家蚕中部丝腺生物反应器双启动子通用型质粒及其构建方法和应用与流程

本发明涉及了一种质粒及其构建方法与应用，尤其是涉及了一种家蚕中部丝腺生物反应器双启动子通用型质粒及其构建方法和应用。

背景技术：

piggyBac转座子最初是从粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)TN-368细胞株的基因组中分离得到的，是目前发现的转座活性最高的DNA转座子。piggyBac转座系统是一种非病毒载体，转座效率较高。与sleeping beauty相比，piggyBac载体容量较大，可携带18kb,可以实现多基因的共表达，且转座片段被切除后不会在原位点留下印迹(footprint)，基因组可以实现切除后精确修复，在可逆转基因的应用中具有重要作用。

piggyBac转座子介导的转基因家蚕丝腺生物反应器的研究开展了十几年，世界各国的科学家致力于外源基因的表达，已经建成了以丝素蛋白轻链启动子(Fib-L Promoter)、丝素蛋白重链启动子(Fib-H Promoter)和丝胶蛋白1启动子(Ser1Promoter)表达外源蛋白的转基因家蚕丝腺生物反应器。

由于piggyBac载体多数含有两个表达框，具有较多的元件和相同的酶切位点，所以，每次表达不同的外源基因时，需要从头构建质粒，组装启动子、信号肽、外源基因、polyA等结构，费时费力，工作效率低下。

另一方面，但纵观十几年来国内外家蚕生物反应器的研究结果，转基因家蚕丝腺生物反应器的外源蛋白表达效率都很低，不管是丝胶启动子驱动表达的外源基因，还是丝素启动子驱动表达的外源基因，极大多数实验的表达量都没有在达到茧层量的1％左右，远远没有达到科学家们期望的象表达蚕丝蛋白那样的高效表达水平。

技术实现要素：

为了解决背景技术中存在的问题，本发明的目的在于提出了一种家蚕中部丝腺生物反应器双启动子通用型质粒及其构建方法和应用，具体是利用常规构建质粒的生物技术方法构建一种不含目的基因，但拥有其它所有必需元件的通用型质粒。

为了达到上述目的，本发明采用的技术方案的步骤如下：

一、一种家蚕中部丝腺生物反应器双启动子通用型质粒：

所述的质粒为pBac[A3-EGFP-SV40]-[Ser1promoter-18s rRNA-promoter-FLSP-His 6-DDDDK-FLPA]，是以piggyBac转座子为基础并带有Amp抗性基因，包括piggyBac转座子的两个转座臂PBL和PBR，以及两个转座臂之间的两个功能表达框。

一个功能表达框是A3启动子启动的绿色荧光蛋白基因表达框，即A3Promoter–EGFP-SV40，另一个功能表达框是包含家蚕丝胶蛋白1基因启动子、18s rRNA启动子、丝素蛋白轻链基因信号肽、六聚组氨酸、肠激酶酶切位点和家蚕丝素蛋白轻链基因3’末端序列的表达框，即Ser1Promoter-18s rRNA promoter-Fibroin L chain signal peptide-His6-DDDDK-Fibroin L chain PolyA。

所述的DDDDK-FLPA之间含有专一性的ApaI和NheI的两个酶切位点，两个酶切位点用于将质粒特异性切开连接外源基因后形成有功能的质粒。

二、一种家蚕中部丝腺生物反应器双启动子通用型质粒的构建方法，该方法的步骤如下：

1)通过分子生物学方法构建包含[丝胶蛋白1基因启动子575-海肾萤光素酶基因-SV40]-[丝胶蛋白1基因启动子4023-萤火虫萤光素酶基因-SV40]-[A3基因启动子-EGFP-SV40]([Ser 575-Rluc-SV40]-[Ser 4023-Fluc-SV40]-[A3-GFP-SV40])的质粒piggy-14413，以质粒piggy-14413为模板，质粒piggy-14413的碱基序列如SEQ ID NO.1，以如SEQ ID NO.2的ggtaccGTTGGCGGTCTTTGGATCG序列1和如SEQ ID NO.3的gaattccttaagGCACACACACTACATACCATGTATTTG序列2为引物，采用PCR扩增获得片段长为583bp的丝胶基因启动子，其碱基序列如SEQ ID NO.4；

2)用EcoRⅠ和KpnⅠ双酶切质粒piggy-5257，质粒piggy-5257的碱基序列如SEQ ID NO.5，得到长度为4549bp，包含18s rRNA基因启动子-丝素轻链蛋白信号肽-六聚组氨酸-肠激酶酶切位点序列-家蚕丝素蛋白轻链3’序列(18s rRNA-FLSP-His 6-DDDDK-FLPA)和Amp抗性基因的片段；

连接步骤1)获得的丝胶蛋白1基因启动子与包含18s rRNA基因启动子-丝素轻链蛋白信号肽-六聚组氨酸-肠激酶酶切位点序列-家蚕丝素蛋白轻链3’序列和Amp抗性基因的片段，得到包含丝胶蛋白1基因启动子-18s rRNA基因启动子-丝素轻链蛋白信号肽-六聚组氨酸-肠激酶酶切位点序列-家蚕丝素蛋白轻链3’序列(Ser 1-18s rRNA-FLSP-His 6-DDDDK-FLPA)的质粒piggy-5140；

