Sept2截短体及其载体和应用的制作方法与工艺

文档序号:13109009
技术领域本发明涉及生物工程技术领域,具体是Sept2截短体及其载体和应用。

背景技术:
肝细胞肝癌(Hepatocellularcarcinoma,HCC)是最常见的恶性肿瘤之一,其发病率在全球恶性肿瘤中居第五位,死亡率居第三位,具有起病隐匿、发展迅速、预后差、转移率高等特点,已成为危害人类健康的重要疾病。因此,加强治疗肝癌的研究,探索新的治疗途径具有十分重要的意义。在肝癌进展过程中,某些基因的表达发生变化,是肝癌发生发展的关键基因,成为肝癌治疗的潜在靶点。现有研究发现肝癌组织中的表达蛋白缺少某段多肽序列后不仅丧失了抑癌功能并且促进肝癌生长,故推测此多肽具有抑癌效应。Sept2是Septins基因家族一种能够调节微管蛋白的基因,它可通过微管蛋白调节G2\/M期转换和细胞有丝分裂,在纺锤体的形成和姊妹染色单体的分离中也发挥重要作用;而干扰Sept2可导致有丝分裂的失败和细胞的多核化以及引起细胞周期阻滞等。并且发现Sept2的某段多肽片段的外源性过表达,会阻断野生型Sept2的作用,从而起到抑癌作用。所以,在此发明中我们利用基因重组技术,Sept2的308氨基酸(aminoacid)多肽对应的DNA序列重组到p3*flag-cmv-13-14真核表达载体。经酶切和序列分析证明重组成功后,将此真核表达重组多肽转染到肝癌细胞,免疫印迹证明多肽的蛋白表达,实现了多肽的重组。将表达多肽序列的重组真核载体转染到肝癌细胞中,证明其独特的抑制肝癌生长和抑制肝癌发生的抗癌效应。发明为肝癌治疗开发新的靶点提供实验依据,对于应用于肝癌的临床治疗具有十分重要的开发应用前景。

