一种表达载体及其在制备转基因植物中的应用的制作方法

文档序号:13685297
技术领域本发明涉及生物技术领域,具体涉及一种表达载体及其在制备转基因植物中的应用。

背景技术:
20世纪以来,基因工程育种一直被认为是改良植物产量、品质和抗逆性的有效途径。事实上,利用基因工程育种技术已经培育了一些转基因植物新品种,如转基因大豆、棉花、玉米和油菜等,并在生产实践中得到了大面积应用。尤其近5年来,植物转基因研究的发展非常迅速,利用转基因方法培育的植物品种逐年增加。同时,由于很多国家政府和消费者对转基因植物安全性的重视,以及转基因植物内在的安全性障碍,多数转基因植物品种难以获准商业化生产。其中,筛选标记基因的存在是转基因植物安全性的最大隐患之一。选择标记基因的广泛应用虽然提高了获得转基因植物的效率,但由于选择标记基因大多属于编码抗生素或除草剂的抗性基因,随着选择过程的结束,这些外源选择基因在植物基因组中的存在和表达变的多余,且它们会随着转基因植物的繁育而遗传给子代,从而引发有关转基因植物安全的许多问题。转基因植物安全问题主要体现在食品安全和环境安全两个层面。在食品安全方面,抗生素类基因及其产物对人类或者畜牧可能具有潜在毒性及致敏性,一旦食物中有所残留,它们将有可能传入微生物中,进而可能增加人或动物消化道内的微生物数量,危及人及牲畜的健康。在环境安全方面,选择标记基因有可能会通过基因漂移传播到野生近缘种中,使杂草获得相应抗性,导致超级杂草的出现,此外,选择标记基因传播到其他生物体中,可能会破坏生态系统的平衡。选择标记基因及其它冗余基因的剔除,可降低转基因植物的潜在风险,利于转基因植物安全评价和推广。故此,培育安全型转基因植物是目前的研究热点之一。获得转基因植物涉及到的筛选标记有两类,一类是细菌筛选标记,如amp、kan、aadA等,用于筛选构建的载体及转化的细菌;另一类是植物筛选标记,如nptII、bar、hpt等,用于筛选转化的植物细胞和再生植株。基因枪介导法不但转入了植物筛选标记,也转入了细菌筛选标记。农杆菌介导法虽然可以避免将细菌筛选标记引入植物,但位于同一T-DNA区域的目标基因与筛选标记转入植物后紧密连锁。因此,人们先后提出了几种获得无筛选标记转基因植物的技术,包括共转化法、定位重组体系、多元自动转化载体系统、转座子系统和同源重组体系等,但只有共转化法应用最为成功。基因枪介导的共转化法虽然可以去除植物筛选标记,但不能去除细菌筛选标记。农杆菌介导的共转化法不但可以避免将细菌筛选标记转入植物,而且可以避免将nptII、bar、hpt等筛选标记转入植物,在获得安全型转基因植物方面具有独特优势。在利用农杆菌介导的共转化法获得安全型转基因植物方面,构建含目标基因的双T-DNA载体是一项非常烦琐的工作。虽然有报道通过构建双T-DNA载体获得了无筛选标记基因的转基因烟草、大豆等,但这些双T-DNA载体由于缺少调控序列和多克隆位点,并不通用,每转化一个基因都需要经过几个中间载体从头开始构建双T-DNA载体,费时费力,而且又难以成功。所以,开发一个既含双T-DNA区段和多克隆位点又含调控序列和适宜筛选标记的双元表达载体,能够方便、快捷插入目标基因全长cDNA或gDNA,对于获得安全型转基因植物具有重要意义。此外,一般利用转基因对基因的功能进行验证时,主要采取过表达该基因和沉默该基因两种途径,因此构建一个既能进行过表达又能沉默(RNA干扰)的无筛选标记的安全型转基因载体也尤其重要。

技术实现要素:
本发明所要解决的技术问题是如何获得安全型的转基因植物。为解决上述技术问题,本发明首先提供了一种表达载体。本发明所提供的表达载体,包含表达盒甲和表达盒乙;所述表达盒甲依次包括如下元件:启动子甲、选择标记基因和终止序列甲;所述表达盒乙依次包括如下元件:启动子乙、内含子和终止序列乙;所述表达盒乙中,所述启动子乙和所述内含子之间具有多克隆位点甲;所述内含子和所述终止序列之间具有多克隆位点乙;所述多克隆位点甲和所述多克隆位点乙中均具有一个以上酶切识别序列;所述表达载体中其它位置的酶切识别序列与所述多克隆位点甲中的酶切识别序列和所述多克隆位点乙中的酶切识别序列均不相同。所述启动子甲可为35S启动子或UBI启动子。所述启动子乙可为35S启动子或UBI启动子。