针对MALAT-1基因的asRNA及其应用的制作方法

本发明涉及生物医学领域，尤其是关于一种针对MALAT-1基因的RNA干扰技术。
背景技术：
：反义技术(Antisensetechnology)是指反义DNA或者RNA以序列特异性的方式抑制基因表达的技术，其已在基因功能解析、靶标确定和疾病治疗等方面得到了广泛运用。至今，人们运用的反义技术主要有三种：反义寡聚核苷酸(Antisenseoligonucleotides，AS-ONs)、核酶(Ribozyme)与脱氧核酶(Deoxyribozyme)以及RNA干扰(RNAinference，RNAi)。AS-ONs和其互补配对的RNA结合，人们已经成功地用新颖的化学修饰方法来增强AS-ONs的稳定性和靶标亲和性；而核酶和脱氧核酶是本身具有催化活性的寡聚核苷酸，它们不仅可以和互补配对的靶序列结合，还能剪切这些靶序列。作为第三种高效的反义技术，RNAi技术利用21-23个核苷酸的小干扰RNA(SmallinterferingRNA，siRNA)分子就能够有效地抑制细胞中靶基因的表达。Dicer酶是RNA干扰(RNAinterference，RNAi)机制中的核心组成之一，其属于RNaseIII超级家族中特异识别双链RNA中的一员。Dicer酶以二聚体的形式切割长双链RNA(DoublestrandRNA，dsRNA)前体，产生22nt左右的小干扰RNA(SmallinterferenceRNA，siRNA)；其还可以作用于Drosha(RNaseIII超级家族另一成员)下游，产生成熟的microRNA(miRNA)，随后siRNA或miRNA进入RNA诱导的沉默复合物(RNA-inducedsilencingcomplexes，RISC)中，通过碱基互补配对的方式和靶mRNA结合，进而降解靶mRNA或者阻止其翻译。技术实现要素：本发明提供一种新的针对MALAT-1基因的asRNA及其应用。本发明提一种针对MALAT-1基因的asRNA，其序列如SEQIDNO:2所示。所述的asRNA在制备治疗癌症的药物中的应用。癌症如宫颈癌和乳腺癌。所述的asRNA在制备抑制癌细胞中MALAT-1基因表达的试剂中的应用。癌细胞如人宫颈癌细胞系Hela和人乳腺癌细胞系MDA-MB-231。所述的asRNA在制备促进癌细胞凋亡的药物中的应用。所述的asRNA在调控癌细胞中MALAT-1基因表达的应用。一种治疗癌症的药物，所述药物包括针对MALAT-1基因的asRNA，所述asRNA的序列如SEQIDNO:2所示。所述asRNA干扰的靶序列是指MALAT-1基因转录本RNA的一段序列，该段RNA序列如下：5’-AUAAAUCCCUUUACACCUC-3’(SEQIDNO:3)，对应的是完整序列的第3099个碱基到第3117个碱基。利用与Dicer酶高效亲和的适配体OligomerRNA定向诱导Dicer切割反义RNA-靶RNA杂交分子，高效实现降解靶RNA，有效地提高基因调控作用。本发明的有益效果是：MALAT-1在癌细胞中高表达，通过在癌细胞中转染asRNA，可以有效敲低MALAT-1的表达，抑制癌细胞增殖和迁移，促进癌细胞凋亡。附图说明图1是GPU6-GFP-Neo质粒的物理图谱；图2是Hela细胞和MDA-MB-231细胞中MALAT-1表达水平的检测结果图，其中左边一组方柱显示转染asRNA后，Hela细胞中MALAT-1的表达水平显著下降；右边一组方柱显示转染asRNA后，MDA-MB-231细胞中MALAT-1的表达水平显著下降；图3是CCK-8法检测Hela细胞和MDA-MB-231细胞增殖能力的变化的曲线图，其中，A部分，实线表示针对Hela细胞的对照组，虚线表示针对Hela细胞的实验组；B部分，实线表示针对MDA-MB-231细胞的对照组，虚线表示针对MDA-MB-231细胞的实验组；图4是EdU法检测Hela细胞和MDA-MB-231细胞增殖能力的变化的曲线图，其中