本发明属于微生物制剂技术领域，具体涉及一种溶解池塘甲藻的蜡样芽孢杆菌JZBC1的工业化液体发酵方法。
背景技术：
近年来水域环境的甲藻赤潮频发，养殖水源环境的污染日趋恶化，这严重影响了池塘养殖生产的健康发展。有研究表明当池塘水体形成以甲藻、蓝藻等有害微藻为优势时，养殖水质恶化，养殖对虾的生长和健康水平受到严重影响(刘孝竹,2011)；当甲藻浓度升高到104cells/L时，致使对虾行为异常并逐渐死亡(Linares,2009)。而南方海水或咸淡水池塘在养殖前中期容易形成以甲藻为优势的微藻群落结构，在此环境下养殖对虾极易发生病害，严重影响了养殖效益(彭聪聪,2011；刘孝竹,2009)。所以，严格控制甲藻的生态优势，稳定养护以绿藻或硅藻为优势的微藻环境，对保障池塘养殖生产顺利开展具有重要的现实意义。目前在甲藻防控领域的研究主要集中在对海湾赤潮(Mayali,2007；Rooney,2005)及相关有害藻特性与治理(谢志浩,2008)，以及相应溶藻菌的分离筛选与溶藻机制分析等(Yang et al,2013；Shi et al,2013)。养殖池塘环境与上述水环境差异巨大，有关利用溶藻菌防控池塘甲藻优势并维护优良微藻藻相的研究及应用还少见报道。近年来报道的微藻溶藻菌种类主要有：芽孢杆菌、海洋杆菌、屈挠细菌、假单胞菌、弧菌、噬胞菌、黄杆菌、节杆菌、葡萄球菌、鞘氨醇单胞菌等。史荣君(2013)、Yang(2013)等从赤潮环境中筛选了可有效溶解赤潮硅藻和甲藻的溶藻菌菌株，它们属于芽孢杆菌、海洋杆菌等多个菌种。
本申请中的溶藻菌株JZBC1为蜡样芽孢杆菌(保藏名称为蜡样芽孢杆菌JZBC1，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉，保藏日期：2016年3月3日，保藏号：CCTCC M 2016081，申请号：201610209371.X)，它仅对池塘优势甲藻——锥状斯氏藻具有溶解消除作用，对小球藻、栅藻、小环藻等优良绿藻和硅藻无不良影响。
蜡样芽孢杆菌广泛存在于环境中，为革兰氏阳性菌，其非毒性菌株可净化养殖水质，促进养殖生物健康生长，已被应用于医药、农业生产等领域(李煜等，2012；李侠等，2001)。曹煜成等在养殖池塘施用蜡样芽孢杆菌CZBC1菌剂，有效控制了颤藻、微囊藻等有害蓝藻，而对养殖对虾和水体其他优良绿藻和硅藻没有影响(曹煜成等，ZL201310 203745.3)；阳钢等使用蜡样芽孢杆菌BC-1有效提高了刺参的生长速度(阳钢等，2012)；何鉴尧等研究发现蜡样芽孢杆菌L7和L8对螺旋鞘丝藻有显著地控制效果(何鉴尧等，2008)。王善龙研究指出虽然对虾养殖水体中也存在蜡样芽孢杆菌，但只有施用了蜡样芽孢杆菌CZBC1的养殖水环境中的蓝藻数量才得到有效控制(王善龙，2015)。可见，即使是同属于蜡样芽孢杆菌，但不同来源的菌株其生态功能特性存在较大的差异。
虽然就芽孢杆菌发酵工艺、溶藻菌发酵条件优化等已有报道(王海云等，一株蜡样芽胞杆菌及其制备方法应用，申请号201410223612.7；朱杰等，芽孢杆菌属溶藻菌的固体发酵与应用，申请号201210308126.6；孙梅等，一种巨大芽孢杆菌及其固体发酵制备菌剂的方法和应用，申请号201310413693.2；荣小军等，一种蜡样芽孢杆菌及其制剂和应用，申请号201010602326.3；叶姜瑜等，响应曲面法优化溶藻细菌发酵条件的研究，2011；许珂等，溶藻细菌W5培养条件优化及发酵培养)。但目前针对蜡样芽孢杆菌JZBC1菌剂的工业化发酵生产方法还未见报道。