所述终止序列甲可为NOS终止子或ployA。所述终止序列乙可为NOS终止子或ployA。所述35S启动子的核苷酸序列可为序列表中序列1自5'末端起第2213至3039位的反向互补序列。所述UBI启动子的核苷酸序列可为序列表序列1的自5’末端起第10950至12942位的反向互补序列。所述NOS终止子的核苷酸序列可为序列表序列1的自5’末端起第10121至10395位的反向互补序列。所述ployA的核苷酸序列可为序列表中序列1自5'末端起第1479至1647位的反向互补序列。所述选择标记基因可为bar基因。所述bar基因的核苷酸序列可为序列表中序列1自5'末端起第1648至2212位的反向互补序列。所述多克隆位点甲中可具有如下酶切识别序列:PstⅠ、BamHⅠ、SmaⅠ、KpnⅠ、SalⅠ、NheⅠ和XholⅠ。所述多克隆位点乙中可具有如下酶切识别序列:SpeⅠ和SacⅠ。所述多克隆位点甲的核苷酸序列可为序列表中序列1自5'末端起第10894至10949位的反向互补序列。所述多克隆位点乙的核苷酸序列可为序列表中序列1自5'末端起第10396至10404位的反向互补序列。所述表达载体自5'末端至3'末端依次可包括所述表达盒甲和所述表达盒乙。所述表达载体的核苷酸序列具体可如序列表中序列1所示。上述任一所述表达载体在制备转基因植物中的应用也属于本发明的保护范围。上述任一所述表达载体在制备转基因植物中的应用具体可为通过上述任一所述的表达载体将目的基因导入受体植物,得到转基因植物;该转基因植物与受体植物相比,所述目的基因的表达升高。在本发明的一个实施例中,所述目的基因具体为GUS基因。上述任一所述表达载体在制备转基因植物中的应用具体可为通过上述任一所述表达载体使受体植物中的目的基因功能丧失,得到转基因植物;该转基因植物与受体植物相比,所述目的基因的表达降低;所述“使受体植物中的目的基因功能丧失”是通过RNA干扰实现的。为解决上述问题,本发明还提供了制备转基因植物的方法。本发明所提供的制备转基因植物的方法具体可为方法一,包括如下步骤:将目的基因插入上述任一所述的表达载体中的所述表达盒乙中的酶切识别序列,然后转化受体植物,借助选择标记基因进行筛选,得到T0代植株;将所述T0代植株进行自交,得到含有所述目的基因且不含有所述选择标记基因的T1代植株,即无选择标记的转基因植株。本发明所提供的制备转基因植物的方法具体可为方法二,包括如下步骤:以上述任一所述的表达载体为出发载体,在多克隆位点甲中插入目的基因中的特定区段,在多克隆位点乙中插入所述目的基因中的特定区段的反向互补序列,得到目的载体;将所述目的载体转化受体植物,借助选择标记基因进行筛选,得到T0代植株;将所述T0代植株进行自交,得到不含有所述目的基因且不含有所述选择标记基因的T1代植株,即无选择标记的转基因植株。上述方法中,所述选择标记基因具体可为bar基因。上述方法中,所述受体植物可为如下a1)至a8)中的任一种:a1)双子叶植物;a2)单子叶植物;a3)水稻;a4)玉米;a5)大麦;a6)黑麦;a7)小麦;a8)小麦品种Fielder。实验证明,将GUS基因(目的基因)插入本发明提供的表达载体,然后转化小麦品种Fielder,借助bar基因进行筛选,得到转GUS基因和Bar基因的T0代植株;将该T0代植株进行自交,得到含有所述GUS基因且不含有Bar基因的T1代转基因小麦植株,即无选择标记的转基因植株,获得无选择标记的转基因植株的比率为3.23%。因此,本发明提供的表达载体在获得安全型转基因植物方面具有重要应用价值。附图说明图1为T0代转基因小麦植株的Bar试纸条检测。图2为T0代转基因小麦植株的GUS染色。图3为T0代转基因小麦植株的Southern杂交。图4为T1代转基因小麦植株的分子检测。图5为T1代转基因小麦植株的Southern杂交。具体实施方式下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述,给出的实施例仅为了阐明本发明,而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验,均设置三次重复实验,结果取平均值。