本发明涉及微生物领域中一种光合细菌菌剂及其制备方法与应用。
背景技术：
：光合细菌(PhotosyntheticBacteria，简称PSB)是自然界最广泛存在的比较古老的、能进行光合作用而不产氧的特殊生理类群的原核微生物的总称，具有原始光能合成体系，能在厌氧条件下进行不放氧的光合作用，是水体兼性厌氧层中主要的初级生产者，并在自然界的碳素、氮素、硫素转化循环中起重要作用。它包括有红螺菌科(Phodospirillaceae)、着色菌科(Chromati-aceae)、绿杆菌科(Chlorobiaceae)、绿色丝状菌科(Chlo-roflexaceae)4科。沼泽红假单胞菌是光合细菌的代表菌株之一，属于红螺菌科、红假单胞菌属，是我国农业部颁布12种允许在饲料中直接添加的活体微生物之一。根据国家农用微生物菌剂标准GB20287-2006，液体光合细菌菌剂的有效活菌数标准为≥2.0亿/ml,保质期≥3个月。培养基的组成和配比对沼泽红假单胞菌的繁殖速度和保藏期长短均有重要的影响。现有的研究表明沼泽红假单胞菌在酵母膏存在的条件下菌体繁殖增快(张玲华,邝哲师,陈薇,等高活性光合细菌沼泽红假单胞菌培养特性初探[J].华南师范大学学报(自然科学版),2001(4):37–391)。菌种是菌剂生产应用的基础。目前，限制沼泽红假单胞菌菌剂发展的瓶颈就是高效菌种的选育问题和沼泽红假单胞菌菌剂的制备和保藏问题。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题是提供一种制备成本低(菌株生长速度快)、保质期长、既能提高鸡生产性能又能提高鸡免疫功能和鸡肉品质的光合细菌菌剂及其制备方法。为了解决以上技术问题，本发明提供了一种光合细菌菌剂。本发明所提供的光合细菌菌剂的活性成分是沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)，所述沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)的菌株号为981，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCCNo.10802，以下简称沼泽红假单胞菌981。所述光合细菌菌剂具体可由沼泽红假单胞菌981和载体组成；所述载体具体可为稻壳粉、脱脂奶粉、麦芽糊精和麸皮中的至少一种。本发明所提供的光合细菌菌剂的制备方法，包括将沼泽红假单胞菌981在微生物培养基中培养得到沼泽红假单胞菌981，将培养得到的沼泽红假单胞菌981作为光合细菌菌剂的活性成分，得到光合细菌菌剂。上述制备方法中，所述微生物培养基可为发酵培养基B，所述发酵培养基B由水和溶质组成，所述溶质由豆芽汁和NaCl组成，所述豆芽汁是用水从豆芽中提取得到的水溶性物质；所述发酵培养基B中NaCl的含量为0.02-0.1g/L(如0.05g/L)，豆芽汁的含量以豆芽计是50-150g/L(如100g/L)。上述制备方法中，所述用水从豆芽中提取可为用水将豆芽煮沸30分钟。上述制备方法中，所述水可为蒸馏水或去离子水。上述制备方法中，所述豆芽可为黄豆芽。本发明所提供的光合细菌菌剂的制备方法，包括将沼泽红假单胞菌981在所述发酵培养基B中培养，收集培养容器内的物质，得到所述光合细菌菌剂。上文中，所述培养可在20-37℃(如28-37℃或30℃)每天24小时的光照强度为1000-1500Lx(1200-1500Lx或1500Lx)的光照条件下培养3天-10天(如3-7天或3天)。由上述任一种制备方法制备的光合细菌菌剂也属于本发明的保护范围。含有上述光合细菌菌剂的动物饲料也属于本发明的保护范围。上述含有光合细菌菌剂的动物饲料中，所述含有光合细菌菌剂的动物饲料由鸡普通饲料和所述光合细菌菌剂组成；所述鸡普通饲料不含有所述光合细菌菌剂。上述含有光合细菌菌剂的动物饲料中，所述光合细菌菌剂和所述鸡普通饲料的配比满足2.5×107-5×107cfu(菌落形成单位)沼泽红假单胞菌981：100g所述鸡普通饲料。上述含有光合细菌菌剂的动物饲料中，所述光合细菌菌剂和所述鸡普通饲料的具体配比满足2.5×107cfu沼泽红假单胞菌981：100g所述鸡普通饲料。上述含有光合细菌菌剂的动物饲料中，所述鸡普通饲料除不含有上述光合细菌菌剂外，其它原料均可与鸡常规饲料相同，如含有能量饲料、蛋白质饲料、矿物质饲料和维生素饲料；进一步，所述鸡普通饲料还可含有抗氧化剂。所述鸡普通饲料可由能量饲料、蛋白质饲料、矿物质饲料和维生素饲料组成，也可由能量饲料、蛋白质饲料、矿物质饲料、维生素饲料和抗氧化剂组成，当然，还可以在所述鸡普通饲料中再加入防腐剂、着色剂、调味剂、药物保健剂、生长促进剂等非营养性添加剂。所述能量饲料可为常用的鸡能量饲料，如可选自下述物质中的至少一种：谷实、糠麸、薯、草籽和树实等。所述蛋白质饲料可为常用的鸡蛋白质饲料，如可选自下述物质中的至少一种：大豆粕、棉籽粕、玉米胚芽粕、肉骨粉、菜籽粕、花生粕和葵粕等。所述矿物质饲料可选自石粉、碳酸氢钙、食盐、贝壳粉、骨粉、磷酸氢钙、碳酸钙、食盐、硫酸铜、硫酸亚铁、硫酸锰、碘化钾、氧化锌、亚硒酸钠和氯化钴等。所述维生素饲料可为常用的维生素饲料，如可选自下述物质中的至少一种：维生素A，维生素D3，维生素E，维生素K3，维生素B1g，维生素B2，维生素B6，维生素B12，烟酸，D-泛酸钙，生物素，氯化胆碱所述抗氧化剂可为维生素E(α-生育酚)或丁基羟基茴香醚(BHA)。