本发明涉及一种帕西瑞肽五肽中间体的液相合成方法，以及该关键中间体在制备帕西瑞肽中的应用。
背景技术：
帕西瑞肽是由诺华公司(Novartis)研制，2012年4月获得欧洲委员会的上市批准，同年12月获得美国FDA的上市批准，其结构如下(Ⅱ)所示，是一种可注射的环六肽生长抑素类似物，它通过与生长抑素受体(ssts)结合发挥其药理学活性，用于无法手术或手术治疗失败的成人库欣病(Cushing’s disease)患者的治疗，是首个用于治疗库欣氏病的孤儿药。
目前帕西瑞肽的合成多采用固相合成方法，例如按标准的Fmoc/tBu策略，以SASRIN Resin为起始树脂，固相缩合得到{(4-Boc-NH-C2H4-NH-CO-O)}Pro}-Phg-D-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Tyr(4-Bzl)-Phe或者Lys(Boc)-D-Trp(Boc)-Phg-{(4-Boc-NH-C2H4-NH-CO-O)Pro}-Phe-Tyr(4-Bzl)，最后液相环化，TFA裂解得到目标产物帕西瑞肽粗肽，再进行HPLC纯化得到合格的帕西瑞肽精肽。相似固相合成方法见专利CN103467575A、WO2005014624、US20060258838A1、EP1654280B1等。固相合成方法存在这样几个问题：制备量少、设备复杂、需要使用大量的树脂和洗涤溶剂等。Novartis公司报道的液相合成方法采用直线式合成路线，具有效率低，总产率不高等缺点。
本发明使用液相合成法制备帕西瑞肽五肽中间体(结构Ⅰ)，采用汇聚式合成路线，节省时间，总产率高。其中使用BSA作为赖氨酸羧基部分的保护基，使得 氨基酸在接肽过程中，产率高，易处理，利于大规模工业生产。
技术实现要素：
本发明解决的技术问题在于提供一种帕西瑞肽五肽中间体的液相合成方法，进而实现帕西瑞肽的液相合成，解决目前采用固相合成法成本高，反应不易检测，不适宜大规模化生产等问题。
为解决本发明的技术问题，提供如下技术方案：
帕西瑞肽五肽中间体的液相合成方法：
a.以N(γ)-叔丁氧羰基赖氨酸为原料，BSA保护其羧基，再与N端保护的D-色氨酸活性酯连接，得到N-苄氧羰基-D-色氨酸-N(γ)-叔丁氧羰基赖氨酸，再于氢解条件下脱去N端保护基得到D-色氨酸-N(γ)-叔丁氧羰基赖氨酸；
b.以D-色氨酸-N(γ)-叔丁氧羰基赖氨酸为原料，使用BSA保护赖氨酸的羧基部分，再与N端保护的苯甘氨酸活性酯连接，制得N-(9-芴甲氧羰基)-苯甘氨酸-D-色氨酸-N(γ)-叔丁氧羰基赖氨酸；
c.以苯丙氨酸酯为原料，与N端保护的O-苄基酪氨酸的活性酯连接，制得N-叔丁氧羰基-O-苄基酪氨酸-苯丙氨酸酯，再于酸性条件下脱去N端保护基得到O-苄基酪氨酸-苯丙氨酸酯；
d.以N-(9-芴甲氧羰基)-苯甘氨酸-D-色氨酸-N(γ)-叔丁氧羰基赖氨酸为原料，与O-苄基酪氨酸-苯丙氨酸酯在TBTU作用下缩合得到N-(9-芴甲氧羰基)-苯甘氨酸-D-色氨酸-N(γ)-叔丁氧羰基赖氨酸-O-苄基酪氨酸-苯丙氨酸酯，再于碱性条件下脱去N端保护基得到苯甘氨酸-D-色氨酸-N(γ)-叔丁氧羰基赖氨酸-O-苄基酪氨酸-苯丙氨酸酯；
合成路线如下：
其中，R＝C1-6烷氧基，优选OCH3，OC2H5，OC(CH3)3，
R1＝OSu、ONb、OBt、OOBt、OAt。
其中，步骤a、b、c所述的氨基酸活性酯，包括N-羟基琥珀酰亚胺酯、N-羟基-5-降冰片烯-2，3-二甲酰亚胺酯、1-羟基苯骈三氮唑酯、3-羟基-4-氧-3,4-二氢-1,2,3-苯骈三氮唑酯、1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑酯。
其中，步骤c所述的酸性条件，优选的酸选自包括三氟乙酸、盐酸、氢氟酸，所用溶剂包括二氯甲烷、四氢呋喃、1,4-二氧六环。
