用于防治花生根腐病的菌株WXX‑2及菌剂的制作方法

本发明属于农业集约化生产
技术领域：
，具体涉及用于防治花生根腐病害的菌株及其菌剂。
背景技术：
：花生是我国的重要油料作物，常年播种面积占油料作物总播种面积的35％左右。南方红壤丘陵区是我国的花生主产区之一，但连作现象普遍。花生连作重茬往往导致土传真菌性病害加剧，其中根腐病是红壤地区花生连作地发病最为严重的病害，是制约当地花生生产的重要因素。目前常用的治理方法为施用化学杀菌剂。化学菌剂或高效熏蒸剂可以有效杀灭土壤病原菌基数，暂时减轻病害发生，但同时也抑制了土壤有益菌，从长远角度来看，化学灭菌将进一步恶化土壤生态功能，不利于农业生产。目前针对土传病害的生物防治方法的研究已有大量报道，生防菌剂的筛选主要从代谢产物促生、营养位点竞争等角度开展。但土传病害的发生与病原菌的数量密切相关，因此降低土壤病原菌基数是抑制土传病害发生的关键。因此，一般的生防菌剂只是从植物促生、微生物竞争的角度控制土传病害的发生，往往效果不稳定。对此，理想的生防细菌剂型应当根据土传病害的特点，从化学生态的角度对土壤病原菌持续进行压制，以达到防治病害效果。花生根腐病由半知菌亚门的镰刀菌中的多个病原菌侵染所引起，包括尖镰孢菌、茄类镰孢菌、粉红色镰孢菌等菌种。上述病原真菌的细胞壁是由有几丁质构成。因此，针对这些病原菌的共性特点，研发有效菌剂，才能从根本上防治花生根腐病的发生。技术实现要素：本发明的目的在于解决现有技术存在的不足，提供一种用于防治由镰刀菌属引起的花生根腐病的生防菌剂有效制备方法，从而有效降低花生根际镰刀菌属病原基数，达到抑制根腐镰刀菌侵染花生根部的目的，本发明方法专化性强，效果稳定。为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：一种短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)WXX-2，保藏编号为CGMCCNo.11540，所述菌株为革兰氏染色阳性细菌，菌株的16srDNA碱基序列如SEQIDNo：1所示。本发明还公开了所述的菌株WXX-2在防治花生根腐病中的应用。本发明还提供了菌株WXX-2在制备防治花生根腐病菌剂中的应用。一种防治花生根腐病的菌剂，是所述短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)WXX-2菌株经真菌菌丝体诱导强化，定殖于蘑菇粉中而制得，菌剂中WXX-2含量为1×109cfu/g以上。菌剂田间适用性强，可应用于防治南方红壤花生根腐病病害发生。本发明提供短小芽孢杆菌WXX-2菌剂制备技术为：1)灭活腐生真菌菌丝诱导体获得：配置PD培养液(马铃薯20％(g/ml)，葡萄糖1.5％(g/ml)，蒸馏水1000ml)，并灭菌处理；然后接种被孢霉(Mortierellasp.)，置于恒温摇床黑暗培养(28℃、120rpm)，7d后，滤纸过滤获得菌丝，蒸馏水洗涤2次，抽滤后高温灭菌(121℃，20min)备用。2)配置抑菌性强化培养基：牛肉膏3％(g/ml)，蛋白胨8％(g/ml)，灭活腐生真菌菌丝体3％(g/ml)；3)菌株稳定性强化：将所述菌株加入上述培养基中，发酵通气量10L/m，搅拌转速200r/min，用盐酸调节pH值5.5-6.5，发酵温度为26℃，发酵时间72h，测得菌液OD值为1.0左右；4)所述菌剂制备：以无菌的蘑菇粉为基质，将上述WXX-2抑菌性强化发酵液按5％比例接种到上述基质，添加NaCl3％(g/ml)，放置恒温箱(28℃)培养7d；经过第二步对所述菌株对真菌菌丝寄生的强化，所述菌剂可高效定殖于含有蘑菇粉基质中，所述菌量达到1×109cfu/g。最后获得WXX-2抑菌性能强化的固体菌剂。本发明所述的菌剂的施用方法，是将所述菌剂与花生种子混拌，剂量10-15公斤/亩；或者是所述菌剂与有机粪肥混合，比例为1:10-1:15(重量比)。一起播于预先开好的播种沟中；这样一方面所述菌株可有效定殖于花生根际，另一方面可有效在花生根圈附近形成防护墙，达到抑制土传病原菌侵染花生根部的目的。本发明可有效防治红壤花生根腐病发生，防效达60％以上，具有田间防治效果稳定、抑菌谱广。本发明的优点是：菌株WXX-2产几丁质酶(降解镰刀菌菌丝细胞壁)活性高，对尖孢镰刀菌、茄腐镰刀菌、枯萎病菌、丝核菌等引起花生根部病害的病原菌均有显著降解能力；是用于防治花生根腐病病害的生防细菌，菌剂用量少、成本低、增产效果显著。花生根腐病是花生连作地中出现的主要病害，可引起花生根部腐烂、枯萎死亡，减产严重。