上述光合细菌菌剂、上述制备方法或上述动物饲料在制备提高鸡免疫性能和/或提高鸡生产性能和/或提高鸡肉品质的产品中的应用也属于本发明的保护范围。所述产品可为微生态制剂或动物饲料。上述光合细菌菌剂、上述制备方法或上述动物饲料在提高鸡生产性能和/或提高鸡肉品质和/或提高鸡免疫性能中的应用也属于本发明的保护范围。上述提高鸡免疫性能可为下述I1)-I5)中的全部或部分：I1)提高肉鸡胸腺指数；I2)提高肉鸡脾脏指数；I3)提高肉鸡法氏囊指数；I4)提高肉鸡红细胞C3b受体花环率；I5)提高肉鸡红细胞免疫复合物花环率；所述生产性能为下述P1)-P6)中的全部或部分：P1)出栏率；P2)肉料比；P3)蛋白质的表观消化率；P4)钙的表观消化率；P5)磷的表观消化率；P6)体重；所述提高鸡肉品质为下述Q1)-Q8)中的全部或部分：Q1)提高鸡肉的缬氨酸含量；Q2)提高鸡肉的蛋氨酸含量；Q3)提高鸡肉的苯丙氨酸含量；Q4)提高鸡肉的胱氨酸含量；Q5)提高鸡肉的酪氨酸含量；Q6)提高鸡肉的粗蛋白含量；Q7)降低鸡肉的胆固醇含量；Q8)降低鸡肉的脂肪含量。本发明还提供了一种提高鸡生产性能和/或改善鸡肉品质和/或提高鸡免疫性能的方法。本发明所提供的提高鸡生产性能和/或改善鸡肉品质和/或提高鸡免疫性能的方法，包括用含光合细菌菌剂日粮饲喂鸡；所述含光合细菌菌剂日粮由鸡普通日粮和所述光合细菌菌剂组成；所述鸡普通日粮不含有所述光合细菌菌剂。所述含光合细菌菌剂日粮中，所述光合细菌菌剂和所述鸡普通日粮的配比为满足2.5×107-5×107cfu(菌落形成单位)所述沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)：100g所述鸡普通日粮。上文中，所述动物可为鸡。所述鸡可为肉鸡，如艾维茵肉鸡或爱拔益加肉鸡。上文中，所述鸡可为雏鸡。本发明光合细菌菌剂的活性成分沼泽红假单胞菌981繁殖速度快，在豆芽汁培养基(发酵培养基B)中在30℃、每天24小时的光照强度为1500Lx的光照条件下培养3天菌体含量(有效活菌数)达2.03×1010cfu/ml，在含酵母提取物培养基(发酵培养基A)中在30℃、每天24小时的光照强度为1500Lx的光照条件下培养3天菌体含量(有效活菌数)达8.37×109cfu/ml。本发明光合细菌菌剂在豆芽汁培养基(发酵培养基B)中在20℃在每天24小时的光照强度为500Lx的光照条件下保质期达120天，本发明光合细菌菌剂在该条件下保藏120天后，沼泽红假单胞菌981的含量是26.625×109cfu/ml，是保藏0天的1.31倍。本发明光合细菌菌剂既能提高下述I1)-I5)这5种鸡免疫性能，又能提高下述Q1)-Q8)这8种鸡肉品质，又能提高下述P1)-P6)这6种生产性能：I1)提高肉鸡胸腺指数；I2)提高肉鸡脾脏指数；I3)提高肉鸡法氏囊指数；I4)提高肉鸡红细胞C3b受体花环率；I5)提高肉鸡红细胞免疫复合物花环率；P1)出栏率；P2)肉料比；P3)蛋白质的表观消化率；P4)钙的表观消化率；P5)磷的表观消化率；P6)体重；Q1)提高鸡肉的缬氨酸含量；Q2)提高鸡肉的蛋氨酸含量；Q3)提高鸡肉的苯丙氨酸含量；Q4)提高鸡肉的胱氨酸含量；Q5)提高鸡肉的酪氨酸含量；Q6)提高鸡肉的粗蛋白含量；Q7)降低鸡肉的胆固醇含量；Q8)降低鸡肉的脂肪含量。保藏说明菌种名称：沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)菌株编号：981保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏机构简称：CGMCC地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号保藏日期：2015年5月11日保藏中心登记入册编号：CGMCCNo.10802具体实施方式下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981CGMCCNo.10802的分离鉴定1.1菌株分离从中国江苏省无锡市的一个水池中采集水样。采用vanNeil紫色非硫细菌富集培养基进行富集培养，先后富集三次，直到培养基中光合细菌成为优势菌群。将富集以后的光合细菌样品分别在光合细菌分离固体培养基上划线分离单菌落，28℃厌氧罐内光照培养24小时。将平板上的单菌落挑出到液体光合细菌分离培养基中继续培养。并重复以上的步骤，得到纯化的菌株。取编号为981的菌株(菌株981)进行下述鉴定。其中，vanNeil紫色非硫细菌富集培养基的配制方法如下:NH4Cl0.1g，NaCl0.2g，NaH2P040.05g，MgCl20.02g，酵母膏0.15g，将以上各组分溶解于100ml水，121℃蒸汽灭菌20min，制成基础培养基。在该基础培养基中加入过滤除菌的10％NaHCO3水溶液50ml，过滤除菌的乙醇1.5ml，用过滤除菌的磷酸调pH值7.0。光合细菌分离培养基的配制方法如下:乙酸钠3.0g，丙酸钠0.3g，NaCl1.0g，(NH4)2SO40.3g，MgSO40.2g，KH2P040.5g，K2HSO40.3g，CaC1250mg，MnSO42.5mg，FeSO45mg，酵母膏0.1g，蛋白胨10mg，谷氨酸0.2mg，水1000ml，pH7.4。