一种产木聚糖酶的重组菌及其应用的制作方法

本发明涉及一种产木聚糖酶的重组菌及其应用，属于酶工程领域。

背景技术：

木聚糖是植物细胞壁半纤维素的主要成分，是一种丰富的可再生生物资源。木聚糖酶是一类可以将木聚糖降解成低聚木糖或木糖的酶的总称。由于木聚糖主链的聚合度不同，支链上残基在主链上的结合位点也不同，化学性质比较复杂，所以多种酶协同作用才能完全降解木聚糖。

木聚糖酶在自然界中来源十分广泛，陆地和海洋的细菌、真菌和酵母、原生动物、甲壳动物中都存在木聚糖酶。微生物中厌氧菌、需氧菌、嗜温微生物、嗜热微生物和极端微生物都可产生木聚糖酶。目前研究和应用得最多的木聚糖酶主要来自曲霉、木霉和细菌，而商品酶应用最多的是丝状真菌来源的木聚糖酶。

木聚糖酶应用非常广泛，目前已经在食品、饲料、造纸、纺织等工业中成功应用，许多来源于木霉、曲霉以及芽孢杆菌等的木聚糖酶被商业化生产，但适用于不同需求，具有优良性质的木聚糖酶仍在不断开发之中。

Clostridium clariflavum是一种嗜热厌氧木质纤维素降解菌，对木质纤维素的降解率非常高，可降解42～59％的无预处理仅经高压灭菌的植物材料柳枝稷，而同属的C.thermocellum仅能降解33％的柳枝稷，但是对来源于Clostridium clariflavum的木聚糖酶的具体性质及相关应用鲜有报道。

技术实现要素：

本发明的第一个目的在于提供一种产木聚糖酶的重组菌，所述重组菌是以pET28a(+)为载体，以E.coli BL21(DE3)为表达宿主，表达如SEQ ID NO.1所示基因。

本发明的第二个目的在于提供构建木聚糖酶重组菌的方法，所述方法包括如下步骤：PCR扩增SEQ ID NO.1所示基因，与pET28a(+)连接并转化到E.coli BL21(DE3)，获得重组菌。

本发明的第三个目的是提供一种诱导表达木聚糖酶的方法，所述方法是将所述重组大肠杆菌接种到培养基中，当OD₆₀₀为1.0～1.9时加入IPTG诱导木聚糖酶的表达。

在本发明的一种实施方式中，所述诱导温度为20～30℃。

在本发明的一种实施方式中，所述诱导时间为4～12h。

在本发明的一种实施方式中，所述诱导剂IPTG的终浓度为0.1～0.9mmol·L^-1。

在本发明的一种实施方式中，所述接种是以2～5％接种量进行接种。

在本发明的一种实施方式中，所述培养基配方为氯化钠10g/L，胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，pH 7。

本发明的第四个目的是提供所述的重组菌在生产木聚糖酶中的应用。

有益效果：本发明成功地实现了Clostridium clariflavum来源的木聚糖酶的异源表达，并通过IPTG诱导的方法提高了木聚糖酶的表达量，使木聚糖酶的酶活是未诱导的73倍。此外，本发明提供的木聚糖酶具有良好的pH稳定性，在pH3.5-9.5酶活性保持在80％以上，并可将木聚糖降解为木糖。

附图说明

图1为本发明的木聚糖酶的pH稳定性；

图2为诱导前后木聚糖酶酶活；

图3为本发明的HPLC检测木聚糖酶降解木聚糖的产物，峰7为木糖。

具体实施方式

酶液制备：将发酵液离心，上清液用于胞外酶活测定；沉淀用20mmol·L^-1的pH 6.0磷酸钠缓冲液重悬细胞，超声波破碎10min，功率为390W，工作3s，间歇5s，破碎以后离心，上清液即为胞内酶液。

酶活测定方法：采用3，5-二硝基水杨酸比色法(DNS法)，取500uL稀释后的酶液、500uL木聚糖底物于比色管中混匀(每种样品平行做3个样)，在65℃水浴中保温10min，加入1mL DNS显色剂，沸水浴反应5min。取出，迅速冷却，用水定容至10mL，混匀，使用分光光度计，在波长540nm处测量吸光度，使测得的吸光值在0.2-0.5之间。根据标准曲线计算木聚糖酶酶活。酶活定义为每分钟降解木聚糖底物生成1μmol木糖所需的酶量为1U。

蛋白浓度的测定：Super-Bradford蛋白定量试剂盒与稀释好的蛋白质反应，用酶标仪测定595nm处的吸光值，根据蛋白标曲计算蛋白浓度。比酶活(U·mg^-1)＝酶活(U·mL^-1)×[蛋白浓度(mg·mL^-1)]^-1。

实施例1

PCR扩增xyn基因，其序列如SEQ ID NO.1所示，将xyn基因和质粒载体pET28a(+)用限制性内切酶BamHⅠ和NotⅠ双酶切并连接转化至E.coli JM109感受态细胞中。提取转化子中重组质粒pET28a(+)-xyn，将此重组质粒转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞，获得重组E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)-xyn。

实施例2

将重组大肠杆菌接种于含有100μg·mL^-1硫酸卡那霉素的LB培养基(氯化钠10，胰蛋白胨10，Yeast Extract 5，pH 7)中，200r·min^-137℃培养10h，然后以2％(v·v^-1)接种量转接至50mL新鲜培养基中，添加诱导剂IPTG至0.1mmol·L^-1，诱导5h后取样10mL，8000r·min^-1离心10min收获细胞。测定细胞内外酶活情况，此时细胞内酶活达1.05U·mL^-1，胞外酶活为0.01U·mL^-1。

