一种琼脂糖交联凝胶微球的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于高分子领域，具体为一种琼脂糖交联凝胶微球的制备方法。
【背景技术】
[0002]琼脂糖Agarose，缩写为AG，是琼脂中不带电荷的中性组成成份，也译为琼胶素或琼胶糖。琼脂作为一种独特的食品在我国已经有悠久的历史。它是从大型海洋藻类石花菜、紫菜、江篱等提取分离制成的。琼脂糖在加热时可以形成均匀的溶液，为单独的多糖大分子链，当温度降低时在氢键的作用下先形成平行的双螺旋结构，双螺旋聚集形成结构有序的胶束，胶束之间形成五角形的孔。琼脂糖形成凝胶时的空间网状结构，孔径分布适中，因此琼脂糖凝胶微球可以作为凝胶筛分的介质使用，是经典的生物的分子分离材料。该琼脂糖凝胶微球具有亲水性、多孔性、电中性和易衍生性等其它生物材料不可比拟的优点而广泛应用于各种生物活性大分子的分离和纯化。
[0003]因此，琼脂糖凝胶微球的制备方法非常多，主要有超声、机械搅拌、均质乳化等乳化冷凝法和喷射冷凝法。但是，制备出的珠体应用时压力降大，层析柱的反压较高，不利于柱式操作以至于限制了其应用。随着交联技术的进步，通过对琼脂糖微球的化学改性，一定程度上提高了凝胶的机械稳定性和通透性。有关琼脂糖微球的交联方法很多，都是在制备出的凝胶微球上进行交联。
[0004]本发明采用一步法制备交联微球，既可以制备出表面光滑、机械强度好的交联微球又节约成本。
【发明内容】
[0005]鉴于上述问题，本专利的目的是提供一种机械性能好、耐热、耐压性强并且粒度均一的微球；以琼脂糖溶液为水相，甲苯为油相，采用环氧氯丙烷对琼脂糖微球的形成过程进行交联，制备机械性能较好的琼脂糖凝胶微球。另一个目的是提供一种方便简洁的交联琼脂糖凝胶微球的制备方法。
[0006]为了实现上述目的，本申请所采取的技术方案如下:
[0007]—种琼脂糖交联凝胶微球的方法，具体步骤如下:
[0008]I)悬浮液制备
[0009]将质量浓度为3-8%的琼脂糖水溶液作为水相，倒入油相70°C的甲苯中，从而制备出悬浮液;所述的琼脂糖水溶液中添加有KCl，且KCl的质量是琼脂糖质量的1.5-3.5 % ;所述的甲苯中含有的聚醋酸乙烯酯和油酸，且其质量分别为甲苯质量的1.5-3%和0.1-1%;所述的油相与水相的体积比为6-8:1;
[00?0] 2)分散乳化
[0011 ]将步骤I)所得的悬浮液，维持在70°C条件下，搅拌0.5-2h ；
[0012]3)交联反应
[0013]在步骤2)处理后的溶液中加入环氧氯丙烷，并滴加质量浓度为50%的NaOH溶液，且在Ih内滴加完毕;保持温度在70°C下，反应3h;所述的环氧氯丙烷与琼脂糖的质量比为3:1;所述的NaOH溶液的体积与环氧氯丙烷的体积相同；
[0014]4)固化
[0015]将步骤3)交联反应后得到的产品，进行冷凝，控制冷却速度2°C/min至温度冷却至10°C以下;多次清洗后制备出粒径为100-300目的琼脂糖凝胶微球。
[0016]优选的，KC1的质量是琼脂糖质量的1.5-2.5%;
[0017]琼脂糖干粉末在水中需要高温条件下加热足够长的时间才能够充分溶解。同时加热时间的增加会导致琼脂糖链段逐渐发生水解，分子量逐渐降低，表现出的理化性质是粘度的下降。较低的粘度有利于更好的在有机相中形成颗粒更加均匀的琼脂微球。但是琼脂溶液的粘度变低也表明琼脂糖的高分子链条被水解成了低分子链，不只会使球形度受到影响，还会影响微球的机械强度和分离性质。
[0018]为了既保证溶液的低粘度来提高微球的均匀性，又不至于使制备的微球机械强度变低，本申请通过在琼脂糖水溶液中加入KCl来加快其溶解，减少其水解。KCl离子降低琼脂糖电荷分子的电荷及水化作用，释放自由水，所以琼脂糖粘度下降，利于其在有机相中形成颗粒更加均匀的琼脂微球。制备出的微球在后期水洗过程中，KCl被水洗掉，离子对琼脂糖电荷分子的电荷及水化作用消失，链段没有被水解，粘度增加，分子间作用力强，机械强度好。KCl量太少(低于1.5 % )，难以保证琼脂糖溶液迅速溶解;KCl量太多(高于2.5 % )，盐离子本身水化作用也增强，并增加了网状结构，故粘度增加。