由于蜡样芽孢杆菌不是所有菌株都具有溶解池塘甲藻的特性，而上述研究中的溶藻菌也非本申请中的蜡样芽孢杆菌或类似的溶藻菌株，也未见相关菌剂的工业化生产产品。所以，本申请拟在溶解池塘优势甲藻—锥状斯氏藻的蜡样芽孢杆菌菌株JZBC1的工业化液体发酵方法方面进行研究。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种溶解池塘甲藻的蜡样芽孢杆菌JZBC1的工业化液体发酵方法，该方法通过研究蜡样芽孢杆菌JZBC1的发酵培养基和发酵参数，建立了将菌剂从菌种到产品的工业化规模生产的相关工艺。
本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：一种溶解池塘甲藻的蜡样芽孢杆菌JZBC1的工业化液体发酵方法，包括以下步骤：
(1)确定蜡样芽孢杆菌JZBC1的工业化发酵罐培养的发酵培养基；
(2)种子液培养：选取蜡样芽孢杆菌JZBC1，在恒温振荡条件下进行活化培养，获得发酵种子液；
(3)工业化发酵罐培养：依照50L—500L—5000L的发酵罐规模，将发酵种子液接入发酵培养基中逐级进行扩大发酵，获得发酵液，其中，50L和500L发酵罐的发酵菌浓度均达到5.0×108～109cfu/mL以上，5000L发酵罐的最终菌浓度达到5.0×109～1010cfu/mL以上，芽孢获得率90～95％以上；
(4)菌泥后处理与包装：采用离心机除去步骤(3)所得发酵液中的多余水分，获得菌泥，将菌泥与载体混匀，经包括干燥、粉碎和包装工序处理后，获得溶解池塘甲藻的蜡样芽孢杆菌JZBC1制剂。
在上述溶解池塘甲藻的蜡样芽孢杆菌JZBC1的工业化液体发酵方法中：
步骤(1)中所述的发酵培养基为：1L水中含有玉米浆18.5～24.5g、大豆蛋白12～20g、NaCl 0.8～1.5g、KH2PO4 0.15～0.4g、MgSO4 0.15～0.4g、CaCl2 0.1～0.3g、质量百分含量为3％的MnSO4溶液1mL。
进一步的，步骤(1)中所述的发酵培养基为：1L水中含有玉米浆20g、大豆蛋白13.5g、NaCl 1g、KH2PO4 0.2g、MgSO4 0.2g、CaCl2 0.1g，质量百分含量为3％的MnSO4溶液1mL。
在此条件下菌株的生长、芽孢形成率和发酵菌体的甲藻溶藻效率最佳。
步骤(2)中的蜡样芽孢杆菌JZBC1，该菌株为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)，保藏名称为蜡样芽孢杆菌JZBC1，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉，保藏日期：2016年3月3日，保藏编号：CCTCC No：M 2016081。具体内容可参阅申请号为201610209371.X的专利申请。
步骤(2)在恒温振荡条件下进行活化培养时，活化培养基为营养肉汤培养基(优选是营养肉汤液体培养基，市售产品，本申请购自广东环凯微生物科技有限公司，此处仅为列举，并非限定)，培养条件优选为：pH 6.00～7.50，170～240rpm，28～32℃恒温振荡培养18～30h。
步骤(3)中各发酵罐使用前经灭菌处理，发酵培养基的体积占各发酵罐总容积的60～75％。
灭菌处理时，优选开启加热设备对发酵罐及管道系统进行灭菌(温度121℃，时间18～24min)，待罐体冷却至28～30℃，在50L发酵罐中接种入JZBC1发酵种子液。
步骤(3)中首先将发酵种子液接种入50L发酵罐中，发酵种子液的接种量占发酵培养基总体积的2.5～5.5％，再依照50L发酵罐—500L发酵罐—5000L发酵罐的流程，进行逐级放大发酵，发酵条件为pH 6.8～7.5，温度28～32℃，转速450～700rpm，通气量20～60L/min，发酵培养16～28h。每级发酵时的条件均保持基本一致。
