本发明涉及遗传工程领域，尤其涉及一种提高乙酰氨基葡萄糖产量的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法。
背景技术：
在人体中，乙酰氨基葡萄糖是糖胺聚糖二糖单元的合成前体，其对修复和维持软骨及关节组织功能具有重要作用。因此，乙酰氨基葡萄糖被广泛添加在药物和营养膳食添加中来治疗和修复关节损伤。此外，乙酰氨基葡萄糖在化妆品和制药领域也具有诸多应用。目前，乙酰氨基葡萄糖主要采用酸解虾壳或蟹壳中甲壳素生产，然而，此方法产生的废液对环境污染较为严重，而且得到的产品易引起过敏反应，不适宜海鲜过敏的人群服用。
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是一种被广泛用作食品酶制剂及重要营养化学品的生产宿主，其产品被FDA认证为GRAS(Generally Regarded as Safe)安全级别。申请号为201510761678.6的中国专利申请中构建的枯草芽孢杆菌BSGNKAP仍然存在乙酰氨基葡萄糖/葡萄糖转化效率低的缺点。由于BSGNKAP敲除了丙酮酸激酶编码基因pyk和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶编码基因pckA后，枯草芽孢杆菌胞内的苹果酸回补途径会促使苹果酸转化为丙酮酸，丙酮酸作为多条代谢途径的代谢节点，因此苹果酸回补生成的丙酮酸会进一步转化为乙偶姻，进而导致副产物过多的积累，造成碳源利用效率较低。同时，由于苹果酸通过回补途径转化为丙酮酸，也会造成乙酰氨糖合成前体α-酮戊二酸供应不足。因此，如何提高葡萄糖的利用效率及乙酰氨基葡萄糖合成效率，是微生物发酵法生产乙酰氨基葡萄糖产量的亟待解决问题。
鉴于上述原因，本发明人积极加以研究创新，以期创建一种提高乙酰氨基葡萄糖产量的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法，使其更具有产业上的利用价值。
技术实现要素：
为解决上述技术问题，本发明提供了一种提高乙酰氨基葡萄糖产量的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法，本发明的重组枯草芽孢杆菌是在枯草芽孢杆菌(BSGNKAP)的基础上，敲除苹果酸脱氢酶编码基因，构建方法简单，具有良好的应用前景。
在一方面，本发明提供了一种提高乙酰氨基葡萄糖产量的重组枯草芽孢杆菌，该重组枯草芽孢杆菌通过敲除枯草芽孢杆菌的苹果酸脱氢酶编码基因得到。
进一步地，苹果酸脱氢酶编码基因为ytsJ、ywkA、malS和mleA中的一种或几种。
进一步地，苹果酸脱氢酶编码基因ytsJ、ywkA、malS和mleA分别为NCBI上Gene ID:937378、Gene ID:937045、Gene ID:938071、Gene ID:938725所示。
在一具体实施例中，敲除枯草芽孢杆菌BSGNKAP的苹果酸脱氢酶编码基因得到本发明的重组枯草芽孢杆菌。BSGNKAP通过以B.subtilis 168ΔnagPΔgamPΔgamAΔnagAΔnagBΔldhΔpta::lox72为宿主，用启动子PxylA、P43分别控制glmS、GNA1的重组表达，并敲除葡萄糖激酶编码基因glck、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶编码基因pckA和丙酮酸激酶编码基因pyk得到，如申请号为201510761678.6的中国专利申请中所公开的。
在又一具体实施例中，通过pP43-GNA1质粒游离表达GNA1基因，通过pM7Z6M-PxylA-glmS质粒整合表达glmS基因。
在另一方面，本发明一种上述提高乙酰氨基葡萄糖产量的重组枯草芽孢杆菌的构建方法，包括以下步骤：
