本发明涉及遗传工程领域，尤其涉及一种提高乙酰氨基葡萄糖产量的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法。
背景技术：
在人体中，乙酰氨基葡萄糖是糖胺聚糖二糖单元的合成前体，其对修复和维持软骨及关节组织功能具有重要作用。因此，乙酰氨基葡萄糖被广泛添加在药物和营养膳食中来治疗和修复关节损伤。此外，乙酰氨基葡萄糖在化妆品和制药领域也具有诸多应用。目前，乙酰氨基葡萄糖主要采用酸解虾壳或蟹壳中甲壳素生产，然而，此方法产生的废液对环境污染较为严重，而且得到的产品易引起过敏反应，不适宜海鲜过敏的人群服用。
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是一种被广泛用作食品酶制剂及重要营养化学品的生产宿主，其产品被FDA认证为GRAS(Generally Regarded as Safe)安全级别。专利申请号为201510761678.6中构建的重组枯草芽孢杆菌BSGNKAP仍然存在乙酰氨基葡萄糖/葡萄糖转化效率低的缺点。因此，如何提高葡萄糖的利用效率及乙酰氨基葡萄糖合成效率，是微生物发酵法生产乙酰氨基葡萄糖产量的亟待解决问题。
鉴于上述原因，本发明人积极加以研究创新，以期创建一种新型的提高乙酰氨基葡萄糖产量的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法，使其更具有产业上的利用价值。
技术实现要素：
为解决上述技术问题，本发明提供了一种提高乙酰氨基葡萄糖产量的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法，该构建方法是加强表达了枯草芽孢杆菌中的丙酮酸羧化酶编码基因(pycA)，操作简单，便于使用，且所构建的重组枯草芽孢杆菌可有效地减少副产物的产生，大大提高乙酰氨基葡糖的产量。在一方面，本发明提供了一种提高乙酰氨基葡萄糖产量的重组枯草芽孢杆菌，该重组枯草芽孢杆菌通过加强表达枯草芽孢杆菌的丙酮酸羧化酶编码基因pycA得到。
在一具体实施例中，用强组成型启动子P43替换丙酮酸羧化酶编码基因pycA原始启动子，并将丙酮酸羧化酶编码基因pycA起始密码子GTG替换为ATG，来加强表达枯草芽孢杆菌的丙酮酸羧化酶编码基因pycA。
在一更具体实施例中，其中基因pycA被加强表达的枯草芽孢杆菌为BSGNKAP，其是以B.subtilis 168Δ nagPΔ gamPΔ gamAΔ nagAΔ nagBΔ ldhΔ pta:：lox72为宿主，分别以启动子PxylA、P43控制glmS、GNA1的重组表达，并敲除葡萄糖激酶编码基因glck、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶编码基因pckA和丙酮酸激酶编码基因pyk得到，如申请号为201510761678.6的中国专利申请中所公开的。
进一步地，丙酮酸羧化酶编码基因pycA如NCBI-Gene ID:935920所示。
在另一方面，本发明还提供了一种上述重组枯草芽孢杆菌的构建方法，包括以下步骤：
(1)构建丙酮酸羧化酶编码基因pycA的启动子和起始密码子的替换框；
(2)经同源重组，用步骤(1)中得到的替换框替换枯草芽孢杆菌基因组中的酮酸羧化酶编码基因pycA的启动子及起始密码子GTG。
在一具体实施例中，在步骤(1)中，用丙酮酸羧化酶编码基因pycA的上游序列、pycA序列、PH01终止子Ter、强组成型启动子P43以及博来霉素抗性 基因zeo序列，构建丙酮酸羧化酶编码基因pycA的启动子和起始密码子替换框。
在一具体实施例中，在步骤(2)中，起始密码子GTG替换为ATG。
在一具体实施例中，丙酮酸羧化酶编码基因pycA的上游序列来自枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 168，枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 168购自美国典型微生物保藏中心，编号为ATCC No.27370。
