七重pcr快速筛查检测商业化应用转基因油菜的引物及检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于转基因检测技术领域，设及屯重PCR快速筛查检测商业化应用转基因 油菜的引物及检测方法。
【背景技术】
[0002] 根据加拿大转基因数据库W及欧洲转基因生物指南提供的信息，选择目前已商业 化种植的16个转基因油菜转化事件作为本发明的研究对象。随着转基因油菜在市场上所占 份额的不断增加给转基因检测带来更多需求。同时，转基因作物的多样性和复杂性，也给转 基因产品的检测带来了挑战。如何快速、准确、科学地对样品进行转基因鉴定，是当前转基 因检测行业所面临的一个关键问题。转基因筛查是转基因检测中最基础的一步，筛查得到 的正确结果，可有效指导转化事件的进一步鉴定。
[0003] 在转基因植物及产品检测技术中主要有蛋白质检测和核酸检测两类，核酸检测技 术中普通PCR技术在实际检测需求中运用较多，其特点为敏感、快速、简便，主要用于检测转 基因作物及产品中的单个外源基因。然而在产品检测时，往往需要对多个外源基因进行检 测来确认其含哪些转基因成分及是否为转基因产品，用普通PCR技术分别对运些外源基因 进行检测时，存在时间和试剂耗费大、操作繁琐等缺点。
[0004] 多重PCR是在普通PCR基础上发展的一种新型扩增技术，即可在一个反应体系中加 入两对或W上引物，同时扩增多个核酸片段，解决了普通PCR存在的缺点。多重PCR已在病理 学、微生物、基因组学等学科中得到了广泛应用。多重PCR检测技术主要利用多重扩增产生 长度不同的扩增片段，采用琼脂糖凝胶电泳或毛细管凝胶电泳分辨出长度不同的片段。普 通琼脂糖凝胶电泳存在操作繁杂，试验周期长，易造成试验室污染等缺点，而毛细管凝胶电 泳可在PCR后直接上机电泳，无需其他点样等操作，节约时间，减少污染。可W说多重PCR相 比单一PCR反应更快捷、更经济，只需要1次PCR反应就能同时检测多个祀标基因，运种方法 具有更大的可靠性和适应性，并能降低检测成本。
[0005] 目前关于已商业化应用的转基因油菜的检测技术，主要集中在单一调控元件或单 个转化事件PCR方法和标准，也有学者针对目前已商业化应用的转基因油菜进行单一PCR筛 查检测技术研究，但尚无针对目前已商业化应用的转基因油菜的多重PCR筛查检测技术。通 过对目前已商业化应用的转基因油菜基因元件分析发现，每种转基因油菜都含有多个外源 基因元件，为了增加检测的可靠性，开发一种能同步筛查检测已商业化应用的转基因油菜 外源基因至少两次的多重PCR检测方法就显得非常有必要。本发明正是提供了一种可同步 筛查检测已商业化应用的转基因油菜外源基因至少两次的多重PCR检测方法，增加了检测 方法的可靠性，弥补了现有技术的缺点。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的主要是提供一种准确、快速、可靠、省时省力的多重PCR快速筛查商 业化应用的转基因油菜外源基因至少两次的多重PCR检测方法。
[0007]本发明通过下述技术方案实现：
[000引屯重PC財夹速筛查检测商业化应用转基因油菜的引物，包括W下引物序列：
[0009] pat-F：5'-CGCGGTTTGTGATATCGTTAAC-3'；
[0010] pat-R:5，-TCTTGCAACCTCTCTAGATCATCAA-3，；
[0011] CruA-F:5'-GGCCAGGGCTTCCGTGAT-3';
[0012] CruA-R:5'-CTGGTGGCTGGCTAAATCGA-3';
[0013] P-FMV 35S-F:5'-CAGCATTCCAGATTGGGTTCA-3';
[0014] P-FMV 35S-R:5'-CTTTTGGCTAATGGTTTGGAGAC-3';
[0015] T-NOS-F:5'-GAATCCTGTTGCCGGTCTTG-3';
[0016] T-NOS-R:5'-TTATCCTAGTTTGCGCGCTA-3';