(1)构建苹果酸脱氢酶编码基因敲除框；
(2)经同源重组，用步骤(1)中的敲除框敲除枯草芽孢杆菌基因组中的苹果酸脱氢酶编码基因ytsJ、ywkA、malS和mleA，分别得到提高乙酰氨基葡萄糖产量的重组枯草芽孢杆菌。
在一具体实施例中，用苹果酸脱氢酶基因的上下游序列和博来霉素抗性基因zeo的序列，构建苹果酸脱氢酶编码基因敲除框；
在一具体实施例中，经同源重组将苹果酸脱氢酶编码基因敲除框中的博来霉素抗性基因zeo替代枯草芽孢杆菌中的苹果酸脱氢酶基因，得到本发明的重组枯草芽孢杆菌。
在一具体实施例中，在步骤(1)中，苹果酸脱氢酶基因的上下游序列来自枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 168，该枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 168购自美国典型微生物保藏中心，编号为ATCC No.27370。
进一步地，苹果酸脱氢酶编码基因为ytsJ、ywkA、malS和mleA中的一种或几种。
进一步地，苹果酸脱氢酶基因ytsJ、ywkA、malS和mleA的上下游序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.8所示。
在一具体实施例中，用步骤(1)中的敲除框依次敲除枯草芽孢杆菌基因组中的苹果酸脱氢酶编码基因ytsJ、ywkA、malS和mleA，得到提高乙酰氨基葡萄糖产量的重组枯草芽孢杆菌BSGNKAPM1、BSGNKAPM2、BSGNKAPM3、BSGNKAPM4。
进一步地，在步骤(1)中，苹果酸脱氢酶编码基因ytsJ、ywkA、malS和mleA敲除框的序列如SEQ ID NO.9～SEQ ID NO.12所示。
在一具体实施例中，在步骤(2)中，枯草芽孢杆菌为BSGNKAP，其是以B.subtilis 168ΔnagPΔgamPΔgamAΔnagAΔnagBΔldhΔpta::lox72为宿主，分别以启动子PxylA、P43控制glmS、GNA1的重组表达，并敲除葡萄糖激酶编码基因glck、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶编码基因pckA和丙酮酸激酶编码基因pyk得到，如申请号201510761678.6中构建的枯草芽孢杆菌。
在另一方面，本发明还提供了一种上述重组枯草芽孢杆菌制备乙酰氨基葡萄糖的方法，包括以下步骤：将重组枯草芽孢杆菌在种子培养基中活化，然后将活化后的种子转入发酵培养基，加入诱导剂进行发酵培养，得到乙酰氨基葡萄糖。
进一步地，种子在35℃-37℃下在种子培养基中活化，活化后的种子在35-37℃发酵培养。
进一步的，种子培养基包括以下成分：蛋白胨、酵母粉和氯化钠；
在一具体实施例中，种子培养基以其重量为基准，包括以下成分：10g/L蛋白胨、5g/L酵母粉和10g/L氯化钠。
进一步地，发酵培养基包括以下成分：葡萄糖、蛋白胨、酵母粉、硫酸铵、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、碳酸钙和微量元素溶液。
在一具体实施例中，发酵培养基以其重量为基准，包括以下成分：20g/L葡萄糖、6g/L蛋白胨、12g/L酵母粉、6g/L硫酸铵、12.5g/L磷酸氢二钾、2.5g/L磷酸二氢钾、5g/L碳酸钙和10ml/L微量元素溶液。
进一步地，微量元素溶液包括：硫酸锰、氯化钴、钼酸钠、硫酸锌、氯化铝、氯化铜、硼酸和盐酸。
在一具体实施例中，微量元素溶液以其重量为基准，包括以下成分：1.0g/L硫酸锰、0.4g/L氯化钴、0.2g/L钼酸钠、0.2g/L硫酸锌、0.1g/L氯化铝、0.1g/L氯化铜、0.05g/L硼酸和5mol/L盐酸。
在一具体实施例中，将活化后的种子以5％-6％的接种量转入发酵培养基中进行培养。
