利用线粒体分子标记鉴定牧草盲蝽种群的方法

文档序号:11023374阅读:288来源:国知局
利用线粒体分子标记鉴定牧草盲蝽种群的方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及分子生物学领域,具体地说,设及一种利用线粒体分子标记鉴定牧草 盲睹种群的方法。
【背景技术】
[0002] 牧草盲睹化ygus pratensis)属于盲睹科(Miridae)草盲睹属(XygUS),为棉田重 要的害虫种类之一,尤其是近十年来,随着转基因棉花的大量种植,伴随着化学农药的减少 使用,该虫已经从次要害虫上升为主要害虫,特别是我国的西北棉区呈急剧上升趋势。牧草 盲睹种群数量大范围内的明显增加和空间范围的扩张给防治工作带来很大挑战。
[0003] 大量的研究表明牧草盲睹虽然在中国西北地区种群数量大且危害严重,但该昆虫 的外部形态特征在不同地理种群间差异并不明显,很难进行区分,因此通过外部形态特征 实现不同地区种群的鉴定是非常困难的。线粒体基因在遗传过程中严格遵守母系遗传,进 化速率快,在短时间内即能完成谱系分化,因此利用线粒体分子标记对牧草盲睹新疆地区 和甘肃、宁夏地区种群进行鉴定是一种非常可靠的分子生物学方法。

【发明内容】

[0004] 本发明的目的是提供一种利用线粒体分子标记快速鉴定牧草盲睹种群的方法,特 别是对新疆种群W及甘肃、宁夏种群进行鉴别。
[0005] 为了实现本发明目的,本发明提供用于鉴定牧草盲睹种群的PCR引物组合,所述引 物组合包括引物对①~④中的至少两种:① PCR扩增牧草盲睹线粒体细胞色素氧化酶II基 因的引物对,②扩增细胞色素 b基因的引物对,③扩增线粒体NADH脱氨酶亚基5基因的引物 对;④扩增16S rDNA的引物对;引物序列如下:
[0006] @1^-C0II-F: 5' - TGGCAGAATAAGTGCCATGA- 3 '
[0007] kCOII-R:5'-GAGACCAATGCTTTCTTTCAGC-3'
[0008] ②L-ND5-F:5 '-AAACATAATTACCTGAACCCATGAA-3 '
[0009] L-ND5-R:5'-TCTTCAACTTTAGTAACTGCAGGAG-3 '
[0010] 忧-F: 5 ' -TCTAATTGATCTTCCTAGCCCAAG-3 '
[0011] kCy忧-R: 5 ' -CCGTGCTCCAATTCATGTTA-3 '
[0012] @kl6S-F: 5' - TCCACAAATATCCCCAATCTG-3 '
[0013] L-16S-R:5'-CCTTGAAATGTCCCTTCTCG-3 '
[0014] 优选所述引物组合包括引物对①~④。
[001引本发明还提供含有所述引物组合的用于鉴定牧草盲睹种群的PCR检现聯剂盒。
[0016] 优选地,所述试剂盒还包括dNTPs、化q DNA聚合酶、Mg2+、PCR反应缓冲液、标准阳性 模板等中的至少一种。
[0017] 本发明还提供利用线粒体分子标记鉴定牧草盲睹种群的方法,包括W下步骤:
[001引1)提取待测牧草盲睹的基因组DNA;
[0019] 2) W步骤I)中提取的DM为模板,利用引物对①~④分别进行PCR扩增反应;
[0020] 3)纯化并分析PCR产物。
[0021] PCR反应体系为:5 XPCR反应缓冲液扣L,IOmM dNTPs 0.化L,抓AU hq DNA聚合 酶0. ,IOiiM上、下游引物各化L,模板DNA化L,无菌水补足至25化。
[0022] PCR 扩增程序为:94°C 预变性 3min;94°C 变性 lmin,55°C 退火 lmin,72°C 延伸 Imin, 30个循环;72°C延伸5min,4°C保存。
[0023] 前述的方法,步骤3)中分别对PCR产物进行纯化和测序后,将测序结果按照COII-ND5-切tb-16S rDNA串联拼接,串联序列大小为3190bp,新疆种群第300、543、1204、1279、 1981、2509、2999、316化9处碱基依次为4、4、1/6、4、4、4、(:,甘肃宁夏种群依次为6、6、(:、4、6、 G、G、T O
[0024] 将上述位点作为分子标记,从而实现对我国牧草盲睹种群,特别是新疆种群W及 甘肃、宁夏种群的鉴定。
[0025] 本发明提供的分子鉴别方法简单可靠,可操作性强,稳定性好,可重复性强。