实施例3

在pH 6的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液中，45～85℃范围内，每隔5℃，测定木聚糖酶酶活，确定最适反应温度为65℃。在最适反应温度条件下，pH 5～7.5范围内，每隔0.5，测定酶活，确定最佳反应pH为6～6.5。

温度稳定性：将酶液在pH为6.5时分别在50、55、60、65、70℃中处理不同时间，冷却后在最佳反应温度下测定剩余酶活，以未处理的酶活为100％。

pH稳定性：将酶液浓缩后以相同的稀释倍数分别稀释到pH 3.5、4.5、5.5、6.5、7.5、8.5、9.5，4℃放置5h，然后在最佳反应条件下测定剩余酶活，以未处理的酶活为100％。

结果显示，木聚糖酶在pH3.5-9.5酶活性保持在80％以上，具有良好的pH稳定性。

实施例4

在重组菌E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)-xyn菌体量OD₆₀₀达到1.1时添加诱导剂IPTG至0.1mmol·L^-1，并于25℃诱导6h，测定细胞内外酶活情况，此时细胞内酶活达0.89U·mL^-1，胞外酶活为0.04U·mL^-1。

实施例5

在重组菌E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)-xyn菌体量OD₆₀₀达到1.5时添加诱导剂IPTG至0.1mmol·L^-1，并于25℃诱导6h，测定细胞内外酶活情况，此时细胞内酶活达0.81U·mL^-1，胞外酶活为0.02U·mL^-1。

实施例6

在重组菌E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)-xyn菌体量OD₆₀₀达到0.8时添加诱导剂IPTG至0.1mmol·L^-1，并于25℃诱导6h，测定细胞内外酶活情况，此时胞内酶活达0.65U·mL^-1，胞外酶活为0.08U·mL^-1。

实施例7

在重组菌E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)-xyn菌体量OD₆₀₀约为1.1时添加诱导剂IPTG至0.1mmol·L^-1，并于20℃诱导6h，测定细胞内外酶活情况，此时，胞内酶活为1.27U·mL^-1，胞外酶活为0.02U·mL^-1。

实施例8

在重组菌E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)-xyn菌体量OD₆₀₀约为1.1时添加诱导剂IPTG至0.1mmol·L^-1，并于20℃诱导4h，测定细胞内外酶活情况，此时，胞内酶活为0.93U·mL^-1，胞外酶活为0.01U·mL^-1。

实施例9

在重组菌E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)-xyn菌体量OD₆₀₀约为1.1时添加诱导剂IPTG至0.1mmol·L^-1，并于20℃诱导12h，测定细胞内外酶活情况，此时，胞内酶活为1.22U·mL^-1，胞外酶活为0.12U·mL^-1。

实施例10

在重组菌E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)-xyn菌体量OD₆₀₀约为1.1时分别添加诱导剂IPTG0.1mmol·L^-1，于20℃诱导9h，测定细胞内外酶活变化情况，结果显示，胞内酶活为1.31U·mL^-1，胞外酶活为0.02U·mL^-1。

实施例11

在重组菌E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)-xyn菌体量OD₆₀₀约为1.1时分别添加诱导剂IPTG0.7mmol·L^-1，于20℃诱导9h，测定细胞内外酶活变化情况，结果显示，胞内酶活为1.36U·mL^-1，胞外酶活为0.05U·mL^-1。

实施例12

在重组菌E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)-xyn菌体量OD₆₀₀约为1.1时分别添加诱导剂IPTG0.9mmol·L^-1，于20℃诱导9h，测定细胞内外酶活变化情况，结果显示，胞内酶活为1.25U·mL^-1，胞外酶活为0.08U·mL^-1。

实施例13

在重组菌E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)-xyn菌体量OD₆₀₀约为1.1时分别添加诱导剂IPTG0.4mmol·L^-1，于20℃诱导9h，测定细胞内外酶活变化情况，并以未诱导的重组菌为对照。结果显示，诱导后的重组菌胞内酶活为1.46U·mL^-1，比酶活为2.84U·mg^-1，胞外酶活为0.04U·mL^-1。不添加诱导剂IPTG时重组菌具有微量木聚糖酶酶活，胞内酶活0.02U·mL^-1，胞外酶活0.01U·mL^-1；添加诱导剂IPTG后重组菌木聚糖酶胞内酶活是未诱导的73倍(图2)。

实施例14

取1mL的1％(w·v^-1)山毛榉木聚糖(溶解于20mmol·L^-1磷酸钠缓冲液)分别与1mL初始酶活1U或10U的重组木聚糖酶反应不同时间，立即煮沸灭活10min，8000r·min^-1离心10min，0.22μm滤膜过滤，采用HPLC法检测生成的木糖、木二糖、木三糖、木四糖、木五糖含量(图3)，结果显示，重组木聚糖酶可以降解山毛榉木聚糖为寡聚糖和单糖木糖，从反应开始就有较多单糖生成，且反应初始产物以木糖和木三糖为主，随着反应的进行木三糖逐渐被降解，产物最终以木糖和木二糖为主，反应3h后分别占总还原糖含量的52.7％和43.2％。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。