在又一具体实施例中，丙酮酸羧化酶编码基因pycA的上游序列及pycA序列如SEQ ID NO.1所示
在一具体实施例中，在步骤(1)中，丙酮酸羧化酶编码基因pycA的启动子和起始密码子替换框的序列如SEQ ID NO.2所示。
在一具体实施例中，在步骤(2)中，枯草芽孢杆菌为BSGNKAP，其是以B.subtilis 168Δ nagPΔ gamPΔ gamAΔ nagAΔ nagBΔ ldhΔ pta:：lox72为宿主，分别以启动子PxylA、P43控制glmS、GNA1的重组表达，并敲除葡萄糖激酶编码基因glck、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶编码基因pckA和丙酮酸激酶编码基因pyk得到的，如申请号为201510761678.6的中国专利申请中所公开的。
在又一具体实施例中，通过pP43-GNA1质粒游离表达GNA1基因，通过pM7Z6M-PxylA-glmS质粒整合表达glmS基因。
在又一方面，本发明还提供了一种上述构建的重组枯草芽孢杆菌制备乙酰氨基葡萄糖的方法，包括以下步骤：将重组枯草芽孢杆菌在种子培养基中活化，然后将活化后的种子转入发酵培养基，加入诱导剂进行发酵培养，得到乙酰氨基葡萄糖。
进一步地，种子在35-37℃下在种子培养基中活化，活化后的种子在35-37℃下发酵培养。
进一步地，种子培养基包括以下成分：蛋白胨、酵母粉和氯化钠；
在一具体实施例中，种子培养基以其重量为基准，包括以下成分：10g/L蛋白胨、5g/L酵母粉和10g/L氯化钠。
进一步地，发酵培养基包括以下成分：葡萄糖、蛋白胨、酵母粉、硫酸铵、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、碳酸钙和微量元素溶液。
在一更具体实施例中，发酵培养基以其重量为基准，包括以下成分：20g/L葡萄糖、6g/L蛋白胨、12g/L酵母粉、6g/L硫酸铵、12.5g/L磷酸氢二钾、2.5g/L磷酸二氢钾、5g/L碳酸钙和10ml/L微量元素溶液。
进一步地，微量元素溶液包括：硫酸锰、氯化钴、钼酸钠、硫酸锌、氯化铝、氯化铜、硼酸和盐酸。
在一具体实施例中，微量元素溶液以其重量为基准，包括以下成分：1.0g/L硫酸锰、0.4g/L氯化钴、0.2g/L钼酸钠、0.2g/L硫酸锌、0.1g/L氯化铝、0.1g/L氯化铜、0.05g/L硼酸和5mol/L盐酸。
在一具体实施例中，活化后的种子以5％-6％的接种量转入发酵培养基中进行培养。
在一具体实施例中，诱导剂为木糖，每升发酵培养基的木糖用量为4.5-5.5g。
借由上述技术方案，与现有技术相比，本发明具有以下优点：
本发明提供了一种提高乙酰氨基葡萄糖产量的重组枯草芽孢杆菌，BSGNKAP2通过加强表达了枯草芽孢杆菌BSGNKAP的丙酮酸羧化酶编码基因pycA得到，与出发菌株相比，其乙酰氨基葡萄糖产量大大提高。本发明通过加强表达丙酮酸羧化酶，将更多的丙酮酸引入到三羧酸循环，提高谷氨酰胺合成前体α-酮戊二酸的浓度，进而提高谷氨酰胺的合成，促进乙酰氨基葡萄糖积累。三羧酸循环中间产物α-酮戊二酸是连接碳代谢和氮代谢关键节点，α-酮戊二酸作为谷氨酰胺合成的前体，同时谷氨酰胺是乙酰氨基葡萄糖的合成前体，因此 提高胞内α-酮戊二酸的合成可以有效增加谷氨酰胺的含量，进而可以提高乙酰氨基葡萄糖的合成。同时，将丙酮酸引入三羧酸循环可以有效的减少副产物乙偶姻的生成，提高葡萄糖的利用效率。本发明的重组枯草芽孢杆菌构建方法简单，便于使用，具有很好地应用前景。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明的技术方案作进一步详细描述。以下实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的保护范围的限制。