，A部分，上方一排是针对Hela细胞的对照组，下方一排是针对Hela细胞的实验组；B部分，上方一排是针对MDA-MB-231细胞的对照组，下方一排是针对MDA-MB-231细胞的实验组；C部分，左边一组方柱显示转染asRNA后，Hela细胞的增殖能力明显下降；右边一组方柱显示转染asRNA后，MDA-MB-231细胞的增殖能力明显下降；图5是划痕法检测Hela细胞和MDA-MB-231细胞迁移能力的变化的结果图；其中，A部分，上方是针对Hela细胞的对照组分别在0h、16h的划痕图，下方是针对Hela细胞的实验组分别在0h、16h的划痕图；B部分，上方是针对MDA-MB-231细胞的对照组分别在0h、16h的划痕图，下方是针对MDA-MB-231细胞的实验组分别在0h、16h的划痕图；C部分，左边一组方柱显示转染asRNA后，Hela细胞的迁移能力被显著抑制；右边一组方柱显示转染asRNA后，MDA-MB-231细胞的迁移能力被显著抑制；图6是Transwell法检测Hela细胞和MDA-MB-231细胞迁移能力的变化的结果图，其中，A部分，左边是针对Hela细胞的对照组，右边是针对Hela细胞的实验组；B部分，左边是针对MDA-MB-231细胞的对照组，右边是针对MDA-MB-231的实验组；C部分，左边一组方柱显示转染asRNA后，Hela细胞的迁移能力被显著抑制；右边一组方柱显示转染asRNA后，MDA-MB-231细胞的迁移能力被显著抑制；图7是ELISA法检测Hela细胞和MDA-MB-231细胞凋亡能力的变化的结果图，其中，左边一组方柱显示转染asRNA后，Hela细胞的凋亡能力显著提高；右边一组方柱显示转染asRNA后，MDA-MB-231细胞的凋亡能力显著提高；图8是Hoechst法检测Hela细胞和MDA-MB-231细胞凋亡能力的变化的结果图。其中，A部分，左边分别是针对Hela细胞和MDA-MB-231细胞的对照组，右边分别是针对Hela细胞和MDA-MB-231细胞的实验组；B部分，左边一组方柱显示转染asRNA后，Hela细胞的凋亡能力显著提高；右边一组方柱显示转染asRNA后，MDA-MB-231细胞的凋亡能力显著提高。具体实施方式下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。技术与方法1实验细胞系人宫颈癌细胞系Hela和人乳腺癌细胞系MDA-MB-231均购自上海生化所细胞库。2质粒构建用GPU6-GFP-Neo质粒构建表达和Dicer酶高度结合的寡聚核苷酸OligomerRNA载体，并经过阳性克隆测序验证，即获得OligomerRNA表达质粒，这也是本研究中对照组(Negativecontrol)实验所用质粒。Oligomer序列如下：5’-GGGAGAAUCAUAAGUAGCGGUGUGUGAGUCGUGGUGCCCCAUGUUAACAGUUAGCC-3’(SEQIDNO:1)用GPU6-GFP-Neo质粒构建表达asRNA的载体(本实验所用靶标为MALAT-1基因)，并经过阳性克隆测序验证，即获得asRNA表达质粒，这也是本研究中实验组实验所用质粒。asRNA序列如下：5’-GGGAGAAUCAUAAGUAGCGGUGUGUGAGUCGUGGUGCCCCAUGUUAACAGUUAGCCAUAAAUCCCUUUACACCUC-3’(SEQIDNO:2)本实验所用质粒载体全由苏州吉玛基因股份有限公司合成，所用GPU6-GFP-Neo质粒的物理图谱如图1所示：3药品及试剂表1药品及试剂4实验仪器设备5.