将以上组分溶于水后调pH，然后121℃蒸汽灭菌30min，如果配置固体培养基则在以上的成分中加入17g琼脂再蒸汽灭菌，倾倒平板，做无菌检测后用于分离单菌落。1.2菌株鉴定菌株981菌体杆状，偶有微弯，大小为0.5-0.8×1.0-2.5um，端生单鞭毛运动的光能异养菌。革兰氏阴性，光合内膜系统呈片层状。光照厌氧条件下培养物为深红色，黑暗好氧则为浅红色，老龄菌聚集成玫瑰花状。对氨基苯甲酸为必需生长因子。该菌具有菌绿素a和标准紫红醚系的类红萝卜素，能利用甲酸盐、乙酸盐、丙酮酸、乳酸盐、琥珀酸盐、丙三醇、天冬氨酸、苯甲酸盐、硫代硫酸钠以及氢气等小分子有机物为光合作用的电子供体，不能利用单糖、糖醇和硫化物。生长pH范围5.5-8.5，最适pH6.8-7.0。生长温度范围20-37℃，最适温度范围28-37℃。菌株981的16SrRNA基因序列如序列表中的序列1所示，与沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)的同源性最高，达到99％。因此，综合以上特征确定菌株981为沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)。沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981已于2015年05月11日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.10802。实施例2、沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981CGMCCNo.10802的培养本实施例采用发酵培养基A和发酵培养基B这两种培养基培养沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981CGMCCNo.10802。发酵培养基A是目前认为最适合沼泽红假单胞菌的含酵母提取物的培养基，培养基B是本发明的发明人筛选到的培养基。发酵培养基A的配制方法如下：将胰蛋白胨3.0g，酵母浸粉3.0g，CaCl20.3g和MgSO4·7H2O0.5g溶于蒸馏水后，用蒸馏水定容至1000mL，然后121℃蒸汽灭菌30min，得到培养基A。发酵培养基B的配制方法如下：将100g(鲜重)黄豆芽用蒸馏水煮沸30分钟，过滤收集全部滤液，该滤液即为豆芽汁，向全部豆芽汁中加入0.05gNaCl，用蒸馏水定容至1000mL，然后121℃蒸汽灭菌30min，得到培养基B。其中，黄豆芽由胚根、胚芽、胚轴和子叶组成，胚根长度为1-2cm。1、菌种的活化挑取沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981CGMCCNo.10802，对其用优选固体培养基进行斜面穿刺培养，保持温度30℃光照强度为1200Lx条件下培养10d。优选固体培养基是在发酵培养基A中加入琼脂得到的固体培养基，具体配制方法如下：将胰蛋白胨3.0g，酵母浸粉3.0g，CaCl20.3g、MgSO4·7H2O0.5g和17g琼脂溶于蒸馏水后，用蒸馏水定容至1000mL，然后121℃蒸汽灭菌30min，得到优选固体培养基。2、制备种子液将步骤1活化的沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981CGMCCNo.10802接种于装有实施例2的发酵培养基A的无菌蓝盖试剂瓶(螺纹口的透明玻璃瓶)中，拧紧蓝盖，在30℃、每天24小时的光照强度为1200Lx的光照条件下培养5天，得到沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981CGMCCNo.10802种子液。3、发酵培养3.1利用发酵培养基B培养沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981CGMCCNo.10802将步骤2的沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981CGMCCNo.10802种子液10ml接入装有100ml发酵培养基B的100ml无菌蓝盖试剂瓶(螺纹口的透明玻璃瓶)中，拧紧蓝盖，在30℃、每天24小时的光照强度为1500Lx的光照条件下培养3天，得到沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981的发酵培养基B的发酵液(简称发酵液B)。实验重复三次，每次重复10个蓝盖试剂瓶。3.2利用发酵培养基A培养沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981CGMCCNo.10802该步骤与3.1的区别仅在于所用的发酵培养基不同，其它条件均相同，具体方法如下：将步骤2的沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981CGMCCNo.10802种子液10ml接入装有100ml发酵培养基A的100ml无菌蓝盖试剂瓶(螺纹口的透明玻璃瓶)中，拧紧蓝盖，在30℃、每天24小时的光照强度为1500Lx的光照条件下培养3天，得到沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981的发酵培养基A的发酵液(简称发酵液A)。