一种原多甲藻酸毒素的产毒藻及其标准样品的制备与应用的制作方法

本发明属于生物技术领域，具体地涉及一种原多甲藻酸毒素的产毒藻及其标准样品的制备与应用。

背景技术：

贝类毒素具有强毒性和不可预见性等特点，对消费者健康安全和近海生态带来严重威胁，是国际社会共同关注的生态灾害和重大海洋环境问题。现有8大类贝类毒素中，原多甲藻酸毒素(Azaspiracid，AZA)是最晚发现的一类新型脂溶性贝类毒素，但由于这类毒素毒性强、残留高且代谢慢，因此成为欧盟、美国、加拿大等国家重点关注的对象，不仅将其限量标准设定为160μg AZA-1eq/kg，监控范围包括AZA-1，AZA-2以及AZA-3三种同系物，3种同系物的结构式质量分数如图1、表1所示，而且在国际贸易中重点加以监控。

表1 3种同系物的质量分数

AZA被认为是已知贝类毒素中风险最大的一种，主要通过蓄积到贝类组织中对人类健康安全带来威胁。AZA是现有贝类毒素中毒性较强的一种，对人类观察到的最小效应剂量(LOAEL)为0.4μg/kg b.w.，远低于麻痹性贝毒2μg/kg b.w.的水平。加上多种贝类对AZA的富集能力都极强，最高则可达到8970μg/kg，为限量标准的56倍之多，比较而言，AZA在贝类中消除半衰期则长达11天，不仅可长时间存在于贝类中，而且消除过程中可代谢成数十种产物，其毒性和 风险性仍不明确，对消费者带来严重的潜在风险。因此，欧盟拟将贝类中AZA限量标准下调到30μg AZA-1eq/kg，并加强对这类毒素及其代谢物的监控。

近几年，已经建立完善了多种AZA毒素的检测方法，如生物检测法、免疫分析法、细胞毒性检测法及理化分析方法等。每一种方法都需要标准样品来定量和定性，以及质控样品对于检测方法的控制。我国对于具有溯源、有证、实物标样的原多甲藻酸贝类毒素标准样品或质量控制样品制备技术是个空白，尚未见有关其标准样品的研制报道。为了完成日常科研与监测任务，目前的标准品均购自加拿大海洋研究所，不仅存在到货周期长且出入境有严格的管理规定的问题，尤其无法保证运输过程中的样品稳定性。

目前标准物质阳性贝类样品经过萃取纯化后制备，存在诸多不足如下：由于贝类基质复杂，标准品的制备步骤多，周期长；阳性贝类采自自然条件下暴露中毒贝类，样品来源不稳定，批次间存在较大差异；标准品最高浓度约10μg/mL溶液状态，每份体积为0.5mL，即不利于样品的保存且取用时浪费，给检测带来巨大成本。

研制原多甲藻酸贝类毒素实物标准样品可以满足对贝类毒素标准样品不断日益扩大的市场需求，解决国内外贝类产品检测实验室的严重缺乏贝类毒素标准样品的需求，对提高食品安全检测技术、解决技术壁垒、保障食品安全起到重大的作用，同时也提高我国在国际上的影响力。

技术实现要素：

本发明是针对目前原多甲藻酸毒素市售标准品的技术不足，提供一种原多甲藻酸毒素的产毒藻及其标准样品的制备与应用。

本发明可提供原多甲藻酸毒素的产毒藻，用于原多甲藻酸毒素的粗提品制备。

本发明可提供应用本方法制备的原多甲藻酸毒素的标准样品。

本发明提供该原多甲藻酸毒素标准样品的应用。

本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。

一种原多甲藻酸毒素的产毒藻，于2016年4月8日保藏于中国典型培养物保藏中心，分类命名为：Azadinium poporum AZDY06，保藏地址：武汉市武昌珞珈山武汉大学，生物保藏号为CCTCC NO：M 2016181。

利用上述产毒藻制备原多甲藻酸毒素的标准样品的方法，包括步骤如下:

(1)从培养的原多甲藻酸毒素产毒藻、原多甲藻酸毒素产毒藻培养液或摄食原多甲藻酸毒素产毒藻之后的贝类阳性样品中提取原多甲藻酸毒素，获得粗提毒素提取液；

(2)将步骤(1)所述粗提毒素提取液用硅胶柱和快速色谱柱进行净化，硅胶柱用的洗脱液分别用正己烷、乙酸乙酯、乙酸乙酯/甲醇混合溶液；快速色谱柱的洗脱液为乙腈/H₂O的混合液；

进一步，所述步骤(2)中的乙腈/H₂O的混合液中乙腈与H₂O的体积比为3:2，另加有0.1％(体积比)的三乙胺。

(3)将步骤(2)净化后的样品过高效液相色谱柱，用含0.1％(体积比)甲酸的乙腈/水混合液进行洗脱，收集目标色谱峰，冷冻干燥，制得白色固体标准样品；

将上述标准样品进行定性，分析纯度并定量；

检验所述标准样品的均匀性和稳定性。

进一步，步骤(1)中从原多甲藻酸毒素产毒藻中提取毒素的方法：将海水抽提过滤后，灭菌，加入2/f培养基，接种原多甲藻酸毒素产毒藻，培养条件为温度：20℃，光照强度：60％，光暗比为12h：12h，用玻璃纤维滤膜收集指 数期(>10⁷cells/L)藻细胞，所述的指数期为藻细胞>10⁷cells/L；将上述藻细胞用丙酮溶解，超声细胞破碎，然后超滤离心，收集上清液。

进一步，所述步骤(1)从原多甲藻酸毒素产毒藻培养液中提取原多甲藻酸毒素的方法：用大孔吸附树脂富集上述产毒藻培养液中AZA毒素，减压旋蒸至干，用乙酸乙酯与氯化钠水溶液进行液相分散萃取后，所述乙酸乙酯与氯化钠水溶液体积比为3：1，取出乙酸乙酯层，旋蒸至干后加入乙酸乙酯溶解，备用。

进一步，所述步骤(1)从贝类阳性样品中提取原多甲藻酸毒素的方法：取出干净的可食部分贝肉，在筛子上平铺沥水5min，然后将贝肉均质、混匀，用10倍体积纯甲醇分两次提取样品后，离心，收集上清液，50℃旋蒸浓缩至干，甲醇溶解后，备用。

附图说明

图1是原多甲藻酸毒素的化学结构式；

图2是本发明的原多甲藻酸毒素标准样品制备工艺流程示意图；

图3是本发明的原多甲藻酸毒素标准样品的二级碎片谱图：a、AZA1，b、AZA2，c、AZA3；1,2,3分别表示三种能量下20eV，35eV和50eV；

图4是本发明的原多甲藻酸毒素标准样品的高分辨质谱精确质量数谱图：a、AZA1，b、AZA2，c、AZA3；

原多甲藻酸毒素的产毒藻，于2016年4月8日保藏于中国典型培养物保藏中心，分类命名为：Azadinium poporum AZDY06，保藏地址：武汉市武昌珞珈山武汉大学，生物保藏号为CCTCC NO：M 2016181。

具体实施方式

下面通过实施例结合附图来对本发明的技术方案作进一步解释，但本发明的保护范围不受实施例任何形式上的限制。

实施例1

一种原多甲藻酸毒素的产毒藻，于2016年4月8日保藏于中国典型培养物保藏中心，分类命名为：Azadinium poporum AZDY06，生物保藏号为CCTCC NO：M 2016181。

利用产毒藻制备原多甲藻酸毒素的标准样品的方法，具体工艺流程见图2，

(1)原多甲藻酸毒素产毒藻的培养与其毒素提取：将海水抽提过滤后，灭菌，加入2/f培养基，接种AZA产毒藻(Azadinium poporum)。温度：20℃，光照强度：60％，光暗比为12h：12h。玻璃纤维滤膜收集指数期(>10⁷cells/L)藻细胞；将上述藻细胞，用丙酮溶解，20％强度超声细胞破碎，间隔0.2s一次。然后用10k超滤离心管1000×g超滤离心1min，收集上清液，获得粗提毒素；