氯化钙法制备感受态细菌制备全程均需实行无菌操作，并于4℃冰上条件下进行，4℃条件下离心，制备步骤如下所示：(1)挑取宿主菌DH5α，在不含氨苄抗生素的LB固体培养基平板上轻轻划线，在37℃条件下的细菌培养箱中培养12-16h，至长出较大单菌落即可；(2)挑取单个大菌落，接种到5ml不含氨苄抗生素的LB液体培养基中，在培养箱温度为37℃，振荡速度为200rpm的条件下培养过夜，当测定培养基OD550＝0.4时结束培养；(3)将500μl培养物按1:100的比例接种到50ml不含氨苄抗生素、且预热过的LB液体培养基中，在振荡速度为200rpm，温度为37℃的条件下培养2-2.5h，即菌液OD550为0.45-0.5；(4)置菌液于冰上预冷15min后，4℃，4,000rpm/分钟，离心5min，收集菌体；(5)弃上清，用15mlTFB1溶液重悬菌体沉淀，涡旋振荡，悬浮彻底后于冰上放置15min，同时准备30个1.5ml离心管，冰上预冷；(6)在4℃，4,000rpm/分钟，离心5min条件下使菌体沉淀，弃上清后，加入3mlTFB2溶液，涡旋振荡，使菌体重悬，冰上放置15min；(7)重新混匀菌液后，按100μl/管的量将其分装到已预冷的1.5mlEP管中，冰上放置4-6h直接用于转化或置于-80℃储存。6.质粒转化转化是指将外源DNA分子导入靶细胞或受体细胞，使靶细胞或受体细胞新增加一些能够稳定遗传的性状的技术。靶细胞或受体细胞细胞膜的通透性通过物理方法，如电击法或者化学方法，如CaCl2、RbCl等处理后会暂时发生改变，即细胞处于感受态，从而使外源性DNA更容易进入细胞。经过转化后的感受态细胞在经过抗性筛选后获得带有异源DNA分子的受体细胞。具体步骤如下：(1)配制LB培养基，以1000ml配置为例，配方如表3所示：表3LB培养基配置(2)室温条件下解冻感受态细胞DH5α，解冻后立刻将其置于冰上，按质粒：感受态细胞＝1:5比例加入相应质粒(质粒10μl、感受态细胞50μl)，两者充分混匀后，静置冰浴30min；(3)在42℃水浴条件下热休克，计时45s，后迅速冰浴1min；(4)加入700μlLB液体培养基，充分混匀后在温度37℃、转速200rpm的条件下培养1h；(5)在12,000rpm的转速条件下离心1min后，倒掉上清，剩下菌液；(6)在超净工作台内，将剩余菌液吹匀后涂于含Amp的LB-琼脂平板培养基上，并用玻璃棒均匀涂板，正面向上放置培养板1h；(7)待培养基完全吸收菌液后倒置培养板，37℃条件下培养16-24h。7.质粒扩增(1)取出长满菌落的培养皿，观察菌落的形态后，挑选单克隆菌落；(2)将5ml的LB液体培养基和5μl卡纳抗生素母液(母液和工作液的浓度比为1000:1)分别加入15ml离心管中；(3)用灭菌的白色小枪头挑取选好的单克隆菌落后，连同白色小枪头一起将菌落置于已加有培养的15ml离心管中，并将其放置在温度37℃的摇床中过夜。8.质粒提取依据Endo-FreePlasmidMiniKitII说明使用进行如下操作：(1)将10-15mlLB培养基和卡纳抗生素母液(母液和工作液的浓度比为1000:1)分别加入到50ml已灭菌的离心管中，扩增携带有目的质粒的大肠杆菌；(2)室温条件下，转速5,000g，离心菌液10min；(3)倒掉上清，用500μlSolutionI/RNaseA重悬细菌沉淀，并混匀；(4)菌液混匀后转移其至新的无菌的2ml离心管中，然后加500μlSolutionII，缓慢上下颠倒、转动离心管数次，观察到菌液澄清后，停止混匀，室温条件下静置离心管2min；(5)向离心管中加入250μlice-cold的BufferN3溶液，缓慢上下颠倒、旋转离心管数次，看到白色絮状沉淀形成后离心，离心条件为室温，但最好在4℃，转速大于12,000g每分钟，离心10min；(6)将上清液小心地转移至新的灭菌的1.5ml离心管中，并用等体积的ETRBindingBuffer溶液混匀；(7)将洁净的HiBindDNAMini柱放置在配套的2ml收集管中，并吸取700μl的上述混合液于Mini柱中，转速10,000g，室温条件下离心1min。去掉收集管内离心下来的液体，并重复使用；(8)重复步骤7，直到混合液全部经过Mini柱；(9)加500μlETRWashBufferI于Mini柱内。转速10,000g，室温条件下离心1min。