高密度脂蛋白模拟肽Reverse-D-4F在治疗LPS诱导呼吸窘迫综合症药物中的应用的制作方法

本发明涉及高密度脂蛋白模拟肽Reverse-D-4F的应用领域，具体为治疗LPS诱导呼吸窘迫综合症的药物中的应用。

背景技术：

急性呼吸窘迫综合征(ARDS)是一种常见的临床综合征，具有较高的死亡率，临床表现为呼吸窘迫、困难,通过传统氧疗纠正缺氧。ARDS的发病机制可分为生物和非生物病原菌。生物病原体包括细菌、病毒、真菌、非典型病原体和恶性肿瘤，而非生物病原包括酸性物质、药物、有毒气体吸入和机械通气相关的伤害。最初，在血液循环中的内毒素等有害物质损伤肺毛细血管内皮细胞(PCEC)，导致内皮细胞通透性增加，以及收缩和死亡。损伤约2小时后，出现肺间质水肿发生；损伤12至24小时后，出现肺泡水肿。

内皮细胞功能障碍和炎症在急性呼吸窘迫综合征的发生和发展中起着重要的作用。伯翰等表明生存率与内皮祖细胞(EPCs)克隆数呈正相关。在LPS诱导的急性肺损伤(ALI)大鼠模型中发现，内皮祖细胞移植可维持肺泡毛细血管屏障的完整性，恢复血管内皮功能，改善炎症状态。因此，EPCs对修复ARDS的内皮损伤和抑制ARDS发生发展具有重要作用。但是，ARDS患者体内促炎因子水平提高(如氧化低密度脂蛋白、IL-6、TNF-αα)，这些炎症因子损害内EPCs的功能，包括细胞增殖、迁移和血管形成。这些受损的内皮祖细胞无法恢复ARDS患者受损的血管内皮系统。因此，增加内皮祖细胞的数量，减轻炎性因子引起的内皮祖细胞功能障碍可能在抑制ARDS发展中发挥重要作用。

高密度脂蛋白(HDL)已被证明具有动员骨髓EPCs，抑制EPCs凋亡和促进EPCs分化为内皮细胞的功能。载脂蛋白A-I(apoA-I)是高密度脂蛋白的重要功能性成分，有243种氨基酸，已被证明能提高脓毒症大鼠的生存率。因为apoA-I脂质结合能力与其两亲性螺旋结构有很大关系，因此最近根据该特性设计了模拟肽，该模拟肽在疏水表面含有四个苯丙氨酸残基(4F；F代表苯丙氨酸)，并模 仿的A类两亲性螺旋，该模拟肽与apoA-I没有序列同源性。据报道，4F有抗炎、抗氧化作用，改善脓毒症大鼠的生存率。Reverse-D-4F是按照D-4F(Ac-DWFKAFYDKVAEKFKEAF-NH2)的反向序列合成的模拟肽，该模拟肽对脓毒症治疗并没有报道。

本发明发现了Reverse-D-4F能修复LPS诱导的EPCs功能损伤,抑制LPS诱导的EPCs凋亡，因而Reverse-D-4F通过动员EPCs并修复其功能来对LPS诱导大鼠肺损伤进行治疗，是治疗肺损伤的一个有效治疗剂，由此完成本发明。

技术实现要素：

本发明涉及一种高密度蛋白模拟肽Reverse-D-4F,其序列为Ac-FAEKFKEAVKDYFAKFWD-NH2。

一种高密度蛋白模拟肽Reverse-D-4F在制备治疗LPS诱导呼吸窘迫综合症的药物或试剂盒中的应用，所述高密度蛋白模拟肽的序列为Ac-FAEKFKEAVKDYFAKFWD-NH2。

一种高密度蛋白模拟肽Reverse-D-4F在制备内皮祖细胞修复内皮损伤药物或试剂盒中的应用，所述高密度蛋白模拟肽的序列为Ac-FAEKFKEAVKDYFAKFWD-NH2。