实验重复三次，每次重复10个蓝盖试剂瓶。对3.1的沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981的发酵培养基B的发酵液和3.2的沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981的发酵培养基A的发酵液按照平板稀释计数法进行计数：量取10ml(精确到0.01ml)发酵液，放入内装90ml无菌水的三角瓶中，置摇床振荡30min，转速200r/min。振荡后静置20min制成1：10的均匀稀释液。采用10倍稀释法稀释。用灭菌吸管吸取1：10稀释液5ml，注入含有45ml无菌水的三角瓶中，制成1：100的稀释液，依次制成10倍递增稀释液。选取三个合适稀释度悬液各取0.1ml，加至直径为90mm的培养皿中，倒入45℃优选固体培养基，轻轻混匀，待凝固。每个稀释度重复三次。保持温度30℃光照强度为1200Lx条件下培养10d。计算菌数：菌体含量(cfu/ml)＝菌落平均数×稀释倍数×基础液体积/(样品量×加样量)。结果表明，沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981的发酵培养基A的发酵液中的菌体含量平均为8.37×109cfu/ml，沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981的发酵培养基B的发酵液中的菌体含量平均为2.03×1010cfu/ml，沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981的发酵培养基B的发酵液中的菌体含量是沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981的发酵培养基A的发酵液中的菌体含量的2.42倍。表1、不同发酵液的菌体含量实施例3、沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981CGMCCNo.10802增强肉鸡免疫功能和体重1、材料1.1、沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981菌剂的制备向实施例2的沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981的发酵培养基B的发酵液中加入稻壳粉在50℃进行干燥，得到沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981菌剂。该沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981菌剂中的沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981含量为1×109cfu/g。其中，稻壳粉事先经过微粉化处理(90％的粉体粒度小于100μm，平均粒径小于50μm，所述平均粒径为50％粉体粒径)。1.2、试验动物选择体重为50±5克的爱拔益加—快大型白羽肉鸡的1日龄健雏，随机均分为3个处理组，即对照组、菌剂Ⅰ组和菌剂Ⅱ组。每个处理组3个重复，每个重复300只鸡。1.3、日粮下述实施例中的肉鸡普通日粮的配方如表2所示。表2、肉鸡普通日粮组成及配比表2中，每千克预混料含:CuSO4·5H2O0.64g,FeSO4·H2O516g,ZnSO4·H2O4g,MnSO4·H2O318g,Na2SeO30.016g,VA16IU,VD3415IU,VE400IU,VK90mg,VB160mg,VB2200mg,烟酸550mg,泛酸钙220mg,叶酸12mg，其余为石粉。表2中的“％”为质量百分含量。肉鸡育雏期日粮分为肉鸡育雏期普通日粮、菌剂Ⅰ组育雏期日粮和菌剂Ⅱ组育雏期日粮。其中，肉鸡育雏期普通日粮如表2所示；菌剂Ⅰ组育雏期日粮是在表2的肉鸡育雏期普通日粮中添加是表2的肉鸡育雏期普通日粮质量的0.025％的沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981菌剂得到的日粮；菌剂Ⅱ组育雏期日粮是在表2的肉鸡育雏期普通日粮中添加是表2的肉鸡育雏期普通日粮质量的0.05％的沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981菌剂得到的日粮。肉鸡育成期日粮分为肉鸡育成期普通日粮、菌剂Ⅰ组育成期日粮和菌剂Ⅱ组育成期日粮。其中，肉鸡育成期普通日粮如表2所示；菌剂Ⅰ组育成期日粮是在表2的肉鸡育成期普通日粮中添加是表2的肉鸡育成期普通日粮质量的0.025％的沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981菌剂得到的日粮；菌剂Ⅱ组育成期日粮是在表2的肉鸡育成期普通日粮中添加是表2的肉鸡育成期普通日粮质量的0.05％的沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981菌剂得到的日粮。