倒掉收集管内离心下来的液体，重复利用收集管；(10)向Mini柱内加500μlBufferEHB，转速10,000g，室温条件下离心1min。倒掉收集管内离心下来的液体，重复利用收集管；(11)向Mini柱内加700μl已用酒精稀释的DNAWashBuffer，转速10,000g，室温条件下离心1min，去掉收集管中离心下来的液体；(12)重复步骤11；(13)去掉收集管内离心下来的液体后，空管离心，转速调至大于等于13,000g，室温条件下离心3min；(14)将Mini柱放入新的1.5ml的离心管中，并向Mini柱内加60-100μlEndotoxin-FreeBuffer溶液溶解积累在Mini柱膜上质粒，室温条件下静置2min后，用转速大于等于13,000g的离心机离心1min。扔掉Mini柱，保留1.5ml离心管。9.细胞复苏(1)从液氮中取出需要复苏的人宫颈癌细胞Hela和人乳腺癌细胞MAD-MB-231冻存管，用镊子将冻存管立刻夹放在37℃水浴锅中，快速摇晃冻存管，使冻存细胞融化；(2)将融化的细胞转移到15ml的离心管中，加入2ml培养基后，在转速1000rpm每分钟的条件下，离心5min，小心吸取上清，用1ml完全培养基(DMEM+10％FBS+P/S)吹打悬浮细胞，转移至培养皿中继续培养。10.细胞培养人宫颈癌细胞株Hela细胞和人乳腺癌细胞株MDA-MB-231细胞均使用含100U/ml青霉素(Penicillin)、100U/ml链霉素(Streptomycin)和10％FBS胎牛血清的DMEM培养基，在CO2浓度为5％、温度为37℃、湿度状态饱和的培养箱中培养。当细胞长满培养皿后，用含EDTA浓度为0.25％的胰蛋白酶(Trypsin)消化细胞，在转速为1000rpm每分钟条件下离心3min，将离心得到的细胞沉淀重悬后，根据实验需要进行传代，每2-3天传代或者更换培养基。11.细胞铺板(1)胰蛋白酶消化处于生长期的细胞，并用含10％FBS培养基中和胰蛋白酶的消化作用，转速1,000rpm条件下离心3min，2ml培养基重悬离心沉淀下来的细胞；(2)细胞计数：先将细胞悬液进行10倍稀释，即吸取10μl细胞悬液于90μl培养基中并混匀，接着，将干净的盖玻片盖在酒精擦拭过的血细胞计数板上后，吸取混匀的稀释过的10μl细胞悬液沿着盖玻片边缘打到计数板上，显微镜下计数(一般中皿长满计500万细胞，大皿长满计1500万细胞，依细胞种类和大小而定)；(3)根据孔板调节细胞铺板密度及培养基量：表4细胞铺板密度孔板类型细胞数目培养基体积6孔板20-50万/每孔2ml12孔板20-30万/每孔1ml24孔板10-20万/孔500μl96孔板5000-8000/孔100μl12.细胞转染本实验采用脂质体转染的方法将外源性基因导入细胞内，所用试剂为Invitrogen公司的Lipofectamine3000，具体实验方案如下：(1)根据实验需要，选择相应的培养板及接种的细胞数量接种细胞，培养至细胞汇合度在70％-90％，一般需要24h，细胞数目满足条件后开始转染；(2)转染复合物的配制：在2个1.5ml的离心管中，使用Opti-MEM培养基分别稀释Lipofectamine3000试剂和DNA质粒，然后将两管培养基混合，并充分混匀后室温条件下静置孵育5min。DNA质粒指的是表达OligomerRNA的对照组质粒以及表达asRNA的实验组质粒。具体稀释比例如下：表5转染复合物(3)取静置孵育好的转染复合物吹打混匀后，缓慢逐滴加入到对应孔板中，把孔板放回培养箱中培养前轻轻摇匀，转染4-6h后弃掉含有转染复合物的培养基，更换成新的培养基。继续将细胞在37℃培养箱中培养2-4天，然后分析转染细胞。13.