【附图说明】
[0026] 图1为本发明实施例1中牧草盲睹新疆种群和甘肃、宁夏种群的线粒体细胞色素氧 化酶II(COII)、细胞色素 b(切tb)、线粒体NADH脱氨酶亚基5(ND5)和16S rDNA,四个基因片 段的串联序列比对结果;其中,表示相同碱基。
[0027] 图2为本发明实施例3中利用引物心切计斗凡-切tb-R进行PCR扩增的结果;其中, 泳道1-15为牧草盲睹样本,16-21为长毛草盲睹,22-24为阴性对照,M为2000bp DNA Markero
[00%]图3为本发明实施例3中引物心切计斗凡-切计-1?的PCR扩增反应体系灵敏度检测 结果;其中,1-6分别代表DNA样品经1〇1、102、103、104、10 5、IO6倍稀释结果,7-9为阴性对照,M 为2000bp DNA Marker。
[0029] 图4为本发明实施例4中利用引物kND5-F/L-ND5-R进行PCR扩增的结果;其中,泳 道1-15为牧草盲睹样本,16-21为长毛草盲睹,22-24为阴性对照,M为2000bp DNA Marker。
[0030] 图5为本发明实施例4中引物kND5-F/l-ND5-R的PCR扩增反应体系灵敏度检测结 果;其中,1-6分别代表DNA样品经1〇1、IO 2、IO3、104、IO5、IO6倍稀释结果,7-9为阴性对照,M为 2000bp DNA Marker。
【具体实施方式】
[0031] W下实施例用于说明本发明,但不用来限制本发明的范围。若未特别指明,实施例 均按照常规实验条件,如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J & Russell DW, Molecular cloning:a Iaboratoiy manual,2001),或按照制造厂商说明书建议的条件。
[0032] 实施例1用于鉴定牧草盲睹种群的PCR引物组合的设计与合成
[0033] 根据牧草盲睹线粒体细胞色素氧化酶II(COII)基因、细胞色素 b(切tb)基因、线粒 体NADH脱氨酶亚基5(ND5)基因 W及16S rDNA序列,利用Primer Prime巧软件分别设计用于 PCR扩增上述四个基因的特异性引物。引物序列如下(SEQ ID N0:l-8):
[0034] @1^-C0II-F: 5' - TGGCAGAATAAGTGCCATGA- 3 '
[0035] kCOII-R:5'-GAGACCAATGCTTTCTTTCAGC-3'
[0036] ②L-ND5-F:5,-AAACATAATTACCTGAACCCATGAA-3 '
[0037] L-ND5-R:5'-TCTTCAACTTTAGTAACTGCAGGAG-3 '
[0038] 忧-F: 5 ' -TCTAATTGATCTTCCTAGCCCAAG-3 '
[0039] kCy忧-R: 5 ' -CCGTGCTCCAATTCATGTTA-3 '
[0040] @kl6S-F: 5' -TCCACAAATATCCCCAATCTG-3 '
[0041 ] L-16S-R:5'-CCTTGAAATGTCCCTTCTCG-3 '
[0042] 上述引物由上海生物工程技术服务有限公司合成。
[0043] 实施例2利用线粒体分子标记快速鉴定牧草盲睹新疆种群W及甘肃宁夏种群的方 法
[0044] 1、采集新疆、甘肃和宁夏的牧草盲睹个体,提取全基因组DNA
[0045] 中国的新疆、甘肃和宁夏地区分别选取代表种群,即在新疆地区的库车、库尔勒和 莎车,甘肃地区的武威,宁夏地区青铜峡采集牧草盲睹个体。牧草盲睹的野外采集使用网捕 法,利用吸虫管收集成虫,再将成虫放入无水乙醇中,然后带回实验室内,采用体式解剖镜 进一步对成虫形态特征进行鉴定确认,确保种类鉴定正确无误。
[0046] 提取基因组DNA时,将成虫腹部和翅去除,剩余组织结构作为试验材料,采用天根 生化科技有限公司生产的TIANamp Genomic DNA试剂盒提取因组DNA。参照说明书操作。
[0047] 2、四种线粒体分子标记的PCR扩增
[0048] 利用实施例1合成的引物进行四种线粒体分子标记的PCR扩增,扩增反应在美国 Bio-RAD公司生产的Myclycler,SlOO PCR扩增仪上进行。
[0049] PCR反应体系为:5 XPCR反应缓冲液扣L,IOmM dNTPs 0.化L,抓AU hq DNA聚合 酶0. ,IOiiM上、下游引物各化L,模板DNA化L,无菌水补足至25化。
