肉果草微卫星分子标记的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种生物科学中的DNA分子标记技术，尤其设及一种肉果草微卫星分 子标记、引物对及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 微卫星分子标记又称作简单序列重复（Simple Sequence Repeats, SSRs)，是指 基因组中Wl-6个核巧酸为单位串联组成的核巧酸序列。由于重复次数的不同或重复程度 的不完全相同，造成了微卫星序列长度的高度变异性，由此产生了微卫星分子标记。虽然微 卫星位点核屯、序列的重复次数在个体间呈高度变异性，但是其两端侧翼序列多是保守的单 拷贝序列，因此可W用两端的侧翼序列设计成对引物，通过PCR技术，经聚丙締酷胺凝胶电 泳(PAGE)或其他适宜方式显示运些分子标记在不同个体间的多态性。微卫星分子标记具有 W下特点：广泛分布于真核生物的基因组中；多态性信息容量高;呈共显性;遵循孟德尔遗 传法则、中性选择等。基于W上特点，微卫星分子标记被广泛用于遗传多样性分析、植物遗 传图谱的构建、基因定位、品种鉴定、种质保存、数量性状基因的分析、进化与亲缘关系等方 面的研究。
[0003] 肉果草化ancea tibetica)，藏名己丫己，隶属于玄参科肉果草属，分布于青藏高 原及其邮邻山区（西藏、青海、甘肃、四川、云南及印属喜马拉雅地区等），生于海拔2000-4500米的草地、疏林中或沟谷旁。肉果草为重要的藏药植物，全草有养肺排脈、清热止咳功 效，花、果能治疗屯、脏病、血性肿瘤(血癌）、哮喘、痛肿疮瘍等。肉果草药理作用主要有如下 几个方面：（1)有抗肿瘤作用；（2)有抗氧化作用；（3)有抗追作用；（4)有抗真菌作用；巧)有 杀菌作用；（6)具有降糖的作用；（7)具有保肝作用。由于其具有很重要的药用价值，肉果草 已经吸引了很多国内外学者的关注。在与玉树等地的藏医交流中发现，肉果草作为一味十 分重要的藏药材，有着较为广泛的应用。但由于对该物种的遗传背景等研究较少，难W开展 人工种植，仅依靠野外采挖获取，加剧了该物种的溯危进程。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是针对现有技术尚未开发肉果草微卫星标记的现状，利用限制性酶 切位点相关DNA的简化基因组测序(RAD-seq)技术开发出肉果草微卫星分子标记并获得对 应的引物，建立一种制备肉果草微卫星分子标记的方法，并由此可W进一步用运些分子标 记进行遗传多样性分析、植物遗传图谱的构建、基因定位、品种鉴定、种质保存、数量性状基 因的分析、进化与亲缘关系研究等。
[0005] 为了实现上述目的，本发明的技术方案为： 一种肉果草微卫星分子标记，具有序列表SEQ. ID.No. 1至SEQ. ID.No. 10中任一种或多 种的核巧酸序列，运些分子标记所对应的位点分别编号为LT4、LT7、LT9、LT10、LT12、LT15、 LT16、LT18、LT25、LT28。
[0006] 适于本发明中任意一种或多种肉果草微卫星分子标记的特异性引物，具有序列表 SEQ ID NO. 11至SEQ ID NO.30中任一种或多种的核巧酸序列，各引物的特点及与微卫星分 子标记(位点）的对应关系见表1。
[0007] 表1微卫星片段引物的特点及与微卫星分子标记(位点）的对应关系