如果把按上述方法制备的菌剂施入花生根际，可有效在花生根部形成抑制病原菌侵染的防护墙，降低花生根围根腐病原菌基数，达到有效防治花生根腐病害的目的。附图说明图1为短小芽孢杆菌WXX-2在培养基(含2％的几丁质)上的生长及透明圈。图2为短小芽孢杆菌WXX-2对尖孢镰刀菌的实验效果图。注：图中1为尖孢镰刀菌，2为短小芽孢杆菌WXX-2图3为短小芽孢杆菌WXX-2对茄腐镰刀菌的实验效果图。注：图中1为茄腐镰刀菌，2为短小芽孢杆菌WXX-2图4为短小芽孢杆菌WXX-2对立枯丝核菌的实验效果图。注：图中1为立枯丝核菌，2为短小芽孢杆菌WXX-2图5为短小芽孢杆菌WXX-2对病原菌真菌菌丝破坏的电镜图。本发明中的菌株WXX-2，所述菌株的分类命名为：短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)，保藏编号为CGMCCNo.11540，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏单位地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期为2015年10月26日。具体实施方式为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。实施例1：采集红壤地区一块连作花生地的花生根际土壤进行相关的试验，其具体步骤为：(1)土样处理：准备灭菌的富集培养基(成份：细粉几丁质2.5g，MgSO4·7H2O0.5g，K2HPO40.7g，KH2PO40.3g，FeSO4·7H2O0.01g，蒸馏水1000ml)，分装20ml于无菌三角瓶中，并取1.0g新鲜土样加入三角瓶中，混匀，室温下150r/min培养48h，得到富集的培养液。(2)涂布分离：吸取1mL滤液加入9.0mL无菌水，连续稀释3次获得稀释度为10-4的样品液，进行梯度稀释，土壤稀释液0.02mL涂布于平板分离培养基上，28℃培养4-7d，观察、挑取产透明圈的细菌菌株。(3)培养与纯化：挑取单个菌落在平板分离培养基上画线纯化培养，纯化培养后得到的菌株作为供试菌株，接种到牛肉膏蛋白胨斜面暂时保藏。(4)活性筛选：采用摇瓶复筛方法进行活性筛选，将分离的菌株接入培养基上(培养基成分：细粉几丁质10g，蛋白胨5g，酵母膏5g，K2HPO40.7g，KH2PO40.3g，MgSO4·7H2O0.5g，FeSO4·7H2O0.01g，ZnSO40.01g，蒸馏水1000ml)，28℃、150r/min振荡培养3-4d，发酵液离心得到粗酶液，测定酶活力，然后选取产酶活力高的菌株进行复筛(图1)。复筛方法同上，测定酶活力，进一步选取产酶活力高的菌株。(5)活性检验：用分离纯化的高产几丁质酶的细菌，以供试根腐病原菌为标靶，采用平板对峙培养法直接测定菌株对病原真菌的抑制率。方法是首先将待筛选菌株活化，在PDA平板中心先接种病原真菌，用直径5mm的打孔器在病原菌菌落边缘打孔制成菌饼，并接到PDA平板中央，然后在培养皿四周距病原菌2.5cm左右接种待测的细菌菌株，每株细菌三个重复，28℃培养一周，观察是否产生抑菌圈，用十字交叉法测定病原真菌菌落直径，计算抑制率。(6)分类地位的确定：提取供试菌株的DNA，进行16SrRNA测序确定菌株的分类地位。(7)通过以上实验筛选出抗菌效果较好的一株菌株(WXX-2)，并扩大培养，提取其DNA，通过16SrNA克隆测序确定了分类地位，该菌株隶属于厚壁菌门-芽孢杆菌纲-芽孢杆菌目-芽孢杆菌科-芽孢杆菌属。并于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏时间为2015年10月26日，保藏编号为CGMCCNo.11540。保藏号为：CGMCCNO.11540的菌株的生物学特征为：该菌为革兰氏阳性细菌，需氧型，杆状，微黄，细菌的大小范围：2-3μm；该菌最适合生长温度为25-28℃，pH为5.5-8.5。实施例2：对各种根腐病原菌的抑菌实验利用保藏编号为CGMCCNO.11540的菌株进行抗菌实验：首先将所述菌株活化，在PDA平板中心先接种病原真菌，用直径5mm的打孔器在病原菌菌落边缘打孔制成菌饼，并接到PDA平板中央，然后在培养皿四周距病原菌2.5cm左右接种待测的细菌菌株，每株细菌三个重复，28℃培养一周，观察是否产生抑菌圈，用十字交叉法测定病原真菌菌落直径，计算抑制率。