[0019]优选的，所述的油相与水相的体积比为6-7:1;
[0020]油水比是树脂行业一个比较重要的概念，油水相的比例小，制备的微球较大或者粘连，不符合制备要求;在本产品中油水比高利于得到粒径更小的球体，同时也会降低批产量，使生产效率降低;更小的油水比，相同的油相投的料更多，但不利于成球，在生产中微球容易发生粒度分布不均匀，球型差，表面不光滑甚至球体粘连，严重影响到微球的机械强度。通过实验得到最佳的油水比为6-7:1。
[0021 ]优选的，聚醋酸乙烯酯加入量为甲苯质量的1.8-2.5%;
[0022]聚醋酸乙烯酯(PVAc)是一种分散剂，它通过降低表面张力，使琼脂糖凝胶分散在甲苯之中，并且在琼脂糖液滴的表面形成胶体，使分散后好的琼脂糖液滴不会因为碰撞而聚积到一块。当PVAc浓度为不足时，分散体系稳定会造成微球的粒径分布很宽，这时球形度也差，形状不规则，微球粘连比较严重，严重影响到微球的机械强度。反之当分散剂浓度过大，所得的微球粒径过小。过多的分散剂会产生再分散现象，并且产生气泡，严重影响微球均匀性和机械强度。综合考虑所用影响因素，选择聚醋酸乙烯酯的浓度范围为1.8-2.5%。
[0023]优选的，油酸加入量与聚醋酸乙烯酯加入量质量比为1:10。
[0024]由于聚醋酸乙烯酯是一种高分子化合物，在甲苯中的溶解度有限，单用它还不足以得到合格的微球，油酸在甲苯中溶解性好，并且由于分子中同时具有亲油的烷基和亲水的羧基，可以对琼脂糖液滴起到很好的保护作用。由于油酸更强的乳化作用，随着加入量的增加，微球的粒径在不断地减小，并且乳化作用强使微球表面产生剥离导致表面不光滑，直接影响球的机械性能。油酸的量少，分散效果差，同样影响微球的机械强度。通过实验得到二者的最佳比例为1:10。
[0025]—是琼脂糖水溶液的预处理。由于琼脂糖为生物大分子，其分子构象受环境的影响。将琼脂糖在水中室温溶胀足够的时间。关键技术之二是KCl量的选择。琼脂糖水溶液中KCl的质量为琼脂糖质量的1.5-3.5%。关键技术之三是环氧氯丙烷的加入量，是琼脂糖固体质量三倍，环氧氯丙烷量加入太多，影响有机相环境，不利于琼脂糖的成球;环氧氯丙烷量加入太少，对琼脂糖的交联量太少，影响成球后的机械性能。关键技术之四是50 %的NaOH溶液加入量及加入方式，加入量太大会破坏琼脂糖结构导致球的耐压性能越差;加入量太少的化不利于环氧氯丙烷的交联;加入不及时反应效率低，一次性加入过多，环氧开环。
[0026]制球和交联一步进行，并且通过实验关键影响因素的控制制备粒度均匀机械性能好的微球，简化了其制备工艺，节约成本。
[0027]琼脂糖的制备方法为悬浮搅拌法，将琼脂糖凝胶溶液倒入有机相后，进行搅拌乳化，在体系中形成小液滴，加入环氧氯丙烷并间断的加入NaOH溶液作为催化剂催化交联反应，促使成球和交联同时进行。
[0028]水相倒入油相，在机械搅拌和表面活性剂的双重作用下，水相在油相中被分散成小液滴。碱性环境下，琼脂糖的-OH与有机相中扩散到液滴内的环氧氯丙烷发生交联反应(反应方程式如下)，在浓度差的作用下使交联继续进行，直至达到化学平衡，随着反应的进行水相体系的粘度增加，最后完全变成固化;同时PVAc降低了甲苯-琼脂糖水溶液间的界面张力，并吸附于液滴表面，形成保护膜，防止滴间合并;搅拌反应足够长，则液滴的破碎-合并以及PVAc和油酸在液滴表面的吸附和解吸达到平衡，液滴粒径分布不再变化。此时交联反应主要发生在微球表面，这样制备的微球存在内部交联和外层交联，机械强度更好。