其中，步骤d所述的碱性条件，优选的碱选自哌啶、浓氨水、乙二胺、乙醇胺、环己胺、1,4-氮氧六环、吡咯烷酮、DBU、氢氧化钠、氢氧化锂；所用溶剂包括二 氯甲烷、四氢呋喃，1,4-二氧六环。
本发明最优选的制备方法，其步骤如下：
(1)制备D-色氨酸-N(γ)-叔丁氧羰基赖氨酸
将BSA和N(γ)-叔丁氧羰基赖氨酸加到无水N，N-二甲基甲酰胺中，10～35℃下搅拌1～2h，滴入N-苄氧羰基-D-色氨酸-(N-羟基)琥珀酰亚胺酯的二氯甲烷溶液，10～35℃下反应6-9h，减压蒸除二氯甲烷，加入乙酸乙酯，水洗除去N,N-二甲基甲酰胺，减压蒸除乙酸乙酯，加乙醚，用5％的碳酸氢钠水溶液萃取；合并水相，加入柠檬酸调至pH5～7，用乙酸乙酯萃取，合并有机相，用饱和食盐水洗涤后经无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩至干，得淡黄色泡沫状固体；将淡黄色固体加之无水甲醇中，10～35℃下加入10％质量分数的5％钯碳，通入氢气，反应4～7h，过滤得淡黄色溶液，蒸干溶剂，加入5％的碳酸氢钠水溶液溶解，柠檬酸调节pH＝6-8，有白色固体析出，过滤，干燥得白色固体。
(2)制备N-(9-芴甲氧羰基)苯甘氨酸-D-色氨酸-N(γ)-叔丁氧羰基赖氨酸
将BSA和D-色氨酸-N(γ)-叔丁氧羰基赖氨酸加入到无水四氢呋喃中，10～35℃下搅拌1-2h，滴入N-(9-芴甲氧羰基)苯甘氨酸-(N-羟基)琥珀酰亚胺酯的四氢呋喃溶液，10～35℃下反应6-9h，减压蒸除四氢呋喃，加入乙醚，用5％的碳酸氢钠水溶液萃取；合并水相，加入柠檬酸调至pH5～7，用乙酸乙酯萃取；合并有机相，用饱和食盐水洗涤后经无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩至干，无水甲醇重结晶，得白色固体。
(3)制备O-苄基酪氨酸-苯丙氨酸酯
将苯丙氨酸酯盐酸盐溶于无水四氢呋喃中，控温于5℃，滴入三乙胺，随后滴入N-叔丁氧羰基-O-苄基酪氨酸-(N-羟基)琥珀酰亚胺酯的四氢呋喃溶液，10～35℃下反应4-6h，减压蒸除四氢呋喃，加入乙酸乙酯，分别经5％碳酸氢钠水溶液洗涤，5％柠檬酸水溶液洗涤，饱和食盐水洗涤；有机相经无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩至干，得到白色固体；所得白色固体加至无水二氯甲烷中，0～5℃下搅拌滴加三氟乙酸至VCH2Cl2：VCF3COOH＝1～5:1，10～35℃下搅拌反应2～5h，减压浓缩至干，乙醚重结晶，得到白色固体。
(4)制备苯甘氨酸-D-色氨酸-N(γ)-叔丁氧羰基赖氨酸-O-苄基酪氨酸-苯丙氨酸酯
将N-(9-芴甲氧羰基)苯甘氨酸-D-色氨酸-N(γ)-叔丁氧羰基赖氨酸和O-苄基 酪氨酸-苯丙氨酸酯溶于无水四氢呋喃中，0～5℃下加入O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸和N-甲基吗啡啉，10～35℃下反应4-8h，减压蒸除四氢呋喃，加入乙酸乙酯，经5％碳酸氢钠水溶液洗涤，5％柠檬酸水溶液洗涤，饱和食盐水洗涤，减压浓缩至干，甲醇重结晶；所得白色固体加至四氢呋喃中，0～5℃下滴加哌啶，10～35℃下反应2-4h，减压蒸除溶剂，加入甲醇重结晶，得到白色固体。
按照本发明提供的制备方法制备的五肽中间体在制备帕西瑞肽中的应用，五肽中间体与(Boc-NHCH2CH2NHCO)Hyp(Fmoc)-OH在缩合剂TBTU作用下进行缩合反应，再于HATU，HOBt作用下进行分子内缩合，得到的产物经酸脱除N端保护基叔丁氧羰基，得到帕西瑞肽。
有益技术效果：
1、本发明制备方法中步骤a和b，采用BSA作为赖氨酸羧基的保护基，具有如下优点(1)与氨基酸反应迅速且完全；(2)由于是中性硅烷化试剂，故不改变反应体系中的酸碱性；(3)此保护基易于脱去，加入水即可分解且副产物溶于水，易与主产物进行分离；(4)BSA来源广泛，价格便宜，常用于工业生产。
