降低种子重量的白桦AP2基因及其编码蛋白的制作方法

背景技术：
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通过对拟南芥的研究发现，在花发育相关基因中大多数基因均属于MADs-box家族的基因，唯独AP2基因具有独特的AP2结构域，该结构域是一个DNA结合结构域，由60到70个左右保守的氨基酸残基组成的3个反向平行的β-折叠和一个两亲性的α-螺旋构成。AP2/EREBP转录因子家族根据其所含AP2结构域数量的不同可分为三类：含有2个AP2结构域的AP2亚家族、含有一个AP2结构域的EREBP亚家族以及含有一个AP2结构域和一个B3结构域的RAV1和RAV2。1994年Jofuku等在拟南芥中发现了AP2(APETALA2)转录因子，同时首次鉴定出了AP2基因的AP2/EREBP结构域。1995年Ohme-Talagi等成功从烟草中分离出4个乙烯反应结合蛋白EREBPs。相关报道表明AP2亚家族在生殖器官和营养器官的发育中具有关键的调节作用。在拟南芥的花器官发育过程中，A类功能基因AP2可以抑制C类功能基因AG(AGAMOUS)在外轮花器官萼片和花瓣中的表达，对萼片和花瓣的发育起着重要的作用，AP2基因不仅在花器官中有表达，在茎、叶和种子等非花组织中也有表达。金鱼草中的LIP1和LIP2均属于AP2转录因子家族，作为A类基因的它们在金鱼草萼片、花瓣和胚珠的发育过程中都具有决定性的作用。但与AP2基因不同的是，LIP基因并不抑制C类基因的表达。AP2基因在种子的发育过程中也起着重要作用，它可以决定种子的大小、重量以及油类物质和蛋白质的积累。苹果的MAP2A基因在花芽、萼片、花瓣、雌雄蕊、子房等花器官以及非花器官叶片中均有表达，说明MAP2A可以调控花器官和营养器官的发育。葡萄的Vv-AP2基因对葡萄的营养器官和生殖器官的发育具有不同的作用。植物的分生组织既有不断的分化出新的组织器官的能力，又要维持自身的分生能力。AP2基因可以维持植物分生组织的分生能力。水稻SNB(SUPERNUMERARY BRACT)是AP2亚族转录因子，它可以调控穗分生组织向花分生组织转变以及花器官发育。玉米IDS1(INDETERMINATE SPIKELET1)是拟南芥AP2基因的同源基因，可以通过调控小穗分生组织特性来调控花序的发育。目前，对于白桦的AP2基因的功能尚不清楚，也没有涉及白桦AP2基因序列及其功能的相关专利报道。

技术实现要素：
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本发明提供一种从白桦中克隆白桦花发育相关基因AP2的方法：

(1)先采用改良的CTAB法提取白桦雌花RNA，用ThermoScriptTM RT-PCR System反转录试剂盒，合成cDNA第一链；

(2)设计含有酶切位点(XbaI和SmaI)克隆白桦AP2编码区全长的PCR引物；引物序列为：正向引物：AP2-F：5′-GCGCTTCTAGAATGTGGGATCTCAATGACTCG-3′；反向引物：AP2-R：5′-GTATCCCGGGATAGAGGGTCTCATGAGAGAAT-3′

(3)利用引物AP2-F和AP2-R对合成的cDNA进行PCR扩增，获得一个AP2转录因子基因的全长cDNA，命名为白桦AP2；

PCR扩增产物经测序，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示；其编码蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:2所示；

本发明构建了白桦AP2基因的植物表达载体，构建的植物表达载体(pBI121-AP2)经农杆菌浸染拟南芥植株，获得转基因拟南芥植株且转基因纯系植株所结种子中游离脂肪酸含量及可溶性蛋白含量均有所下降，表明该基因具有降低拟南芥种子游离脂肪酸及可溶性蛋白含量的功能并且能够调控两种物质的生物合成途径。

构建白桦AP2基因植物表达载体的技术方案如下：

选择pBI121载体作为基本植物表达载体，在pBI121上选择XbaI和SmaI两个酶切位点，设计带有酶切位点和保护碱基的白桦AP2引物，并克隆出白桦AP2基因全长。双酶切质粒和白桦AP2基因，再用T4连接酶进行连接，检测构建的载体pBI121-AP2。

本发明提供的白桦AP2基因在调节拟南芥种子游离脂肪酸含量及可溶性蛋白含量中的应用。将上述植物表达载体pBI121-AP2转化农杆菌EHA105，经农杆菌介导的浸花法浸染，获得白桦AP2过表达的转基因拟南芥植株，经抗性筛选及PCR检测最终得到4个转基因阳性纯合株系：line5，line6，line9，line15，白桦AP2可以降低转基因拟南芥种子游离脂肪酸和可溶性蛋白的含量，与野生型非转基因植株相比，转基因纯合拟南芥种子游离脂肪酸含量降低28.48％-32.68％；可溶性蛋白含量降低8.42％-40.64％。构建的植物表达载体(pBI121-AP2)能够降低转基因拟南芥种子中游离脂肪酸以及可溶性蛋白的含量，为今后利用转基因技术调节白桦种子中游离脂肪酸以及可溶性蛋白含量的研究提供了理论基础与基因资源。

