水稻GW5基因在培育粒型改变的转基因植物中的应用的制作方法

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种水稻gw5基因在培育粒型改变的转基因植物中的应用。

背景技术：

水稻是重要的粮食作物，世界上一半以上的人口以稻米为主食。随着耕地的减少、人口的增多以及气候的变化，提高水稻的产量对解决未来全球的粮食安全问题具有十分重要的战略意义。谷粒重量是决定水稻产量的重要性状，提高籽粒重量是一条有效的增产途径，籽粒重量主要受粒型影响，同时，粒型对水稻的市场价值也有重要影响，不同地域人群对粒型的偏好不同。目前，对粒型基因的分子调控机制及遗传调控网络的研究非常有限。故解析水稻粒型相关基因的遗传调控机理，对水稻分子设计育种技术体系的建立有重要意义。

技术实现要素：

本发明的一个目的是提供如下1)-3)中任一种物质的新用途。

本发明提供了如下1)-3)中任一种物质在调控植物粒型中的应用：

1)蛋白gw5；

2)编码蛋白gw5的dna分子；

3)含有编码蛋白gw5的dna分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌；

所述蛋白gw5为如下(1)或(2)：

(1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(2)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由(1)衍生的蛋白质。

上述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

本发明另一个目的是提供如下1)-3)中任一种物质的用途。

本发明提供的如下1)-3)中任一种物质在培育粒型改变植物中的应用：

1)蛋白gw5；

2)编码蛋白gw5的dna分子；

3)含有编码蛋白gw5的dna分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌；

所述蛋白gw5为如下(1)或(2)：

(1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(2)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由(1)衍生的蛋白质。

上述应用中，所述编码蛋白gw5的dna分子是如下1)至5)中任一所述的dna分子：

1)序列表中序列1所示的dna分子；

2)序列表中序列1第17-1426位核苷酸；

3)序列表中序列3所示的dna分子；

4)在严格条件下与1)或2)或3)所限定的dna分子杂交且编码由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的dna分子；

5)与1)或2)或3)所限定的dna分子至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且编码由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的dna分子。

上述严格条件可为在6×ssc，0.5％sds的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×ssc，0.1％sds和1×ssc，0.1％sds各洗膜一次。

上述应用中，所述调控植物粒型或所述粒型改变均为降低籽粒粒宽、降低籽粒粒厚、降低籽粒千粒重、降低颖壳细胞数目和/或增加籽粒粒长。

上述应用中，所述植物为单子叶植物或双子叶植物；

所述单子叶植物具体为水稻。

本发明第三个目的是提供一种培育粒型改变的转基因植物的方法。

本发明提供的方法，为将编码蛋白gw5的dna分子导入目的植物中，得到转基因植物；

所述转基因植物籽粒的粒宽、粒厚、千粒重和/或颖壳细胞数目均低于所述目的植物；

和/或，所述转基因植物籽粒的粒长高于所述目的植物；

所述蛋白gw5为如下(1)或(2)：

(1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(2)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由(1)衍生的蛋白质。

上述方法中，所述编码蛋白gw5的dna分子是如下1)至5)中任一所述的dna分子：

1)序列表中序列1所示的dna分子；

2)序列表中序列1第17-1426位核苷酸；

3)序列表中序列3所示的dna分子；

4)在严格条件下与1)或2)或3)所限定的dna分子杂交且编码由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的dna分子；

5)与1)或2)或3)所限定的dna分子至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且编码由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的dna分子。

上述方法中，所述编码蛋白gw5的dna分子通过重组载体导入所述目的植物中。

上述方法中，所述植物为单子叶植物或双子叶植物；

所述单子叶植物具体为水稻。

本发明第四个目的是提供一种重组载体。

本发明提供的重组载体，为将编码蛋白gw5的dna分子插入表达载体中，得到表达蛋白gw5的重组载体；

所述蛋白gw5为如下(1)或(2)：

(1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(2)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由(1)衍生的蛋白质。

在本发明中，重组载体为在pcambia1390载体bamhⅰ酶切位点间插入序列表中序列1所示的gw5基因得到的载体。

本发明的实验证明，本发明将gw5基因转入野生型水稻中，得到转基因水稻，其余野生型水稻相比，gw5基因过量表达，水稻的粒宽和粒重显著减少，粒长显著增加，叶片变细变长，叶夹角增大，另外细胞学观察表明gw5基因过量表达使水稻的颖壳横向细胞分裂显著增加。因此gw5基因与粒型相关，为提高粒型改变的转基因植物培育奠定基础。