[0017] P-CaMV 35S-F:5'-GCTCCTACAAATGCCATCATTGC-3';
[0018] P-CaMV 35S-R:5'-GATAGTGGGATTGTGCGTCATCCC-3';
[0019] CP4-EPSPS-F：5'-GACTTGCGTGTTCEGGCTT-3'；
[0020] CP4-EPSPS-R:5'-AACACCGTTGAGCTTGAGA-3';
[0021] bar-F:5 '-GAAGGCACGCAACGCCTACGA-3 '；
[0022] bar-R:5，-CCAGAAACCCACGTCATGCCA-3，。
[0023] 屯重PC財夹速筛查检测商业化应用转基因油菜的方法，包括W下步骤：
[0024] (1)合成W下引物：
[00 巧]pat-F:5'-CGCGGTTTGTGATATCGTTAAC-3';
[00%] pat-R:5 '-TCTTGCAACCTCTCTAGATCATCAA-3 '；
[0027] CruA-F:5'-GGCCAGGGCTTCCGTGAT-3';
[0028] CruA-R:5'-CTGGTGGCTGGCTAAATCGA-3';
[00巧]P-FMV 35S-F:5，-CAGCATTCCAGATTGGGTTCA-3，；
[0030] P-FMV 35S-R:5'-CTTTTGGCTAATGGTTTGGAGAC-3';
[0031] T-NOS-F：5'-GAATCCTGTTGCCGGTCTTG-3'；
[0032] T-NOS-R:5'-TTATCCTAGTTTGCGCGCTA-3';
[0033] P-CaMV 35S-F:5'-GCTCCTACAAATGCCATCATTGC-3';
[0034] P-CaMV 35S-R:5'-GATAGTGGGATTGTGCGTCATCCC-3';
[0035] CP4-EPSPS-F:5'-GACTTGCGTGTTCEGGCTT-3';
[0036] CP4-EPSPS-R:5'-AACACCGTTGAGCTTGAGA-3';
[0037] bar-F:5 '-GAAGGCACGCAACGCCTACGA-3 '；
[0038] bar-R:5，-CCAGAAACCCACGTCATGCCA-3，；
[0039] (2)制备待测DNA稀释液；
[0040] (3)配制PCR反应体系；
[0041 ] (4)进行 PCR 检测；
[0042] (5)取PCR反应产物进行毛细管电泳。
[0043] 进一步地，步骤（1)中pat引物的浓度为0.3皿ol/L，CruA引物的浓度为0.05皿〇1/ UP-CaMV 35S引物和bar引物的浓度为0.15皿ol/L，CP4-EPSPS引物的浓度为0.25皿ol/L， P-FMV 35S引物和T-NOS引物的浓度均为0.2曲lol/l;步骤(2)所述制备的DNA稀释液的浓度 为 50ng/]iL。
[0044] 再进一步地，所述PCR反应条件为:94°C变性5min;然后进入35个循环，94°C 30s，56 1：3〇3,721：3〇3;循环结束后72°(：延伸3111111。
[0045] 再进一步地，引物退火溫度为58°C。
[0046] 本发明具有W下优点及有益效果：
[0047] 本发明在同一次PCR反应中可W同时检出油菜内标基因和转基因油菜中使用频率 较高的6种外源基因。
[0048] 本发明采用毛细管电泳仪进行结果分析，不仅分辨率可达几个碱基(普通凝胶电 泳几乎不能将其分开），而且相对普通凝胶电泳的分离效果更好，并且只需要一次电泳分析 即可得知样品是否含有转基因油菜中使用频率较高的6种外源基因。
[0049] 本发明仅一次PCR反应可快速、准确检测出随机选择的目前已商业化转基因油菜 中所含有的外源基因，且成本低、准确率高，屯重PCR技术体系也能有效控制假阴性和假阳 性的出现。
【附图说明】
[0050] 图1为本发明屯重PCR引物浓度梯度和退火溫度梯度正交优化试验扩增图谱。