[0029]传统的交联微球的制备为两步法:第一，制备出没有交联的琼脂糖基球;第二，将制备出的成品凝胶微球加入环氧氯丙烷进行交联反应;该方法下的交联反应环氧氯丙烷只能在球的表面进行交联，目前常见微球琼脂糖的浓度为4%、6%、8%、12%，剩下的为水。环氧氯丙烷与水不互溶，因此交联反应只能停留在球表面。
[0030]本申请中交联微球的制备方法边成球边交联，在成球中琼脂糖在不停地碰撞和分配过程中琼脂糖相与有机相中的环氧氯丙烷发生交联，轻微交联的水相琼脂糖可能又与下一个水相液滴相溶，交联继续进行，在这个过程中凝胶微球交联在表面逐渐稳定，这样制备的微球存在内部交联，机械强度更好。
[0031]球均匀度与表面活性剂聚醋酸乙烯酯(PVAc)和油酸有关，PVAc降低了甲苯-琼脂糖水溶液间的界面张力，并吸附于液滴表面，形成保护膜，防止了滴间合并。分散时间足够长，则液滴的破碎-合并以及PVAc和油酸在液滴表面的吸附和解吸达到平衡，液滴粒径分布不再变化。本专利经过多次优化和验证，探索出琼脂糖凝胶微球均匀的表面活性剂比例。
[0032]本发明制备的交联琼脂糖凝胶介质同其他的层析介质相比，其明显的优点是，原料便宜，制备过程简便经济，设备简单;一步法制备的琼脂糖凝胶微球较两步制备的微球机械强度更好，球大小更均匀，且不影响其后期的微球表面接枝。
【附图说明】
[0033]图1为光学显微镜下本申请的实施例1制备的4B交联琼脂糖介质的照片(放大倍数为40)；
[0034]图2为光学显微镜下GE4FF琼脂糖介质的照片(放大倍数为40);
[0035]图3为光学显微镜下本申请的实施例1制备的4B交联琼脂糖介质的照片(放大倍数为 100);
[0036]图4为光学显微镜下GE4FF琼脂糖介质的照片(放大倍数为100);
[0037]图5为实施例1制备的交联琼脂糖凝胶介质和Sephar0Se4FF流速和压力的关系曲线；
【具体实施方式】
[0038]下面的实例将对本发明提供的方法予以进一步的说明。
[0039]实施例1
[0040]取7.5g琼脂糖于250mL水中(琼脂糖水溶液浓度为3%)，常温搅拌lh，加入
0.12gKCl继续搅拌0.5h后，加热至琼脂糖沸腾，溶液呈现透明状。准备1.5L甲苯溶液，加入23.49g聚醋酸乙烯酯和2.349g油酸。将有机相于70°C下恒温搅拌至混合均匀，将沸腾的琼脂糖水溶液倒入有机相中，一定搅拌下琼脂糖的分散乳化lh。一次性加入22.5g环氧氯丙烷，分次滴加20mL50 %的NaOH溶液，Ih内滴加完毕。一定搅拌下固化3h后再进行冷凝，控制冷却速度2°C/min至温度冷却至10°C以下。多次清洗后制备出粒径为100-300目的琼脂糖凝胶微球。
[0041 ] 实施例2
[0042]取1g琼脂糖于250mL水中(琼脂糖水溶液浓度为4%)，常温搅拌lh，加入0.2gKCl继续搅拌0.5h后，加热至琼脂糖沸腾，溶液呈现透明状。准备1.75L甲苯溶液，加入30.45g聚醋酸乙烯酯和3.045g油酸。将有机相于70°C下恒温搅拌至混合均匀，将沸腾的琼脂糖水溶液倒入有机相中，一定搅拌下琼脂糖的分散乳化lh。一次性加入30g环氧氯丙烷，分次滴加25mL50 %的NaOH溶液，Ih内滴加完毕。一定搅拌下固化3h后再进行冷凝，控制冷却速度2 °C/min至温度冷却至10°C以下。多次清洗后制备出粒径为100-300目的琼脂糖凝胶微球。
[0043]实施例3
[0044]取15g琼脂糖于250mL水中(琼脂糖水溶液浓度为6%)，常温搅拌lh，加入
0.375gKCl继续搅拌0.5h后，加热至琼脂糖沸腾，溶液呈现透明状。准备1.625L甲苯溶液，加入35.3g聚醋酸乙烯酯和3.53g油酸。将有机相于70°C下恒温搅拌至混合均匀，将沸腾的琼脂糖水溶液倒入有机相中，一定搅拌下琼脂糖的分散乳化lh。一次性加入45g环氧氯丙烷，分次滴加38mL50 %的NaOH溶液，Ih内滴加完毕。一定搅拌下固化3h后再进行冷凝，控制冷却速度2°C/min至温度冷却至10°C以下。多次清洗后制备出粒径为100-300目的琼脂糖凝胶微球。