本发明对于进一步阐明植物籽粒发育分子机理并通过基因工程手段培育优质、高产的作物新品种具有重要的理论意义和现实意义。

附图说明

图1为pcambia1390载体图谱。

图2为野生型水稻nipponbare与gw5基因过量表达水稻的表型。

图3为野生型水稻nipponbare与gw5基因过量表达水稻的粒长、粒宽、粒厚以及千粒重统计数据。

图4为野生型水稻nipponbare与gw5基因过量表达水稻的表达检测。

图5为野生型水稻nipponbare和gw5基因过量表达水稻水稻的颖壳横向细胞增 殖情况。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

n6培养基购自美国phytotechnologylaboratories，货号为c167。

水稻品种nipponbare(oryzasativa)和水稻品种kasalath(oryzasativa)在文献“liz,wanj,xiaj,etal.mappingofquantitativetraitlocicontrollingphysico-chemicalpropertiesofricegrains(oryzasatival.).breedingscience,2003,53(3):209-215”中公开过，公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得。

根癌农杆菌eha105(agrobacteriumtumefacienseha105)在文献“hood,elizabethe；gelvin,stantonb；melchers,leos；hoekema,andre.1993.newagrobacteriumhelperplasmidsforgenetransfertoplants.transgenicresearch，2(4):p.208-218-218”中公开过，公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得。

pcambia1390载体为商业化载体，公众可通过商业渠道购买到，也可从中国农业科学院作物科学研究所获得。

实施例1、gw5基因在培育粒型改变的转基因植物中的应用

一、过表达载体pcambia1390-gw5的构建

1、gw5基因的获得

提取野生型kasalath的总rna并反转录为cdna，以其cdna为模板，以gw5-cds-f和gw5-cds-r为引物进行pcr扩增，得到1442bp的gw5基因(具有序列1所示的核苷酸,序列1第17-1426位核苷酸为gw5基因的开放阅读框序列,序列1第1-16及第1427-1442位核苷酸为连载体用载体接头序列)。

gw5基因的基因组序列为序列3，gw5基因的cdna为序列1，其编码蛋白gw5，蛋白gw5的氨基酸序列为序列表中序列2。

引物如下：

gw5-cds-f:5’-gcaggtcgacggatccatgggcaaggcggcgcggtggtt-3’(下划线序列为载体接头序列)

gw5-cds-r:5’-gaattcccggggatcctcaccacctcctctgcaagaacgcgtg-3’(下划线序列为载体接头序列)

2、gw5过表达载体的构建

用限制性内切酶bamhⅰ酶切pcambia1390载体，回收约12060bp的线性质粒，得到载体大片段，pcambia1390载体环状载体图谱如图1所示。利用clontech公司的in-fusion酶(www.clontech.com，货号：st0344)将12060bp的线性质粒与上述1 获得的gw5基因in-fusion连接，得到重组质粒，记作pcambia1390–gw5。(片段通过两端所加载体接头序列同源重组进载体)

pcambia1390–gw5送去测序，重组质粒pcambia1390–gw5为在pcambia1390载体bamhⅰ酶切位点间插入序列表中序列1第17-1426位所示的gw5基因得到的载体。

二、转gw5水稻的获得

1、重组菌的构建

将重组质粒pcambia1390–gw5导入根癌农杆菌eha105，得到重组农杆菌eha105/pcambia1390–gw5。

2、gw5基因过量表达转gw5水稻获得

将eha105/pcambia1390–gw5转入水稻nipponbare(oryzasativa)(以下简称野生型水稻)胚的愈伤组织中，具体步骤如下：

(一)用含50μmol/l卡那霉素的液体lb培养基悬浮重组农杆菌eha105/pcambia1390–gw5，得到od600nm≈0.5的菌悬液。

(二)取野生型水稻的成熟胚愈伤组织与步骤(一)得到的菌悬液混合，侵染30min，用滤纸吸干菌液后将愈伤组织放置于共培养培养基(含0.03924mg/l乙酰丁香酮的固体n6培养基)上，24℃培养3天。

(三)将步骤(二)得到的愈伤接种至含150mg/lg418的固体n6培养基上，24℃培养16天。

(四)取步骤(三)得到的健康愈伤组织，接种至含200mg/lg418的固体n6培养基上，24℃培养，每15天继代一次。

(五)取步骤(四)得到的健康愈伤组织，接种至分化培养基(含150mg/lg418、2mg/l激动素、0.05mg/l萘乙酸的固体n6培养基)上，24℃培养45天(此时植株地上部分高度约为15cm)，打开瓶口炼苗3天，然后移栽至温室栽培，即为t0代植株。

(六)将t0代植株自交，收获种子并培育为植株，即为t1代植株。

3、转gw5水稻的pcr鉴定

分别提取t0代转gw5水稻植株和t1代转gw5水稻植株的基因组dna作为模板，以1390-f和gw5-r为引物进行pcr扩增。

引物如下：

1390-f：5'-tgccttcatacgctatttatttgc-3'；

gw5-r：5'-gccgcacacgctcttggtc-3'。

1390-f对应于图1载体上的10707-10730bp,gw5-r引物对应于序列1中的第1059-1078bp,如果pcr扩增出大小约为1284bp的条带，则说明为植株为阳性转基因植株。