一种基于RAD-seq技术获取本发明所述肉果草微卫星分子标记的方法，其包括W下步 骤： (1) 肉果草DNA文库的构建:用CTAB法提取肉果草基因组DNA、通过限制性内切酶进行酶 切、连接接头pl、随机打断、末端修复、加 A尾、连接接头p2、PCR扩增、回收300-7(K)bp序列和 纯化，在111皿ina HiSeq测序平台上进行双末端测序； (2) 测序数据质量控制：每端测序12化P，用111皿ina化sava 1.8进行碱基识别（Base 化1 ling)，获得原始测序序列（Sequenced Reads),称之为raw base,对其测序质量分布、测 序错误率分布W及GC含量分布进行检查，得到clean base; (5) RAD-^g捕获率统计：统计clean base去重后reads中酶hg开头的reads数，W及 酶捕获的reads数目与去重后reads数目的比值，得到RAD-Tag相关统计信息（本发明RAD-Tag捕获率为97.65%，所有样本的数据量足够，测序质量合格，GC含量正常）； (4)聚类与组装:对于样本中含有酶识别位点reads,用cd-hit-est软件进行聚类，并从 中选取reads支持数为10-400之间的类，根据聚类结果，用Velvetopt进行参数设置，对筛 选后的类进行组装，组装后，并对12化P W下的cont ig进行过滤； 巧)SSR检测:对于已经组装好的contig，用rimmomatic V. 0.32软件进行SSR检测，SSR 检测标准如下：SSR重复单元的最小长度为化p、SSR重复单元的最大长度为6bp、SSR序列的 最小长度为12bp、SSR上下游序列长度为10化P、两个SSR的最小距离为12bp; (6) 分离SSR引物：用Primer 3软件批量设计SSR引物，合成SSR引物，并鉴定其在不同肉 果草中的多态性。
[000引一种利用本发明所述引物分析肉果草遗传多样性的方法，包括W下步骤： (1) 实验材料的准备：肉果草采样，采集野外自然状态下肉果草生长正常的嫩叶，用娃 胶迅速干燥后带回实验室，并分别提取用于检测分析的每个个体的基因组DNA; (2) PCR扩增:利用本发明所述的任意一对或多对引物，W提取的不同个体的基因组DNA 为模板进行PCR扩增反应，94 °C预变性4分钟，94 °C变性45秒，退火30秒(退火溫度见表1 )，72 °C延伸35秒，变性至退火=个步骤重复35次，最后72°C充分延伸8分钟，4°C保存； (3 )电泳检测:对PCR扩增产物进行1%的琼脂糖凝胶电泳检测，对于条带清晰的PCR产物 用聚丙締酷氨凝胶电泳进行检测； (4)结果分析:用genepop软件计算期望杂合度和观察杂合度，并计算近交系数，W此来 描述相关肉果草微卫星DNA多态性的特征。
[0009] 本发明的有益效果:开发出肉果草微卫星分子标记并分离出对应的引物，并建立 了行之有效的获取肉果草微卫星分子标记的方法，运些分子标记及其引物可进行遗传多样 性分析、植物遗传图谱的构建、基因定位、品种鉴定、种质保存、数量性状基因的分析、进化 与亲缘关系研究等。根据实际需要，可W采用本发明公开的任意一种或多种标记，或与相关 标记对应的任意一对或多对特异性引物进行分析研究。
【附图说明】
[0010] 图1是肉果草的DNA文库构建及库检示意图； 图2是测序质量分布检测； 图3是测序错误率分布检测； 图4是G、C含量分布检测； 图5是肉果草SSR不同重复单元数量统计； 图6是LW位点对所有个体扩增后经PAGE电泳检测图。
【具体实施方式】
[0011] 为了详细说明本发明肉果草微卫星分子标记的技术内容、构造特征，W下结合实 施方式并配合附图作进一步说明。
[0012] 实施例一：肉果草微卫星分子标记的制备方法 I.肉果草DNA文库的构建 1.1基因组DNA的提取:用CTAB法提取肉果草基因组，然后通过限制性内切酶进行酶切， 酶切后的DNA片段连接接头pi。
[001引 1.2混池:打断的DNA，经过末端修复后，在打断的DNA另一端加上A尾，然后加上p2 接头。
[0014] 1.3测序：对W上的DNA片段进行PCR扩增，回收300-700bp的序列，纯化后，在 111皿ina化Seq测序平台上进行双末端测序。肉果草DNA文库构建及库检示意图见图1。
