一种RNAi植物表达载体及其应用的制造方法与工艺

文档序号:11172893阅读:567来源:国知局
一种RNAi植物表达载体及其应用的制造方法与工艺
本发明属于农业生物技术领域,具体涉及一种能够抑制细胞色素P450基因表达的RNAi植物表达载体和其构建方法和应用。

背景技术:
农作物杂种优势利用是农业增产重要手段之一。水稻是全世界最重要的粮食作物之一,具有明显的杂种优势。中国是世界上首个成功实现杂交水稻商品化生产的国家,杂交水稻使我国水稻产量提高了20%,全国杂交水稻常年种植面积已超过水稻年播种面积的50%。“三系法”和“两系法”是目前杂交水稻制种的主要方法,但由于三系核质互作的基因型限制及两系的光温敏在特殊条件下的不稳定,杂交水稻产业的发展已受到制约。美国先锋公司的SPT技术利用转基因技术成功解决了杂交制种中的一系列问题,并于2012年在玉米中实现商业化应用,水稻杂交制种也极有可能利用类似SPT技术实现更新换代。同时,转基因技术在各种农作物领域的应用越来越广泛。然而转基因产品自诞生之日起产生的争议,至今仍甚嚣尘上。因此,转基因产品需要加以严格的控制和监管,防止转基因漂移污染其他品种甚至其他物种就显得尤为重要。因此,需要建立一种能够定向清除杂交种子或转基因植株的机制。培育获得除草剂敏感的不育系是解决问题的有效手段之一。苯达松(bentazon)是一种苯并噻二唑类除草剂,属杂环类选择性化学除草剂,多数阔叶类杂草和莎草科杂草对苯达松敏感,而包括水稻在内的禾本科和豆科植物则对其有较强的耐药性,苯达松具有广谱,高效,低毒的特性。因此,苯达松用于清除稻田的阔叶类杂草和莎草科杂草十分有效,而对水稻又十分安全(张集文(2010)水稻苯达松敏感突变研究进展.中国水稻科学24:551-558)。水稻对苯达松抗性由一个单隐性基因细胞色素P450(CYP81A6)控制,该基因位于水稻第3号染色体上,参与苯达松在植物体内的羟基化脱毒过程。苯达松敏感型突变体“Norin8m”、“M8077S”、“嘉浙mB”、“GZmlS”和“GZm2S”等都是由于CYP81A6基因突变造成的。CYP81A6基因的突变,导致上述突变体无法在体内降解苯达松,从而导致喷施苯达松除草剂时,植物死亡。同时,该细胞色素P450也是磺酰脲类除草剂的作用靶标,包含CYP81A6突变基因或苯达松敏感的植物,在喷施磺酰脲类除草剂时,也会导致死亡。因此,有必要开发出一种能够有效的影响水稻细胞色素P450(CYP81A6)表达的技术手段,从而为杂交水稻制种、培育转基因新品种、防止转基因逃逸等方面提供有效管控方案。

技术实现要素:
本发明的目的是提供一种能够有效的影响水稻细胞色素P450(CYP81A6)表达的植物表达载体及其构建方法:为达到以上目的,本发明提供了一种能够抑制细胞色素P450基因表达的RNAi植物表达载体,含有发卡结构表达盒,其中所述发卡结构表达盒含有由SEQIDNo.1-3所示的DNA片段所形成的发卡结构。其中,SEQIDNo.1所示的DNA片段为基于CYP81A6的长度为494bp的正向DNA片段,SEQIDNo.3所示的DNA片段为基于CYP81A6的长度为494bp的与SEQIDNo.1所示的DNA片段反向互补的DNA片段。SEQIDNo.2为来自水稻Zincfinger基因的内含子序列(Riceintron)。SEQIDNo.1至3所示的DNA片段按照从上游到下游的方向依次排列。该发夹表达盒可在转化的植物细胞中转录形成发卡式的二级结构,SEQIDNo.2所示的DNA片段形成发卡的“环”,SEQIDNo.1和3所示的DNA片段互补形成发卡的“茎”。其中,所述发卡结构表达盒还包括位于发卡结构上游的植物组成型启动子或植物组织特异性启动子,以及,位于发卡结构下游的终止子。其中所述植物组成型启动子为水稻或玉米的Ubi启动子、CAMV35S启动子或Actin启动子;所述植物组织特异性启动子为Rubisco小亚基启动子或Cab启动子。优选的,当启动子为水稻或玉米的Ubi启动子时,能够取得非常强的干扰CYP81A6基因表达的效果。所述终止子包括:NOS终止子,Ubi终止子等在植物中可以终止基因转录的DNA序列。优选的,所述终止子为NOS终止子。所述RNAi植物表达载体还包括选择标记表达盒,所述选择标记表达盒含有启动子、标记基因和终止子,其中所述启动子为水稻或玉米的Ubi启动子,CAMV35S启动子或Actin启动子,优选的,当启动子为CAMV35S启动子时,能够取得良好的驱动选择标记基因在植物中超量表达的效果。所述终止子为NOS终止子或Ubi终止子,优选为NOS终止子。所述标记基因为可产生颜色变化的酶的基因(如GUS基因、荧光素酶基因等)、荧光标记基因(如荧光蛋白基因)、抗生素标记基因(可供筛选的抗生素标记如潮霉素、庆大霉素、卡那霉素基因)、除草剂筛选标记基因(如抗草甘膦基因、抗双草醚基因等)或抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因等)。特别优选的,所述标记基因为潮霉素基因。所得到的RNAi植物表达载体pTCK303-P450i-2。特别优选的,所述的RNAi植物表达载体,具有SEQIDNo.4所示的核苷酸序列。其中,所述植物为水稻,优选的,所述植物为转基因水稻株系。值得注意的是,用于RNAi植物表达载体构建的中间载体和具有选择标记基因的RNAi表达载体,工程菌及包含P450i-2茎环结构的细胞、愈伤组织、转基因苗、种子等均属于本发明的保护范围。本发明还提供了一种本发明所述的RNAi植物表达载体在干扰植物细胞色素P450基因CYP81A6表达制备除草剂显性敏感植物中的应用。本发明的RNA...
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