对于某一t0代植株，如果该植株及其t1代植株pcr鉴定均为阳性，该植株为纯合的gw5基因过量表达植株，该植株及其自交后代为一个gw5基因过量表达株系，共得到18个t0代转gw5水稻。

4、植株的mrna表达量的检测

为了验证转基因后代的gw5基因表达程度，利用实时定量pcr来检测野生型水稻、及t0代转gw5水稻体内gw5基因的表达情况。实时定量pcr在定量pcr仪(7900real-time，appliedbiosystems)上按照appliedbiosystems提供的操作步骤进行，以水稻ubiqutin基因作为反应中的内参。引物在60℃退火，反应40个循环，每个样品设置三个重复。反应体系为25μl，其中包括2μl反转录产物、0.25μm的正反向引物和12.5μlsybrgreen混合物(购自takara)。

实时定量pcr鉴定所使用的引物如下：

qrt-f：5'-tcctctgcaagaacgcgtggc-3'；

qrt-r：5'-gcttgagcggcgtgggcat-3'。

部分结果如图4所示，与野生型水稻相比，t0代转gw5水稻株系go-1、go-2和go-3中的gw5基因表达量显著提高。

采用同样的方法将pcambia1390载体导入野生型水稻，得到t2代转空载体水稻。

t0代植株自交，收获种子并培育为植株，即为t1代植株。

t1代植株自交，收获种子并培育为植株，即为t2代植株。

三、转gw5水稻的表型以及农艺性状的统计

1、表型观察

将t2代转gw5水稻和野生型水稻在抽穗灌浆后，对水稻的株型和粒型进行性状考察和拍照。

结果如图2所示。

图2中，wt代表野生型水稻；gw5-ox代表t2代转gw5水稻。

图2a为水稻的株型，图2b为水稻的粒形。

图2表明，与野生型水稻相比，t2代转gw5水稻的株型变散，叶片变细长，叶夹角变大，水稻籽粒宽度显著减小，粒长显著增加。

2、农艺性状的统计

当t2代转gw5水稻、t2代转空载体水稻和野生型水稻水稻籽粒成熟后，收获烘干后在室温下保存3个月，集成糙米，用于稻米粒长测定。

参照《中华人民共和国国家标准》gb/t17981-1999，进行水稻糙米和稻谷的粒型测定，重复3次，取平均值作为性状表型值。

随机挑选各水稻1000粒饱满水稻稻粒，用千分之一电子天平称重，重复三次，取平均值作为千粒重表型值。

结果如图3。

图3中，wt代表野生型水稻；gw5-ox代表t2代转gw5水稻。

图3a为稻粒的粒宽，图3b为稻粒的粒长，图3c为稻粒的粒厚，图3d为1000粒饱满水稻稻粒的千粒重。

图3表明，与野生型水稻相比，t2代转gw5水稻的粒宽、粒厚及千粒重显著减少，粒长显著增加。

t2代转空载体水稻和野生型水稻水稻结果无显著差异。

3、具体株系农艺性状的统计

将t2代转gw5水稻株系go-1、go-2和go-3、t2代转空载体水稻和野生型水稻水稻籽粒成熟采用上述2的方法检测粒型相关性状。

结果如图4和表1所示，

表1野生型及转基因植株后代粒型相关性状的统计

t2代转空载体水稻和野生型水稻水稻结果无显著差异。

可以看出，与野生型水稻相比，t2代转gw5水稻的粒宽、粒厚及千粒重显著减少，粒长显著增加，且株型变散，叶片变细长，叶夹角变大。

4、颖壳横向细胞增殖情况

利用石蜡切片在细胞学水平观察野生型水稻nipponbare和t2代转gw5水稻的颖壳横向细胞增殖情况，具体如下：

将野生型水稻nipponbare和t2代转gw5水稻株系的抽穗前15天的颖壳浸入faa固定液中，真空抽气后固定24h以上。梯度酒精脱水，二甲苯透明，随后用石蜡(paraplastplus,购自sigma)将二甲苯完全置换，利用包埋机(leicaeg1150)将样品包埋于蜡块中。根据材料幼嫩的程度，用切片机(leicarm2265)将组织切成8-10μm的薄片，切片用0.025％的甲苯胺蓝溶液染色30min左右，灭菌水漂洗两次后镜检，拍照。利用imagj软件对颖壳最外层细胞数以及周长进行统计。

结果如图5所示。

图5中，wt代表野生型水稻；gw5-ox代表t2代转gw5水稻。

图5a和5b分别为野生型水稻和t2代转gw5水稻的颖壳横切面。

图5c和5d分别为野生型水稻和t2代转gw5水稻的颖壳横切面对应的局部放大图。

图5表明，与野生型水稻相比，t2代转gw5水稻的颖壳细胞数目明显减少。