2、用沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981CGMCCNo.10802提高肉鸡免疫器官指数和红细胞免疫功能试验期28天，试验期间所有肉鸡自由采食和饮水，按照常规免疫程序进行免疫，各组除饲喂的日粮不同外，其它饲养条件完全相同。其中，对照组在第1-28日龄用表2的肉鸡育雏期普通日粮进行饲喂；菌剂Ⅰ组在第1-28日龄用菌剂Ⅰ组育雏期日粮进行饲喂；菌剂Ⅱ组在第1-28日龄用菌剂Ⅱ组育雏期日粮进行饲喂。分别于14日龄、21日龄、28日龄测定肉鸡的脾脏、胸腺和法氏囊指数。测定方法为：每个重复随机抽取20只鸡，早晨空腹称重，屠宰后摘取脾脏、法氏囊以及两侧胸腺，剔除脂肪后用电子天平称重，计算免疫器官指数。免疫器官指数＝免疫器官重(mg)/体重(g)。按照如下方法测定21日龄肉鸡红细胞C3b受体花环(E-C3bR)率和红细胞免疫复合物花环(E-ICR)率：每组每个重复随机抽取6只鸡，采血抗凝，离心取红细胞，配成1.25×107个/mL的红细胞悬液，作为待测红细胞悬液。将酵母菌用生理盐水洗涤3次后，配成1％悬液，置水浴内煮沸20min，充分混匀。用二层定性滤纸过滤，除去小凝块，在低倍镜下呈单个酵母菌细胞分散状态。加等量小白鼠血清，混匀后置37℃水浴致敏15min。用生理盐水洗涤一次，2500r/min离心10min。去尽上清，用生理盐水重混悬。计数后配成1×108/ml补体(C3)致敏的酵母菌悬液。按照如下步骤进行测定：(1)取两支小试管，每管加待测红细胞悬液100ul，第一管再加补体致敏酵母菌悬液100ul，第二管加未致敏的酵母菌悬液100ul，摇匀放37℃水浴30min；(2)取出用手腕轻轻摇匀，加生理盐水200ul；(3)混匀后，再加0.25％戊二醛75μl并轻轻混匀；(4)分别取1/3量水平涂片、吹干、加甲醇固定；(5)用瑞氏法染色，油镜下计数。涂片染色后RBC为红色，酵母菌为蓝色。红细胞上粘附2个或2个以上酵母菌者为花环。分别计数200个红细胞，算出花环阳性细胞百分率。第一管为RBC-C3b受体花环率，第二管为RBC-IC花环率。花环形成百分率(％)＝(红细胞花环数/200)×100。试验所有数据采用SPSS12.0(SPSSInc.，USA)统计软件的独立样本t检验处理统计。结果如表3所示，14日龄和21日龄时，菌剂Ⅰ组和菌剂Ⅱ组的脾脏指数均极显著高于对照组(P<0.01)；14日龄时，菌剂Ⅰ组和菌剂Ⅱ组的胸腺指数均极显著高于对照组(P<0.01)；菌剂Ⅰ组和菌剂Ⅱ组其它日龄的胸腺指数、脾脏指数和法氏囊指数均显著高于对照组(P<0.05)。表明沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981对肉鸡脾脏、法氏囊和胸腺的发育具有促进作用。表3、沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981对肉鸡免疫器官指数的影响(mg/g)注：同行数据标注不同小写字母者差异显著(P<0.05)，标注不同大写字母者差异极显著(P<0.01)。如表4所示，菌剂Ⅰ组和菌剂Ⅱ组的(E-C3bR)率和(E-ICR)率均极显著高于对照组(P<0.01)，并且菌剂Ⅰ组的(E-C3bR)率和(E-ICR)率均极显著高于菌剂Ⅱ组。表明沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981对鸡红细胞免疫功能具有促进作用。表4、沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981对21日龄肉鸡红细胞花环率的测定结果(％)注：同列数据标注不同小写字母者差异显著(P<0.05)，标注不同大写字母者差异极显著(P<0.01)。3、用沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981CGMCCNo.10802提高肉鸡体重试验期42天，试验期间所有肉鸡自由采食和饮水，按照常规免疫程序进行免疫，各组除饲喂的日粮不同外，其它饲养条件完全相同。其中，对照组在第1-28日龄用表2的肉鸡育雏期普通日粮进行饲喂，在第29-42日龄用表2的肉鸡育成期普通日粮进行饲喂；菌剂Ⅰ组在第1-28日龄用菌剂Ⅰ组育雏期日粮进行饲喂，在第29-42日龄用菌剂Ⅰ组育成期日粮进行饲喂；菌剂Ⅱ组在第1-28日龄用菌剂Ⅱ组育雏期日粮进行饲喂，在第29-42日龄用菌剂Ⅱ组育成期日粮进行饲喂。测定试验期间肉鸡的体重。测定方法为：分别于7日龄、14日龄、21日龄、28日龄、42日龄分别称重一次，清晨禁食禁水称重。称重时，每个重复随机抽取100只鸡，分别记录。试验所有数据采用SPSS12.0(SPSSInc.，USA)统计软件的独立样本t检验处理统计。结果表明，7日龄时，各组肉鸡体重差异不显著(P＞0.05)；14日龄至42日龄时，菌剂Ⅰ组和菌剂Ⅱ组的肉鸡活重均显著高于对照组(P<0.05)。表明沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981对提高肉鸡活重具有良好的促进作用。