[0051] 图2为本发明屯重PCR灵敏度试验扩增图谱。
[0化2]图3为本发明屯重PCR已知样品验证扩增图谱。
【具体实施方式】
[0053] 下面结合实施例对本发明做进一步的说明，但本发明的实施方式并不限于此。
[0054] 实施例
[0055] 屯重PC財夹速筛查检测商业化应用转基因油菜的方法，包括W下步骤：
[0056] (1)合成W下引物：
[0化 7] pat-F：5'-CGCGGTTTGTGATATCGTTAAC-3'；
[005引 pat-R:5 '-TCTTGCAACCTCTCTAGATCATCAA-3 '；
[0059] CruA-F:5'-GGCCAGGGCTTCCGTGAT-3';
[0060] CruA-R:5'-CTGGTGGCTGGCTAAATCGA-3';
[0061 ] P-FMV 35S-F:5'-CAGCATTCCAGATTGGGTTCA-3';
[0062] P-FMV 35S-R:5'-CTTTTGGCTAATGGTTTGGAGAC-3';
[0063] T-NOS-F:5'-GAATCCTGTTGCCGGTCTTG-3';
[0064] T-NOS-R:5'-TTATCCTAGTTTGCGCGCTA-3';
[00化]P-CaMV 35S-F:5'-GCTCCTACAAATGCCATCATTGC-3';
[0066] P-CaMV 35S-R:5'-GATAGTGGGATTGTGCGTCATCCC-3';
[0067] CP4-EPSPS-F:5'-GACTTGCGTGTTCEGGCTT-3';
[006引 CP4-EPSPS-R:5'-AACACCGTTGAGCTTGAGA-3';
[0069] bar-F:5 '-GAAGGCACGCAACGCCTACGA-3 '；
[0070] bar-R:5，-CCAGAAACCCACGTCATGCCA-3，；
[0071] (2)制备待测DNA稀释液；
[0072] (3)配制PCR反应体系；
[0073] (4)进行 PCR 检测；
[0074] (5)取PCR反应产物进行毛细管电泳。
[00对其中，步骤（1)中pat引物的浓度为0.3皿01 /L，CruA引物的浓度为0.05皿01 /L，P-CaMV 35S引物和bar引物的浓度为0.15皿ol/L，CP4-EPSPS引物的浓度为0.25皿ol/L,P-FMV 35S引物和T-NOS引物的浓度均为0.2wiiol/l;步骤(2)所述制备的DNA稀释液的浓度为50ng/ 化;所述PCR反应条件为:94°C变性5min;然后进入35个循环，941：303,561：303,721：303;循 环结束后72°C延伸3min;引物退火溫度为58°C。
[0076] 为了验证本发明的筛查检测效果W及相应的参数选取的真实性，对各步骤进行具 体的验证试验，其具体情况如下：
[0077] (1)扩增检测引物的合成：
[007引表1引物序列信息表
[0079]
[0080] (2)待测转基因 DNA的小量提取：
[0081] 采用天根生化科技(北京)有限公司生产的植物基因组DNA提取试剂盒(DP305)提 取样品基因组DNA，称取转基因粉末样品200mg，加入70iil洗脱液TE洗脱样品基因组DNA，其 他提取步骤参照试剂盒说明书操作。
[0082] 采用化ermo Nano Drop 1000紫外分光光度计测定样品基因组DNA的浓度和纯度， 并将样品DM浓度稀释至SOngAiL待测。
[0083] (3)屯重 PCR
[0084] ①引物浓度梯度和引物退火溫度梯度正交试验：
[0085] PCR反应体系组成为：PCR Master Mix终浓度为IX，CruA、pat、P-FMV 35S、T-N0S、 P-化MV 35S、CP4-EPSPS、bar引物终浓度梯度见表2，待测DNA模板3.化L，补充d地2〇至体积 为2如L。
[0086] 表2反应体系引物终浓度(皿ol/L)梯度
[OORTl