本发明与现有的技术相比具有如下有益效果：

1、本发明提供了降低种子游离脂肪酸以及可溶性蛋白含量的白桦AP2蛋白，可用于改进与植物游离脂肪酸以及可溶性蛋白含量，并且可用于搜寻在其他植物中调控游离脂肪酸以及可溶性蛋白合成的相关基因。

2、本发明提供的含有白桦AP2基因重组载体，可有效控制种子中游离脂肪酸以及可溶性蛋白的含量。

3、本发明提供的白桦AP2基因具有调控种子中游离脂肪酸以及可溶性蛋白的含量的功能，可用于植株游离脂肪酸以及可溶性蛋白的含量相关的发育研究中，并为植物游离脂肪酸以及可溶性蛋白合成相关基因的功能研究提供参考资源。

附图说明

图1为白桦AP2基因全长cDNA的PCR扩增显示图。

图2为植物表达载体pBI121-AP2构建流程图。

图3为植物表达载体pBI121-AP2PCR检测图。

图4为植物表达载体pBI121-AP2质粒提取检测图。

图5为转基因过表达白桦AP2拟南芥植株PCR验证图。

图6为野生型拟南芥种子于过表达白桦AP2拟南芥种子的重量、种子中游离脂肪酸以及可溶

性蛋白含量统计图。

具体实施方式：

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1：白桦AP2基因的克隆

(1)植物材料的获得

实验材料白桦雌花，采自东北林业大学白桦林。采集后立即冷藏到-80℃冰箱保存备用。(2)白桦RNA的抽提

白桦总RNA使用改良的CTAB法步骤进行，使用琼脂糖凝胶电泳、紫外分光光度计测总RNA的纯度和浓度。用ThermoScript^TM RT-PCR System反转录试剂盒合成cDNA第一链，然后用AP2-F和AP2-R进行PCR扩增，PCR反应体系：cDNA模板1μl，10×Buffer 5μl，dNTP(2.5mM)4μl，正反向引物各2μl(10μM)，Taq Plus DNA polymerase 1μl，灭菌蒸馏水补足50μl。PCR扩增条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min30s，35个循环；72℃延伸10min。PCR产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳分离，回收目的条带后与pMD19T连接，连接体系如下：目的基因4μl，T easy vector 1μl，Solution I 5μl。连接产物转化大肠杆菌，提取质粒并测序。

白桦AP2核苷酸序列分析

白桦AP2基因序列长为1554bp，序列见序列表SEQ ID NO:1，通过BLASTN序列分析结果表明，白桦AP2cDNA与拟南芥(Arabidopsis thaliana)、毛果杨(Populus trichocarpa)相似性高达70％以上。

白桦AP2基因编码的蛋白质序列分析

白桦AP2基因总共编码517个氨基酸，序列见序列表SEQ ID NO:2，通过BLASTP进行序列比对，结果表明，与白桦AP2氨基酸序列与毛果杨(Populus trichocarpa)、蓖麻(Ricinus communis)的亲缘关系最接近。

实施例2：白桦AP2基因的植物表达载体构建

(1)白桦AP2的双酶切并进行检测

植物表达载体双酶切步骤如下：

克隆载体和植物双元载体pBI121都用XbaI和SmaI双酶切，酶切体系如下：DNA 2μg，10×FD buffer 2μl，XbaI 1μl，SmaI 1μl，灭菌蒸馏水补足20μl。混匀后37℃孵育2～3h，65℃孵育5min。双酶切产物经0.8％琼脂糖凝胶电泳，按OMEGA回收试剂盒步骤回收目的片段。

(2)双酶切产物的连接

16℃过夜连接，连接体系如下：目的基因10μl，pBI121载体片段4μl，T4连接酶1μl，T4buffer 2μl，灭菌蒸馏水补足20μl

(4)转化大肠杆菌及检测

将双酶切后的连接产物直接转到大肠杆菌中，使其大量表达，富集表达载体的浓度。接着将转化产物接种于含有卡那霉素(50μg/mL)的LB固体培养基上，平板倒置于37℃恒温培养箱中培养12-18h。扩大培养的菌液进行菌液PCR鉴定。

