一种逐步放大T细胞培养方法与流程

本发明涉及医学免疫技术领域，尤其涉及一种逐步放大T细胞培养方法。

背景技术：

当前，免疫细胞治疗已经成为肿瘤、糖尿病、自体免疫疾病等多种疾病最具前景的技术。而在这些技术实现中，一个重要的环节是免疫T细胞的扩增，实现免疫T细胞的数量放大，这样回输机体才能发挥免疫调节或免疫反应的作用。而对于T细胞的扩增，培养密度与营养、细胞因子控制节点极其重要。

由于CIK等T细胞的生长与扩增效率与细胞密度高度相关，密度太高，会抑制细胞生长；而密度低，则相互促进作用不明显。

技术实现要素：

基于背景技术存在的技术问题，本发明提出了一种逐步放大T细胞培养方法，实现在有限时间内对T细胞的最大化扩增。

本发明提出的一种逐步放大T细胞培养方法，包括如下步骤：

S1、按体积份数将人外周血单个核细胞重悬于38～42份分选培养基中进行分选培养，其中人外周血单个核细胞与分选培养基的个数体积比(个/mL)为1～1.6×10⁸：38～42，取出未贴壁的细胞置于已包被的培养瓶中，再向培养瓶中加入IFNγ，然后静置培养，第二天再向培养瓶中加入IL-1α、IL-2继续培养；

S2、当培养瓶中的T细胞密度≥1～2×10⁶cell/mL时，再向培养瓶中加入38～42份GT-T551培养基和IL-2进行放大培养；

S3、当培养瓶中的T细胞密度≥1～2×10⁶cell/mL时，再向培养瓶中加入76～84份GT-T551培养基和IL-2进行放大培养；

S4、重复S3的操作至培养瓶体积为310～330份，然后当培养瓶中的T细胞密度≥1～2×10⁶cell/mL时，再加入670～690份GT-T551培养基和IL-2进行最终放大培养。

优选地，S1中，分选培养的条件为：37℃，5％CO₂，分选培养的时间为110～130min。

优选地，S1中，已包被的培养瓶为采用CD3/CD28抗体包被的T-175培养瓶。

优选地，S1中，IFNγ的添加量为900～1100U/mL。

优选地，S1中，IL-1α、IL-2为4℃解冻得到，IL-1α、IL-2的添加量均为190～210U/mL。

优选地，S2中IL-2的添加量、S3中IL-2的添加量和S4中IL-2的添加量均为190～210U/mL。

由于T细胞的生长与扩增效率与细胞密度高度相关，密度太高，会抑制细胞生长；而密度低，则相互促进作用不明显。而现有技术中不会考虑到这些因素，往往采用直接培养的方式得到T细胞。

本发明将T细胞在GT-T551培养基中进行培养，当达到1～2×10⁶cell/mL时再进行放大培养并加入190～210U/mL的IL-2，如图1所示，图1为初始体系T细胞的细胞密度与3天后的增殖倍数关系，由图1可知：本发明采用逐步放大T细胞培养方法使T细胞快速倍增；而细胞因子IL-2对于T细胞的增殖分化有非常重要的促进作用，而这细胞因子的剂量与加入的时间节点也会对T细胞的扩增倍数有重要的影响，当培养的细胞密度再次达到1～2×10⁶cell/mL时，转入培养袋，使用含有IL-2的1L的培养基，实现对T细胞的再次放大。

附图说明

图1为初始体系T细胞的细胞密度与3天后的增殖倍数关系。

具体实施方式

下面，通过具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明。

实施例1

本发明提出的一种逐步放大T细胞培养方法，包括如下步骤：

S1、按体积份数将人外周血单个核细胞重悬于38份分选培养基中进行分选培养130min，其中人外周血单个核细胞与分选培养基的个数体积比(个/mL)为1～1.6×10⁸：38，分选培养的条件为：37℃，5％CO₂，取出未贴壁的细胞置于采用CD3/CD28抗体包被的T-175培养瓶中，再向培养瓶中加入IFNγ，IFNγ的添加量为900U/mL，然后静置培养，第二天再向培养瓶中加入4℃解冻得到的IL-1α、IL-2继续培养，IL-1α、IL-2的添加量均为210U/mL；

S2、当培养瓶中的T细胞密度≥1～2×10⁶cell/mL时，再向培养瓶中加入38份GT-T551培养基和IL-2进行放大培养，IL-2的添加量均为210U/mL；

S3、当培养瓶中的T细胞密度≥1～2×10⁶cell/mL时，再向培养瓶中加入76份GT-T551培养基和IL-2进行放大培养，IL-2的添加量均为210U/mL；

S4、重复S3的操作至培养瓶体积为310份，然后当培养瓶中的T细胞密度≥1～2×10⁶cell/mL时，再加入690份GT-T551培养基和IL-2进行最终放大培养，IL-2的添加量均为190U/mL。

实施例2

本发明提出的一种逐步放大T细胞培养方法，包括如下步骤：

S1、按体积份数将人外周血单个核细胞重悬于42份分选培养基中进行分选培养110min，其中人外周血单个核细胞与分选培养基的个数体积比(个/mL)为1～1.6×10⁸：42，分选培养的条件为：37℃，5％CO₂，取出未贴壁的细胞置 于采用CD3/CD28抗体包被的T-175培养瓶中，再向培养瓶中加入IFNγ，IFNγ的添加量为1100U/mL，然后静置培养，第二天再向培养瓶中加入4℃解冻得到的IL-1α、IL-2继续培养，IL-1α、IL-2的添加量均为190U/mL；

S2、当培养瓶中的T细胞密度≥1～2×10⁶cell/mL时，再向培养瓶中加入42份GT-T551培养基和IL-2进行放大培养，IL-2的添加量均为190U/mL；

S3、当培养瓶中的T细胞密度≥1～2×10⁶cell/mL时，再向培养瓶中加入84份GT-T551培养基和IL-2进行放大培养，IL-2的添加量均为190U/mL；

S4、重复S3的操作至培养瓶体积为330份，然后当培养瓶中的T细胞密度≥1～2×10⁶cell/mL时，再加入670份GT-T551培养基和IL-2进行最终放大培养，IL-2的添加量均为210U/mL。

实施例3

本发明提出的一种逐步放大T细胞培养方法，包括如下步骤：

S1、按体积份数将人外周血单个核细胞重悬于40份分选培养基中进行分选培养120min，其中人外周血单个核细胞与分选培养基的个数体积比(个/mL)为1～1.6×10⁸：40，分选培养的条件为：37℃，5％CO₂，取出未贴壁的细胞置于采用CD3/CD28抗体包被的T-175培养瓶中，再向培养瓶中加入IFNγ，IFNγ的添加量为1000U/mL，然后静置培养，第二天再向培养瓶中加入4℃解冻得到的IL-1α、IL-2继续培养，IL-1α、IL-2的添加量均为200U/mL；

S2、当培养瓶中的T细胞密度≥1～2×10⁶cell/mL时，再向培养瓶中加入40份GT-T551培养基和IL-2进行放大培养，IL-2的添加量均为200U/mL；

S3、当培养瓶中的T细胞密度≥1～2×10⁶cell/mL时，再向培养瓶中加入80份GT-T551培养基和IL-2进行放大培养，IL-2的添加量均为200U/mL；

S4、重复S3的操作至培养瓶体积为320份，然后当培养瓶中的T细胞密度 ≥1～2×10⁶cell/mL时，再加入680份GT-T551培养基和IL-2进行最终放大培养，IL-2的添加量均为200U/mL。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。