一种高密度蛋白模拟肽Reverse-D-4F在制备预防或治疗肺损伤药物或试剂盒中的应用，所述高密度蛋白模拟肽的序列为Ac-FAEKFKEAVKDYFAKFWD-NH2。

一种高密度蛋白模拟肽Reverse-D-4F在制备预防或治疗脓毒症药物或试剂盒中的应用，所述高密度蛋白模拟肽的序列为Ac-FAEKFKEAVKDYFAKFWD-NH2。

其中所述肺损伤为肺水肿，所述试剂盒还进一步包括佐剂，所述佐剂为氢氧化铝佐剂、短小棒状杆菌、脂多糖、细胞因子或明矾。

本发明发现提出Reverse-D-4F能抑制LPS诱导大鼠肺损伤模型的肺水肿，抑制体内炎症因子的产生，抑制肺泡壁增厚，胞间隙红细胞和白细胞的浸润，以及肺血管内皮炎症标志的产生(ICAM-1、VCAM-1和iNOS)，增加内皮的标志(eNOS和vWF)。Reverse-D-4F促进LPS诱导大鼠肺损伤模型EPCs动员，无论在体外还是在体内，Reverse-D-4F均能修复LPS诱导大鼠肺损伤模型EPCs损伤的功能。

附图说明

图1所示是Reverse-D-4F能抑制LPS诱导大鼠肺损伤模型的肺水肿和体内 炎症因子的产生。

图2所示是Reverse-D-4F抑制LPS诱导大鼠肺损伤模型肺泡壁增厚，胞间隙红细胞和白细胞的浸润

图3所示是Reverse-D-4F抑制LPS诱导大鼠肺损伤模型肺血管内皮炎症标志的产生(ICAM-1、VCAM-1和iNOS)，并增加内皮的标志(eNOS和vWF)。

图4所示是Reverse-D-4F动员LPS诱导大鼠肺损伤模型的EPCs。

图5所示是Reverse-D-4F修复LPS诱导大鼠肺损伤模型EPCs损伤的功能。

图6所示是Reverse-D-4F体外修复LPS诱导EPCs损伤的功能。

具体实施方式

Reverse-D-4F治疗LPS诱导大鼠肺损伤模型。

动物ARDS模型建立，24只雄性C57小鼠分为4组：

(1)对照组(腹腔注射PBS)；

(2)Reverse-D-4F组(腹腔注射Reverse-D-4F 10mg/Kg)

(3)模型组(腹腔注射LPS 10mg/Kg)；

(4)Reverse-D-4F处理组(腹腔注射Reverse-D-4F 10mg/Kg和LPS10mg/Kg)

模型制作2天后，通过盐酸氯胺酮静脉注射全麻后处死，取左肺，肺组织表面液体用吸水纸吸干净，称取左肺的重量被认为是湿重；左肺被放置在干燥箱60℃干燥48小时，然后称取重量为干重。湿干重比值来评价肺水肿程度。

用ELISA试剂盒来检测小鼠血浆中肿瘤坏死因子-α和ET-1的表达水平。

肺部的右叶均经10％福尔马林固定，石蜡包埋，切片6μm，然后用苏木精-伊红染色。用特异性抗体(VCAM-1、ICAM-1、iNOS、eNOS、vWF和Sca-1)进行免疫组织化学染色和HE染色。

用高倍镜随机挑选10个视野观察HE染色肺切片，并对浸润的红细胞和白细胞计数，同时对肺泡壁厚度进行测量。

用红细胞裂解缓冲液裂解外周血红细胞。然后用抗体FITC-CD34(BD)，PE-Flk-1，和APC-CD133标记细胞。流式分析阳性细胞数。

C57小鼠麻醉后断头处死，75％乙醇浸泡15min，剪取股骨和胫骨；冷PBS液反复冲洗骨髓腔直至冲洗液清亮，将冲洗液反复吹打，100μm滤网过滤成单 细胞悬液；冲洗液与Ficoll分离液的体积比为1∶1，20℃下2 000r/min离心20min。轻轻吸取离心管中间乳白色云雾状单个核细胞层到新的离心管中，磷酸盐缓冲液PBS洗细胞沉淀2次；完全培养液重悬细胞,反复轻柔吹打制成单细胞悬液后进行细胞计数。按10⁶/cm²的密度接种在预先用Fibronectin包被的六孔板或培养瓶上；培养3d后,用PBS液洗掉非贴壁细胞，每3d更换培养液一次。