其中500L发酵罐发酵时，将50L发酵罐中的发酵液全部接种入500L发酵罐中，5000L发酵罐发酵时，将500L发酵罐中的发酵液全部接种入5000L发酵罐。
50L发酵罐—500L发酵罐发酵结束后，对发酵液取样进行显微镜检测，保证发酵液未受到污染，菌量达到5.0×108cfu/mL～109cfu/mL以上。
步骤(3)中依照50L—500L—5000L的发酵规模，进行逐级扩大发酵，各级发酵的操作要求同上所述，5000L发酵罐的最终菌浓度达到5.0×109cfu/mL～1010cfu/mL以上，芽孢获得率90％～95％以上。
对步骤(3)的最终发酵液进行抽检，检测发酵菌体的甲藻溶藻效率，以池塘优势甲藻—锥状斯氏藻为测试藻，藻液的初始藻细胞浓度设为1.0×104cell/mL，依照105cfu/mL的菌浓度将发酵菌体添加至藻液中，当锥状斯氏藻5d内的死亡率达到90％以上时视为甲藻溶藻性能合格，保证发酵获得的菌体保持良好的甲藻溶藻特性。
步骤(4)中优选按单机单次装载量为3～6kg将发酵液引入离心机，设定离心机转速设为10000～14000rpm，离心40～50min，获得菌量超过1010cfu/mL的菌泥。
步骤(4)中所述载体优选为麸皮，菌泥和麸皮的质量份配比为1：3～5，干燥在63～75℃下用流化床干燥，使得物料的水分含量达到8％以下。
最后以孔径80～120目的规格用粉碎机进行粉碎，再按浓度109个/g用真空密封包装。然后随机抽取包装好的菌剂产品，进行甲藻溶藻功效复查，复查程序和溶藻指标要求同上文所述，确保菌泥后处理加工过程对菌株的生长及溶藻特性无不良影响。
步骤(4)中对获得的获得溶解池塘甲藻的蜡样芽孢杆菌JZBC1制剂进行随机抽检，抽检芽孢含量、菌体生长情况和甲藻溶藻情况，制剂中菌浓度达到5.0×109～1010cfu/mL以上，芽孢获得率达到90～95％以上，以池塘优势甲藻—锥状斯氏藻为测试藻，藻液的初始藻细胞浓度设为1.0×104cell/mL，依照105cfu/mL的菌浓度将发酵菌体添加至藻液中，当锥状斯氏藻5d内的死亡率达到90％以上时，视为合格产品，确保蜡样芽孢杆菌JZBC1经过各项工序处理后仍然保持良好的生长性能和甲藻溶藻特性。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
(1)本发明方法实现了对优选水产养殖池塘甲藻溶藻菌——蜡样芽孢杆菌JZBC1的工业化液体发酵生产，建立了将菌剂从菌种到产品的工业化规模生产的相关工艺，实现了甲藻溶藻菌在水产养殖业的产业化应用；
(2)本发明针对发酵环节实行多次抽样检测，在保证发酵菌体保持甲藻溶藻性能的前提下，获得高纯度的发酵菌剂，并且菌剂仅对池塘优势甲藻具有溶解专一性，对养殖对虾和水体中的优良绿藻和硅藻无不良影响，可安全用于池塘养殖生产应用。
附图说明
图1是JZBC1菌剂在灭菌池塘水体的生长曲线。
具体实施方式
以下实施例用于阐明与实施本发明，属于发明的保护范围，本技术领域的普通技术人员根据以上公开的内容均可实现本发明的目的。
实施例1
菌剂的工业化液体发酵参数的确立
利用50L发酵罐系统平台研究确立菌剂工业化液体发酵工艺参数。以蜡样芽孢杆菌JZBC1的生长速率、芽孢形成率、发酵菌剂的溶藻效率为评估指标，建立和优化发酵参数。所获得的相关发酵参数即可应用于50L-500L-5000L的逐级发酵系统平台进行JZBC1菌株的工业化扩大发酵培养。