在一具体实施例中，诱导剂为木糖，每升发酵培养基的木糖用量为4.5g～5.5g。
借由上述技术方案，与现有技术相比，本发明具有以下优点：
本发明提供了提高乙酰氨基葡萄糖产量的重组枯草芽孢杆菌BSGNKAPM1、BSGNKAPM2、BSGNKAPM3、BSGNKAPM4，是在枯草芽孢杆菌BSGNKAP的基础上依次敲除苹果酸脱氢酶基因(ytsJ、ywkA、malS和mleA)得到的，与出发菌株BSGNKAP相比，其乙酰氨基葡萄糖胞外积累量得到提高，且减少了副产物乙偶姻的产量。本发明通过敲除ytsJ、ywkA、malS和mleA基因，可以有效的减少副产物生成，提高乙酰氨基葡萄糖的积累。本发明通过阻断宿主菌胞内苹果酸通过回补途径转化为丙酮酸的反应，防止了TCA循环中的碳再次流向乙偶姻、乙酸合成途径，同时阻断苹果酸回补途径可以有效增加乙酰氨基葡萄糖合成前体α-酮戊二酸含量，进一步促进了乙酰氨基葡萄糖积累。本发明的重组枯草芽孢杆菌构建方法简单，便于使用，具有很好地应用前景。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明的技术方案作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1
构建枯草芽孢杆菌BSGNKAP
根据中国专利申请201510761678.6中所公开的内容，以B.subtilis168ΔnagPΔgamPΔgamAΔnagAΔnagBΔldhΔpta::lox72为宿主，分别以启动子PxylA、P43控制glmS、GNA1的重组表达，以pP43-GNA1质粒游离表达GNA1基因，pM7Z6M-PxylA-glmS质粒整合表达glmS基因，然后在此基础上敲除葡萄糖激酶编码基因glck、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶编码基因pckA和丙酮酸激酶编码基因pyk，得到枯草芽孢杆菌BSGNKAP。
实施例2
构建重组枯草芽孢杆菌BSGNKAPM1
根据NCBI上公布的购买自美国典型微生物保藏中心，编号为ATCC No.27370的Bacillus subtilis 168的苹果酸脱氢酶基因ytsJ的上下游序列(如序列表SEQ ID NO.1所示)，以及博来霉素抗性基因zeo的序列，构建序列如SEQ ID NO.2所示的苹果酸脱氢酶编码基因敲除框。
将构建好的苹果酸脱氢酶编码基因敲除框转化实施例1中得到的枯草芽孢杆菌BSGNKAP，经同源重组，将苹果酸脱氢酶编码基因敲除框中的博来霉素抗性基因zeo替代枯草芽孢杆菌BSGNKAP中苹果酸脱氢酶基因ytsJ，阻断了宿主菌胞内苹果酸转化为丙酮酸的反应，通过博来霉素抗性平板筛选、菌落PCR验证，确认苹果酸脱氢酶基因ytsJ敲除成功，得到重组枯草芽孢杆菌BSGNKAPM1。
实施例3
构建重组枯草芽孢杆菌BSGNKAPM2
根据NCBI上公布的购买自美国典型微生物保藏中心，编号为ATCC No.27370的Bacillus subtilis 168的苹果酸脱氢酶基因ywkA的上下游序列(如序列表SEQ ID NO.1所示)，以及博来霉素抗性基因zeo的序列，构建序列如SEQ ID NO.2所示的苹果酸脱氢酶编码基因敲除框。
将构建好的苹果酸脱氢酶编码基因敲除框转化实施例2中得到的枯草芽孢杆菌BSGNKAPM1，经同源重组，将苹果酸脱氢酶编码基因敲除框中的博来霉素抗性基因zeo替代枯草芽孢杆菌BSGNKAPM1中苹果酸脱氢酶基因ywkA，阻断了宿主菌胞内苹果酸转化为丙酮酸的反应，通过博来霉素抗性平板筛选、菌落PCR验证，确认苹果酸脱氢酶基因ywkA敲除成功，得到重组枯草芽孢杆菌BSGNKAPM2。
实施例4
构建重组枯草芽孢杆菌BSGNKAPM3