根癌农杆菌C58C1为BioVectorNTCC中国质粒载体菌种细胞基因保藏中心的产品(网址为http://biovector.chemdrug.com/;电话:18901268599)。MS基本培养基(不含维生素)为北京西美杰科技有限公司产品,货号为M524。MS基本培养基(含维生素)为北京西美杰科技有限公司产品,货号为M519。所述光照交替培养即光培养和暗培养交替,条件为:28℃;14小时光照培养/10小时黑暗培养;光照培养的光照强度为90μE/m2/s。载体pPTN290记载于如下文献中:HoweA1,SatoS,DweikatI,FrommM,ClementeT.RapidandreproducibleAgrobacterium-mediatedtransformationofsorghum.PlantCellRep.2006Aug;25(8):784-91.染色液:将38mLNaH2PO4水溶液(浓度为0.2mol·L-1)、62mLNa2HPO4水溶液(浓度为0.2mol·L-1)、1mLK3[Fe(CN)6]水溶液(浓度为0.1mol·L-1)、1mLK4[Fe(CN)6]水溶液(浓度为0.1mol·L-1)、4mLNa2EDTA水溶液(浓度为0.5mol·L-1)、200mgX-Gluc、50mL甲醇和120μlTriton-X溶于蒸馏水,用蒸馏水定容至250mL。小麦品种Fielder记载在如下文献中:刘盼.小麦TaERF5基因多样性与功能分析[D].北京:中国农业科学院,2015.小麦品种Fielder以下简称Fielder。下述实施例中涉及的培养基如下:愈伤组织诱导培养基Ⅰ(简称SD2培养基):将MS基本培养基(不含维生素)4.33g、Vb11mg、天冬酰胺150mg、蔗糖30g、2,4-D2mg和植物凝胶2.4g溶于1L蒸馏水,调节pH至5.8,121℃灭菌15min。共培养培养基(简称WCCⅠ培养基):将MS基本培养基(含维生素)0.443g、麦芽糖40g、MgCl20.75g、MES1.95g、谷氨酰胺0.5g、水解酪蛋白0.1g、葡萄糖10g、维生素C100mg、Picloram2.2mg和乙酰丁香酮(Acetosyringone,AS)39mg溶于1L蒸馏水,调节pH至5.4,121℃灭菌15min。恢复培养基:含250mg/L羧苄青霉素的SD2培养基。筛选培养基:将MS基本培养基(含维生素)4.43g、蔗糖30g、天冬素150mg、2,4-D2mg、Glufosinate5mg、250mg羧苄青霉素和植物凝胶2.4g溶于1L蒸馏水,调节pH至5.8,121℃灭菌15min。分化培养基:将MS基本培养基(含维生素)4.43g、蔗糖30g、2,4-D0.2mg、维生素C0.1mg、Glufosinate5mg、250mg羧苄青霉素和植物凝胶2.4g溶于1L蒸馏水,调节pH至5.8,121℃灭菌15min。壮苗培养基:将MS基本培养基(含维生素)4.43g、蔗糖20g、IAA0.2mg、MET0.5mg、Glufosinate5mg、100mg羧苄青霉素和植物凝胶2.4g溶于1L蒸馏水,调节pH至5.8,121℃灭菌15min。实施例1、载体pWMB122的获得人工合成质粒pWMB122,质粒pWMB122(环形)的核苷酸序列如序列表序列1所示。质粒pWMB122中具有两个表达盒,分别命名为表达盒甲和表达盒乙。表达盒甲的反向互补序列如序列表序列1的自5’末端第1479至3039位所示,其中序列表序列1的自5’末端第2213至3039位为35S启动子的反向互补序列,第1648至2212位为bar蛋白的编码基因的反向互补序列,第1479至1647位为ployA的反向互补序列(用于终止转录)。表达盒乙的反向互补序列如序列表序列1的自5’末端第10121至12942位所示,其中序列表序列1的自5’末端第10950至12942位为UBI启动子的反向互补序列,第10894至10949位为多克隆位点甲(多克隆位点甲包括限制性内切酶PstⅠ、BamHⅠ、SmaⅠ、KpnⅠ、SalⅠ、NheⅠ和XholⅠ等)的反向互补序列,第10405至10893位为来源于水稻的内含子的反向互补序列,第10396至10404位为多克隆位点乙(多克隆位点乙包括限制性内切酶(SpeⅠ和SacⅠ)的反向互补序列,第10121至10395位为NOS终止子的反向互补序列。