一种青蛤抗肿瘤酶解寡肽的制作方法

本发明涉及一种海洋生物活性寡肽，具体涉及一种青蛤抗肿瘤酶解寡肽。
背景技术：
：前列腺癌的发病率在男性恶性肿瘤中位居首位，好发于老年男性。在我国，前列腺癌发病率呈逐年上升趋势，居泌尿系统肿瘤的首位，严重威胁老年男性的健康。传统治疗方法如手术、放疗和冷冻治疗等效果并不理想，且复发率比较高，并且当复发的前列腺癌转化为非雄激素依赖性时，治疗将更困难；而化疗药物产生耐药性后，疗效更差并毒副作用明显。因此，寻找抗前列腺癌药物成为学者们研究的热点。海洋是发现新型抗癌药物的一个丰富的资源宝库，多种海洋寡肽、糖胺聚糖等都具有抗肿瘤、抗病毒、抗真菌等生理活性。从双壳贝类中提取的文蛤寡肽Mere15、菲律宾蛤仔寡肽对人慢性骨髓性白血病K562细胞、前列腺癌细胞具有增殖抑制作用，并导致浓度依赖性细胞凋亡；从近江牡蛎提取的糖胺聚糖具有体内外抗肿瘤活性，不仅可以抑制K562、CNE-2Z、Hela细胞的生长，还对CTX损伤小鼠的免疫功能有一定的修复作用。青蛤（Cyclinasinensis）属于软体动物门，鳃瓣纲，异齿亚纲，帘蛤目、帘蛤科，含高蛋白、低脂肪和高含量的不饱和脂肪酸，味道鲜美，具有很好的营养价值。青蛤在民间入药具有悠久的历史，是一种重要的海洋药物，具有软坚散结、清热燥湿及镇咳作用。ChangxingJ等从青蛤中提取出的多糖具有抗氧化和保肝活性，对人胃癌BGC-823细胞的生长具有强烈的抑制作用。然而，目前关于青蛤寡肽的提取及活性的研究报道并不多，本实验采用蛋白酶酶解青蛤内脏，经正交实验获得最佳酶解条件，经分离纯化，筛选出活性寡肽，研究其体外抗人前列腺癌DU-145细胞的活性，以期为青蛤活性寡肽的制备及抗癌作用研究提供实验依据。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题是提供一种具有抗肿瘤功效的青蛤抗肿瘤酶解寡肽。本发明为解决上述技术问题所采取的技术方案为：该寡肽的氨基酸序列为Ile-Leu-Tyr-Met-Pro（ILYMP），分子量为635.82Da。该肽采用如下方式制备：1）取青蛤匀浆，以活性酶在最适酶解温度及pH值条件下，加蛋白酶200~12000U/g、保温4~10h进行酶解；然后后灭活，在0~4oC、12000r/min的条件下离心，取上清；2）取最佳酶种及最优酶解条件下酶解的上清液，用截留分子量为3ku的超滤膜进行超滤；3）取超滤组分进行琼脂糖凝胶层析分离，浓度：0.01~0.5g/mL，离心后取上清过0.22µm滤膜，进行洗脱；收集洗脱产物，冷冻干燥；4）取组分过HPLC进一步分离得到青蛤抗肿瘤酶解寡肽。与现有技术相比，本发明提供的一种青蛤抗肿瘤酶解寡肽的优点在于：本发明工艺科学合理，操作简单，随着青蛤抗肿瘤酶解寡肽（CSOP）浓度的增加，作用时间的延长，DU-145细胞的增殖抑制率明显上升；倒置显微镜下观察、AO/EB荧光染色、Hoechst33258荧光染色及透射电镜技术实验表明细胞出现凋亡的形态学变化；流式细胞术结果表明，细胞早期凋亡率及线粒体膜电位下降所占百分率增加，且随着CSOP浓度增加，早期凋亡率增加较为明显，其膜电位下降更为显著，即预示线粒体凋亡信号通路在CSOP诱导的DU-145细胞凋亡过程中起着重要作用。同时，本发明所制备的青蛤抗肿瘤酶解寡肽是天然原料经酶解制得，安全、无毒副作用，抗肿瘤活性显著，青蛤抗肿瘤酶解寡肽可以作为抗前列腺癌药品、功能食品进行开发。附图说明图1本为发明实施例分子结构示意图；图2本为发明实施例琼脂糖凝胶柱洗脱峰示意图；图3本为发明实施例寡肽组分在280nm处高效液相色谱图；图4本为发明实施例寡肽对DU-145细胞的增殖抑制作用对比图；图5为本发明实施例对DU-145细胞nm23H1蛋白的表达示意图。具体实施方式以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。实施例：一种青蛤抗肿瘤酶解寡肽制备工艺流程如下：1）样品的制备将青蛤洗净、去壳、取内脏，并用0.1mol/L的NaoH溶液浸泡去脂，于蒸馏水中轻轻搅拌去杂质，加一倍体积的纯水匀浆后备用。2）青蛤的酶解：分别取10.0g匀浆样品，以碱性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和胃蛋白酶这5种酶为供试酶种，在各自最适酶解温度及pH值条件下（见表1），加蛋白酶1200-1800U/g、保温1-6h进行酶解。结束后灭活15min，4oC、12000r/min离心10min，取上清。表1不同蛋白酶的最适酶解温度和pH酶种酶解温度（℃）酶解pH碱性蛋白酶45.010.0胰蛋白酶37.08.0木瓜蛋白酶60.06.0中性蛋白酶45.07.0胃蛋白酶37.02.0作为优选，最优酶种为木瓜蛋白酶。料液比为1:4，pH值为7.0，加酶量为1500U/g，温度为45.0℃，酶解时间是4h。3）青蛤抗肿瘤酶解寡肽的分离纯化：将选取上述上清液＜3ku分子段酶解液进行下步纯化。具体过程为：取＜3ku分子段冻干样品进行琼脂糖凝胶层析，于280nm处出现三个峰，即峰1、峰2和峰3，见图2，收集各峰组分，冷冻干燥。MTT法显示峰1和峰3对DU-145细胞的抑制活性较好。收集峰1冷冻干燥。峰1即为青蛤酶解寡肽，该峰的保留时间约为12min，峰面积16.32，峰高1999.79，经N端测序得出该肽的氨基酸序列为：Ile-Leu-Tyr-Met-Pro，分子量635.82Da。CSOP作用DU-145细胞后的MTT结果见图4。青蛤酶解寡肽（即CSOP）浓度的增加、作用时间的延长，增值抑制率IR明显上升。当CSOP浓度为2mg/mL，作用时间为24h，IR为9.89±0.49%；而当浓度为15mg/mL，作用时间72h，IR达到84.17±4.21%，IC50为5.36±0.27mg/mL，与对照组相比具有统计学意义（P＜0.05）。nm23H1蛋白阳性表达为细胞质内出现棕色结构。A正常DU-145细胞B2mg/mLCSOP组DU-145细胞，C8mg/mLCSOP组DU-145细胞，D12mg/mLCSOP组DU-145细胞。对照组大部分细胞胞浆内呈浅棕色，个别细胞呈现阴性（见A）。而随着CSOP作用浓度的增加，视野下的细胞数量明显减少，细胞质内的阳性部位颜色逐渐加深，出现了巨核细胞，部分细胞核呈固缩状态。最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的一个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。SEQUENCELISTING<110>浙江海洋学院<120>一种青蛤抗肿瘤酶解寡肽<130>zjou-yzs-01<160>1<170>PatentInversion3.5<210>1<211>5<212>PRT<213>人工合成<400>1IleLeuTyrMetPro15当前第1页1 2 3