[00 加 ]PCR 扩增程序为:94°C 预变性 3min;94°C 变性 1111111,55。(:退火1111111,72。(:延伸1111111, 30个循环;72°C延伸5min,4°C保存。
[0化1] 3、PCR产物纯化
[0052] PCR产物采用1 %琼脂糖凝胶检测,EB染色,在凝胶成像仪器中将PCR产物切胶回 收,用PCR产物纯化试剂盒(购自上海生工生物工程有限公司)进行纯化,参照说明书操作。 [0化3] 4、纯化PCR产物测序和序列比对
[0054] 将纯化的PCR产物送金唯智生物科技有限公司进行测序,采用双向测序方法,测序 反应在3730化DNA Genetic Analyser(ABI)测序仪上进行。获得测序结果后,利用BioEdit version 7.0.5序列分析软件进行双向测序结果的拼接及序列的校对。利用Clustal X2软 件进行序列比对,从而得到不同地区牧草盲睹种群线粒体序列间保守碱基位点和变异碱基 位点,通过碱基变异位点对新疆种群W及甘肃、宁夏种群进行鉴别。
[0055] 本实施例中区别我国新疆地区的库车、库尔勒、莎车种群和甘肃地区的武威、宁夏 地区的青铜峡牧草盲睹种群四个线粒体分子标记的串联序列(C0II-ND5-切tb-16S rDNA) 比对结果如图1所示。
[0056] 新疆地区库车、库尔勒、莎车种群和甘肃地区武威、宁夏地区青铜峡牧草盲睹种群 线粒体基因串联序列(31Wbp)的比对结果显示,五个地区=大种群存在8个碱基的转换,其 中第300、543、1981、2509、2999碱基位点为4一6转换;第1279碱基位点为6-4转换;第1204 位点为T-C转换;第3161位点为C-T转换。将上述位点作为分子标记,从而实现对我国牧草 盲睹种群,特别是新疆种群W及甘肃、宁夏种群的鉴定。
[0057]本方法稳定性好,可重复性强,操作简单易行,因此利用本发明的四种线粒体分子 标记能够快速的区分牧草盲睹新疆、甘肃、宁夏地区种群。
[005引实施例3利用PCR引物kCy忧-FA-Cy忧-R检测牧草盲睹的特异性和灵敏度分析 [0化9] 1、样本来源:
[0060]本实施例中使用两种草盲睹,其中牧草盲睹来自于新疆的库尔勒、甘肃武威、宁夏 青铜峡地区;同属于草盲睹属的长毛草盲睹化ygus rugulipennis)来自于新疆的库尔勒、 库车、莎车地区,运些样本保存于中国农业科学院棉花研究所植物保护研究室。
[0061 ] 2、DNA 提取:
[0062]同实施例2所述。
[006;3] 3、PCR 扩增:
[0064] PCR反应体系和PCR扩增程序同实施例2所述。
[00化]4、结果分析:
[0066] 取PCR扩增产物化L,在2%琼脂糖凝胶上进行电泳,电压为150V,25~30分钟后在 紫外光下检测结果,如果出现大小约910bp的特征条带,则证明所检测样本为牧草盲睹。电 泳检测结果如图2所示,泳道1-15为牧草盲睹样本,均能扩增出约91化P的特征条带,而同属 长毛草盲睹未出现条带。上述结果表明引物kCy忧-FA-Cy忧-R的特异性强。
[0067] 将DNA样品分别进行10l、102、103、104、105、10 6倍浓度梯度,并W稀释的DNA样品为 模板进行PCR扩增反应。PCR扩增程序和扩增产物检测方法同上。结果如图3所示,当稀释至 IO3倍时,条带不明显。因此,该引物对的灵敏度可达7.99ng/iiL,检测灵敏度高。
[006引实施例4利用PCR引物kND5-F/l-ND5-R检测牧草盲睹的特异性和灵敏度分析
[0069] PCR反应使用的引物为レND5-F和レND5-R,PCR扩增反应和扩增产物检测方法同实 施例3所述,引物的特异性和灵敏度分析方法同实施例3。
[0070] PCR扩增反应结束后,取扩增产物扣L在2%琼脂糖凝胶上进行电泳检测,如果出现 大小约570bp的特征条带,则证明所检测样本为牧草盲睹,而同属长毛草盲睹未出现条带。 电泳检测结果如图4所示,泳道1-15为牧草盲睹样本,均能扩增出约57化P的特征条带,而同 属长毛草盲睹未出现条带。该结果表明引物レND5-F和レND5-R的特异性强。
[0071] 将DNA样品分别进行10l、102、103、104、105、10 6倍浓度梯度,并W稀释的DNA样品为 模板进行PCR扩增反应。PCR扩增程序和扩增产物检测方法同上。结果如图5所示,当稀释至 IO6倍时,条带不明显。因此,该引物对的灵敏度可达7.99Xl(T3ngAiL,检测灵敏度最高。