实施例3：白桦AP2基因在拟南芥中过表达功能分析

(1)拟南芥无菌苗的培养：

a)取适量种子于离心管中，加入适量无菌蒸馏水，充分漩涡震荡，短时瞬离，将漂浮的种子和无菌水一起吸出。

b)加入1ml 70％的乙醇，漩涡震荡10s，使种子充分悬浮于乙醇溶液中，吸出乙醇(乙醇消毒时间不宜过长，避免乙醇渗入，降低种子活性)，加入无菌ddH₂O，震荡清洗2遍。

c)加入1ml 10％次氯酸钠，漩涡充分震荡5min，12000rpm离心1min，超净工作台中，用1ml无菌ddH₂O，震荡清洗3-5遍，直至离心管内溶液变为无色，降低残余次氯酸钠对种子的影响。

d)将洗好的无菌种子均匀铺于MS培养基表面，待培养基表面水分稍干后，封好封口膜，并做好标记。

e)将密封好的培养基放入4℃冰箱中春化处理2-3天，目的是打破种子休眠。

f)取出春化后的平板放入培养架上光照培养(16h light/8h dark)

g)待幼苗生长10d左右，长出两片真叶时即可将其大量移栽至已高温灭菌并浇过饱和营养液的土壤中培养。

(2)农杆菌介导的浸花法转化拟南芥

a)农杆菌培养：平板上挑取EHA105菌株的一个单菌落，接种到20m1附加相应抗生素的细菌培养液体培养基(pH7.0)中，在恒温摇床上，于27℃，180r/min培养至为0.6-1.0。将菌液转入新配制的无激素相应液体培养基中，稀释至OD₆₀₀为0.2-0.3时即可用于转化；

b)可选步骤：当拟南芥长出主花序后，从其底部将花序全部剪掉，4-6d后花序会重新抽出，此步骤能够保证各个植株的花序生长状况基本相同并延迟开花。

c)侵染前先将植株浇水至饱和，然后减去已经开放的花朵和角果，将花序和莲座叶一同侵入农杆菌侵染溶液中30s，至植株表面覆盖一层液体膜。

d)侵染后用吸水纸将植株表面多余的农杆菌侵染溶液吸干，用保鲜膜包裹植株。

e)用牛皮纸将所有侵染过的拟南芥遮盖起来，放于避光条件下暗培养24h。

f)去除遮盖的牛皮纸将植株放在16h长日照的条件下正常培养，正常浇水，待植株长高后可插入竹签将植株绑到竹签上防止植株倒伏，当长角果变黄即将炸裂开时即可收取种子。

(3)抗性植株的筛选及PCR检测

将收集到的种子，无菌培养于含有终浓度为50μg/ml Kan的MS培养基上，方法同拟南芥无菌苗的培养，将筛选出的抗性植株进行PCR检测，转白桦AP2基因拟南芥的PCR检测所使用得引物分别为BplAP2特异性引物(AP2-F2：5′-ACTGCCTCTGCTGGTGC-3′和AP2-R2：5′-GAATGCTGTCCCGTTGC-3′)、NPTⅡ引物(NPTⅡ-F：5′-GGGCACAACAGACAATCG-3′和NPTⅡ-R：5′-ATCACGGGTAGCCAACG-3′)，PCR反应体系为20μl，组成成分各体积分别为：Template(DNA模板)，2μl；Primer-F(10μM)，1μl；Primer-R(10μM)，1μl；2×Taq PCR MasterMix，10μl；加ddH₂O补至20μl。PCR扩增条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸，45s，30个循环；72℃延伸10min。利用抗性筛选及PCR检测的方法筛选出抗性纯合株系，进行后续实验。

将获取的转基因拟南芥植株提取DNA，以无菌水和未进行基因转化的DNA为模板作阴性对照，以测序确认的pBI121-AP2质粒为模板作阳性对照。扩增后各取5μl PCR产物在1％的凝胶中电泳，进行PCR检测。对检测为阳性的纯合拟南芥植株和野生型拟南芥植株个24株，进行种子生物量的测量，结果如图6所示，为具体分析白桦AP2转基因种子于野生型拟南芥种子生物量差异的显著性，对白桦AP2转基因植株和野生型拟南芥植株种子生物量进行量化分析，统计结果如表1所示。与野生型非转基因植株相比，转基因纯合拟南芥种子重量下降10％-15％；种子中游离脂肪酸含量降低28.48％-32.68％；种子中可溶性蛋白含量降低8.42％-40.64％。

上述结果表明，白桦AP2基因过表达可降低拟南芥种子中游离脂肪酸含量及可溶性蛋白含量，使转基因拟南芥种子重量降低，说明白桦AP2基因可以通过调控种子中游离脂肪酸及可溶性蛋白的合成来调节种子的重量，可为后续研究提高作物种子产量提供一定科学依据。

表1：白桦AP2转基因拟南芥与野生型拟南芥种子生物量比较

注：表中重量及两种物质含量均为Mean±SD，比率值为转白桦AP2基因植株与野生型植株含量差值。