质粒pWMB122即为获得的载体pWMB122。实施例2、小麦的遗传转化和T0代转基因小麦植株的检测一、重组质粒pWMB123的构建1、人工合成引物GusF110-3:5'-AAAGGATCCATGACCACCAGTGCAAG-3'(下划线为限制性内酶切BamHⅠ的识别序列)和GusR110-3:5'-AAAGAGCTCTCTCACACGTGATGGTGTGGTG-3'(下划线为限制性内酶切SacⅠ的识别序列)。2、以载体pPTN290为模板,以步骤1合成的GusF110-3和GusR110-3为引物进行PCR扩增,获得约2084bp的双链DNA分子。3、完成步骤2后,用限制性内酶切BamHⅠ和SacⅠ双酶切步骤2获得的双链DNA分子,回收酶切片段。4、用限制性内酶切BamHⅠ和SacⅠ双酶切质粒pWMB122,回收约13kb的载体骨架。5、将步骤3回收的酶切片段与步骤4得到的载体骨架连接,得到重组质粒pWMB123。根据测序结果,对重组质粒pWMB123进行结构描述如下:将载体pWMB122的BamHⅠ和SacⅠ识别序列间的片段(载体pWMB122被限制性核酸内切酶BamHⅠ和SacⅠ切成一个大片段和一个小片段,该DNA为该小片段)替换为序列表中序列2所示的DNA分子。重组质粒pWMB123中含有一个由UBI启动子启动GUS基因表达的表达盒。二、重组农杆菌的获得将重组质粒pWMB123导入根癌农杆菌C58C1,得到重组农杆菌,命名为C58C1/pWMB123。将质粒pWMB122导入根癌农杆菌C58C1,得到重组农杆菌,命名为C58C1/pWMB122。三、小麦的遗传转化1、将C58C1/pWMB123单克隆接种于20mL含卡那霉素50mg/L和利福平50mg/L的YEB液体培养基,28℃、220rpm震荡培养12~16h后,然后按2%-4%(体积百分含量)的比例接种于含乙酰丁香酮100μM的YEB液体培养基,28℃、220rpm振荡培养至OD600值达到0.6~0.8,4℃、3500rpm离心10min,收集菌体。2、取步骤1收集的菌体,用WCCⅠ培养基悬浮,得到OD600值为0.7左右的农杆菌侵染液。3、取Fielder的幼胚,置于SD2培养基,28℃光照交替培养4天,得到小麦幼胚外植体。4、取小麦幼胚外植体,浸泡于农杆菌侵染液,室温侵染30min,然后放在铺有一层灭菌滤纸的共培养培养基上,25℃暗培养2天。5、完成步骤4后,取愈伤组织置于恢复培养基,25℃暗培养5天。6、完成步骤5后,取愈伤组织,置于筛选培养基,25℃暗培养14~21天,得到胚性愈伤组织。7、完成步骤6后,取胚性愈伤组织,置于分化培养基,25℃光照交替培养21~28天,得到抗性苗。8、完成步骤7后,取抗性苗,置于壮苗培养基,25℃光照交替培养,得到抗性植株。待抗性植株长至6~10cm时,清洗琼脂转移至花盆中,获得235个T0代拟转基因小麦植株。按照上述步骤,将C58C1/pWMB123替换为C58C1/pWMB122,其它步骤均不变,得到空载体植株。四、T0代拟转基因小麦植株的检测1、Bar免疫检测试纸鉴定(1)取T0代拟转基因小麦植株的叶片0.1g,放入离心管(体积为2mL)中,研磨。然后加入QuickStixKit试剂盒(美国Envirologix公司产品)附赠蛋白提取液EB2缓冲液500μL,混匀。(2)样本检测将Bar免疫检测试纸恢复至室温,然后将该检测试纸垂直插入完成步骤(1)的离心管中,淹没深度约为0.5cm,1min后取出放平阅读检测结果。(3)结果判断检测线及对照线一般可在30s内出现,检测标准为:在检测条上仅出现一条紫红色质控线为阴性结果;在检测条上出现两条紫红色条带,一条为紫红色检测线,一条为紫红色质控线,此为阳性结果。凡能得到两条紫红色条带的T0代拟转基因小麦植株鉴定为转bar基因小麦植株;凡能得到一条紫红色条带的T0代拟转基因小麦植株鉴定为非转bar基因小麦植株。实验结果见图1。2、GUS染色检测(1)取T0代拟转基因小麦植株的叶片,剪成约0.5cm长的小段,置于培养皿。