本发明属于药物
技术领域：
，涉及药物制剂质量分析，具体涉及颈康胶囊的质量控制方法。
背景技术：
：颈康胶囊由熟地黄、何首乌、杜仲、鹿衔草、骨碎补(烫)、钩藤、葛根、三七、莱菔子(炒)9味中药精制而成，具有补肾、活血、止痛的功效，用于肾虚血瘀所致的颈椎病。技术实现要素：本发明的第一目的在于提供一种从颈康胶囊中分离得到的新化合物；本发明的第二目的在于提供上述新化合物的制备方法；本发明的第三目的在于提供一种基于上述新化合物的液相分析方法，用于控制颈康胶囊的质量，提高颈康胶囊的质量控制水平；本发明的第四目的在于提供上述新化合物在颈康胶囊质量控制中用作对照品的用途。本发明的上述目的是通过下面的技术方案得以实现的：一种具有下述结构式的化合物(Ⅰ)，所述的化合物(Ⅰ)的制备方法包括如下操作步骤：步骤S1，将钩藤的带钩茎枝粉碎，用65～75％乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水饱和的正丁醇萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；步骤S2，将步骤S1中正丁醇萃取物用大孔树脂富集，先用8～12％乙醇洗脱6～10个柱体积，再用60～70％乙醇洗脱10～14个柱体积，收集60～70％乙醇洗脱液，减压浓缩得60～70％乙醇洗脱浓缩物；步骤S3，将步骤S2中60～70％乙醇洗脱浓缩物用正相硅胶分离，依次用体积比为80:1、40:1、20:1和10:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到4个组分；步骤S4，将步骤S3中组分3用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为30:1、20:1和10:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；步骤S5，将步骤S4中组分2用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度为60～70％的甲醇水溶液等度洗脱，收集8～12个柱体积洗脱液，减压浓缩得到化合物(Ⅰ)。进一步地，步骤S1中用70％乙醇热回流提取。进一步地，步骤S2中所述大孔树脂为D101型大孔吸附树脂。进一步地，步骤S2中，先用10％乙醇洗脱8个柱体积。更进一步地，步骤S2中，再用65％乙醇洗脱12个柱体积，收集65％乙醇洗脱液，减压浓缩得65％乙醇洗脱浓缩物。进一步地，步骤S5中用体积百分浓度为65％的甲醇水溶液等度洗脱。上述化合物(Ⅰ)在颈康胶囊质量控制方法中用作化学对照品的用途。所述颈康胶囊质量控制方法为高效液相色谱法，参数如下：色谱柱：C18柱(4.6mm×250mm，5μm)；流动相：A为乙腈，B为0.1％甲酸溶液(三乙胺调节pH值至6.0)；梯度洗脱程序：0～5min，A35％；5～10min，A35％→70％；10～15min，A70％→35％；15～20min，A35％；流动相流速：1.0mL·min-1；检测波长：255nm；柱温：30℃；进样量10μL。进一步地，所述的C18柱为WatersXBridgeC18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)。本发明的优点：1、本发明提供的化合物(Ⅰ)为首次报道，具有促进颈椎病康复作用，可能是颈康胶囊发挥治疗作用的物质基础之一；2、化合物(Ⅰ)可以从钩藤的带钩茎枝中分离得到，本发明提供的制备方法得率高，可以进行大规模制备；3、本发明提供的液相分析方法可以将颈康胶囊中的化合物(Ⅰ)与其他化合物分开，达到基线分离(分离度＞2.0)，化合物(Ⅰ)峰纯度检测合格；4、本发明制备的化合物(Ⅰ)纯度高，在颈康胶囊的质量控制过程中可以用于化合物(Ⅰ)的定性或定量。具体实施方式下面结合实施例进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和保护范围。