[0088] 在定性PCR仪上运行如下反应程序:94 °C变性5min;然后进入35个循环，94 °C 30s， 退火 303,721：303;循环结束后72°(：延伸5111111。退火溫度梯度为50°(：、54°(：、56°(：、58°(：、60 °C、64°C。引物浓度梯度和引物退火溫度梯度采用正交设计进行试验。结果见附图1，其中泳 道M:size maker;泳道1-6对应终浓度梯度1:泳道7-12对应终浓度梯度2;泳道13-18对应终 浓度梯度3;泳道19-24对应终浓度梯度4;泳道25-30对应终浓度梯度5;泳道31-35对应终浓 度梯度6;其中，泳道1-6，、泳道7-12、泳道13-18、泳道19-24、泳道25-30、泳道31-35退火溫 度依次为50 °C、54°C、56 °C、58 °C、60 °C、64°C。
[0089] 结论：由图I结果可知：CruA、pat、P-FMV 35S、T-N0S、P-CaMV 35S、CP4-EPSPS、bar 引物终浓度(皿ol/L)为终浓度3及引物退火溫度为58°C时，各外源基因特异性条带扩增效 率更高更一致。
[0090] ②灵敏度试验：
[0091] PCR反应体系组成为:PCR Master Mix终浓度为1 X，引物浓度配比参照引物浓度 梯度试验结果，待测DNA模板终浓度(ng/化)梯度1.5、1、0.3、0.1、0.03,补充d地2〇至体积为 2!5化。
[0092] 在定性PCR仪上运行如下反应程序:94 °C变形5min;然后进入35个循环，94 °C 30s， 58°C30s，72°C30s;循环结束后72°C延伸5min。结果见附图2,其中泳道M:size maker,泳道 1-5分别对应浓度梯度1.5、1、0.3、0.1、0.03,泳道6为dd也0对照。
[0093] 结论：由图2结果可知，模板浓度低至0.：3ngAiL条件下，灯^、口曰*、口斗1￥355、1'-N0S、P-CaMV 35S、CP4-EPSPS、bar的特异性条带结果能被清晰判断。
[0094] ③已知样品验证试验：
[0095] PCR反应体系组成为:PCR Master Mix终浓度为I X，引物浓度配比参照引物浓度 梯度试验结果，待测DNA模板3.化L，补充d地2〇至体积为化化。
[0096] 在定性PCR仪上运行如下反应程序:94 °C变性5min;然后进入35个循环，94 °C 30s， 56°C30s，72°C30s;循环结束后72°C延伸5min。结果见附图3,其中泳道M:size maker,泳道 1-14:转基因油菜混合阳性(GT73+RF3巧45)、转基因油菜RF1、RF2、RF3、MS1、MS8、转基因玉 米 GA2UM0N810、化 1UM0N863、转基因棉花 M0N1445、LLC0TT0N25、转基因水稻 TT51-1、转基 因大豆GTS40-3-2，15: d地2〇对照。
[0097] 结论:由图3结果可知，各已经样品都能检测到相关特异性条带。
【主权项】
1. 七重PCR快速筛查检测商业化应用转基因油菜的引物，其特征在于，包括以下引物序 列： pat-F:5 '-CGCGGTTTGTGATATCGTTAAC-3 '； pat-R:5 '-TCTTGCAACCTCTCTAGATCATCAA-3 '； CruA-F:5，-GGCCAGGGCTTCCGTGAT-3，； CruA-R:5，-CTGGTGGCTGGCTAAATCGA-3，； P-FMV 35S-F:5 '-CAGCATTCCAGATTGGGTTCA-3 '； P-FMV 35S-R:5 '-CTTTTGGCTAATGGTTTGGAGAC-3 '； T-NOS-F：5'-GAATCCTGTTGCCGGTCTTG-3'； T-NOS-R:5 '-TTATCCTAGTTTGCGCGCTA-3 '； P-CaMV 35S-F:5 '-GCTCCTACAAATGCCATCATTGC-3 '； P-CaMV 35S-R:5 '-GATAGTGGGATTGTGCGTCATCCC-3 '； CP4-EPSPS-F:5 '-GACTTGCGTGTTCEGGCTT-3 '； CP4-EPSPS-R:5 '-AACACCGTTGAGCTTGAGA-3，； bar-F: 5 '-GAAGGCACGCAACGCCTACGA-3 '； bar-R: 5 '-CCAGAAACCCACGTCATGCCA-3 '。