细胞RNA提取(1)吸去孔板中的培养基，然后将500μlTrizol试剂于每孔，室温反应5min，待贴壁细胞全部脱落后转移至灭菌的1.5ml离心管中，室温条件下细胞裂解15min；(2)在预冷的低温高速离心机以温度为4℃，转速为12,000rpm的条件离心15min，离心后可见溶液分为三层，最上面的上清液为需要回收的RNA层，中间的蛋白质层和下层的有机层则直接弃掉；(3)将含RNA的上清液吸取到另一灭菌的1.5ml离心管中(注意避免吸到蛋白层)，加入体积和上清液相等的异丙醇，轻轻上下颠倒混匀，室温条件下静置15min，用已经预冷的低温高速离心机在转速为12,000rpm每分钟的条件下，离心10min，白色的RNA会沉淀于管底，小心吸去上清；(4)按75％乙醇与Trizol体积比大于等于1的原则，加入用灭菌双蒸水处理过的75％乙醇悬浮沉淀，上下缓慢颠倒离心管进行RNA洗涤，用4℃已经预冷的低温高速离心机在转速为7,500rpm每分钟的条件下，离心5min。清洗步骤重复1-2次；(5)吸去上清，室温条件下静置约10min，自然干燥RNA沉淀，加入适量(10-50μl)的灭菌的DEPC水于55-60℃温度下溶解；(6)用ThermoNanoDrop2000紫外分光光度计对RNA样品浓度进行测定，其中作为空白对照的是灭菌的去离子水，读取OD260和OD280后并计算OD260/OD280比值，用来分析RNA纯度(OD260/OD280的比值在1.8-2.0之间说明提取的RNA纯度较好，OD260/OD280＜1.8表示有蛋白质污染，OD260/OD280＞2.2表示RNA已降解)。0.8％琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量；(7)记录每管RNA的浓度、纯度及提取时间，于-80℃冰箱保存备用。14.反转录(ReverseTranscription，RT)反应根据日本ReverTraAce-α-TMFirstStrandcDNASynthesisKit试剂盒说明书(所有操作均在冰上进行)：(1)融化模板RNA和反转录试剂，缓慢颠倒数次混匀并离心数十秒；(2)按照下表成份配制反应液用来去除RNA基因组中DNA杂质；表6去DNA混合液(3)灭活DNA酶：去除DNA的反应结束后，将离心管迅速置于冰上，加入1μl10mM的EDTA试剂后，充分振荡混匀，65℃条件下处理10min；(4)合成cDNA：参照说明书配制如下反转录体系：表7反转录体系反应组分体积(μl)DNaseI处理过的RNA(1μg)115×RT-Buffer4DntpMixture2Oligo(dT)201RNaseInhibitor1ReverTraAce1Total20(5)振荡混匀，稍离心后，继续以下反转录反应，反应结束后于-20℃条件下保存反转录产物。表8反转录反应条件反应温度孵育条件42℃30min99℃5min4℃5min15.引物合成本实验所用引物代由上海生工生物工程股份有限公司合成。表9引物序列16.实时荧光定量PCR反应(1)参照SYBRPremixExTaqTMII使用说明书配制下表反应混合液：表10实时荧光定量PCR反应体系(2)上述反应体系混匀后向96孔反应板中加样，封膜，室温下1000转/分钟离心1分钟去除气泡；(3)按如下表反应条件进行实时荧光定量PCR反应：表11实时荧光定量反应条件(4)数据分析：本实验采用数据分析方法为2-ΔΔCt法，采用SPSS数据统计分析软件分析结果和GraphPadPrism6.0软件作图。17.CCK-8法检测细胞增殖(1)细胞转染换液后标记为0H，向其中加入培养基体积1/10的CCK-8；(2)将孔培养板继续放置于5％CO2和37℃的培养箱内继续培养约1-4h，取出孔板用MultiscanGO在450nm波长处检测OD值，并记录实验结果。(3)24H、48H和72H时CCK-8处理方法同上，注意CCK-8孵育时间一致。18.EdU法检测细胞增殖细胞转染换液48H后进行EdU标记，标记方法如下：(1)用细胞培养基按1000:1的比例稀释EdU溶液(试剂A)，制备适量50μMEdU培养基；注：①EdU浓度与孵育时间相关，短时间孵育(<2h)宜采用高浓度(10～50μM)，长时间孵育(>24h)宜采用低浓度(1～10μM)；②如果需配置10μMEdU培养基，需调整为5000：1稀释比例；③配置好的培养基的保存时间取决于培养基的性质。