根据NCBI上公布的购买自美国典型微生物保藏中心，编号为ATCC No.27370的Bacillus subtilis 168的苹果酸脱氢酶基因mleA的上下游序列(如序列表SEQ ID NO.1所示)，以及博来霉素抗性基因zeo的序列，构建序列如SEQ ID NO.2所示的苹果酸脱氢酶编码基因敲除框。
将构建好的苹果酸脱氢酶编码基因敲除框转化实施例3中得到的枯草芽孢杆菌BSGNKAPM2，经同源重组，将苹果酸脱氢酶编码基因敲除框中的博来霉素抗性基因zeo替代枯草芽孢杆菌BSGNKAPM2中苹果酸脱氢酶基因mleA，阻断了宿主菌胞内苹果酸转化为丙酮酸的反应，通过博来霉素抗性平板筛选、菌落PCR验证，确认苹果酸脱氢酶基因mleA敲除成功，得到重组枯草芽孢杆菌BSGNKAPM3。
实施例5
构建重组枯草芽孢杆菌BSGNKAPM4
根据NCBI上公布的购买自美国典型微生物保藏中心，编号为ATCC No.27370的Bacillus subtilis 168的苹果酸脱氢酶基因malS的上下游序列(如序列表SEQ ID NO.1所示)，以及博来霉素抗性基因zeo的序列，构建序列如SEQ ID NO.2所示的苹果酸脱氢酶编码基因敲除框。
将构建好的苹果酸脱氢酶编码基因敲除框转化实施例1中得到的枯草芽孢杆菌BSGNKAPM3，经同源重组，将苹果酸脱氢酶编码基因敲除框中的博来霉素抗性基因zeo替代枯草芽孢杆菌BSGNKAPM3中苹果酸脱氢酶基因malS，阻断了宿主菌胞内苹果酸转化为丙酮酸的反应，通过博来霉素抗性平板筛选、菌落PCR验证，确认苹果酸脱氢酶基因malS敲除成功，得到重组枯草芽孢杆菌BSGNKAPM4。
实施例6
重组枯草芽孢杆菌BSGNKAPM1、BSGNKAPM2、BSGNKAPM3、BSGNKAPM4发酵生产乙酰氨基葡萄糖
种子培养基的成分包括：10g/L蛋白胨、5g/L酵母粉和10g/L氯化钠。
发酵培养基的成分包括：20g/L葡萄糖、6g/L蛋白胨、12g/L酵母粉、6g/L硫酸铵、12.5g/L磷酸氢二钾、2.5g/L磷酸二氢钾、5g/L碳酸钙和10ml/L微量元素溶液。
其中微量元素溶液以其重量为基准，包括如下成分：1.0g/L硫酸锰、0.4g/L氯化钴、0.2g/L钼酸钠、0.2g/L硫酸锌、0.1g/L氯化铝、0.1g/L氯化铜、0.05g/L硼酸和5mol/L盐酸。
使用高效液相色谱法检测乙酰氨基葡萄糖的含量，高效液相色谱法测试条件：仪器型号Agilent 1200，RID检测器，柱子：NH2柱(250×4.6mm，5μm)，流动相：70％乙腈，流速0.75mL/min，柱温30℃，进样体积为10μL。
发酵液中葡萄糖浓度的检测：SBA生物传感分析仪。
在种子培养基中将重组枯草芽孢杆菌BSGNKAP1于37℃、220rpm下培养8h，然后将种子以5％的接种量转入发酵培养基，于500mL摇瓶中37℃、220rpm条件下发酵培养48h。发酵结束时，检测发酵上清液中乙酰氨基葡萄糖的含量。
BSGNKAPM4发酵上清液中乙酰氨基葡萄糖的含量达到12.09g/L，与对照菌株BSGNKAP相比，其产量提高了13.8％，发酵上清液中乙偶姻的产量为9.63g/L，而出发菌株中的乙偶姻的产量为11.75g/L，副产物乙偶姻的产量仅为对照菌株的81.9％。此外，本发明的BSGNKAP菌株的乙酰氨基葡萄糖比合成速率达到0.054g/g DCW/h，与对照菌株BSGNKAP相比，提高了10.2％。实验结果如表1所示。因此通过敲除苹果酸酶基因(ytsJ、ywkA、malS和mleA)，可以有效提高乙酰氨基葡萄糖的积累。本发明实现了乙酰氨基葡萄糖在重组枯草芽孢杆菌胞外产量的提高，降低了副产物的产量。
表1改造重组菌株各参数比较
以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。