首先，利用单因素试验方法，在基础发酵培养基的基础上，选取不同的碳源(蔗糖、葡萄糖+蔗糖、可溶性淀粉、糖蜜、玉米浆、麸皮、麸皮+糖蜜、可溶性淀粉+玉米浆)等量替代基础培养基中的葡萄糖；再以不同的氮源(酵母膏、蛋白胨+酵母膏、硫酸铵、豆粕、大豆蛋白、豆粕+大豆蛋白)等量替代基础培养基中的蛋白胨，分析不同种类的培养基配方对蜡样芽孢杆菌JZBC1的影响，并结合工业化发酵生产的具体要求建立优化培养基配方。
其次，在单因素试验的基础上，将玉米浆(碳源)、大豆蛋白(氮源)、pH、接种量、转速、温度、装液量等7个因素作为测试变量，测试次数设为12，进行参数优化分析。
结果表明，1L水中含有玉米浆18.5～24.5g、大豆蛋白12～20g、NaCl 0.8～1.5g、KH2PO4 0.15～0.4g、MgSO4 0.15～0.4g、CaCl2 0.1～0.3g、质量百分含量为3％的MnSO4溶液1mL时，尤其是在1L水中含有玉米浆20g，大豆蛋白13.5g，NaCl 1g，KH2PO4 0.2g，MgSO40.2g，CaCl2 0.1g，质量浓度3％的MnSO4溶液1mL时，发酵16～28h得到的菌浓度达到5.0×109cfu/mL～1010cfu/mL以上，芽孢获得率90％～95％以上，以105cfu/mL的用菌浓度，锥状斯氏藻(初始密度104cells/mL)5d内的死亡率达到90％以上。
表1-表3的结果表明，培养基最佳为：1L水中含有玉米浆20g、大豆蛋白13.5g、NaCl 1g、KH2PO4 0.2g、MgSO4 0.2g、CaCl2 0.1g，质量百分含量为3％的MnSO4溶液1mL。
表1不同碳源对蜡样芽孢杆菌JZBC1的影响
表2不同氮源对蜡样芽孢杆菌JZBC1的影响
表3不同因素的数量水平对蜡样芽孢杆菌JZBC1的影响贡献
实施例2
在广州市花都区中国水产科学研究院南海水产研究所花都微生物工业发酵实验工厂进行了蜡样芽孢杆菌JZBC1工业化液体发酵生产应用，发酵系统为50L—500L—5000L的工业化液体发酵系统。
(1)蜡样芽孢杆菌JZBC1菌种用营养肉汤培养基液体培养基进行活化制备种子液，pH6.00～7.50，200～240rpm，28～32℃恒温振荡培养20～30h。
(2)发酵培养基配方为在1L水中含有玉米浆20g，大豆蛋白13.5g，NaCl 1g，KH2PO40.2g，MgSO4 0.2g，CaCl2 0.1g，质量百分含量为3％的MnSO4溶液1mL，依照以上配方按70％的装液量在发酵罐配制所需的培养基。
(3)开启加热设备对发酵罐进行灭菌(温度121℃，时间18～24min)，待罐体冷却至28～30℃，在50L发酵罐中接种合格的JZBC1种子液，种子液的接种体积占发酵培养基总体积的3％，发酵条件设定为pH 7.0，温度30℃，转速500rpm，通气量45L/min，发酵培养16～28h，对发酵液取样进行显微镜检测，菌量达到5.0×108cfu/mL～109cfu/mL以上，依照50L——500L——5000L的规模发酵流程，进行逐级扩大发酵，各级发酵的操作要求基本一致，5000L发酵罐的最终菌浓度为5.0×109cfu/mL～1010cfu/mL以上，芽孢获得率95％以上。
(4)对5000L发酵罐的发酵液进行抽检，以池塘优势甲藻—锥状斯氏藻为测试藻，藻液的初始藻细胞浓度设为1.0×104cell/mL，以105cfu/mL的菌浓度将菌体添加至藻液中，当锥状斯氏藻5d内的死亡率达到90％以上时视为甲藻溶藻性能合格。