(2)每孔加入500μl50μMEdU培养基孵育2小时，弃培养基；注：①最佳孵育时间与细胞周期相关(表12)，大多数肿瘤细胞系均可采用2小时孵育时间；②EdU培养基用量以没过细胞为宜，但需要保证EdU孵育时间内的营养物质持续供给(表13)。表12EdU孵育时间设定参考表13EdU培养基及染色反应液的使用量参考(3)PBS清洗细胞1-2次，每次5min；注：清洗目的是将未渗入DNA的EdU洗脱，清洗方式依据不同的细胞类型而定，贴壁不牢的细胞请降低清洗强度。(4)细胞固定化每孔加入500μl细胞固定液(即含4％多聚甲醛的PBS)室温孵30min，弃固定液；每孔加入500μl2mg/mL甘氨酸，脱色摇床孵育5min后，弃甘氨酸溶液；(5)每孔加入500μLlPBS，脱色摇床清洗5min，弃PBS；(6)(加强)每孔加入500μl渗透剂(0.5％TritonX-100的PBS)脱色摇床孵育10min；PBS清洗1次，5min。(7)Apollo染色每孔加入500μl的1X染色反应液，避光、室温、脱色摇床孵育30min后，弃染色反应液；加入500μl渗透剂(0.5％TritonX-100的PBS)脱色摇床清洗2-3次，每次10min，弃渗透剂；(加强)每孔每次加入500μl甲醇清洗1-2次，每次5min；PBS清洗1次，每次5min。(8)DNA染色用去离子水按100:1的比例稀释试剂F，制备适量1XHoechst33342反应液，避光保存；每孔加入500μl1XHoechst33342反应液，避光、室温、脱色摇床孵育30min后，弃染色反应液；每孔每次加入500μlPBS清洗1-3次；建议染色完成后立即进行观测拍照；如果条件限制，请避光4℃湿润保存待测，但不应超过3天。19.划痕实验检测细胞迁移(1)细胞铺板本实验所用孔板为6孔板，取对数生长期的细胞消化离心后适量接种于6孔板，每孔2ml细胞悬液。(2)划痕处理培养板接种细胞之前先用标记笔在6孔板背面画横线标记(方便拍照时定位同一个视野)；细胞铺6孔板培养，细胞转染，数量以细胞转染贴壁后铺满板底为宜；细胞转染4-6小时后用白枪头(2.5μl)比着垂直于板背后横线的直尺，尽量枪头垂直于孔板划一道痕，尽量保证各个划痕宽度一致；轻轻摇晃以除去划落细胞，吸去旧培养基，并用灭菌1×PBS轻轻洗孔板3次，换上无血清培养基；拍照记录划痕宽度；16小时后再次拍照记录划痕宽度。20.Transwell实验检测细胞迁移(1)细胞铺板本实验所用孔板为12孔板，取对数生长期的细胞消化离心后适量接种于12孔板，每孔1ml细胞悬液。(2)Transwell处理细胞接种前可先让细胞撤血清饥饿12-24h，进一步去除血清的影响(但这一步并不是必须的)；消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，(用PBS洗1-2遍)，用无血清的DMEM培养基重悬，并调整细胞密度至5×105/ml；取细胞悬液100μl加入Transwell小室；24孔板下室一般加入600μl含FBS的培养基；常规培养细胞12-48h(主要依癌细胞侵袭能力而定)。24h较常见，时间点的选择除了要考虑到细胞侵袭力外，处理因素对细胞数目的影响也不可忽视；取出Transwell小室，弃去孔中培养液，用PBS洗2遍，甲醇固定30min，将小室适当风干；0.1％结晶紫染色20min，用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞，用PBS洗3遍；对染色的细胞拍照后用33％的冰醋酸溶解细胞，并测定细胞在波长570nm处的吸收值，记录实验结果。21.ELISA法检测细胞凋亡(1)试剂配置①洗涤工作液浓洗涤液按1:25倍用去离子水进行稀释。