[0072] 虽然,上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述,但在 本发明基础上,可W对之作一些修改或改进,运对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此,在不偏离本发明精神的基础上所做的运些修改或改进,均属于本发明要求保护的范围。
【主权项】
1. 用于鉴定牧草盲蝽种群的PCR引物组合,其特征在于,所述引物组合包括引物对①~ ④中的至少两种:① PCR扩增牧草盲蝽线粒体细胞色素氧化酶II基因的引物对,②扩增细胞 色素 b基因的引物对,③扩增线粒体NADH脱氢酶亚基5基因的引物对;④扩增16S rDNA的引 物对;引物序列如下: ?L-COII-F:5,-TGGCAGAATAAGTGCCATGA-3 ' L-COII-R:5'-GAGACCAATGCTTTCTTTCAGC-3' ② L-ND5-F:5,-AAACATAATTACCTGAACCCATGAA-3 ' L-ND5-R:5,-TCTTCAACTTTAGTAACTGCAGGAG-3 ' ③ L-Cytb-F:5 '-TCTAATTGATCTTCCTAGCCCAAG-3 ' L-Cytb-R:5 '-CCGTGCTCCAATTCATGTTA-3 ' ?L-16S-F:5 '-TCCACAAATATCCCCAATCTG-3 ' L-16S-R:5 '-CCTTGAAATGTCCCTTCTCG-3 '。2. 根据权利要求1所述的PCR引物组合,其特征在于,所述引物组合包括引物对①~④。3. 含有权利要求1或2所述引物组合的用于鉴定牧草盲蝽种群的PCR检测试剂盒。4. 根据权利要求3所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括dNTPs、Taq DNA聚合 酶、Mg2+、PCR反应缓冲液、标准阳性模板中的至少一种。5. 利用线粒体分子标记鉴定牧草盲蝽种群的方法,其特征在于,包括以下步骤: 1) 提取待测牧草盲蝽的基因组DNA; 2) 以步骤1)中提取的DNA为模板,利用权利要求1或2所述引物对①~④分别进行PCR扩 增反应; 3) 纯化并分析PCR产物。6. 根据权利要求5所述的方法,其特征在于,PCR反应体系为:5 X PCR反应缓冲液5yL, 10mM dNTPs 0.5yL,5UAU Taq DNA聚合酶0·5μL,10μΜ上、下游引物各lyL,模板DNA 2yL,无 菌水补足至25yL。7. 根据权利要求5或6所述的方法,其特征在于,PCR扩增程序为:94 °C预变性3min; 94 °C 变性lmin,55°C退火lmin,72°C延伸lmin,30个循环;72°C延伸5min,4°C保存。8. 根据权利要求5-7任一项所述的方法,其特征在于,步骤3)中分别对PCR产物进行纯 化和测序后,将测序结果按照C0II-ND5-Cytb-16S rDNA串联拼接,串联序列大小为3190bp, 新疆种群第 300、543、1204、1279、1981、2509、2999、316比口处碱基依次为4、4、1'、6、4、4、八、(:, 甘肃宁夏种群依次为G、G、C、A、G、G、G、T。
【专利摘要】本发明提供利用线粒体分子标记快速鉴定牧草盲蝽(Lygus pratensis)种群的方法,特别是对新疆种群以及甘肃、宁夏种群进行鉴别。本发明根据牧草盲蝽线粒体细胞色素氧化酶II(COII)、细胞色素b(Cytb)、线粒体NADH脱氢酶亚基5(ND5)、16S rDNA四个基因片段分别设计特异性引物,然后将PCR扩增产物进行串联比对,从而实现对我国牧草盲蝽种群的鉴定。该方法简单可靠,可操作性强,稳定性好,可重复性强。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/68
【公开号】CN105713979
【申请号】CN201610212419
【发明人】张利娟, 崔金杰, 雒珺瑜, 张帅, 王春义, 吕丽敏, 朱香镇, 王丽, 李春花
【申请人】中国农业科学院棉花研究所
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