一种扇贝抗氧化肽的制备方法
【技术领域】
[0001 ]本发明涉及一种利用扇贝加工废弃物一一扇贝外套膜及加工碎肉，通过生物酶解技术制备抗氧化肽的方法，属于食品科学高新技术领域。
【背景技术】
[0002]扇本发明主要利用生物酶解技术，利用扇贝加工废弃物制备抗氧化肽，实现扇贝加工废弃物的综合利用的目的。
[0003]本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案实现的:
本发明是利用扇贝加工废弃物一一扇贝外套膜及加工碎肉，利用蛋白酶进行水解，制备抗氧化肽的方法，其特点是:
1)将扇贝外套膜及加工碎肉速冻，捣碎备用；
2)称取定量扇贝废弃物，选取木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、碱性蛋白酶、胃蛋白酶、风味蛋白酶和菠萝蛋白酶水解扇贝废弃物，以水解度和抗氧化活性作为评价指标，筛选出制备扇贝抗氧化肽的最佳蛋白酶；
3)通过响应面法优化酶解工艺条件；
4)酶解产物进一步经过超滤、凝胶色谱层析、反向液相色谱等技术进行分离纯化，获得抗氧化肽，并利用质谱仪测定其分子量范围。
[0004]本发明具有明显的优点是:
I)产品活性强。通过此工艺可获得扇贝抗氧化肽，其超氧阴离子的清除率达到70%以上。
[0005]2)工艺简单易于实施。本发明只需要经过原料处理和酶解过程即可。
[0006]3)产品实现了无废弃物加工，通过本发明可以使扇贝废弃物的附加值得到很大的提高，实现了扇贝无废弃物加工。
[0007]【具体实施方式】:
下面通过实施例，对本发明的技术方案作进一步具体的说明。
[0008]实施例1:
1)将扇贝裙边进行速冻后捣碎备用；
2)菠萝蛋白酶酶解扇贝裙边制备抗氧化肽的工艺研究。以DPPH清除率即抗氧化活性为评价指标，通过单因素及响应面法优化试验得到了菠萝蛋白酶水解制备扇贝裙边抗氧化肽的最佳工艺条件。该工艺条件为反应温度68.37°C，pH 9.35，底物浓度6.25%，加酶量6000U/g，反应时间6 ho在此最优酶解条件下测定DPPH的清除率达到70.32%。
[0009]3)利用超滤技术对扇贝裙边酶解液进行初步分离，比较不同截留分子量膜包(10kDa、5kDa、3kDa、lkDa)获得活性肽组分的体外抗氧化活性。结果表明:六种分子量多肽组分中，SSPH-n(l kDa?3 kDa)的组分清除DPPH自由基和羟自由基能力最强。
[0010]4)利用葡聚糖凝胶Sephadex G-25对SSPH-Π进行进一步纯化得到两个组分SSPH-n-F^SSPH-n-F2。测定其DPPH自由基清除能力得知SSPH-11士的抗氧化能力高于SSPH-Π-F2t3RH-HPLC 分离纯化 SSPH-m-Fi 并得到单一组分 SSPH-m-F1-P。
[0011]5) RH-HPLC分离纯化SSPH-11-F1，得到SSPH-Π-F冲含量相对较高并且分离效果较好的 SSPH-Π-F1-P7.6)海湾扇贝裙边多肽的组分SSPH-11-F1-P7经过在线净化液相色谱-四级杆静电场轨道阱串联质谱仪(Q Exative)分析鉴定可知该组份由7种多肽组成，它们的分子量1000 Da-1700 Da之间。
[0012]贝是一种海产贝类，属于软体动物门、瓣鳃纲、珍珠贝目、扇贝科。世界上共有扇贝60多种。在我国分布的扇贝主要有四种，即栉孔扇贝、华贵栉孔扇贝、海湾扇贝及虾夷扇贝。目前我国沿海人工养殖量最大的是海湾扇贝。自20世纪80年代以来，随着我国水产养殖业的迅速发展，扇贝的养殖量以及冻贝柱、干贝柱的加工和出口量也越来越大。在加工贝柱的过程中产生了大量的加工废弃物，小部分扇贝加工废弃物被作为饲料低价出售，大部分弃于海边任其腐烂，造成极大的资源浪费和环境污染。扇贝外套膜及加工碎肉是加工扇贝柱时的加工废弃物，其蛋白含量高、氨基酸组成齐全，综合开发利用潜力巨大。
[0013]目前，制备活性肽的方法主要有以下几种:酶解法，微生物发酵法，生物提取法，化学降解法，DNA重组法，化学合成法。(I)酶解法:采用商品蛋白酶对蛋白质进行适度水解，产品安全性高，生产条件温和，这是目前制备抗氧化肽的主要手段；(2)微生物发酵法:从产酶菌中筛选出抗氧化活性肽高产菌株，将其与原料混合，置于最适条件下发酵，发酵后对发酵产物进行分离纯化得到抗氧化肽；(3)生物提取法:存在于细菌、真菌、动植物等生物体内的激素、酶抑制剂等天然活性肽;(4)化学降解法:在密闭的容器里，将原料蛋白质置于适宜浓度的强酸或强碱溶液中，加热至适宜温度并持续一段时间后终止反应。该法操作简单，成本低廉但会生成有毒物质；(5)DNA重组法:获得抗氧化肽的基因片段，采用分子生物技术使基因在其它生物体上表达，以达到大规模生产；(6)化学合成法:采用液相或固相化学合成法制取，但该法生产成本高，副产物及残留化合物多等因素而制约其发展。