2、本发明采用3+2汇聚式合成策略，首先分别合成N-(9-芴甲氧羰基)苯甘氨酸-D-色氨酸-N(γ)-叔丁氧羰基赖氨酸、O-苄基酪氨酸-苯丙氨酸酯两个片段，然后3+2汇聚合成目标产物帕西瑞肽五肽中间体，总产率高(23.6％)，且可以分头并进，缩短路线时长。
3、本发明采用液相合成法，所需设备简单，与固相合成法相比，具有很多优点：(1)不需要树脂和大大过量的保护氨基酸及缩合剂；(2)不需要大量的洗涤溶剂；(3)反应易于监测；(4)易于实现规模化生产，大大降低生产成本。
术语和简称
Boc：叔丁氧羰基
Cbz：苄氧羰基
Fmoc：9-芴甲氧羰基
BSA：N,O-双(三甲基硅基)乙酰胺
NMM：N-甲基吗啉
DCC：N，N’-二环己基碳二亚胺
TBTU：O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸
HATU：2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯
HOBt：1-羟基苯并三唑
HOSu：N-羟基琥珀酰亚胺
HONb：N-羟基-5-降冰片烯-2,3-二甲酰亚胺
HOOBt：3-羟基-4-氧-3,4-二氢-1,2,3-苯骈三氮唑
HOAt：1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑
DBU：1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯
TFA：三氟乙酸
THF：四氢呋喃
DMF：N，N-二甲基甲酰胺
H-N(γ)-Boc-L-Lys-OH：N(γ)-叔丁氧羰基-L-赖氨酸
Cbz-D-Trp-OH：苄氧羰基-D-色氨酸
Boc-L-Tyr(Bzl)-OH：叔丁氧羰基-O-苄基-L-酪氨酸
H-L-Phe-OR：L-苯丙氨酸酯
Fmoc-Hyp-OH：9-芴甲氧羰基-反式-4-羟基-L-脯氨酸
具体实施方式
下面结合具体的实施例来对本发明进行阐述。
制备例
制备例1 N-苄氧羰基-D-色氨酸-(N-羟基)琥珀酰亚胺酯(a)
N-苄氧羰基-D-色氨酸(7.0g，20.7mmol)和N-羟基琥珀酰亚胺(2.4g，20.7mmol)加至无水THF(80ml)中，室温下搅拌。控温于5℃左右，缓慢滴入DCC(4.3g，20.9mmol)的THF(20ml)溶液。室温搅拌24h，多次过滤，滤液减压浓缩至干。所得黄色油状物，用异丙醇重结晶，得类白色固体7.6g，收率84.6％。1HNMR(400MHz,DMSO)δ10.94(s,1H),8.14(d,J＝8.2Hz,1H),7.56(d,J＝7.9Hz,1H),7.31(ddd,J＝24.4,17.1,8.5Hz,5H),7.09(t,J＝7.2Hz,1H),7.00(t,J＝7.2Hz,1H),4.99(q,J＝12.6Hz,2H),4.72-4.59(m,1H),3.35(dd,J＝14.6,4.7Hz,1H),3.17(dd,J＝14.6,9.9Hz,1H),2.80(d,J＝31.4Hz,4H)
制备例2 N-(9-芴甲氧羰基)苯甘氨酸-(N-羟基)琥珀酰亚胺酯(b)
N-(9-芴甲氧羰基)苯甘氨酸(10g，26.8mmol)和N-羟基琥珀酰亚胺(3.1g，26.8mmol)加至无水THF(100ml)中，室温下搅拌。控温于5℃左右，缓慢滴入DCC(5.6g，27.1mmol)的THF(20ml)溶液，室温搅拌24h。多次过滤，滤液减压浓缩至干，加入乙酸乙酯重结晶，得到白色固体11.2g，收率89.2％。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.76(d,J＝7.3Hz,2H),7.64-7.53(m,2H),7.40(t,J＝7.4Hz,2H),7.31(t,J＝7.4Hz,2H),5.79(s,1H),4.54(m,J＝8.1Hz,1H),4.45-4.40(m,1H),4.39-4.23(m,1H),2.81(s,4H)