表5、沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981对肉鸡活重的影响(g)日龄(d)对照组菌剂Ⅰ组菌剂Ⅱ组7196.2±3.84ab207.6±4.08a184.3±4.15b14312.5±6.53b338.7±6.25a332.1±7.99a21718.6±16.28b759.5±15.10a751.3±14.52a281168.1±18.77b1295.9±14.28a1265.2±16.22a351560.9±18.79b1714.2±21.35a1703.3±19.01a421898.9±21.02b2095.8±22.21a2085.2±20.12a注：表中同行的英文字母表示差异显著程度，相同字母的处理间在0.05水平无显著差异，字母不同的处理间在0.05水平有显著差异。实施例4、用沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981CGMCCNo.10802提高肉鸡生产性能和改善肉鸡肌肉品质1、材料1.1、沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981菌剂的制备向实施例2的沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981的发酵培养基B的发酵液中加入稻壳粉在50℃进行干燥，得到沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981菌剂。该沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981菌剂中的沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981含量为1×109cfu/g。其中，稻壳粉事先经过微粉化处理(90％的粉体粒度小于100μm，平均粒径小于50μm，所述平均粒径为50％粉体粒径)。1.2、试验动物选择体重为50±5克艾维茵—白羽肉鸡的1日龄健雏，随机均分为3个处理组，即对照组、菌剂Ⅰ组和菌剂Ⅱ组。每个处理组3个重复，每个重复300只鸡。1.3、日粮同实施例3的1.3。2、用沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981CGMCCNo.10802提高肉鸡生产性能试验期47天，试验期间所有肉鸡自由采食和饮水，按照常规免疫程序进行免疫，各组除饲喂的日粮不同外，其它饲养条件完全相同。其中，对照组在第1-28日龄用表2的肉鸡育雏期普通日粮进行饲喂，在第29-47日龄用表2的肉鸡育成期普通日粮进行饲喂；菌剂Ⅰ组在第1-28日龄用菌剂Ⅰ组育雏期日粮进行饲喂，在第29-47日龄用菌剂Ⅰ组育成期日粮进行饲喂；菌剂Ⅱ组在第1-28日龄用菌剂Ⅱ组育雏期日粮进行饲喂，在第29-47日龄用菌剂Ⅱ组育成期日粮进行饲喂。测定试验期间肉鸡的死亡率、出栏率、采食量以及料肉比。于第36日龄至47日龄采集肉鸡粪样和日粮样品，以内源指示剂法(4mol/L盐酸不溶灰分)测定肉鸡的营养物质表观消化率。日粮和粪样中的粗蛋白(CP)含量采用GB/T6432-1994饲料中粗蛋白测定方法，钙含量采用NY/T1944-2010饲料中钙的测定(原子吸收分光光谱法)，磷含量采用GB/T6437-2002饲料中总磷的测定(分光光度法)。计算公式如下：死亡率(％)＝死亡鸡只数(只)/入舍鸡只数(只)×100；出栏率(％)＝出栏鸡只数(只)/入舍鸡只数(只)×100；平均日采食量＝(配料总量—剩料量)/试验天数*每组鸡数平均日增重＝(试验末平均体重—试验初平均体重)/试验天数料肉比＝平均日采食量/平均日增重。日粮营养物质表观消化率(％)＝[1-(b/a)×(c/d)]×100。其中，a为日粮中某营养成分的含量(％)；b为粪便中某营养成分的含量(％)；c为日粮中盐酸不溶灰分的含量(％)；d为粪便中盐酸不溶灰分的含量(％)。试验所有数据采用SPSS12.0(SPSSInc.，USA)统计软件的独立样本t检验处理统计。结果表明，菌剂Ⅰ组的料肉比显著低于对照组(P<0.05)(表6)。表明沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981能够降低肉鸡料肉比。表6、沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981对肉鸡料肉比的影响处理料肉比对照组1.98a菌剂Ⅰ组1.83b菌剂Ⅱ组1.94ab注：同列标注不同字母为差异显著(P<0.05)。结果表明，菌剂Ⅰ组和菌剂Ⅱ组的死亡率均显著低于对照组(P<0.05)，菌剂Ⅰ组和菌剂Ⅱ组的出栏率均显著高于对照组(P<0.05)(表7)。表明沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981能够降低肉鸡死亡率，提高出栏率。表7、沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981对肉鸡死亡率的影响注：同列标注不同字母为差异显著(P<0.05)。