[0014]本发明采用扇贝加工废弃物作为主要原料，通过筛选优良的蛋白酶，优化酶解工艺，制备具有较强抗氧化活性的扇贝裙边酶解产物，进一步分离纯化得到活性最强的抗氧化组分，得到抗氧化肽产品，使原料变废为宝达到综合利用资源的目的。
[0015]
【发明内容】
[0016]本发明主要利用生物酶解技术，利用扇贝加工废弃物制备抗氧化肽，实现扇贝加工废弃物的综合利用的目的。
[0017]本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案实现的:
本发明是利用扇贝加工废弃物一一扇贝外套膜及加工碎肉，利用蛋白酶进行水解，制备抗氧化肽的方法，其特点是:
1)将扇贝外套膜及加工碎肉速冻，捣碎备用；
2)称取定量扇贝废弃物，选取木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、碱性蛋白酶、胃蛋白酶、风味蛋白酶和菠萝蛋白酶水解扇贝废弃物，以水解度和抗氧化活性作为评价指标，筛选出制备扇贝抗氧化肽的最佳蛋白酶；
3)通过响应面法优化酶解工艺条件； 4)酶解产物进一步经过超滤、凝胶色谱层析、反向液相色谱等技术进行分离纯化，获得抗氧化肽，并利用质谱仪测定其分子量范围。
[0018]本发明具有明显的优点是:
I)产品活性强。通过此工艺可获得扇贝抗氧化肽，其超氧阴离子的清除率达到70%以上。
[0019]2)工艺简单易于实施。本发明只需要经过原料处理和酶解过程即可。
[0020]3)产品实现了无废弃物加工，通过本发明可以使扇贝废弃物的附加值得到很大的提高，实现了扇贝无废弃物加工。
[0021]【具体实施方式】:
下面通过实施例，对本发明的技术方案作进一步具体的说明。
[0022]实施例1:
1)将扇贝裙边进行速冻后捣碎备用；
2)菠萝蛋白酶酶解扇贝裙边制备抗氧化肽的工艺研究。以DPPH清除率即抗氧化活性为评价指标，通过单因素及响应面法优化试验得到了菠萝蛋白酶水解制备扇贝裙边抗氧化肽的最佳工艺条件。该工艺条件为反应温度68.37°C，pH 9.35，底物浓度6.25%，加酶量6000U/g，反应时间6 ho在此最优酶解条件下测定DPPH的清除率达到70.32%。
[0023]3)利用超滤技术对扇贝裙边酶解液进行初步分离，比较不同截留分子量膜包(10kDa、5kDa、3kDa、lkDa)获得活性肽组分的体外抗氧化活性。结果表明:六种分子量多肽组分中，SSPH-n(l kDa?3 kDa)的组分清除DPPH自由基和羟自由基能力最强。
[0024]4)利用葡聚糖凝胶Sephadex G-25对SSPH-Π进行进一步纯化得到两个组分SSPH-Π-F^SSPH-n-F2。测定其DPPH自由基清除能力得知SSPH-Π 士的抗氧化能力高于SSPH-Π-F2t3RH-HPLC 分离纯化 SSPH-m-Fi 并得到单一组分 SSPH-m-F1-P。
[0025]5) RH-HPLC分离纯化SSPH-Π -F1，得到SSPH-Π -F冲含量相对较高并且分离效果较好的 SSPH-Π-F1-P7.6)海湾扇贝裙边多肽的组分SSPH-11-F1-P7经过在线净化液相色谱-四级杆静电场轨道阱串联质谱仪(Q Exative)分析鉴定可知该组份由7种多肽组成，它们的分子量1000 Da-1700 Da之间。
【主权项】
1.一种扇贝抗氧化肽的制备方法，其特征在于包括以下制备过程: (1)将扇贝外套膜及加工碎肉速冻，捣碎备用；以DPPH清除率即抗氧化活性为评价指标，通过单因素及响应面法优化试验得到了菠萝蛋白酶水解制备扇贝裙边抗氧化肽的最佳工艺条件，在最优酶解条件下DPPH的清除率达到70%以上； (2)利用超滤技术对扇贝裙边酶解液进行初步分离，比较不同截留分子量膜包获得活性肽组分的体外抗氧化活性;利用葡聚糖凝胶Sephadex G_25和反相HPLC分离纯化抗氧化肽，对抗氧化活性最高的组分进行在线净化液相色谱-四级杆静电场轨道阱串联质谱仪(QExative)分析鉴定，抗氧化肽由7种多肽组成，它们的分子量1000 Da?1700 Da之间。
【专利摘要】一种扇贝抗氧化肽的制备方法，本发明选用扇贝加工废弃物——扇贝外套膜及加工碎肉为主要原料，通过生物酶解技术制备抗氧化肽的方法。以DPPH清除率即抗氧化活性为评价指标，设定反应温度，pH值，底物浓度为三个待优化因素，利用响应面分析法进行优化分析，得到菠萝蛋白酶水解制备扇贝裙边抗氧化肽的最佳工艺条件，在此最优酶解条件下测定DPPH的清除率达到70.32%。所得产品可作为功能食品直接食用或作为附加材料添加到其他食品中，增强保健作用，实现废弃物综合环保利用。
【IPC分类】C12P21/06, C07K1/16, C07K1/36, C07K1/34, C07K1/20
【公开号】CN105713945
【申请号】CN201610271264
【发明人】桑亚新, 王向红, 李荣乔, 李彩, 刘卫华, 韩军
【申请人】河北农业大学