制备例3 N-叔丁氧羰基-O-苄基-酪氨酸-(N-羟基)琥珀酰亚胺酯(c)
N-叔丁氧羰基-O-苄基-酪氨酸(7.4g，19.9mmol)和N-羟基琥珀酰亚胺(2.3g,19.9mmol)加至无水THF(80ml)中，室温下搅拌。控温于5℃左右，缓慢滴入DCC(4.1g，20.1mmol)的THF(20ml)溶液，室温搅拌5h。多次过滤，滤液减压浓缩至干，加入乙酸乙酯重结晶，得到白色固体8.5g，收率91.0％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.47-7.29(m,4H),7.20(d,J＝8.1Hz,2H),6.93(d,J＝8.1Hz,2H),5.04(s,2H),4.89(d,J＝12.6Hz,1H),3.31-3.06(m,2H),2.85(s,4H),1.42(s,9H)
实施例
实施例1 帕西瑞肽五肽中间体的液相合成方法
a:D-色氨酸-N(γ)-叔丁氧羰基赖氨酸(2)的制备
步骤1 N-苄氧羰基-D-色氨酸-N(γ)-叔丁氧羰基赖氨酸(1)
BSA(9.1g，44.9mmol)和N(γ)-叔丁氧羰基赖氨酸(5g，20.3mmol)加到无水DMF(50ml)中，室温下搅拌4h，滴入化合物a(8.8g，20.3mmol)的二氯甲烷(50ml)溶液，室温下搅拌，反应6h，减压蒸除二氯甲烷，加入乙酸乙酯(150ml)，水(100ml×3)洗除去DMF，减压蒸除乙酸乙酯，加乙醚(50ml)，用5％的碳酸氢钠水溶液(50ml×3)萃取；合并水相，加入柠檬酸调至pH＝6，用乙酸乙酯(100ml×3)萃取，合并有机相，用饱和食盐水洗涤后经无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩至干，得淡黄色泡沫状固体6.3g，收率55.2％。ESI-MS(m/z)：566.32[M+H]+； 1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.64(s,1H),10.79(s,1H),8.24(d,J＝7.9Hz,1H),7.66(d,J＝7.9Hz,1H),7.40-7.21(m,6H),7.15(s,1H),7.05(t,J＝7.5Hz,1H),6.96(t,J＝7.5Hz,1H),6.74(t,J＝5.7Hz,1H),4.94(s,2H),4.38(td,J＝9.1,5.0Hz,1H),4.15(q,J＝7.6Hz,1H),3.07(dd,J＝14.5,5.0Hz,1H),2.95-2.89(m,1H),2.84(t,J＝6.7Hz,2H),1.70-1.59(m,1H),1.58-1.46(m,1H),1.38-1.33(m,9H),1.16(q,J＝8.3,7.8Hz,2H)
步骤2 D-色氨酸-N(γ)-叔丁氧羰基赖氨酸(2)
化合物1(5g，8.8mmol)和钯碳(0.5g，10％)加至无水甲醇(50ml)中，通入氢气，室温下搅拌5h，过滤得淡黄色溶液，蒸干溶剂，加入5％的碳酸氢钠水溶液(30ml)溶解，柠檬酸调节pH＝6，有白色固体析出，过滤，干燥得白色固体3.6g，收率93.5％。ESI-MS(m/z)：432.82[M+H]+；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.64(s,1H),10.87(s,1H),8.07(s,1H),7.59(d,J＝7.9Hz,1H),7.33(d,J＝8.1Hz,1H),7.18(t,J＝7.4Hz,1H),7.06(t,J＝7.1Hz,1H),6.98(t,J＝7.4Hz,1H),6.73(s,1H),4.03(s,1H),3.74(dd,J＝6.9Hz,1H),3.12(dd,J＝14.4,5.9Hz,1H),2.88-2.78(m,3H),1.65-1.52(m,1H),1.52-1.41(m,1H),1.35(s,9H),1.31-1.23(m,2H),1.12-0.97(m,2H)