技术实现要素:
发明目的:针对现有技术中存在的不足,本发明的目的是提供一种Sept2截短体,具有抗肝癌的应用价值。本发明的另一目的是提供上述Sept2截短体的表达载体。本发明还有一目的是提供上述Sept2截短体的应用。技术方案:为了实现上述发明目的,本发明采用的技术方案为:Sept2截短体,其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。编码所述的Sept2截短体的基因,其DNA序列如SEQIDNO.2所示。含有所述的Sept2截短体的编码基因的DNA序列的载体。所述的载体,将Sept2截短体的DNA序列连接进p3*flag-cmv-13-14真核表达载体,构建出重组表达质粒。所述的Sept2截短体在制备抗肿瘤药物中的应用。有益效果:与现有技术相比,本发明利用生物工程技术,基因重组一段308个氨基酸多肽对应的DNA序列到p3*flag-cmv-13-14真核表达载体,经酶切和序列分析证明重组成功后,将此真核表达重组多肽转染到肝癌细胞中,免疫印迹证明多肽的蛋白表达,实现了多肽的重组。接着对多肽的抗肝癌功能进行了研究,细胞学实验表明此多肽具有抑制肝癌细胞活性的重要抗癌功能,在制备抗肿瘤药物中的将具有广泛的应用,为肿瘤治疗开发新的靶点提供实验依据,对于应用于肿瘤的临床治疗具有十分重要的开发应用前景。附图说明图1是Sept2截短体免疫印迹蛋白表达结果电泳图;大小为34KD;图2是PI染色流式细胞术检测Sept2截短体抑制HepG2细胞增殖结果图;图3是CCK-8实验检测Sept2截短体对HepG2活性的抑制结果图;图4是EDU实验检测Sept2截短体抑制Huh7细胞增殖结果图;图5是EDU实验检测Sept2截短体抑制Huh7细胞增殖柱状图。具体实施方式下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,例如分子克隆实验指南(第三版,J.萨姆布鲁克等著,黄培堂等译,科学出版社,2002年)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件进行。实施例1重组肽的克隆载体构建提取人的mRNA,逆转录为cDNA,以cDNA为模板,上游引物为5’-TGCAAGCTTACCATGTCTAAGCAACAGCCAACTC-3’(含HindⅢ酶切位点);下游引物为5’-TCGGAATTCCCGCCTCTCTTGAGTCTC-3’(含EcoR1酶切位点),应用PCR技术成功扩增出Sept2截短体(SEQIDNO.1所示)对应的924bp的mRNA序列(SEQIDNO.2所示)。扩增得到的片段与p3*flag-cmv-13-14载体连接,将连接产物转入感受态大肠杆菌DH5α中,在含Amp+琼脂平板上挑选克隆,以碱裂解法小提重组质粒后,以ECOR1酶切鉴定。实施例2重组肽的真核表达载体构建及其表达鉴定将含有Sept2截短体的p3*flag-cmv-13-14质粒经ECOR1酶切后,利用回收试剂盒获得该片段,同时用相同的酶处理质粒p3*flag-cmv-13-14,然后将回收多肽核酸片段和经酶切的载体pcDNA3.1在T4DNA连接酶作用下于16℃连接过夜。酶切鉴定重组体。将正确连接的Sept2截短体真核表达载体转染HepG2细胞,48小时后搜集样品,RIPA细胞裂解液裂解,免疫印迹结果证明了多肽的表达,如图1所示为Sept2截短体,大小为34KD。实施例3重组肽抗肝癌功能的检测1)PI染色流式细胞术实验证明重组肽细胞水平的抗肝癌效应PI染色流式细胞分析术检测细胞周期:在Huh7和HepG2等HCC细胞中,转染野生型、Sept2截短体的Sept2载体48h后,胰酶消化细胞,完全培养基终止消化并收集到5mLEP管中离心后弃掉培养基,用预冷的细胞PBS重悬洗涤3次,离心,弃掉PBS,用70%乙醇重悬,置于-20℃固定至少24h。检测前,离心收集的细胞,弃乙醇,用PBS洗涤3次,并用含1%TritonX-100的PBS,4℃通透,每管200μL。后加入RNaseA,避光4℃反应,每管300-400μL。加入200μLPI染色剂,避光4℃染色20min,每管200μL,流式细胞仪检测。结果如图2:相对于对照组而言,转染Sept2截短体(Sept2△1-308aa)比转染野生型Sept2细胞S期和G2期比例有明显的降低说明Sept2△1-308aa能引起细胞增殖阻滞。2)CCK-8实验证明重组肽细胞水平的抗肝癌效应CCK-8细胞增殖实验:在Huh7和HepG2等HCC细胞中,转染野生型,308aa片段截短的Sept2载体48h后收集细胞,每孔5000个细胞接种到96孔板,每孔体积100μL。待细胞完全贴壁后(根据实验目的和实际情况决定培养时间),每孔换液(CCK-8与培养液的比例为1:10),37℃孵育2h,终止培养,酶标仪以490nm波长测量各孔的吸光度值,每组设四复孔。每24h测定各组CCK-8吸光度值一次,共检测5天,以时间为横坐标,吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。结果如图3。同样,CCK-8也显示转染Sept2△1-308aa组比转染对照组细胞增殖明显抑制。3)EDU掺入实验证明重组肽细胞水平的抗肿瘤效应将HepG2分别以每孔4×103~1×105细胞接种于96孔板中,利用Lipofectamin2000kit将308aa片段截短的Sept2载体瞬时转染HepG2细胞,48h后进行EDU孵育(50nM),2小时后弃培养基,而后通过细胞固定、Apollo染色、DNA染色后,进行观测并统计。结果如图4和图5显示,同样验证了该实验结果。...
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