结果表明，菌剂Ⅰ组和菌剂Ⅱ组的粗蛋白(CP)表观消化率、钙(Ca)表观消化率、磷(P)表观消化率均显著高于对照组(P<0.05)(表8)。说明沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981可提高肉鸡粗蛋白表观消化率、钙表观消化率和磷表观消化率。表8、沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981对肉鸡日粮表观消化率的影响注：同列标注不同字母为差异显著(P<0.05)。3、用沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981CGMCCNo.10802改善肉鸡肌肉品质试验期47天，试验期间所有肉鸡自由采食和饮水，按照常规免疫程序进行免疫，各组除饲喂的日粮不同外，其它饲养条件完全相同。其中，对照组在第1-28日龄用表2的肉鸡育雏期普通日粮进行饲喂，在第29-47日龄用表2的肉鸡育成期普通日粮进行饲喂；菌剂Ⅰ组在第1-28日龄用菌剂Ⅰ组育雏期日粮进行饲喂，在第29-47日龄用菌剂Ⅰ组育成期日粮进行饲喂；菌剂Ⅱ组在第1-28日龄用菌剂Ⅱ组育雏期日粮进行饲喂，在第29-47日龄用菌剂Ⅱ组育成期日粮进行饲喂。试验期结束前一天，每重复选取体重相近的鸡3只，颈部放血屠宰，宰前禁食12h。测定鸡全身肌肉中胆固醇含量、粗蛋白含量和氨基酸含量。3.1胆固醇含量按照GB/T5009.128-2003《食品中胆固醇的测定》标准进行测定。3.2粗蛋白质含量测定称取肉样，然后用组织捣碎机捣碎，放入烘箱恒温烘干。在消解管中加入2g肉样、2.5g抗氧化剂和10mL浓硫酸，然后在高温消解炉上进行样品消化。应用凯氏定氮仪进行测定，计算公式为：粗蛋白％＝(A-A0)×0.014×6.25×0.1612/W×100％A0为空白对照，W为肉样重(g)，0.1612为硫酸浓度，A为机读数。3.3粗脂肪含量测定取肉样，然后用组织捣碎机捣碎混匀，在烘箱中恒温烘干，在滤纸筒内放置1g样品；烘干滤纸筒，直至称量为恒重，在脂肪测定仪上进行粗脂肪的测定。3.4氨基酸含量测定按照GB/T5009.124-2003《食品中氨基酸的测定》标准进行测定试验所有数据采用SPSS12.0(SPSSInc.，USA)统计软件的独立样本t检验处理统计。结果表明菌剂Ⅰ组和菌剂Ⅱ组的肌肉的胆固醇含量和粗脂肪含量显著低于对照组，粗蛋白含量显著高于对照组(P<0.05)(表9)。说明沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981CGMCCNo.10802可以有效地改善肉鸡肉质的营养成分。表9、沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981对肌肉营养成分的影响检测指标对照组菌剂Ⅰ组菌剂Ⅱ组胆固醇(mg/100g)79.63±1.59a75.58±1.35b75.81±1.55b粗蛋白(％)24.71±0.26b26.72±0.21a26.39±0.27a粗脂肪(％)4.46±0.19a3.62±0.15b3.79±0.18b注：同行标注不同字母为差异显著(P<0.05)。结果表明菌剂Ⅰ组和菌剂Ⅱ组肌肉的缬氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、胱氨酸和酪氨酸含量显著高于对照组(P<0.05)，其它氨基酸含量没有显著差异(表10)。缬氨酸含量的增加，可以使血浆中丙氨酸升高，并且提高动物机体免疫机能；蛋氨酸含量的增加，可以提高机体免疫力、降低日粮粗蛋白质水平，同时在一定的程度上提高生产性能；赖氨酸的升高，可以提高胃液分泌功效，起到增进食欲、促进生长与发育的作用，提高钙的吸收及其在体内的积累，加速骨骼生长。说明沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981CGMCCNo.10802可以提高鸡肌肉的缬氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、胱氨酸和酪氨酸含量。表10、沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981对肌肉氨基酸含量的影响注：同行标注不同字母为差异显著(P<0.05)。实施例4、沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981CGMCCNo.10802的保存1、菌种的活化挑取沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981CGMCCNo.10802，对其用优选固体培养基进行斜面穿刺培养，保持温度30℃光照强度为1200Lx条件下培养10d。优选固体培养基是在发酵培养基A中加入琼脂得到的固体培养基，具体配制方法如下：将胰蛋白胨3.0g，酵母浸粉3.0g，CaCl20.3g、MgSO4·H2O0.5g和17g琼脂溶于蒸馏水后，用蒸馏水定容至1000mL，然后121℃蒸汽灭菌30min，得到优选固体培养基。