或原多甲藻酸毒素产毒藻培养液中的毒素富集与浓缩：用HP20大孔吸附树脂富集上述产毒藻培养液中AZA毒素，减压旋蒸至干，用乙酸乙酯与氯化钠水溶液(体积比为3：1)进行液相分散萃取后，取出乙酸乙酯层，旋蒸至干后加入乙酸乙酯溶解，获得粗提毒素；

或贝类阳性样品中原多甲藻酸毒素的毒素提取与浓缩：用清水将贝壳外表洗净。撬开贝壳，切断闭壳肌，用水淋洗，去除内部泥沙及其它异物，仔细取出贝肉，切勿割破贝体，在筛子上平铺沥水5min，然后将贝肉均质、混匀。严禁加热或用麻醉剂开壳。对扇贝样品，只取可食部分。用10倍体积纯甲醇分两次提取样品后，离心，收集上清液，40℃旋蒸浓缩至干，10mL甲醇溶解后，获得粗提毒素；

(2)粗提毒素的净化：将上述粗提毒素与silica gel(100-200目)混匀拌样蒸干后，添加到预填(200-300目)silica gel萃取柱中(3×35cm)，洗脱液为正己烷、乙酸乙酯、乙酸乙酯/甲醇混合液(体积比9:1)、乙酸乙酯/甲醇混合 液(体积比7:3)，先后分别用减压过柱，所述的洗脱液各300mL，除了正己烷均含0.1％(体积比)甲酸，收集7:3的乙酸乙酯/甲醇洗脱液，旋蒸至干，备用；

(3)将步骤(2)所得样品，用乙腈/H₂O的混合液溶解后，加载到苯基己基(19.9×2cm)填充柱，用乙腈/H₂O的混合液，4mL/min洗脱，收集样品5mL，所述乙腈/H₂O的混合液中乙腈/H₂O体积比为3:2，另加0.1％(体积比)三乙胺；

(4)制备色谱：将步骤(2)收集的样品分次手动进样100uL，用半制备高效液相色谱光电二极管阵列(PDA)检测(210nm)，配Cosmosil nacalai Tesque C₁₈(5μm，250×10mm)色谱柱，30℃，用乙腈/水(13:7，含0.1％甲酸)在2mL/min，进行洗脱，收集目标色谱峰，冷冻干燥，制得白色固体标准样品。

(5)封装所属标准样品：准确称取100μg样品，分装至2mL安培瓶中，乙炔喷灯封口，加贴唯一性标示，冻存；

(6)分别用液相色谱串联质谱分析法的二级碎片谱图与标准品谱库匹配(见图3)和高分辨液相色谱仪测定精确质量数(见图4)两种方式进行结构鉴定，三个能量段(CE为20,35以及50eV)二级谱图匹配度Fit值大于85％，且高分辨质谱精确质量数准确度小于3×10-7，两种检测方法均证明所分离标准物质为高纯度AZA1，AZA2以及AZA3。

(7)定量并检验所述标准样品的均匀性；

从样品中随机抽取10瓶，分别用甲醇移取稀释，定容至10mL容量瓶，制成浓度为10μg/mL标准溶液，分析标准样品的AZA含量。所有试材以随机次序在重复性条件下测试，分别稀释至500ng/mL，200ng/mL，以及100ng/mL的溶液，以液相色谱串联质谱检测，单个浓度测试6次，计算批内变异系数。每个样品分三个批次进行测试，标准品中AZA的对数值呈正态分布，结果见表2。

表2原多甲藻酸毒素标准样品均匀性试验

表3原多甲藻酸毒素标准样品均匀检验结果

从表3的结果分析可知，P＝0.67>0.05，充分说明了试验结果间没有显著性差异， 证明样品均一，且标准样品纯度约为99.4％。

(8)稳定性试验

将包装完好的标准样品置于+18℃条件下储藏12个月以及置于+60℃条件下储藏30天，分别抽取三组按照上述稀释步骤检测，用于测定样品稳定性，具体试验结果见表4、表5：

表4 +18℃条件下储藏12个月

表5 +60℃条件下储藏30天

以上结果表明标准样品在两种极限环境条件下稳定性较好。

本发明方法制备的原多甲藻酸毒素标准样品，其毒素组分包括AZA1，AZA2，AZA3。