实施例1：化合物(Ⅰ)的制备和结构确证分离制备方法：步骤S1，将2kg钩藤的带钩茎枝粉碎，用70％乙醇热回流提取(10L×3次)，合并提取液，浓缩至无醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水饱和的正丁醇萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；步骤S2，将步骤S1中正丁醇萃取物用D101型大孔树脂富集，先用10％乙醇洗脱8个柱体积，再用65％乙醇洗脱12个柱体积，收集65％乙醇洗脱液，减压浓缩得65％乙醇洗脱浓缩物；步骤S3，将步骤S2中65％乙醇洗脱浓缩物用正相硅胶分离，依次用体积比为80:1(5个柱体积)、40:1(6个柱体积)、20:1(8个柱体积)和10:1(6个柱体积)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到4个组分；步骤S4，将步骤S3中组分3用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为30:1(5个柱体积)、20:1(5个柱体积)和10:1(4个柱体积)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；步骤S5，将步骤S4中组分2用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度为65％的甲醇水溶液等度洗脱，收集8～12个柱体积洗脱液，减压浓缩得到化合物(Ⅰ)(585mg，HPLC归一化纯度大于98％)。结构确证：淡黄色粉末，HRAPCIMS显示[M+H]+为m/z241.0822，结合核磁特征可得分子式为C15H12O3，不饱和度为10。核磁共振氢谱数据δH(ppm，CDCl3，500MHz)：H-1(7.62，d，J＝8.5Hz)，H-2(7.28，dd，J＝8.5，7.9Hz)，H-3(6.98，d，J＝7.9Hz)，H-8(8.12，s)，H-12(7.71，s)，H-13(4.87，d，J＝4.8Hz，2H)，H-14(9.98，s)，H-15(2.94，s)，13-OH(1.76，t，J＝5.0Hz)；核磁共振碳谱数据δC(ppm，CDCl3，125MHz)：127.2(CH，1-C)，118.5(CH，2-C)，127.9(CH，3-C)，135.4(C，4-C)，112.5(C，5-C)，156.8(C，6-C)，128.6(C，7-C)，130.3(CH，8-C)，126.2(C，9-C)，120.8(C，10-C)，121.9(C，11-C)，142.7(CH，12-C)，55.9(CH2，13-C)，194.2(CH，14-C)，17.2(CH3，15-C)。红外波谱表明该化合物含有羟基(3382cm-1)，羰基(1715cm-1)，烯烃(1655cm-1)和芳香环(1612cm-1，1574m-1，1462cm-1)基团。13C-NMR、DEPT和HSQC谱中显示有15个碳信号，包括一个甲基δC17.2，一个连氧亚甲基δC55.9，六个次甲基(一个羰基碳，四个烯烃碳与一个连氧烯烃碳)δC127.2、118.5、127.9、130.3、142.7、194.2，以及七个季碳(七个烯烃碳)δC135.4、112.5、156.8、128.6、126.2、120.8、121.9；以上功能结构再结合不饱和数表明该化合物为三环结构。1H-NMR谱显示一个甲基质子信号δH2.94(3H，s)，一组移向低场的羟甲基质子信号δH4.87(2H，d，J＝4.8Hz)，一组AMX系统质子信号δH7.62(d，J＝8.5Hz)、7.28(dd，J＝8.5，7.9Hz)与6.98(d，J＝7.9Hz)，一个环内连氧烯烃质子信号δH7.71(1H，s)，一个芳烃质子信号δH8.12(1H，s)，一个醛基质子信号δH9.98(1H，s)，一个羟基质子信号δH1.76(1H，t，J＝5.0Hz)。HMBC谱中，H2-13与C-7和C-12的相关性确认了一个羟甲基与C-11位连接，H-14与C-10和C-8的相关性表明一个醛基连接在C-9位，H3-15与C-3和C-5的相关性可知甲基与C-4是相连的。此外，分析HMBC谱中H-1与C-2和C-10，H-3与C-2和C-4，H-8与C-7和C-9，H-12与C-6和C-11以及H3-15与C-3和C-5的相关性并结合1H-1HCOSY谱中H-1/H-2/H-3与H-12/H2-13/13-OH的相关性可以构建出该化合物的连接方式，进而确证该化合物的结构。综合氢谱、碳谱、HMBC谱和NOESY谱，以及文献关于相关类型核磁数据，可基本确定该化合物如下所示，立体构型进一步通过ECD试验确定，理论值与实验值基本一致。