所选病原菌为：立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)、茄腐镰刀菌(Fusariumsolani)和尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporumf.sp.diath)，如图2—图4，发现所述菌株对上述土传病原真菌均具有很好的抑菌作用(表1)。然后通过扫描电镜对真菌菌丝进行显微观察发现，菌丝细胞原生质收缩，出现空泡；菌丝畸形膨大成球状；菌丝细胞壁破损、消解，原生质外溢(图5)。表1菌株离体抑菌率的测定实施例3：温室活体防治实验在PDA培养基中活化花生根腐病原菌(茄腐镰刀菌)28℃下培养7d，用无菌水分别冲洗培养基上病原菌孢子，菌液用已灭菌的滤纸过滤以除去菌丝，病原菌将滤液加适当蒸馏水稀释成孢子浓度为1×107个/mL的悬浮液，备用。将供试生防菌株加入不含真菌菌丝诱导体培养液(牛肉膏3％，蛋白胨8％)进行液体发酵(26℃、72h、200rpm)，然后再以按5％比例接种灭菌的蘑菇粉基质，放置恒温箱(28℃)培养5d，作为菌剂A备用。同时按上述同样方法，只是在液体培养基中添加灭活真菌菌丝诱导体(3％)进行抑菌强化液体发酵，制备的菌剂B备用。采集的红壤旱地农田土壤，粉碎过筛后，与121℃，湿热灭菌3h，以制备无菌土。按5％比例添加病原菌孢子液与无菌土拌匀，装盆。然后按1:1比例将花生种子和菌剂A/B进行混匀，待用。实验共设4个处理：CK1，灭菌土壤，不含病原菌和菌剂；CK2，向灭菌土壤添加茄腐镰刀菌，获得带菌土壤；A，含有茄腐镰刀菌的土壤+菌剂A；B，含有茄腐镰刀菌的土壤+菌剂B。每处理10盆，栽种后定时浇水观察发病情况。30d后调查花生根部发病程度。花生根腐病病害分级标准：0级，无可见症状；1级，黑腐面积占整个主根面积的5％以下；2级，黑腐面积占整个主根面积5％～25％；3级，黑腐面积占整个主根面积的25％～50％；4级，黑腐面积占整个主根面积的50％～75％；5级，黑腐面积占整个主根面积的75％以上。表2菌株WXX-2不同菌剂类型处理对土传病害的防治效果处理类型病情指数防治效果(与CK2相比)CK10/CK266.40A31.253.0％B15.976.1％不同菌剂对花生生长都具有很好的促进作用，株高及根系发达程度均显著高于对照组。防效测定结果表明，制备的2种菌剂针对花生根腐病的活体防效分别为53.0％、76.1％，其中菌剂B对土传病菌的防效最好，显著降低了腐烂褐变，防效非常显著。实施例4：田间连作花生地实验将保藏编号为CGMCCNO.11540的菌株转为连作花生田间试验，连续3年在田间自然栽培条件下验证该菌株制备的菌剂对连作花生土传真菌性病害的抑制效果，具体如下：(1)供试土壤基本情况：试验安排于江西余江县红壤旱地花生种植区的连作障碍土壤，试验区常年根腐发病率在40％－70％，并随连作年限延长发病率不断攀升，有的片区土壤已不能耕种，发病率高达80％以上。2012年试验选用了区域已连作5年的红壤花生田块进行效果验证，2013年选用了已连作7年的花生田块进行效果验证，2014年选用了已连作4年的花生田块进行效果验证，每年分别设置4组对比试验，除试验处理差异外，保持试验区土壤条件及栽培管理技术统一。(2)试验处理与方法：试验共设12个小区，每个小区长10m，宽5m小区之间设1m沟距，随机区组排列花生株距为18-20cm，行距为45-50cm，每穴播2粒种子。设4组实验，分别：CK:常规NPK施肥，在播种前基施尿素150kghm-2、氯化钾225kghm-2、钙镁磷1125kghm-2；A:用含菌丝诱导体制备的菌剂B与花生种子拌匀(1:1)，常规NPK施肥量同CK处理；B：用含菌丝诱导体制备的菌剂B与腐熟猪粪按1:10混合，放置5d。使用量3000kghm-2，去除生物有机肥所含NPK量，补加常规化肥，施肥量同CK处理。C：50％多菌灵可湿性粉剂800倍，常规NPK施肥量同CK处理。每个处理设3次重复。(3)试验结果：连续3年对不同连作花生田块的防效试验结果表明(表3)：WXX-2生防菌剂对连作花生地中的土传真菌病害均具有较好的防治效果，其中本发明制备菌剂采用与花生拌种及与有机肥混施均对花生根腐病具有显著防治效果。2012至2014年的对根腐病防效分别为63.2～70.2％、68.7～75.0％、50.9～70.3％，其防病和增产效果均明显好于50％多菌灵可湿性粉剂处理。总之，本发明以保藏编号为CGMCCNO.11540的菌株制备的菌剂对抑制红壤花生根腐病害的发生及蔓延具有较好的作用功效，且防治效果稳定，是南方红壤区花生根腐病的生物修复产品。表3WXX-2生防菌不同菌剂防治红壤花生根腐病的田间防效及增产分析(2012年-2014年)当前第1页1 2 3