b:N-(9-芴甲氧羰基)苯甘氨酸-D-色氨酸-N(γ)-叔丁氧羰基赖氨酸(3)的制备
BSA(3.7g，18.3mmol)和化合物2(3.6g，8.3mmol)溶于无水THF(30ml)中，室温搅拌2h，滴入化合物b(3.9g，8.3mmol)的THF(20ml)溶液，室温下反应7h，减压浓缩至干，加入乙醚(50ml)，用5％的碳酸氢钠溶液(50ml×3)萃取；合并水相，加入柠檬酸调节pH＝6，乙酸乙酯萃取(100ml×3)，合并有机相，用饱和食盐水洗涤后经无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩至干，无水甲醇重结晶，得类白色固体3.7g，收率56.2％。ESI-MS(m/z)：788.27[M+H]+；1H NMR(400MHz,DMSO)δ12.53(s,1H),10.68(d,J＝2.4Hz,1H),8.50(d,J＝8.1Hz,1H),8.25(d,J＝7.8Hz,1H),8.02(d,J＝8.5Hz,1H),7.86(d,J＝7.5Hz,2H),7.75(dd,J＝11.3,7.6Hz,2H),7.55(d,J＝7.9Hz,1H),7.39(td,J＝7.4,3.0Hz,2H),7.31-7.17(m,7H),7.01(t,J＝7.4Hz,1H),6.91(s,1H),6.71(t,J＝5.8Hz,1H),5.36(d,J＝8.4Hz,1H),4.57(q,J＝8.1Hz,1H),4.22(dd,J＝13.5,7.1Hz,2H),3.04(dd,J＝14.5,5.2Hz,1H),2.88(d,J＝9.8Hz,1H),2.82(q,J＝6.7,6.1Hz,2H),1.58(s,1H),1.49(t,J＝7.5Hz,1H),1.33(s,9H),1.26(q,J＝7.2Hz,2H),1.09(dt,J＝13.9,7.6Hz,2H).
c:O-苄基酪氨酸-苯丙氨酸甲酯(5)的制备
步骤1 N-叔丁氧羰基-O-苄基酪氨酸-苯丙氨酸甲酯(4)
苯丙氨酸甲酯盐酸盐(5g，23.2mmol)溶于无水THF(50ml)中，控温于5℃，滴入三乙胺(2.3g，23.2mmol)，随后滴入化合物c(10.9g，23.2mmol)的THF(20ml)溶液，室温下搅拌5h，减压蒸除溶剂，加入乙酸乙酯(100ml)，用5％的碳酸氢钠水溶液(100ml×3)洗涤，用5％的柠檬酸水溶液(100ml×3)洗涤，最后用饱和 食盐水洗涤后经无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩至干，得到白色固体11.6g，收率93.5％。ESI-MS(m/z)：533.34[M+H]+；1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ7.36(ddt,J＝23.3,14.4,7.5Hz,5H),7.22(s,3H),7.10(d,J＝8.1Hz,2H),6.98(d,J＝6.9Hz,2H),6.89(d,J＝8.2Hz,2H),6.25(d,J＝7.4Hz,1H),5.03(s,2H),4.78(dd,J＝6.6Hz,1H),4.27(dd,1H),3.66(s,3H),3.01(dd,J＝27.1,6.5Hz,4H),1.40(s,9H)
步骤2 O-苄基酪氨酸-苯丙氨酸甲酯(5)
