本发明属于水牛胚胎培养及检测
技术领域：
，尤其涉及一种适合代谢组学水牛胚胎培养及检测胚胎发育潜能的方法。
背景技术：
：代谢组学是研究细胞和生物体的所有代谢中间体和终产物的一门新兴科学，相对于DNA或蛋白质等生物高分子而言，代谢组学的研究对象一股为分子质量在1000Da以下的小分子。由于代谢网络处于基因调控、信号传导及蛋白质互作网络的下游，因此代谢组学研究反映了基因组、转录组和蛋白质组受内外环境影响下相互协调作用的最终结果，代谢组学的研究更接近于细胞或生物的表型。代谢组的功能和代谢组学的重要性使代谢组学成为生物学中继基因组学、转录组学、蛋白质组学后的又一个重要的组学平台，被广泛地应用于医学、药学、微生物学、环境学和食品科学等生命科学的各个研究领域。代谢组学具有如下特点：首先，与细胞或机体的基因和蛋白质相比，代谢物数量显著少，人类基因组大约包含2.5万个基因，编码10万～20万个转录子，翻译100万种蛋白质，却仅产生2500～3000种代谢物，故代谢组检测要比转录组或蛋白组检测简单廉价。其次，转录组及蛋白组的改变并不总是与细胞表型相关，而代谢物组是基因表达的终产物，反应了细胞的真实功能状态，可较前者更准确地评估基因功能。最后，基因过度表达等微小变化经转录组和蛋白组逐级放大后，在代谢物水平上更易被检测。胚胎质量的优劣直接关系到胚胎移植后妊娠效率。目前对胚胎质量的评估中，应用最为广泛的是对胚胎发育时期各阶段的形态特征进行评分。近年来在形态学结合实时成像分析系统对胚胎发育过程进行连续观察并对其进行选择，但却无具体的数值标准来判定，且容易受观察者主观影响。而通过检测胚胎培养基中代谢物的代谢组学方法可更有效地分析胚胎活性，有效地反映细胞发育情况，预测胚胎发育的最终结果，对提高胚胎附植率将有重要的意义。技术实现要素：本发明要解决的技术问题是提供一种适合代谢组学水牛胚胎培养及检测胚胎发育潜能的方法，该法可为胚胎生产中的胚胎移植前胚胎质量提供判断依据。为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：适合代谢组学的水牛胚胎培养方法，第一步，取未成熟的水牛卵母细胞，经体外成熟、体外受精后获得假定受精胚胎进行群体培养；第二步，待胚胎发育到囊胚阶段，进行单胚胎培养。上述适合代谢组学的水牛胚胎培养方法，按以下操作进行：取未成熟的水牛卵母细胞进行体外成熟，将体外成熟的卵子经体外受精后，把假定受精胚胎放到共培养液体系中，微滴群体培养；待胚胎发育到囊胚阶段，用捡卵针捡出囊胚，用PBS溶液洗涤1-2次，放入事先在培养箱中平衡2h以上的20μl盖油的SOF液(SOF液成分参照Carolantetal.，1995，Theriogenology43：1115-l128)培养，每个胚胎一滴，于培养箱中继续培养5-6h后，收集代谢液到200μl的EP管中-80℃冻存。检测水牛胚胎发育潜能的方法，按上述培养方法进行培养，单胚胎培养后收集代谢液；通过LC/MS检测囊胚代谢液成分，通过PCA数据分析鉴定胚胎发育能力。代谢液按以下操作进行预处理：首先把样品从-80℃冰箱中，放入冰面上解冻，然后用超纯水预洗涤一次膜的MerckMillipore离心过滤管，4度12000g.min-1离心15min。LC/MS检测条件及参数按以下设置：选择前用乙晴冲洗柱子15min，用95％的0.1％甲酸水平衡柱子15min；选择方法：液相，A相0.1％甲酸水，B相100％乙腈；其中，0-2min5％乙腈，2-20min5％乙腈-95％乙腈，20min-23min100％乙晴，23min-23.1min5％乙晴，23.1min-25min5％乙晴，流速为0.30mL/min；进样量：2μL；一级质谱参数：二级质谱参数：HESTSOURCE参数：针对目前水牛胚胎质量检测存在的问题，发明人建立了一种适合代谢组学的水牛胚胎二步培养法，该法经体外成熟、体外受精后获得假定受精胚胎进行群体培养，待胚胎发育到囊胚阶段，进行单胚胎培养。