实施例1
构建枯草芽孢杆菌BSGNKAP
根据中国专利申请201510761678.6中所公开的内容，以B.subtilis 168Δ nagPΔ gamPΔ gamAΔ nagAΔ nagBΔ ldhΔ pta:：lox72为宿主，分别以启动子PxylA、P43控制glmS、GNA1的重组表达，以pP43-GNA1质粒游离表达GNA1基因，pM7Z6M-PxylA-glmS质粒整合表达glmS基因，然后在此基础上敲除葡萄糖激酶编码基因glck、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶编码基因pckA和丙酮酸激酶编码基因pyk，得到重组枯草芽孢杆菌BSGNKAP。
实施例2
构建重组枯草芽孢杆菌BSGNKAP2
根据NCBI上公布的购买自美国典型微生物保藏中心，编号为ATCC No.27370的Bacillus subtilis 168的丙酮酸羧化酶编码基因pycA的上游序列和pycA序列(如序列表SEQ ID NO.1所示)，PH01终止子Ter、P43强组成型启动子以及博来霉素抗性基因zeo的序列，构建序列如SEQ ID NO.2所示的替换框。本发明中通过引入PHT01质粒的终止子Ter终止pycA原始启动子的表达调控。
将构建好的替换框转化实施例1中得到的枯草芽孢杆菌BSGNKAP，经同 源重组，用构建好的替换框整合至枯草芽孢杆菌BSGNKAP基因组中，达到替换丙酮酸羧化酶编码基因pycA的启动子及起始密码子GTG，得到重组枯草芽孢杆菌BSGNKAP2，加强表达了宿主菌胞内丙酮酸羧化酶，通过博来霉素抗性平板筛选、菌落PCR验证，确认启动子和起始密码子替换框整合成功，得到重组枯草芽孢杆菌BSGNKAP2。
实施例3
重组芽孢杆菌BSGNKAP2发酵生产乙酰氨基葡萄糖
种子培养基的成分包括：10g/L蛋白胨、5g/L酵母粉、和10g/L氯化钠。
发酵培养基的成分包括：20g/L葡萄糖、6g/L蛋白胨、12g/L酵母粉、6g/L硫酸铵、12.5g/L磷酸氢二钾、2.5g/L磷酸二氢钾、5g/L碳酸钙10ml/L微量元素溶液。
其中微量元素溶液以其重量为基准，包括如下成分：1.0g/L硫酸锰、0.4g/L氯化钴、0.2g/L钼酸钠、0.2g/L硫酸锌、0.1g/L氯化铝、0.1g/L氯化铜、0.05g/L硼酸和5mol/L盐酸。
使用高效液相色谱法检测乙酰氨基葡萄糖的含量，高效液相色谱法测试条件：仪器型号Agilent 1200，RID检测器，柱子：NH2柱(250×4.6mm，5μm)，流动相：70％乙腈，流速0.75mL/min，柱温30℃，进样体积为10μL。
发酵液中葡萄糖浓度的检测：SBA生物传感分析仪。
在种子培养基中将重组枯草芽孢杆菌BSGNKAP1于37℃、220rpm下培养8h，然后将种子以5％的接种量转入发酵培养基，于500mL摇瓶中37℃、220rpm条件下培养48h。发酵结束时，检测发酵上清液中乙酰氨基葡萄糖的含量。
发酵结束时，BSGNKAP2发酵上清液中乙酰氨基葡萄糖含量达到12.1g/L，与对照菌株BSGNKAP相比提高了15.4％(结果如表1所示)，实现了乙酰氨基 葡萄糖在重组枯草芽孢杆菌胞外产量的提高。此外，本发明的BSGNKAP2菌株的乙酰氨基葡萄糖比合成速率达到0.0154g/g DCW/h，与对照菌株BSGNKAP相比，比合成速率提高了22.1％。发酵上清液中乙偶姻的产量为10.83g/L，而出发菌株中的乙偶姻的产量为12.18g/L，副产物乙偶姻的产量仅为对照菌株的88.8％。因此通过加强表达丙酮酸羧化酶编码基因pycA，可以有效提高乙酰氨基葡萄糖的积累，减少副产物的生成，提高碳源的利用效率。
表1 两种菌株各产物比较
以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。
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