化合物4(6g，11.6mmol)加至无水二氯甲烷(25ml)中，控温于5℃左右，搅拌下滴加三氟乙酸(12ml)，室温搅拌4h，减压浓缩至干，乙醚重结晶得到白色固体5.9g，收率98.0％。ESI-MS(m/z)：433.32[M+H-CF3COOH]+；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.43-7.27(m,5H),7.22-7.08(m,5H),7.01(d,J＝7.0Hz,2H),6.89(d,J＝7.3Hz,1H),6.85(d,J＝8.6Hz,2H),4.96(s,2H),4.62(dd,J＝13.4,6.6Hz,1H),4.20(dd,J＝7.1Hz,1H),3.60(s,3H),3.14(dd,J＝13.9,6.3Hz,1H),3.04(d,J＝8.0Hz,1H),3.01-2.92(m,2H)
d:苯甘氨酸‐D‐色氨酸‐N(γ)‐叔丁氧羰基赖氨酸‐O‐苄基酪氨酸‐苯丙氨酸甲酯(7)的制备
步骤1 N-(9-芴甲氧羰基)苯甘氨酸-D-色氨酸-N(γ)‐叔丁氧羰基赖氨酸‐O‐苄基酪氨酸‐苯丙氨酸甲酯(6)
化合物3(3.5g，4.4mmol)和化合物5(1.4g，4.4mmol)溶于无水THF(50ml)中，控温于5℃左右，缓慢加入O‐苯并三氮唑‐N,N,N',N'‐四甲基脲四氟硼酸(1.6g，5.1mmol)和N‐甲基吗啡啉(0.5g，5.1mmol)，室温下搅拌6h，减压浓缩至干，加入乙酸乙酯(100ml)，用5％的碳酸氢钠水溶液(100ml×3)洗涤，用5％的柠 檬酸水溶液(100ml×3)洗涤，最后用饱和食盐水洗涤经无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩至干，甲醇重结晶，得到白色固体4.7g，收率87.8％。ESI-MS(m/z)：1202.36[M+H]+；1H NMR(400MHz,DMSO)δ10.70(d,J＝18.5Hz,1H),8.64(d,J＝6.7Hz,1H),8.27(d,J＝7.0Hz,1H),8.17(d,J＝7.6Hz,1H),7.97‐7.90(m,1H),7.85(d,J＝7.4Hz,2H),7.71(dd,J＝18.4,7.2Hz,2H),7.53(d,J＝8.0Hz,1H),7.41‐7.33(m,5H),7.31‐7.11(m,17H),7.04‐6.97(m,1H),6.95‐6.88(m,2H),6.84(d,J＝8.6Hz,2H),6.67(s,1H),5.38(d,J＝8.3Hz,1H),4.97(s,2H),4.57‐4.39(m,3H),4.26‐4.12(m,3H),4.09(s,1H),3.60‐3.45(m,3H),3.09‐2.85(m,5H),2.78(s,3H),1.43(s,1H),1.36(s,1H),1.33(s,9H),1.20(s,2H),0.93(d,J＝7.1Hz,2H).
步骤2 苯甘氨酸‐D‐色氨酸‐N(γ)‐叔丁氧羰基赖氨酸‐O‐苄基酪氨酸‐苯丙氨酸甲酯(7)
化合物6(4g，3.3mmol)溶于无水THF(50ml)中，控温于5℃左右，滴加25ml哌啶，室温下反应40min。减压蒸除溶剂，加入乙醚重结晶，得到白色固体3.0g，收率92.5％。ESI-MS(m/z)：980.78[M+H]+；1H NMR(400MHz,DMSO)δ10.70(s,1H),8.54(d,J＝8.3Hz,1H),8.25(d,J＝6.9Hz,1H),8.10(d,J＝10.7Hz,1H),7.88(d,J＝9.6Hz,1H),7.52(d,J＝10.8Hz,1H),7.41‐6.80(m,24H),5.26(dd,J＝8.7,5.4Hz,1H),4.97(s,2H),4.52‐4.37(m,3H),4.14‐4.01(m,1H),3.50(s,3H),3.07‐2.79(m,7H),2.69(dd,J＝25.9,12.5Hz,1H),1.32(s,9H),1.26‐1.11(m,4H),0.98‐0.82(m,2H).
