1.一种基于特异性SS-COI 引物的丽草蛉PCR快速检测方法,包括以下步骤:
(1)制备特异性SS-COI 引物:根据丽草蛉的线粒体DNA 序列(genbank:KJ592501.1),设计一对丽草蛉的特异性SS-COI引物,其包括:
正向引物CfF5 :5'- TAGTTTAAGTTTATTAATTCGGG-3’
反向引物CfR1 :5'- TTGAAGATGCCAGTAATAAG-3’;
(2)提取样品总DNA:在棉田采集丽草蛉,将单头虫体放入离心管中将其磨碎,用提取试剂盒提取单头虫体基因组溶液,将基因组溶液保存备用,进行PCR扩增时吸取基因组溶液作为DNA模板;
(3)以步骤2)提取的总DNA为模板,利用正向引物CfF5和反向引物CfR1 进行PCR 扩增反应;
PCR 反应体系以20μL计为:
10×Taq PCR buffer 2.0μL;
2.5mM dNTPs 1.6μL;
20nM CfF5 0.3μL;
20nM CfR1 0.3μL;
5U/μL Taq DNA聚合酶 0.2μL;
DNA模板 1.0μL;
ddH2O 用灭菌水补足20μL;
(4)分析PCR产物:对PCR 扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测,如出现大小为250bp 的DNA 扩增条带,则表明样品为丽草蛉。
2.根据权利要求1所述的基于特异性SS-COI 引物的丽草蛉PCR快速检测方法,其特征在于:所述步骤(1)中,通过genbank的KJ592501.1,结合DNA条形码技术中的通用引物:
LepF1:(5'-ATTCAACCAATCATAAAGATATTGG-3’)和
LepR1:(5'-AAACTTCTGGATGTCCAAAAAATCA-3’)
扩增出丽草蛉的COI产物,进行多条引物设计,从中筛选出特异性SS-COI引物,即正向引物CfF5和反向引物CfR1。
3.根据权利要求1所述的基于特异性SS-COI 引物的丽草蛉PCR快速检测方法,其特征在于:所述步骤(3)中PCR 反应条件为:首先,94℃3分钟;其次,94℃30秒,51℃30秒,72℃1分钟,共45循环次;最后,72℃10分钟。