2、制备种子液将步骤1活化的沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981CGMCCNo.10802接种于装有实施例2的发酵培养基A的无菌蓝盖试剂瓶(螺纹口的透明玻璃瓶)中，拧紧蓝盖，在30℃、每天24小时的光照强度为1200Lx的光照条件下培养5天，得到沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981CGMCCNo.10802种子液。3、发酵培养将步骤2的沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981CGMCCNo.10802种子液10ml接入装有100ml实施例2的发酵培养基B的100ml无菌蓝盖试剂瓶(螺纹口的透明玻璃瓶)中，拧紧蓝盖，在30℃、每天24小时的光照强度为1500Lx的光照条件下培养3天，得到沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981的发酵培养基B的发酵液(简称发酵液B)，该发酵液B即为沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981液体菌剂。实验重复三次，每次重复10个蓝盖试剂瓶。4、保藏将步骤3的发酵液B进行B1和B2这两种保藏：B1、在光照强度为500Lx的光照条件下进行保藏将步骤3发酵刚结束得到的沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981液体菌剂转入无菌蓝盖试剂瓶(螺纹口的透明玻璃瓶)中，将沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981液体菌剂装至瓶口，拧紧蓝盖，置于20℃在每天24小时的光照强度为500Lx的光照条件下分别放置30天、60天、90天、120天、150天、180天和210天后，按照实施例2的平板稀释计数法进行计数。将步骤3发酵刚结束得到的沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981液体菌剂记为放置0天。每个处理重复三次，每次重复10个蓝盖试剂瓶。B2、在光照强度为10Lx的光照条件下进行保藏该步骤与B1的区别仅在于光照强度不同，其它条件均相同，具体方法如下：将步骤3发酵刚结束得到的沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981液体菌剂转入无菌蓝盖试剂瓶(螺纹口的透明玻璃瓶)中，将沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981液体菌剂装至瓶口，拧紧蓝盖，置于20℃在每天24小时的光照强度为10Lx的光照条件下分别放置30天、60天、90天、120天、150天、180天和210天后，按照实施例2的平板稀释计数法进行计数。将步骤3发酵刚结束得到的沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981液体菌剂记为放置0天。每个处理重复三次，每次重复10个蓝盖试剂瓶。结果表明沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981液体菌剂在B1条件下保藏120天后，沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981(简称沼泽红假单胞菌981)的含量是26.625×109cfu/ml，是保藏0天的1.31倍，保藏150天后沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981(简称沼泽红假单胞菌981)的含量是12.375×109cfu/ml，是保藏0天的0.61倍；沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981液体菌剂在B2条件下保藏60天后沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981(简称沼泽红假单胞菌981)的含量是12.0×109cfu/ml，是保藏0天的0.59倍(表11)。沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981液体菌剂在B1条件下的保质期为120天，在B2条件下的保质期为60天。沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981液体菌剂在B1条件下满足农业微生物菌剂标准(GB20287-2006)中关于液体剂型菌剂有效活菌数大于等于2.0亿cfu/ml，保质期大于等于三个月的规定。表11、B1和B2保藏不同时间后的沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981液体菌剂中沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)981含量当前第1页1 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