3)用AflII和BglII、ScaI酶切步骤2)获得的piggy-5140质粒，得到长度为2493bp的包含丝胶蛋白1基因启动子-18s rRNA基因启动子-丝素轻链蛋白信号肽-六聚组氨酸-肠激酶酶切位点序列-家蚕丝素蛋白轻链3’序列 (Ser1-FLSP-His 6-DDDDK-FLPA)的片段；

4)用AflII和BglII双酶切包含A3基因启动子-绿色荧光蛋白基因-SV40(A3-GFP-SV40)和Amp抗性基因的质粒piggy-6212，质粒piggy-6212的碱基序列如SEQ ID NO.6，得到长度为5870bp的包含A3基因启动子-绿色荧光蛋白基因-SV40(A3-GFP-SV40)的片段；

5)连接步骤3)获得的包含丝胶蛋白1基因启动子-18s rRNA基因启动子-丝素轻链蛋白信号肽-六聚组氨酸-肠激酶酶切位点序列-家蚕丝素蛋白轻链3’序列的片段与步骤4)获得的包含A3基因启动子-EGFP-SV40的片段，得到包含A3基因启动子-EGFP-SV40-丝胶基因启动子-18s rRNA基因启动子-丝素轻链蛋白信号肽-六聚组氨酸-肠激酶酶切位点序列-家蚕丝素蛋白轻链3’序列([A3-EGFP-SV40]-[Ser1promoter-18s rRNA-promoter-FLSP-His6-DDDDK-FLPA])的家蚕中部丝腺生物反应器双启动子通用型质粒piggy-8363质粒作为本发明所述的质粒，其碱基序列如SEQ ID NO.7。

三、所述质粒用于构建表达各种外源基因的donor质粒的应用。

本发明先设计引物，用PCR的方法获得获得丝胶蛋白1基因启动子的序列；再分别用限制性内切酶酶切相应的片段，电泳得到目的条带后，切胶回收，用T4连接酶将相应的片段相连，使所需的元件(Ser Promoter-18s rRNA promoter-Fibroin L chain signal peptide-His6-DDDDK-Fibroin L chain PolyA)依次连接；然后将标记基因与上述元件整合到同一个质粒，得到含有双启动子的通用型质粒，最终如图1所示。

本发明的有益效果是：

本发明质粒可对于任意一种外源基因，只需经一步酶切连接反应，就将任何一种外源基因导入质粒，构建成有功能的能够表达外源基因的质粒，且可以利用双启动子启动外源基因表达，旨在提高外源基因的表达量。

附图说明

图1是本发明Ser1和18s rRNA双启动子通用型质粒的组成示意图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

本发明的实施例如下：

(1)设计引物，以piggy-14413质粒(SEQ ID NO.1)为模板，获得丝胶蛋白1基因启动子(SEQ ID NO.4)。并在启动子5’端加EcoRⅠ的酶切位点，在3’端加KpnI的酶切位点。用EcoRⅠ和KpnI双酶切PCR产物，得到593bp的片段，即丝胶蛋白1基因启动子，然后胶回收；用EcoRⅠ和KpnI双酶切piggy-5257 质粒(SEQ ID NO.5)，得到4549bp的片段，胶回收；将所得到的2个片段连接，连接后的质粒命名为piggy-5140质粒。

(2)用AflII和BglII、ScaI酶切piggy-5140质粒，得到长度为2493bp的片段；用AflII和BglII双酶切piggy-6212质粒(SEQ ID NO.6)，得到长度为5870bp的片段，连接上述两目的片段，得到piggy-8363质粒(SEQ ID NO.7)，即家蚕中部丝腺生物反应器双启动子通用型质粒。

(3)用ApaI和NheI双酶切piggy-8363质粒，得到长度为8361bp的包含[A3-EGFP-SV40]-[Ser1promoter-18s rRNA promoter-FLSP-His6-DDDDK-FLPA和Amp抗性基因的基因序列。将上游端带有ApaI酶切粘性末端序列、下游端带有NheI酶切粘性末端序列的T4连接酶基因与上述片段连接，构建成家蚕中部丝腺生物反应器表达T4连接酶基因的质粒piggy-9887，该质粒包含的表达框序列为[A3-EGFP-SV40]-[Ser1promoter-18s rRNA promoter-FLSP-His6-DDDDK-T4Ligase-FLPA]。

上述结果说明，利用家蚕中部丝腺生物反应器双启动子通用型质粒piggy-8363，仅仅一步就能够得到在家蚕中部丝腺表达T4连接酶基因的质粒。

采用转基因家蚕技术将该双启动子质粒导入家蚕基因组，获得的转基因家蚕的T4连接酶基因表达量，比用单个丝胶蛋白1启动子启动的T4连接酶基因表达量高1.2倍，结果差异达到显著水平。

说明利用本发明的家蚕中部丝腺生物反应器双启动子通用型质粒构建转基因家蚕的donor质粒，操作程序简单，工作效率高，而且外源基因的表达量也有显著提高。