[0045]实施例4
[0046]取20g琼脂糖于250mL水中(琼脂糖水溶液浓度为8% )，常温搅拌lh，加入0.36gKCl继续搅拌0.5h后，加热至琼脂糖沸腾，溶液呈现透明状。准备1.7L甲苯溶液，加入32.5g聚醋酸乙烯酯和3.25g油酸。将有机相于70°C下恒温搅拌至混合均匀，将沸腾的琼脂糖水溶液倒入有机相中，一定搅拌下琼脂糖的分散乳化lh。一次性加入60g环氧氯丙烷，分次滴加50mL50 %的NaOH溶液，Ih内滴加完毕。一定搅拌下固化3h后再进行冷凝，控制冷却速度2 °C/min至温度冷却至10°C以下。多次清洗后制备出粒径为100-300目的琼脂糖凝胶微球。性能测试
[0047]I，图1和图3是本申请的实施例1制备的4B交联琼脂糖介质分别放大40和100倍数的图片；图2和图4是GE4FF介质分别放大40和100倍数的图片；相同放大倍数下图1和图2对比，图3和图4对比，图1和图3的样相对比较均匀。(通过对比图可以看出用该方法得到的琼脂糖凝胶更均匀，从而具有更好的使用性能。)
[0048]2，采用层析系统测定，取交联凝胶装于1.6cm*20cm的柱中。柱床稳定后，通过逐步间隔式增大流速，观察压力的变化。记录流速稳定时所呈现的恒定压力值，绘制耐压-流速曲线。如图5所示。图5反映了本专利下制备的琼脂糖的交联凝胶微球的机械强度可以达到GE4FF的水平。
【主权项】
1.一种琼脂糖交联凝胶微球的方法，其特征在于，具体步骤如下: 1)悬浮液制备 将质量浓度为3-8%的琼脂糖水溶液作为水相，倒入油相70°C的甲苯中，从而制备出悬浮液;所述的琼脂糖水溶液中添加有KCl，且KCl的质量是琼脂糖质量的1.5-3.5% ;所述的甲苯中含有的聚醋酸乙烯酯和油酸，且其质量分别为甲苯质量的1.5-3%和0.1-1%;所述的油相与水相的体积比为6-8:1; 2)分散乳化 将步骤I)所得的悬浮液，维持在70 °C条件下，搅拌0.5-2h; 3)交联反应 在步骤2)处理后的溶液中加入环氧氯丙烷，并滴加质量浓度为50%的NaOH溶液，且在Ih内滴加完毕;保持温度在70°C下，反应3h;所述的环氧氯丙烷与琼脂糖的质量比为3:1;所述的NaOH溶液的体积与环氧氯丙烷的体积相同； 4)固化 将步骤3)交联反应后得到的产品，进行冷凝，控制冷却速度2°C/min至温度冷却至10°C以下;多次清洗后制备出粒径为100-300目的琼脂糖凝胶微球。2.如权利要求1所述的琼脂糖交联凝胶微球的方法，其特征在于，所述的KCl的质量是琼脂糖质量的1.5-2.5%。3.如权利要求1所述的琼脂糖交联凝胶微球的方法，其特征在于，所述的油相与水相的体积比为6-7:1。4.如权利要求1所述的琼脂糖交联凝胶微球的方法，其特征在于，所述的聚醋酸乙烯酯加入量为甲苯质量的1.8-2.5%。5.如权利要求1所述的琼脂糖交联凝胶微球的方法，其特征在于，所述的油酸加入量与聚醋酸乙烯酯加入量质量比为1:10。
【专利摘要】本发明属于高分子领域，具体为一种琼脂糖交联凝胶微球的制备方法。本申请提供了一种机械性能好、耐热、耐压性强并且粒度均一的微球；以琼脂糖溶液为水相，甲苯为油相，采用环氧氯丙烷对琼脂糖微球的形成过程进行交联，制备机械性能较好的琼脂糖凝胶微球。另一个目的是提供一种方便简洁的交联琼脂糖凝胶微球的制备方法。
【IPC分类】C08J3/24, C08J3/16, C08K5/1515, C08L31/04, C08L5/12, C08K3/16, C08K5/09
【公开号】CN105713212
【申请号】CN201610168364
【发明人】刘书霞, 罗文军, 王玲, 杨申勇
【申请人】艾美科健（中国）生物医药有限公司