[0015] 2.测序数据质量控制 2.1数据质量检查：每端测序12化P，用Illumina Casava 1.8进行碱基识别（Base Calling),获得原始测序序列（Sequenced Reads),称之为raw base、raw data 或 raw reads,对其测序质量分布进行检测，结果见图2;对测序错误率分布进行检查，结果见图3; 对GC含量分布进行检查，结果见图4。
[0016] 2.2测序数据过滤：测序得到的2，800，948，250bp的raw base中，错误分布率为 0.04%，Q20为93.24%，Q30为87.66%;GC含量为35.33%，共得到2，764，204，500bp的clean base。综上所述，所有样本的数据量足够，测序质量合格，GC含量正常，建库成功。
[0017] 2.3 RAD-Tag捕获率统计：统计clean base去重后reads中酶!"ag开头的reads数。 酶捕获率的reads数目与去重后reads数目的比值为97.65%，从11056818条clean reads中 共得到8074787条去重后的reads。
[001引 3.聚类与组装 对于样本中含有酶识别位点reads,用cd-hit-est软件进行聚类，并从中选取reads支 持数为10-400之间的类，对过滤的类数的统计见表2。根据聚类结果，用Velvetopt进行参 数设置，对筛选后的类进行组装，组装后，对12化pW下的contig进行过滤，结果统计见表3。 [0019]表2类数统计结果
4. SSR检测 对于已经组装好的contig，用rimmomatic V. 0.32软件进行SSR检测。SSR检测标准如 下：（I)SSR重复单元的最小长度为2; (2)SSR重复单元的最大长度为6; (3)SSR序列的最小长 度为12;(4)SSR上下游序列长度为lOObp;巧)两个SSR的最小距离为12bp;其统计结果见图 5;随机挑选出100对SSR序列用Primer 3软件进行引物设计。
[0020] 5.分离SSR引物 用设计的100对SSR引物，对来自3个居群(YD，QML，MY)的56个个体进行PCR扩增，肉果草 居群位置信息见表4。反应程序:94°C预变性4分钟，94°C变性45秒，退火30秒(退火溫度见表 1)，72°C延伸35秒，变性至退火S个步骤重复35次，最后72°C充分延伸8分钟，4°C保存，1%的 琼脂糖凝胶电泳检测。对于条带清晰的PCR产物用PAGE电泳进行检测，得到10个多态性的微 卫星标记。用LW位点对应引物对所有的个体进行扩增后，在PAGE电泳进行检测的电泳图见 图6。
[0021] 亲4巧要直臣描仿晋倍烏
实施例二:用所述10对引物进行肉果草遗传多样性分析 用gen邱OP软件计算期望杂合度和观察杂合度，并计算近交系数，W此来描述10个肉果 草微卫星DNA多态性的特征。结果见表5。
[0022] 由表5可W看出本发明的10个微卫星序列在3个居群的56个个体中都有多样性。由 此可见，本发明的10个微卫星标记可W用于遗传多样性分析、植物遗传图谱的构建、基因定 位、品种鉴定、种质保存、数量性状基因的分析、进化与亲缘关系研究等，具有重复性好的特 点，是一种可靠有效的分子标记。
[0023] 亲5肉果草的10个引物在3个居趙中结果
注：化:期望杂合度;化:观察杂合度;NA:零等位基因频率;Fis :近交系数，*代表偏离哈 德溫伯格平衡的於〇.〇1。
[0024] 从上述分析结果可W看出，本发明公开的任意一种微卫星分子标记及其相应的引 物(对)均可W用于肉果草遗传多态性的分析研究，可W根据需要和实验，选定所需的标记、 标记组合及相关引物，可W为其中的某一种、某几种，也可W是全部。
[0025] 本发明的标记物和/或相应的引物可W应用于肉果草遗传多样性分析、植物遗传 图谱的构建、基因定位、品种鉴定、种质保存、数量性状基因的分析和/或进化与亲缘关系等 方面的研究中。
[0026] W上掲示的仅为本发明的较佳实施例而已，不能W此来限定本发明之权利范围， 依本发明权利所做的等同变化，仍属于本发明所涵盖的范围。
【主权项】