以此为基础，发明人还建立了一种检测水牛胚胎发育潜能的方法，即按上述培养方法进行培养，单胚胎培养后收集代谢液；通过LC/MS检测囊胚代谢液成分，通过PCA数据分析鉴定胚胎发育能力。试验表明，本发明根据PCA数据的特点，以孵化能力作为判定，可以对胚胎发育潜能进行预测，直接应用与胚胎体外生产中胚胎移植前，对胚胎质量进行有数据依据的检测，避免了肉眼预测选择胚胎的缺陷，弥补了人为判断的不足，将大大节约生产中的经济成本。附图说明图1是应用本发明检测水牛胚胎发育潜能的负极质谱图。图中：对照组为1蓝色点，胚胎代谢液检测组为2红色点。具体实施方式实施例1两步法收集水牛囊胚代谢液第一步，经屠宰场获得的卵巢，抽取未成熟的水牛卵母细胞进行体外成熟，将体外成熟的卵子经体外受精后，把假定受精胚胎放到共培养液体系中，微滴群体培养，20μl的培养体系中放入15-20个胚胎，盖油；第二步，将体外受精第7d发育到桑葚胚胎阶段的胚胎，用捡卵针捡出发育到桑葚胚或囊胚的胚胎，用PBS溶液洗涤1-2次(以消除原有代谢液成分的影响)，放入事先在培养箱中平衡2h以上的20μl盖油的SOF液(无血清)培养，每个胚胎一滴，于培养箱中继续培养5-6h后，从培养箱拿出，用1ml移液器吸出所盖矿物油，待在40倍的体式显微镜下观察到液滴的顶端无油覆盖时终止吸矿物油。用内径为0.5-0.8mm的捡卵针把代谢液放入到500μl的灭菌EP管中，再把胚胎移入到含有血清的培养液中继续培养，检测胚胎的孵化潜能。每个胚胎对应一管代谢液，每个胚胎为17μl左右代谢液放入-80℃的冰箱中待检测，在代谢液进行处理分析前，保持代谢液的冻存状态。结果显示，采用两步法，在囊胚期进行单滴培养，从囊胚率上两步法培养的囊胚孵化率为4.85％，对照---群体培养组(从受精后，假定胚胎直到发育到囊胚一直采用群体培养)的对照组为3.85％，差异不显著。说明在胚胎发育到囊胚阶段进行单滴培养收集代谢液，没有影响到囊胚的孵化情况，见表1。表1两步水牛单胚胎培养方法不同组别比较组别总胚胎数孵化数(％)两步法培养37118(4.85)对照组1044(3.85)实施例2应用LC/MS进行水牛单囊胚代谢液的检测(1)采用两步法收集囊胚阶段的代谢液参照实施例1。(2)LC/MS检测代谢液的成分样品的预处理：由于培养液中带有0.3％的BSA，因此，在LC/MS检测前，要进行去除蛋白质大分子物质，首先把样品从-80℃冰箱中，放入冰面上解冻，然后用超纯水预洗涤一次膜的MerckMillipore离心过滤管，4度12000g.min-1离心15min，去除代谢液中BSA(牛血清白蛋白)的影响。LC/MS检测参数选择前用乙晴冲洗柱子15min，用95％的0.1％甲酸水平衡柱子15min。选择方法：液相，A相0.1％甲酸水，B相100％乙腈；其中，0-2min5％乙腈，2-20min5％乙腈-95％乙腈，20min-23min100％乙晴，23min-23.1min5％乙晴，23.1min-25min5％乙晴，流速为0.30mL/min；进样量：2μL；一级质谱参数：二级质谱(dd-MS2/dd-SIM)参数：HESTSOURCE参数：(3)PCA分析得到的负极质谱图，导入到热电公司的Sevier软件中，进行主成分分析(PCA分析)。从图1中可以看到，通过上述实施方式，对照组的代谢液(不放囊胚，但同样的处理条件)与囊胚代谢液组(放囊胚的代谢液，处理条件与对照组相同)，经过LC/MS处理，在负极模式下，经过PCA分析，完全可以将对照组与囊胚代谢液组分开。当前第1页1 2 3