化学结构式和碳原子编号如下：实施例2：化合物(Ⅰ)的药理作用(促进颈椎病康复)本实施例采用动静力失衡性大鼠颈椎间盘退变模型复合肾上腺皮质激素和肾上腺素法建立血瘀型颈椎病模型。检测血液流变学指标、CD62p、三酰甘油和胆固醇、血浆cAMP、cGMP，观察药物降低血浆黏度、CD62p、三酰甘油、cAMP，改善颈椎间盘退变等方面的抗血瘀型颈椎病作用。1、材料与方法1.1动物3月龄SPF级SD雌性大鼠，由斯莱克实验动物有限责任公司提供。1.2试剂与样品化合物(Ⅰ)自制，制备方法见实施例1。氢化可的松琥珀酸钠，天津市生物化学制药厂；盐酸肾上腺素，上海禾丰制药有限公司；盐酸氯胺酮，上海第一生化药业公司；雌二醇(estradiol，E2)放射免疫分析药盒，北京北方生物技术研究所；125I-环磷酸腺苷(cyclicadenosinemono-phosphate，cAMP)、125I-环磷酸鸟苷(cyclicguanosinemonophosphate，cGMP)放射免疫分析试剂盒，上海中医药大学核医学实验室；Ⅱ型胶原兔抗鼠抗体，美国CellSignalingTechnology公司；Ⅹ型胶原兔抗鼠抗体，武汉博士德生物工程有限公司；Ⅱ型、Ⅹ型胶原免疫组化试剂盒，深圳晶美生物工程有限公司；聚集蛋白聚糖(aggrecan-1，Agc1)、Ⅱ型前胶原基因(typeⅡprocollagengene，Col2a1)、基质金属蛋白酶-13(matrixmetalloproteinase-13，MMP-13)和基质金属蛋白酶抑制剂-1(tissueinhibitorofmetalloproteinases-1，TIMP-1)引物，大连浩嘉生物技术有限公司；藻红蛋白(phycoerythrin，PE)标记的鼠抗人血小板表面α-颗粒膜糖蛋白(alpha-granularmembraneprotein，CD62p)抗体，英国Serotec公司；TRIzol试剂，美国MRC公司；逆转录酶，北京天根生化科技有限公司。1.3仪器全自动石蜡包埋机，LeicaEG1160；轮转式切片机，LeicaRM2135；组织脱水，机，LeicaTP1020；CMIAS-99B；紫外/可见光分光光度计，BeckmanDU800/VIS；全自动自清洗血流变仪，LBY-N6C；流式细胞仪，BectonDickinsonFACS-Calibur；γ-放免计数器，SN-682。1.4大鼠分组及模型制备将大鼠按随机分组设计，分为正常对照组、模型对照组(血瘀型颈椎病模型组)和化合物(Ⅰ)组(20mg·kg-1)。血瘀模型采用肾上腺皮质激素加肾上腺素应用法。氢化可的松10mg/kg体质量肌肉注射，用药13d；然后肾上腺素0.36mg/kg体质量皮下注射，用药1d。颈椎病模型采用动静力失衡大鼠颈椎间盘退变模型。将大鼠颈后部剪毛和清洁后，按氯氨酮0.1g/kg体质量行腹腔注射麻醉，取颈背部正中纵向切口，长约2～2.5cm，切开皮肤后，横向切断颈夹肌和头、颈、寰最长肌，切除颈骼肋肌与头半棘肌，然后依次切除棘上和棘间韧带，建立动静力失衡性大鼠颈椎间盘退变模型。观察3个月。血瘀型颈椎病模型通过上述两种模型复合而成，在颈椎病模型的基础上复合血瘀模型，当颈椎病模型造模2.5个月后，开始造血瘀模型，至3个月时，两个模型同时结束造模，当颈椎病模型建立3个月后，正常组和模型组正常饲养，化合物(Ⅰ)组予药物治疗1个月。1.5血液流变学指标检测大鼠用戊巴比妥麻醉后，腹主动脉采血5ml，肝素抗凝，摇匀，全自动自清洗血流变仪检测血液流变学变化。1.6CD62p检测上述方法采血1ml，肝素抗凝，用流式细胞仪检测CD62p的表达。取0.1ml抗凝血，加单抗CD62pPE20μl，混合，4℃放置20min；加2ml红细胞溶解液放置10min破红细胞；2000r/min离心5min，弃上清液；用PBS洗涤细胞2～3次，再悬浮于0.3mlPBS中，检测。1.7三酰甘油和胆固醇检测上述方法采血2ml，离心，取血清，全自动生化分析仪检测三酰甘油、胆固醇含量。1.8血浆cAMP、cGMP检测上述方法采血1ml，EDTA抗凝，离心，取血浆，按照试剂盒说明书操作要求，用放射免疫法测定血浆cAMP和cGMP含量。1.9颈椎间盘组织病理学检测取颈椎间盘，4％多聚甲醛固定24h，清水冲洗后，20％EDTA脱钙4周，脱水，透明，包埋，连续6μm横断面切片，HE染色。在光学显微镜下观察每个椎间盘正中矢状面的髓核、纤维环和软骨终板等结构。