明显变化，而有产表面活性剂菌存在的产表面 活性剂菌测试瓶内的培养液中原油分散乳化、摇动后培养液变黑；因此，产表面活性剂菌测 试瓶中的原油分散乳化、摇动后培养液变黑，表示有产表面活性剂菌生长；
[0042] (9)根据产表面活性剂菌测试瓶内指示细菌生长的情况和有菌生长的测试瓶的瓶 数，查表1可计算出待测水样中的产表面活性剂菌菌数。
[0043] 表1单瓶产表面活性剂菌最大可能值
[0044]
[0045] 若要更准确地测定细菌数量，可采取二、=、四、五次平行瓶测定方法，按生长指数 查表(分别查二、=、四、五次重复测数统计表)即可得到准确细菌数量。
[0046] 运些重复测数统计表可在许多文献中查到，如石油天然气行业标准SY/T0532-93 《油田注入水细菌分析方法-绝迹稀释法》的附录A;国家标准GB/T14643.5-93《工业循环冷 却水中硫酸盐还原菌的测定》的附录A，B，C;中国环境科学出版社1990年出版的俞銃馨等主 编《环境工程微生物检验手册》第140-142页。
[0047] 本测试方法采用二次平行瓶测定方法，表2列出了二次重复测数统计表。
[0048] 表2二个平行瓶的细菌最大可能值
[0049]
[0050] 实施例二
[0051] 实施例二与实施例一基本相同，区别在于，菌数测试瓶的制备过程如下：
[0052] 在常溫下m配制IL培养液为例，W此类推），分别称取氯化钢3. Og、硝酸锭3. Og、 憐酸氨二钟1.5g、硫酸儀0.3g和酵母膏0.7g，依次用蒸馈水溶解，并加入到IL容量瓶中混 合，测定其酸碱度，并用0.5111〇1/1的氨氧化钢或0.5111〇1/1的盐酸调节其抑值到7.5，再用蒸 馈水定容到IL刻度线，充分摇匀，即配制成制取产表面活性剂菌测试瓶所需的培养液；
[0053] 将12ml模制西林瓶清洗干净、干燥，用液体分装器将所配制的培养液按每瓶9.Oml 装入瓶中，并滴加原油10滴，使原油含量为0.5-1.5%，用A-13型药用胶塞加盖、用普通抗生 素玻璃瓶侣盖经专用封口器封口，最后将经加盖封口的测试瓶用高溫蒸汽灭菌锅在115°C 条件下进行高溫灭菌20分钟，冷却后即制成产表面活性剂菌测试瓶。
[0054] 实施例S
[0055]实施例S与实施例一基本相同，区别在于，菌数测试瓶的制备过程如下：
[0056] 在常溫下（W配制IL培养液为例，W此类推），分别称取氯化钢6.Og、硝酸锭I.Og、 憐酸氨二钟〇.5g、硫酸儀0.1 g和酵母膏0.3g，依次用蒸馈水溶解，并加入到IL容量瓶中混 合，测定其酸碱度，并用0.5111〇1/1的氨氧化钢或0.5111〇1/1的盐酸调节其抑值到7.2，再用蒸 馈水定容到IL刻度线，充分摇匀，即配制成制取产表面活性剂菌测试瓶所需的培养液；
[0057] 将12ml模制西林瓶清洗干净、干燥，用液体分装器将所配制的培养液按每瓶9.Oml 装入瓶中，并滴加原油10滴，使原油含量为0.5-1.5%，用A-13型药用胶塞加盖、用普通抗生 素玻璃瓶侣盖经专用封口器封口，最后将经加盖封口的测试瓶用高溫蒸汽灭菌锅在130°C 条件下进行高溫灭菌10分钟，冷却后即制成产表面活性剂菌测试瓶。
[0058] W上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用W限制本发明，凡在本发明的精神和 原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种菌数测试培养液，其特征在于:所述培养液组分包括:氯化钠、硝酸铵、磷酸氢二 钾、硫酸镁、酵母膏、水、原油。2. 如权利要求1所述的菌数测试培养液，其特征在于：以占培养液的重量百分比计，所 述氯化钠含量为〇 . 3-0.6 %，所述硝酸铵含量为0.1-0.3 %，所述磷酸氢二钾含量为0 . Οδ-Ο. 15 % ， 所述硫酸镁含量为 0.01-0.03 % ， 所述酵母膏含量为 0.03-0.07 % ， 所述原油含量为 0.5-1.5%。3. 如权利要求2所述的菌数测试培养液，其特征在于:所述培养液的pH值为7.2-7.5。4. 如权利要求1所述的菌数测试培养液，其特征在于:所述菌数测试培养液用于测定产 表面活性剂的微生物。5. -种菌数测试瓶，其特征在于:包括如权利要求1所述的菌数测试培养液及瓶体。6. 如权利要求5所述菌数测试瓶的制备方法，其步骤包括： a、 配制培养液：以重量百分比计，氯化钠0.3-0.6%，硝酸铵0.1-0.3 %，磷酸氢二钾 0.05-0.15 %，硫酸镁0.01-0.03 %，酵母膏0.03-0.07 %，余量为水，再滴加0.5-1.5 %原油 至水溶液中，即得培养液； b、 将培养液加至瓶体中后密封，110-130 °C下灭菌10_20min，即得菌数测试瓶。7. 如权利要求6所述菌数测试瓶的制备方法，其特征在于：步骤a所述培养液的配制过 程中，将氯化钠、硝酸铵、磷酸氢二钾、硫酸镁和酵母膏依次加入到蒸馏水中，充分溶解，再 滴加原油。8. 如权利要求6所述菌数测试瓶的制备方法，其特征在于：步骤a所得培养液采用 0 · 5mol/L 的 NaOH或 0 · 5mol/L 的 HC1 调节 pH至 7 · 2-7 · 5。9. 一种采用权利要求1所述的菌数测试培养液的菌数测试方法，其步骤包括:将待测样 品注入到菌数测试培养液内，根据原油分散乳化、振荡后培养液变黑色来判断微生物存在 情况，采用绝迹稀释法计算菌数。
【专利摘要】本发明提供了一种菌数测试培养液，组分包括：氯化钠、硝酸铵、磷酸氢二钾、硫酸镁、酵母膏、水、原油。并进一步提供了菌数测试瓶及其制备方法，以及采用该菌数测试瓶的菌数测试方法。本发明能够快速准确地测定样品中的产表面活性剂菌的菌数，生长指示明显、操作简单、可大大提高工作效率，方便判断，大大降低测试误差，提高准确率。且本发明采用的培养液为产表面活性剂菌专用，测试工作不会受其它微生物的干扰，结果准确、特异性高，适用于油藏微生物生态分布分析和微生物采油等工作领域，在油藏水质检测和微生物采油现场检测监控等方面具有广泛的应用前景。
【IPC分类】C12Q1/06, C12M1/24, C12Q1/04, C12M1/34
【公开号】CN105713954
【申请号】CN201610152384
【发明人】易绍金
【申请人】长江大学