(5)将5000L发酵罐的发酵菌液去除多余水分，按单机单次装载量为3～6kg引入离心机，转速设为10000～14000rpm，离心40～50min，获得菌量超过1010cfu/mL的菌泥；菌泥和麸皮按质量比1:3～1:5的比例进行搅拌混匀，在63～75℃下用流化床干燥，使得水分含量达到8％以下；最后以孔径80～120目的规格用粉碎机进行粉碎，再按109个/g浓度用真空密封包装。
(6)随机抽取包装好的菌剂产品，进行芽孢含量、菌体生长情况、甲藻溶藻功效等检测，制剂中菌浓度达到5.0×109～1010cfu/mL以上，芽孢获得率达到90～95％以上，以池塘优势甲藻—锥状斯氏藻为测试藻，藻液的初始藻细胞浓度设为1.0×104cell/mL，依照105cfu/mL的菌浓度将发酵菌体添加至藻液中，当锥状斯氏藻5d内的死亡率达到90％以上时，视为合格产品，确保蜡样芽孢杆菌JZBC1经过各项加工过程后仍然保持良好的生长性能和甲藻溶藻特性。
结果显示，菌剂中的芽孢在灭菌池塘水体环境能萌发复活生长(图1)。其次，在加入菌剂的微藻培养系统中，锥状斯氏藻的藻细胞数量在第6天时减少了98.3％，而未加菌的对照组锥状斯氏藻数量则增加了1.1倍；而在小环藻培养液中，加菌组的小环藻数量由4.7×105cell/mL下降到4.1×105cell/mL，仅减少了12.8％；加菌组的小球藻数量则由3.3×106cell/mL上升到2.9×107cell/mL，增加了7.8倍。可见，JZBC1菌在经过一系列发酵培养及后处理工艺制备成菌剂，它依然保持了对池塘优势甲藻—锥状斯氏藻的溶藻专一性，对绿藻和硅藻等有益微藻无明显影响。
实施例3
与实施例2不同的是，发酵培养基的配方为：1L水中含有玉米浆18.5g、大豆蛋白0g、NaCl 0.8g、KH2PO4 0.4g、MgSO4 0.15g、CaCl2 0.3g、质量百分含量为3％的MnSO4溶液1mL。
实施例4
与实施例2不同的是，发酵培养基的配方为：1L水中含有玉米浆24.5g、大豆蛋白12g、NaCl 1.5g、KH2PO4 0.15g、MgSO4 0.4g、CaCl2 0.1g、质量百分含量为3％的MnSO4溶液1mL。
实施例5
以汕头养殖实验基地对虾养殖初期的池塘水体为本底，利用纯培养的锥状斯氏藻、蛋白核小球藻、条纹小环藻的藻液，调配养殖水体的微藻群落结构，使得上述各种微藻细胞的初始浓度稳定在104cell/mL的数量水平。其中，加菌组JZBC1菌剂(实施例2制备获得)的初始添加浓度设定为104cfu/mL～105cfu/mL，对照组养殖水体不施加JZBC1。自然条件下培养14d，各培养桶的水体容积为100L，每组设4个平行，培养过程中以充气方式为水体增氧，光照强度2000～7800lx。每24h取样以显微镜检测水体中的锥状斯氏藻、蛋白核小球藻、条纹小环藻的数量。结果表明，JZBC1加菌组2～3d内可令水体中的锥状斯氏藻数量由初始的104cell/mL大幅减少至32～50，测试结束时水体中蛋白核小球藻的数量则明显升高至106cell/mL～107cell/mL，条纹小环藻的数量无明显变化，而对照组中的锥状斯氏藻数量始终维持在104cell/mL～105cell/mL数量水平。可见，JZBC1可有效去除锥状斯氏藻，促进水体形成以蛋白核小球藻、条纹小环藻等优良绿藻和硅藻为优势的微藻环境。
表4测试结束时各试验组的微藻数量 单位(cells/mL)
本发明不局限于上述特定的实施方案范围内，上述实施方案仅仅是为了能够对本发明的使用过程进行详细地说明，而且有相等功能的生产方法和技术细节也属于本发明内容的一部分。事实上，本领域技术人员根据前文的描述，就能够根据各自需要找到不同的调整方案，这些调整都应在所附的权利要求书的范围内。