(2)取所述培养皿,加入染色液,进行GUS染色。(3)结果判断:如果叶片呈现蓝色,则为阳性结果;如果叶片不呈现蓝色,则为阴性结果。凡叶片呈现蓝色的T0代拟转基因小麦植株,则鉴定为转GUS基因小麦植株;凡叶片不呈现蓝色的T0代拟转基因小麦植株,则鉴定为非转GUS基因小麦植株。实验结果见图2。3、Southern杂交提取T0代拟转基因小麦植株的基因组DNA,分别以序列表中序列2第675至1670位的反向互补序列为探针序列和序列表中序列1第1654至2204位所示的探针序列进行Southern杂交。以序列表中序列2第675至1670位的反向互补序列为探针序列进行Southern杂交的结果见图3中A(泳道1-11为T0代拟转基因小麦植株,泳道P为重组质粒pWMB123,泳道M为DNAMarker)。以序列表中序列1第1654至2204位所示的探针序列进行Southern杂交的结果见图3中B(泳道1-11为T0代拟转基因小麦植株,泳道P为重组质粒pWMB123,泳道M为DNAMarker)。如果以序列表中序列2第675至1670位的反向互补序列为探针序列能进行Southern杂交且以序列表中序列1第1654至2204位所示的探针序列能进行Southern杂交,则该T0代拟转基因小麦植株鉴定为转GUS基因和Bar基因的小麦植株。五、安全型转GUS基因小麦植株的获得将步骤四获得的转GUS基因和Bar基因的小麦植株在温室中培养至成熟,自交,收获种子。将每株转GUS基因和Bar基因的小麦植株作为一个T1代株系(即T1代转基因小麦株系)。随机选择14个T1代转基因小麦株系(编号为L1至L14)进行检测分子检测和Southern杂交。1、分子检测分别用处于抽穗期的T1代转基因小麦的叶片的基因组DNA作为模板,采用引物F1:5'-CAAGGAAATCCGCAACCATATC-3'和引物R1:5'-TCAAACGTCCGAATCTTCTCCC-3'组成的引物对甲进行PCR扩增,用于鉴定GUS基因;采用引物F2:5'-ACCATCGTCAACCACTACATCG-3'和引物R2:5'-GCTGCCAGAAACCCACGTCATG-3'组成的引物对乙进行PCR扩增,用于鉴定bar基因。采用引物对甲进行PCR扩增的电泳图见图4中A,采用引物对乙进行PCR扩增的电泳图见图4中B(图4中,泳道1-14为L1至L14,泳道P为重组质粒pWMB123,泳道CK为Fielder叶片的基因组DNA,泳道M为DNAMarker)。结果显示,泳道6、7、8和9采用引物对甲能够获得大小约为995bp条带(图4中A的箭头所示),且采用引物对乙不能够获得大小约为429bp条带(图4中B的箭头所示)。因此,L6、L7、L8和L9为仅含GUS基因的T1代安全型转基因小麦植株。2、Southern杂交利用Southern杂交进行进一步验证。提取处于抽穗期的T1代转基因小麦的叶片的基因组DNA,分别以序列表中序列2第675至1670位的反向互补序列为探针序列和序列表中序列1第1654至2204位所示的探针序列进行Southern杂交。以序列表中序列2第675至1670位的反向互补序列为探针序列进行Southern杂交的结果见图5中A(泳道1-11为L3至L13,泳道P为重组质粒pWMB123,泳道M为DNAMarker)。以序列表中序列1第1654至2204位所示的探针序列进行Southern杂交的结果见图5中B(泳道1-11为L3至L13,泳道P为重组质粒pWMB123,泳道M为DNAMarker)。结果显示,泳道4-7以序列表中序列2第675至1670位的反向互补序列为探针序列能进行Southern杂交且以序列表中序列1第1654至2204位所示的探针序列不能进行Southern杂交,说明L6、L7、L8和L9为仅含GUS基因的T1代安全型转基因小麦植株。对12个T1代转基因小麦株系中的GUS基因和Bar基因的分离情况进行了统计,统计结果见表1,结果表明,获得仅含GUS基因的T1代转基因小麦植株的比率为3.23%。表1.T1代小麦转基因株系的分离比例统计
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