技术领域本发明涉及本发明涉及植物育种领域，具体是一种抗烟嘧黄隆除草剂的植物培育方法。
背景技术：
农田杂草可导致农作物的减产并降低作物的品质。除草剂除草已成为当今农田有效控制杂草，减少除草劳动量，提高作物产量与质量，发展农业生产一项基本措施。抗除草剂育种工程也一直受到人们的广泛重视，特别是对那些不具抗除草剂特性、不能用除草剂除草的作物尤为重要。谷子抗旱耐瘠，是我国北方优质抗旱粮食作物。然而谷子为小粒作物，单粒顶土能力差，需密植确保出苗，然后进行人工间苗。另外，谷子对市场上销售的除草剂均不敏感，谷田除草一直依靠人工作业。这种落后的生产方式不适合现代农业的要求，成为制约谷子集约化、规模化生产的瓶颈难题。因此培育抗除草剂谷子品种具有重要意义。近年来，通过远缘杂交育成的抗除草剂谷子品种，实现了谷田的化学除草；另通过选育抗、感拿捕净的同型姊妹系，二者按一定比例混合播种，利用二者对除草剂的抗性差异，苗期通过喷施拿捕净同步实现了谷子的化学间苗、化学除草。抗除草剂谷子的培育，简化了谷子栽培、实现了谷田的化学除草，使谷子集约化、规模化生产成为可能。目前应用于抗除草剂谷子育种的主要是拿捕净和咪唑乙烟酸两种类型。然而谷田杂草种类繁多，拿捕净为单子叶杂草除草剂，对双子叶无效，除草不彻底；咪唑乙烟酸对单双子叶都有效，但长期使用单一除草剂具有使杂草产生抗药性的潜在风险。挖掘和利用可用于谷子育种的新型除草剂抗性基因，对于拓宽谷子抗除草剂育种、增加谷子除草剂抗性的多样性是保障谷子化学除草持续有效和安全使用的一项重要措施。
技术实现要素：
对此，本发明通过从加拿大引进的抗咪唑乙烟酸野生青狗尾草群体中筛选获得的抗烟嘧黄隆突变体为材料，并与国内谷子杂交，用产生的YM15谷子种质为材料克隆抗烟嘧黄隆基因NiALS，并进行转化和检测。采用本发明的抗烟嘧黄隆除草剂的植物培育方法，有效地提高了植物的生产力和品质。本发明的技术方案是：一种抗烟嘧黄隆基因，其特征在于，由SEQIDNO：1或SEQIDNO：2所示的核苷酸序列组成。一种抗烟嘧黄隆基因在培育抗除草剂谷子中的应用，其特征在于，该基因由SEQIDNO：1或SEQIDNO：2所示的核苷酸序列组成。一种抗烟嘧黄隆基因在培育抗黄酰脲类除草剂谷子中的应用，其特征在于，该基因由SEQIDNO：1或SEQIDNO：2所示的核苷酸序列组成。一种抗烟嘧黄隆除草剂的植物培育方法，其特征在于，包括如下步骤：(4)抗烟嘧黄隆除草剂基因(NiALS)扩增：引物序列F1：ACGAACGAGTGTGGCCTAAG；R1：GTCAAAGAAAGGCAAGGGCG；(5)植物表达载体构建：以克隆基因NiALS为模板设计引物，正向引物序列5端加SpeI酶切位点，反向引物序列5端加SacI酶切位点，序列为：F2：GactagtACGAACGAGTGTGGCCTAAG，R2：CgagctcGTCAAAGAAAGGCAAGGGCG，PCR扩增，产物经SpeI-SacI酶切后与XbaI-SacI酶切的pBI121连接获得表达载体，命名为pBI121-NiALS。(6)植物转化：叶盘法转化，经卡那霉素筛选获得再生植株。步骤(1)中，PCR扩增反应体系为：50μL,含10×buffer5μL、250μmolL-1dNTP各4μL、10mmolL-1引物各4μL、PrimerStarHS高保真聚合酶1μL(TakaRa)、模板DNA1μL；反应条件为：98℃预变性5s；98℃变性10s,58℃退火30s,72℃延伸2min,40个循环；最后72℃延伸10min。步骤(2)中，PCR扩增反应体系为：50μL,含10×buffer5μL、250μmolL-1dNTP各4μL、10mmolL-1引物各4μL、PrimerStarHS高保真聚合酶1μL(TakaRa)、模板DNA1μL；反应条件为：98℃预变性5s；98℃变性10s,58℃退火30s,72℃延伸2min,40个循环；最后72℃延伸10min。