1.10统计学方法实验数据用均数±标准差(x±s)表示，应用SPSS18.0版统计软件进行单因素方差分析和t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。2、实验结果2.1对血瘀型颈椎病模型大鼠血液流变学和CD62p的影响与模型对照组比较，化合物(Ⅰ)组血浆黏度和CD62p显著降低(P＜0.01)。结果见表1。2.2对血瘀型颈椎病模型大鼠三酰甘油和胆固醇的影响与正常对照组比较，模型对照组三酰甘油和胆固醇增高(P＜0.01)；与模型对照组比较，化合物(Ⅰ)组三酰甘油和胆固醇明显降低(P＜0.01)。结果见表1。2.3对血瘀型颈椎病模型大鼠cAMP、cGMP表达的影响与正常对照组相比，模型对照组cAMP增高。与模型对照组比较，化合物(Ⅰ)组合物组cAMP、cGMP明显降低(P＜0.01)。结果见表2。表1对血瘀型颈椎病模型大鼠血液流变学和CD62p及三酰甘油和胆固醇的影响表2对血瘀型颈椎病模型大鼠cAMP、cGMP表达的影响组别cAMP(nmol/L)cGMP(nmol/L)正常对照组36.78±10.665.21±2.08模型对照组47.87±19.315.37±2.87化合物(Ⅰ)组27.58±8.182.79±2.092.4颈椎间盘HE染色结果正常组椎间盘外周的纤维环排列稍紊乱，有的可见裂隙，中央的髓核略有皱缩，软骨终板分为生长软骨层和关节软骨层，潮标清晰可见，钙化的关节软骨极薄；模型组椎间盘纤维环有明显裂隙，胶原纤维排列紊乱、无规则，髓核尚可，软骨终板变薄，潮标前移；化合物(Ⅰ)组与模型组相比，椎间盘结构有所改善，纤维环有裂隙，大部分胶原纤维排列紧密，髓核无皱缩，细胞较多，软骨终板厚度增加，潮标后移。上述结果表明，本发明提供的化合物(Ⅰ)对血瘀型颈椎病的具有明显的治疗效果，可能是颈康胶囊发挥治疗作用的物质基础之一。实施例3：颈康胶囊的质量控制方法1、仪器：Agilent1260高效液相色谱仪2、试剂：化合物(Ⅰ)自制，HPLC归一化纯度大于98％，制备方法见实施例1；颈康胶囊为河南省洛正制药厂产品。3、色谱条件：色谱柱：WatersXBridgeC18柱(4.6mm×250mm，5μm)；流动相：A为乙腈，B为0.1％甲酸溶液(三乙胺调节pH值至6.0)；梯度洗脱程序：0～5min，A35％；5～10min，A35％→70％；10～15min，A70％→35％；15～20min，A35％；流动相流速：1.0mL·min-1；检测波长：255nm；柱温：30℃；进样量10μL。4、供试品溶液的制备取本品适量，取约1g，精密称定，加入水饱和的正丁醇50mL，密塞，称定重量，放置过夜，超声处理1h，放冷至室温，再称定重量，用水饱和的正丁醇补足减失的重量，滤过，精密量取续滤液20mL，用正丁醇饱和的氨试液洗涤2次，每次25mL，洗涤液再用水饱和的正丁醇振摇提取2次，每次20mL，合并正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇溶解并转移至5mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。5、对照品溶液的制备精密称取化合物(Ⅰ)20mg至20ml容量瓶中，甲醇超声溶解，冷却至室温后定容。精密移取2ml至20容量瓶中，甲醇稀释定容，配制成浓度约为0.1mg/ml的对照品溶液。6、分析方法验证使用DAD检测器，分别进样分析供试品溶液和对照品溶液，结果：供试品溶液液相色谱图中在对照品溶液液相色谱图出峰位置出峰；对照品溶液中化合物(Ⅰ)色谱峰的光谱图与供试品溶液中对应色谱峰的光谱图一致；供试品溶液中化合物(Ⅰ)色谱峰与相邻色谱峰的分离度大于2.0，且峰纯度高于阈值。7、样品含量测定分别取3个批号的颈康胶囊样品，按上述方法处理制备供试液，测定样品中化合物(Ⅰ)含量，3批样品中的含量分别为0.0588％、0.0591％、0.0592％。本发明提供的化合物(Ⅰ)为首次报道，具有促进颈椎病康复作用，可能是颈康胶囊发挥治疗作用的物质基础之一，可以从钩藤的带钩茎枝中分离得到，在颈康胶囊的质量控制过程中可以作为化学对照品用于化合物(Ⅰ)的定性或定量分析。上述实施例的作用在于说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和保护范围。当前第1页1 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