EPCs与2.5mg/L的DiI-acLDL在37℃孵育2h；然后用1-2％多聚甲醛固定细胞5min；PBS浸洗后，加入10mg/L的FITC-UEA，37℃孵育1h后，洗去多余染料后，中性甘油封片，用荧光显微镜或激光共聚焦观察；显示红色荧光的为DiI-acLDL阳性，显示绿色荧光的为FITC-UEA-1阳性，显示黄色的为免疫双荧光阳性，被确认为DiI-acLDL和FITC-UEA双染色阳性细胞被认为是正在分化的EPCs。

将EPCs胰酶消化后接种于预先铺好纤维连接蛋白的培养板中，同培养液孵育30min，随即取5个高倍镜(×10)视野计数贴壁细胞。细胞接种于铺有纤维连接蛋白的96孔板中，每孔接种3000个细胞，24h后，每孔加入MTT(5g/L)20μL后37℃继续孵育4h，弃上清，各孔加入150μL二甲基亚砜(DMSO)，室温震荡10min，酶标仪492nm读取吸光度值。

将消化好的EPC接种于预先铺有matrigel胶的培养板上，37℃、5％CO2培养24小时后，显微镜观察成血管情况。

用8μm 24孔板检测EPCs的迁移。不同处理后的细胞，用0.25％胰蛋白酶消化，1.2×10⁴细胞液分别置于上腔。EGM-2MV培养基置于下室。37℃培养24h，上部细胞用棉签去除，下室用DAPI染色。随机选五个视野观察(×10)迁移的细胞计数。

培养7天的小鼠骨髓来源的单个核细胞用0.25％胰蛋白酶消化，10³细胞置于96孔板中。每隔一天用0.25％胰蛋白酶消化并进行细胞计数。

附图1表征了Reverse-D-4F能抑制LPS诱导大鼠肺损伤模型的肺水肿和体内炎症因子的产生情况，小鼠经LPS或Rev-D4F处理48小时后处死，取肺左叶检测湿干比(A)；取小鼠血浆检测ET-1(B)和TNF-α(C)水平。据图1所示，LPS诱导的小鼠急性肺损伤模型中肺水肿明显增加，模型血液中炎症因子TNF- α和ET-1明显增加；给予高密度脂蛋白模拟肽Reverse-D-4F治疗后，小鼠肺水肿明显降低，并且血液中炎症因子TNF-α和ET-1的增加水平明显得到抑制。

附图2是Reverse-D-4F抑制LPS诱导大鼠肺损伤模型肺泡壁增厚，胞间隙红细胞和白细胞的浸润，Rev-D4F对LPS诱导的小鼠肺损伤的修复作用。A,肺右叶进行HE染色；B，量取肺泡壁厚度，以对照组为100％，分别计算各组肺泡壁厚度的百分比；C，各组选取十个视野数红细胞数，最后取其均值；D，各组选取十个视野数白细胞数，最后取其均值。据图2所示，LPS诱导的小鼠急性肺损伤模型中肺泡壁厚度明显增加，且肺胞间隙明显出现红细胞和白细胞浸润；给予Reverse-D-4F治疗后，明显改善小鼠肺损伤模型的上述表现。LPS诱导的小鼠急性肺损伤模型中