1. 一种肉果草微卫星分子标记，其特征在于具有序列表SEQ. ID. No. 1至SEQ. ID. No . 10 中任意一种或多种的核苷酸序列。2. -种适于权利要求1所述分子标记的特异性引物，其特征在于具有序列表SEQ ID NO. 11至SEQ ID NO.30中任意一种或多种的核苷酸序列。3. -种基于RAD-seq技术获取权利要求1所述的肉果草微卫星分子标记的方法，其特征 在于包括以下步骤： (1) 肉果草DNA文库的构建：用CTAB法提取肉果草基因组DNA、通过限制性内切酶进行酶 切、连接接头pl、随机打断、末端修复、加 A尾、连接接头p2、PCR扩增、回收300-700bp序列和 纯化，在11 lumina HiSeq测序平台上进行双末端测序； (2) 测序数据质量控制:每端测序125bp，用Illumina Casava 1.8进行碱基识别，获得 原始测序序列raw base，对其测序质量分布、测序错误率分布以及GC含量分布进行检查，得 到clean base; (3) RAD_Tag捕获率统计:统计clean base去重后reads中酶Tag开头的reads数，以及酶 捕获的reads数目与去重后reads数目的比值，得到RAD-Tag相关统计信息； (4) 聚类与组装:对于样本中的含有酶识别位点reads，用cd-hit-est软件进行聚类，并 从中选取reads支持数为10-400之间的类，根据聚类结果，用Velvetopt进行参数设置，对筛 选后的类进行组装，组装后，对125bp以下的contig进行过滤； (5) SSR检测：对于已经组装好的contig，用rimmomatic ν·0· 32软件进行SSR检测，SSR 检测标准如下：SSR重复单元的最小长度为2bp、SSR重复单元的最大长度为6bp、SSR序列的 最小长度为12bp、SSR上下游序列长度为100bp、两个SSR的最小距离为12bp; (6) 分离SSR引物：用Primer 3软件批量设计SSR引物，合成SSR引物，鉴定其在不同肉果 草中的多态性，筛选出具有稳定性和多态性的引物。4. 一种利用权利要求2所述的引物分析肉果草遗传多样性的方法，其特征在于包括以 下步骤： (1) 实验材料的准备：肉果草采样，并分别提取用于检测分析的每个个体的基因组DNA; (2) PCR扩增：利用权利要求2所述的引物，以提取的不同个体的基因组DNA为模板进行 PCR扩增反应，94 °C预变性4分钟，94 °C变性45秒，退火30秒，72 °C延伸35秒，变性至退火三个 步骤重复35次，最后72°C充分延伸8分钟，4°C保存； (3) 电泳检测:对PCR扩增产物进行1%的琼脂糖凝胶电泳检测，对于条带清晰的PCR产物 用聚丙烯酰氨凝胶电泳进行检测； (4) 结果分析:用genepop软件计算期望杂合度和观察杂合度，并计算近交系数，以此来 描述肉果草相关微卫星DNA多态性的特征。5. 权利要求1所述的分子标记或权利要求2所述的引物在肉果草遗传多样性分析、植物 遗传图谱的构建、基因定位、品种鉴定、种质保存、数量性状基因的分析和/或进化与亲缘关 系研究中的应用。
【专利摘要】本发明涉及一种肉果草微卫星分子标记，属DNA分子标记技术领域，其通过RAD?seq技术从肉果草基因组DNA中分离微卫星分子标记，根据每个微卫星分子标记位点两端的侧翼序列设计该分子标记的特异性引物，对来自不同居群的肉果草个体进行PCR扩增并检测扩增结果的稳定性和多态性，获得了10个有效的微卫星分子标记。本发明开发出有效的肉果草微卫星分子标记，建立了制备肉果草微卫星分子标记的方法，并可用这些分子标记进行遗传多样性分析、植物遗传图谱的构建、基因定位、品种鉴定、种质保存、数量性状基因的分析、进化与亲缘关系研究等。
【IPC分类】C12Q1/68, C12N15/10, C12N15/11
【公开号】CN105713984
【申请号】CN201610251776
【发明人】张发起, 田尊哲, 陈世龙, 高庆波
【申请人】中国科学院西北高原生物研究所