例如用量筒量取240ml去离子水，倒入烧杯或者其他洁净容器中，再量取10ml浓洗涤液，均匀加入，搅拌均匀，在临用前配妥。浓洗涤液低温保存会有盐析出，稀释时可在水浴中加温助溶。②辣根过氧化物酶标记物工作液辣根过氧化物酶标记物按1:100倍用辣根过氧化物酶标记物稀释液进行稀释。如10ul辣根过氧化物酶标记物加990ul辣根过氧化物酶标记物稀释液，轻轻混匀，在临用钱10分钟内配妥。(2)样本采集及保存①细胞在24孔板中转染48H后，对细胞进行消化，收集到对应的1.5mlEP管中：胰酶100μl/孔+全陪200μl/孔终止；②1000转离心5min，去上清；③400μl冷PBS/孔重悬细胞，1000转离心，3min，去上清；④200μl冷PBS/孔再次重悬细胞，1000转离心，3min，去上清；⑤100μl冷PBS/孔重悬细胞，转至-80°保存待明天或继续⑥；⑥反复冻融：-80°冻存30min，立即转至37°水浴锅30min；重复3次。(3)将各种试剂移至室温(18-25℃)平衡至少30分钟；(4)加样：每孔待测样本100μl。轻轻晃动混匀，覆上板贴，37°温育30分钟；(5)弃去孔内液体，甩干，洗板3次。每次浸泡2分钟，200μl/每孔，甩干；(6)每孔加入辣根过氧化物酶标记物工作液100μl，轻轻晃动混匀，覆上板贴，37°温育30分钟；(7)弃去孔内液体，甩干，洗板5次。每次浸泡2分钟，200μl/每孔，甩干；(8)依序每孔加底物溶液90μl，37°避光显色20分钟；(9)依序每孔加终止溶液50μl，终止反应；(10)在反应终止后5分钟内用酶标仪在450nm波长依序测量各孔的光密度(OD值)。22.Hoechst法检测细胞凋亡(1)细胞转染48小时后，将培养基吸出，然后用灭菌的1×PBS洗涤2-3次；(2)4％多聚甲醛固定20min；(3)吸除固定液，用灭菌1×PBS洗涤2次，每次3分钟；(4)加入Hoechst33342染色液，室温染色5-15分钟，灭菌1×PBS洗2次，每次3分钟；(4)取出爬片，反盖在滴有封片液的载玻片上，稍晾干；荧光显微镜下观察并拍照，统计凋亡细胞。实验结果1.Hela细胞和MDA-MB-231细胞中MALAT-1表达水平的检测细胞转染对照组质粒和实验组质粒48h后，收集细胞，并在提取RNA后逆转录，实时荧光定量PCR技术检测Hela细胞和MDA-MB-231细胞中MALAT-1表达水平结果如图2所示。和对照组相比，Hela细胞和MDA-MB-231细胞中转染表达asRNA质粒后，两种细胞中MALAT-1的表达水平都显著降低(P<0.05)。2.Hela细胞和MDA-MB-231细胞增殖能力的检测采用CCK-8和EdU两种方法检测Hela细胞和MDA-MB-231细胞增殖能力的变化。如图3和图4所示，和对照组相比，Hela细胞和MDA-MB-231细胞中转染表达asRNA质粒后，两种细胞的增殖能力都显著降低(CCK-8，P<0.001；EdU，P<0.05)。图3是利用CCK-8法检测Hela细胞和MDA-MB-231细胞增殖能力的变化。图3的A部分中，和对照组相比，asRNA实验组中，Hela细胞增殖能力显著降低(P<0.001)；图3的B部分中，和对照组相比，asRNA实验组中，MDA-MB-231细胞增殖能力明显下降(P<0.001)。图4是利用EdU法检测Hela细胞和MDA-MB-231细胞增殖能力的变化。图4的A、B部分中，Hoechst染料标记的是所有细胞，EdU染料标记的是24h内增殖的细胞，Merge表示两种染料标记的细胞重叠。图4的C部分中，通过细胞计数，计算增殖细胞占所有细胞比例，结果显示，转染asRNA后，Hela细胞和MDA-MB-231细胞的增殖能力明显下降(P<0.05)。3.Hela细胞和MDA-MB-231细胞迁移能力的检测向Hela细胞和MDA-MB-231细胞中转染对照组质粒和asRNA质粒后，用用划痕和Transwell两种方法检测两种细胞迁移能力的变化。