附图3是Reverse-D-4F抑制LPS诱导大鼠肺损伤模型肺血管内皮炎症标志的产生(ICAM-1、VCAM-1和iNOS)，并增加内皮的标志(eNOS和vWF)。免疫组化对肺组织各指标检测：ICAM-1、VCAM-1和iNOS是肺内皮炎症标志物，eNOS和vWF是肺内皮细胞标志。据图3所示，LPS诱导的小鼠急性肺损伤模型肺组织中内皮损伤的炎症标志因子VCAM-1、ICAM-1和iNOS表达水平明显增加，而正常内皮细胞标志因子eNOS和vWF明显降低；给予Reverse-D-4F治疗后，明显降低内皮损伤的炎症标志因子VCAM-1、ICAM-1和iNOS的表达水平，同时提高正常内皮细胞标志因子eNOS和vWF的表达水平。

附图4是Reverse-D-4F动员LPS诱导大鼠肺损伤模型的EPCs，其中，A，小鼠外周血中CD34⁺、FLK-1⁺、CD133⁺、CD34⁺/FLK-1⁺、FLK-1⁺/CD133⁺和CD34⁺/CD133⁺各亚群百分比(NS为100％)；B，免疫组化染祖细胞标志Sca-1，检测肺组织祖细胞归巢情况。据图4所示，LPS能动员干细胞至外周血，如CD34⁺、FLK-1⁺、CD133⁺、CD34/FLK-1⁺、FLK-1/CD133⁺和CD34/CD133⁺细胞明显增加，在肺组织中带有干细胞标志因子Sca-1⁺的细胞也明显增加；给予Reverse-D-4F治疗后，外周血CD34⁺、CD34/FLK-1⁺和CD34/CD133⁺细胞的增加明显得到抑制，而FLK-1⁺、CD133⁺和FLK-1/CD133⁺带有内皮祖细胞标志的细胞进一步增加，在肺组织中Sca-1⁺细胞数量进一步增加来修复LPS诱导的肺损伤。

附图5表征了Reverse-D-4F修复LPS诱导大鼠肺损伤模型EPCs损伤的功能。 取各组小鼠骨髓诱导分化为EPCs并检测其功能：A，各组小鼠骨髓单个核细胞以10⁶/cm²接种于六孔培养板，3天后去除非贴壁细胞，贴壁细胞选取五个视野进行细胞计数，然后各组取均值；B，各组小鼠骨髓细胞诱导分化EPCs胰酶消化后，取12000个细胞接种于迁移小室上室，下室加入EGM-2MV诱导24小时后，DAPI染色，选取五个视野荧光显微镜下计数；C，各组小鼠骨髓细胞诱导分化EPCs进行吸附低密度脂蛋白(红色)和结合凝集素(绿色)实验，选取五个视野荧光显微镜下观察，双阳性细胞占所有细胞的百分比；D，各组小鼠骨髓单个核细胞培养7天，胰酶消化，以每孔1000个细胞接种于96孔板，细胞每隔1天计数一次。据图5所示，不同组小鼠骨髓取出并诱导分化为EPCs，并检测其功能，结果发现模型组小鼠EPCs分化的细胞数减少，尽管模型组EPCs能迅速增殖，但其粘附能力和迁移能力较对照组有所下降；给予Reverse-D-4F治疗后，小鼠骨髓单个核细胞分化为EPCs的数量有所增加，其粘附和迁移功能的损伤也得到了修复。

附图6表征了Reverse-D-4F体外修复LPS诱导EPCs损伤的功能，其中，A，MTT检测各组EPCs活力，以对照组的OD值为100％；B，迁移小室方法检测各组EPCs的迁移能力；C，Matrigel凝胶方法检测EPCs的体外成血管能力。据图6体外研究所示，LPS(30μg/ml)明显损伤EPCs的增殖、迁移和体外血管生成的功能，而Reverse-D-4F能明显修复LPS诱导上述功能的损伤，用LY294002(PI3K抑制剂)明显抑制Reverse-D-4F对EPCs功能损伤的修复作用。