2. 七重PCR快速筛查检测商业化应用转基因油菜的方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 合成以下引物： pat-F:5 '-CGCGGTTTGTGATATCGTTAAC-3 '； pat-R:5 '-TCTTGCAACCTCTCTAGATCATCAA-3 '； CruA-F:5，-GGCCAGGGCTTCCGTGAT-3，； CruA-R:5，-CTGGTGGCTGGCTAAATCGA-3，； P-FMV 35S-F:5 '-CAGCATTCCAGATTGGGTTCA-3 '； P-FMV 35S-R:5 '-CTTTTGGCTAATGGTTTGGAGAC-3 '； T-NOS-F：5'-GAATCCTGTTGCCGGTCTTG-3'； T-NOS-R:5 '-TTATCCTAGTTTGCGCGCTA-3 '； P-CaMV 35S-F:5 '-GCTCCTACAAATGCCATCATTGC-3 '； P-CaMV 35S-R:5 '-GATAGTGGGATTGTGCGTCATCCC-3 '； CP4-EPSPS-F:5 '-GACTTGCGTGTTCEGGCTT-3 '； CP4-EPSPS-R:5 '-AACACCGTTGAGCTTGAGA-3，； bar-F: 5 '-GAAGGCACGCAACGCCTACGA-3 '； bar-R: 5 '-CCAGAAACCCACGTCATGCCA-3 '； (2) 制备待测DNA稀释液； (3) 配制PCR反应体系； (4) 进彳丁PCR检测； (5 )取PCR反应产物进行毛细管电泳。3. 根据权利要求2所述的七重PCR快速筛查检测商业化应用转基因油菜的方法，其特征 在于，步骤（1)中pat引物的浓度为0.3ymol/L，CruA引物的浓度为0.05ymol/L，P-CaMV 35S 引物和匕31引物的浓度为0.15以111〇1/1，0?44?5?3引物的浓度为0.254111〇1/1，？-卩]/^355引 物和T-NOS引物的浓度均为0.2ymol/L;步骤(2)所述制备的DNA稀释液的浓度为50ngAiL。4. 根据权利要求2或3所述的七重PCR快速筛查检测商业化应用转基因油菜的方法，其 特征在于，所述PCR反应条件为:94°C变性5min;然后进入35个循环，94°C 30s，56 °C30s，72°C 30s;循环结束后72°C延伸3min。5. 根据权利要求4所述的七重PCR快速筛查检测商业化应用转基因油菜的方法，其特征 在于，引物退火温度为58°C。
【专利摘要】本发明公开了一种快速筛查检测商业化应用的转基因油菜外源基因至少两次的多重PCR检测方法，所述引物具有较强的特异性，能够用于多重PCR筛查检测分析。所述检测方法提供了一种检测快速、操作简便、扩增性能好、灵敏度高的转基因筛查检测方法，实现了转基因油菜多个外源基因同步检测。利用毛细管电泳对PCR扩增产物进行分析，其片段大小区分率可达数个碱基，分辨率高。本发明的引物和检测方法为转基因植物提供了一种快速、有效、可靠的高通量筛查检测方法。本发明建立的多重PCR反应体系不仅可以检测转基因油菜外源基因，而且还能扩增到其他转基因植物的筛查检测。
【IPC分类】C12Q1/68, C12N15/11
【公开号】CN105713977
【申请号】CN201610189016
【发明人】尹全, 李忆, 宋君, 张富丽, 刘勇, 雷绍荣, 郭灵安, 王东, 刘文娟, 常丽娟
【申请人】四川省农业科学院分析测试中心