应用例 帕西瑞肽五肽中间体在制备帕西瑞肽中的应用
1、反式-4-(N-叔丁氧羰基-乙二氨基)甲酰氧基-N-(9-芴甲氧羰基)-脯氨酸(ⅱ)的制备
步骤1 反式-4-(N-叔丁氧羰基-乙二氨基)甲酰氧基-N-(9-芴甲氧羰基)-脯氨酸甲酯(ⅰ)
三光气(3.2g，10.6mmol)和反式-4-羟基-(9-芴甲氧羰基)-脯氨酸甲酯(6.5g，17.7mmol)溶于无水THF(50ml)中，室温下反应2h，控温于5℃，滴加N-叔丁氧羰基乙二胺(14.2g，88.5mmol)的THF(20ml)溶液，加入4-二甲氨基吡啶(2.2g，17.7mmol)，室温下搅拌6h，减压浓缩至干，加入乙酸乙酯(100ml)，0.1mol/L盐酸水溶液(100ml×3)洗涤，用饱和食盐水洗涤后经无水硫酸钠干燥，过滤，蒸除部分乙酸乙酯后静置重结晶，得到白色固体6.7g，收率68.5％。ESI-MS(m/z)：554.6[M+H]+；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.77(d,J＝7.6Hz,2H),7.58(dd,J＝15.3,7.3Hz,2H),7.40(t,J＝7.4Hz,2H),7.32(t,J＝7.4Hz,2H),5.26(d,J＝20.9Hz,1H),4.79(s,1H),4.48(s,1H),4.42(d,J＝7.5Hz,1H),4.37–4.31(m,1H),4.28(d,J＝7.7Hz,1H),4.16(s,1H),3.82(s,1H),3.76(s,3H),3.66(s,1H),3.27(s,4H),2.45(s,1H),2.22(s,1H),1.44(s,9H)
步骤2 反式-4-(N-叔丁氧羰基-乙二氨基)甲酰氧基-N-(9-芴甲氧羰基)-脯氨酸(ⅱ)
化合物ⅰ(5g，9.0mmol)溶于无水甲醇(30ml)中，加入氢氧化钠(0.72g，18.0mmol)水溶液(10ml)，室温下搅拌2h，减压蒸除甲醇，得到不溶于水的白色固体4.2g，收率85.5％。ESI-MS(m/z)：540.41[M+H]+；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.77(d,J＝7.6Hz,2H),7.58(dd,J＝15.3,7.3Hz,2H),7.40(t,J＝7.4Hz,2H),7.32(t,J＝7.4Hz,2H),5.26(d,J＝20.9Hz,1H),4.79(s,1H),4.48(s,1H),4.42(d,J＝7.5Hz,1H),4.37–4.31(m,1H),4.28(d,J＝7.7Hz,1H),4.16(s,1H),3.82(s,1H),3.66(s,1H),3.27(s,4H),2.45(s,1H),2.22(s,1H),1.44(s,9H)
2、反式‐4‐(N‐叔丁氧羰基‐乙二氨基)甲酰氧基脯氨酸‐苯甘氨酸‐D‐色氨酸‐N(γ)‐Boc‐赖氨酸‐O‐苄基酪氨酸‐苯丙氨酸(ⅳ)的制备
步骤1 反式‐4‐(N‐叔丁氧羰基‐乙二氨基)甲酰氧基‐N‐(9‐芴甲氧羰基)脯氨酸‐苯甘氨酸‐D‐色氨酸‐N(γ)‐叔丁氧羰基赖氨酸‐O‐苄基酪氨酸‐苯丙氨酸甲酯(ⅲ)
化合物7(2.5g，2.55mmol)和化合物ⅱ(1.38g，2.55mmol)溶于无水THF(50ml)中，控温于5℃左右，缓慢加入O‐苯并三氮唑‐N,N,N',N'‐四甲基脲四氟硼酸(0.94g，2.93mmol)和N‐甲基吗啡啉(0.30g，2.93mmol)，室温下反应6h，减压蒸除溶剂，加入乙酸乙酯(100ml)，经5％的碳酸氢钠水溶液洗涤(100ml×3)，经5％的柠檬酸水溶液洗涤(100ml×3)，然后用饱和食盐水洗涤后经无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩至干，甲醇重结晶，得到白色固体2.85g，收率74.5％。ESI-MS(m/z)：1502.58[M+H]+；1H NMR(400MHz,DMSO)δ10.69(dd,J＝27.1,6.2Hz,1H),8.54(dd,J＝42.4,12.0Hz,2H),8.36(dd,J＝21.2,8.6Hz,1H),8.08(dd,J＝19.8,9.3Hz,1H),7.96‐7.90(m,1H),7.87(d,J＝5.0Hz,2H),7.59(d,J＝7.8Hz,2H),7.56‐7.51(m,1H),7.42‐7.11(m,26H),6.88(m,2H),5.58(dd,J＝39.8,8.0Hz,1H),4.96(m,2H),4.89‐4.70(m,1H),4.49(s,2H),4.23(d,J＝9.8Hz,2H),4.15(s,1H),4.08‐4.00(m,1H),3.90(s,1H),3.80(t,J＝14.3Hz,1H),3.52(d,J＝4.9Hz,3H),3.29(s,2H),3.07‐2.93(m,9H),2.92‐2.82(m,4H),2.28‐2.14(m,1H),2.02(dd,J＝15.3,9.7Hz,1H),1.55‐1.40(m,2H),1.35(s,18H),1.30‐1.23(m,2H),0.97(m,J＝16.8,10.8Hz,2H).