如图5和图6所示，转染asRNA质粒后的Hela细胞和MDA-MB-231细胞的迁移能力明显被抑制(划痕：Hela，P<0.01；MDA-MB-231，P<0.05；Transwell：Hela，P<0.01；MDA-MB-231，P<0.01)。图5是利用划痕法检测Hela细胞和MDA-MB-231细胞迁移能力的变化。对于图5的A、B部分，Hela细胞和MDA-MB-231细胞分别转染对照组和asRNA质粒后，0H时划痕处理后拍照，继续培养细胞16h后，再拍照。对于图5的C部分，计算16H后细胞迁移的比率，结果表明，Hela细胞和MDA-MB-231细胞中转录出来的asRNA能够显著抑制细胞的迁移能力(HelaP<0.01，MDA-MB-231P<0.05)。图6是利用Transwell法检测Hela细胞和MDA-MB-231细胞迁移能力的变化。对于图6的A、B部分，Hela细胞和MDA-MB-231细胞分别转染对照组和asRNA质粒24H后，消化并转移细胞至Transwell小室中，继续培养20H，细胞固定染色后拍照，用33％冰醋酸溶解细胞后测OD值。对于图6的C部分，依据OD值的结果表明，Hela细胞和MDA-MB-231细胞转染表达asRNA的质粒后细胞的迁移显著下降(P<0.01)。4.Hela细胞和MDA-MB-231细胞凋亡能力的检测将asRNA质粒转染到Hela细胞和MDA-MB-231细胞后，用ELISA和Hoechst染色两种方法检测细胞凋亡能力的变化。如图7和图8所示，转染asRNA质粒的Hela细胞和MDA-MB-231细胞凋亡能力明显强于转染对照组质粒的细胞。图7是利用ELISA法检测Hela细胞和MDA-MB-231细胞凋亡能力的变化。和对照组相比，asRNA实验组中，Hela细胞和MDA-MB-231细胞的凋亡能力显著提高(P<0.05)。图8是Hoechst法检测Hela细胞和MDA-MB-231细胞凋亡能力的变化。对于图8的A部分，用Hoechst染料标记细胞，其中标记较亮的为凋亡细胞。对于图8的B部分，统计凋亡细胞数目后并计算其比率，结果显示，和对照组相比，asRNA实验组中，Hela细胞和MDA-MB-231细胞的凋亡数目明显多于对照组(P<0.01)。本实验利用Dicer酶能将长双链RNA切割成短双链RNA的特性，通过一段与Dicer酶高度亲和的寡聚核苷酸(OligomerRNA)定向引导Dicer酶切割反义RNA-靶RNA双链，最终达到降解靶RNA的目的。本实验选取与肿瘤发生发展相关的肺腺癌转移相关因子MALAT-1基因的RNA作为靶RNA，将其反义RNA和OligomerRNA相连后，形成人工小RNA(ArtificialsmallRNA，asRNA)，选取Hela细胞和MDA-MB-231细胞为实验细胞。成功构建转录asRNA质粒后，用脂质体转染的方法将其导入到Hela细胞和MDA-MB-231细胞中，其中对照组实验所用质粒为只转录OligomerRNA的质粒。在亲和力和碱基互补原则作用下，细胞中转录出来的反义RNA和Dicer、靶RNA形成一个复合体，接着，复合体中靶RNA和反义RNA中的互补序列形成的双链RNA被Dicer酶剪切。该技术发挥结合内源Dicer蛋白功能的核酸适配体OligomerRNA与发挥识别靶点RNA功能的反义RNA实现连接，形成人工反义RNA，这种新型器件可在细胞内高亲和性结合Dicer蛋白分子，并进一步借助反义RNA特异性抑制RNA的表达。本实验利用适配体OligomerRNA定向诱导Dicer切割反义RNA-靶RNA杂交分子，高效实现降解靶RNA，有效地提高基因调控作用，拓宽了基因工程的方法路线，进一步推动了反义技术在基因调控中的研究，加强了其在功能基因组学、靶标鉴定和医学等领域的应用和发展。以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换。当前第1页1 2 3