步骤2 反式‐4‐(N‐叔丁氧羰基‐乙二氨基)甲酰氧基脯氨酸‐苯甘氨酸‐D‐色氨酸‐N(γ)‐叔丁氧羰基赖氨酸‐O‐苄基酪氨酸‐苯丙氨酸(ⅳ)
化合物ⅲ(2.0g，1.33mmol)溶于THF(40ml)中，控温于5℃左右，滴加氢氧化钠(0.16g，3.99mmol)的水溶液(5ml)，室温反应4h，减压蒸除溶剂，即得 到不溶于水的白色固体，过滤，得白色固体1.54g，收率91.3％。ESI-MS(m/z)：1264.80[M+H]+；1H NMR(400MHz,DMSO)δ11.21(s,1H),10.69(dd,J＝27.1,6.2Hz,1H),8.54(dd,J＝42.4,12.0Hz,2H),8.36(dd,J＝21.2,8.6Hz,1H),8.08(dd,J＝19.8,9.3Hz,1H),7.96‐7.90(m,1H),7.56‐7.51(m,1H),7.42‐7.11(m,22H),6.88(m,2H),5.58(dd,J＝39.8,8.0Hz,1H),4.96(m,2H),4.89‐4.70(m,1H),4.23(d,J＝9.8Hz,2H),4.08‐4.00(m,1H),3.90(s,1H),3.80(t,J＝14.3Hz,1H),3.52(d,J＝4.9Hz,3H),3.29(s,2H),3.07‐2.93(m,9H),2.92‐2.82(m,4H),2.28‐2.14(m,1H),2.02(dd,J＝15.3,9.7Hz,1H),1.55‐1.40(m,2H),1.35(s,18H),1.30‐1.23(m,2H),0.97(m,J＝16.8,10.8Hz,2H).
3、帕西瑞肽(ⅵ)的制备
步骤1 环[反式‐4‐(N‐叔丁氧羰基‐乙二氨基)甲酰氧基脯氨酸‐苯甘氨酸‐D‐色氨酸‐N(γ)‐叔丁氧羰基赖氨酸‐O‐苄基酪氨酸‐苯丙氨酸](ⅴ)
化合物ⅳ(1.5g，1.19mmol)溶于无水DMF(50ml)中，控温于-5℃左右，缓慢加入HOBt(4.02g，2.98mmol)和TBTU(1.14g，2.98mmol)，-5℃下反应2h，加入水(50ml)，即有白色固体析出，过滤，水洗，得浅黄色固体1.3g，收率87.4％。ESI-MS(m/z)：1247.60[M]+
步骤2 帕西瑞肽(ⅵ)
化合物ⅴ(1g，0.8mmol)溶于无水DCM(25ml)中，控温于5℃左右，滴加 TFA(12ml)，室温反应1h，减压蒸除溶剂，加入无水乙醚，析出白色固体，过滤，得白色固体0.9g，收率90％。ESI-MS[m/z]：1047.29[M-2CF3COOH]+；1070.28[M+23-2CF3COOH]+；523.85[M/2+1-2CF3COOH]+。