步骤(3)中，转化方法如下：表达载体质粒pBI121-NiALS，通过电击法转入根癌农杆菌AGL1中，用于烟草转化；剪取新鲜叶子70％乙醇漂洗1min，10％NaClO消毒10min；切掉叶片叶脉和叶片边缘，5-6个外植体叶片，置于预培养基中(MS+0.1mgL-1IAA+1mgL-16-BA)，光照下，预培养2天；预培养2天后，取外植体置于提前准备好的OD600＝1.0的农杆菌菌液中，轻轻晃动，侵染3-5min；用滤纸吸除残留菌液后，置于新的预培养基中，避光共培养2天；2天后将外植体转入诱导培养基中(MS+0.1mgL-1IAA+1mgL-16-BA+160mgL-1Timentin+100mgL-1Kan)；待抗性芽长到约1cm左右时，移到生根培养基上(MS+100mgL-1Kan)，获得转基因再生植株。一种检测权利要求1所述抗烟嘧黄隆除草剂的植物的方法，其特征在于，包括如下步骤：T0代再生植株提取DNA，进行PCR检测：设计特异性检测引物F4：GCTCCATCACCAAGCACAAC，R4：CAGAGACAGTGGGTCGTCAC；电泳观察，阳性植株可扩出392bp大小的电泳条带，阴性植株无扩增条带。PCR检测的反应体系20μL,含2×Mix10μL、10mmolL-1引物各0.5μL、模板DNA1μL。反应条件为94℃预变性4min；94℃变性40s,59℃退火40s,72℃延伸20s,35个循环；最后72℃延伸5min。一种抗烟嘧黄隆除草剂的基因检测试剂盒，包括引物序列F4：GCTCCATCACCAAGCACAAC，R4：CAGAGACAGTGGGTCGTCAC。在一个实施例中，所述试剂盒还包括引物序列F1：ACGAACGAGTGTGGCCTAAG；R1：GTCAAAGAAAGGCAAGGGCG。附图说明图1是NiALS基因PCR扩增结果电泳图。图2是本发明的pEASY-E1-NiALS重组蛋白表达结果电泳图。图3是本发明的PBI121-NiALS表达载体构建示意图。图4NiALS转化烟草及转基因植株PCR检测电泳图。具体实施方式为了阐明本发明的技术方案及技术目的，下面结合附图及具体实施方式对本发明做进一步的介绍。抗烟嘧黄隆谷子种质YM15由本实验室通过谷子与野生青狗尾草杂交获得。转基因烟草受体W38、质粒PBI121由本实验室保存。基因克隆和生物信息学分析参考NCBI公布的豫谷1号ALS基因(GenBankaccessionno.：XM_004952503.2)、抗烟嘧黄隆突变狗尾草ALS基因(GenBankaccessionno.：KF020517)和谷子基因组(http://plants.ensembl.org/Setaria_italica)，设计扩增YM15中烟嘧黄隆除草剂基因(NiALS)，引物序列F1：ACGAACGAGTGTGGCCTAAG；R1：GTCAAAGAAAGGCAAGGGCG。PCR反应体系50μL,含10×buffer5μL、250μmolL-1dNTP各4μL、10mmolL-1引物各4μL、PrimerStarHS高保真聚合酶1μL(TakaRa)、模板DNA1μL。反应条件为98℃预变性5s；98℃变性10s,58℃退火30s,72℃延伸2min,40个循环；最后72℃延伸10min。用1.2％琼脂糖凝胶,在5Vcm-1电压下电泳分离PCR产物,用0.01％EB溶液染色15min,用紫外成像仪照相。扩增片段大小预计为2100bp。PCR获得了目的大小的片段(图1)。PCR产物与pEASY-T1载体连接后，经转化，挑取阳性克隆。送去测序。每个克隆测序三次。获得NiALS全长序列。对该序列进行ORF读码框预测，氨基酸预测。PCR产物与T载体连接后，测序获得NiALS序列(SEQIDNO：1)。ORF分析结果表明，该序列包含1932bp的读码框(SEQIDNO：2)，编码643个氨基酸(SEQIDNO：3)，分子量为69KD。表达载体构建以克隆基因NiALS为模板设计引物，构建植物表达载体。正向引物序列5端加SpeI酶切位点，反向引物序列5端加SacI酶切位点，序列为：F2：GactagtACGAACGAGTGTGGCCTAAG，R2：CgagctcGTCAAAGAAAGGCAAGGGCG。PCR反应体系为：50μL,含10×buffer5μL、250μmolL-1dNTP各4μL、10mmolL-1引物各4μL、PrimerStarHS高保真聚合酶1μL(TakaRa)、模板DNA1μL；反应条件为：98℃预变性5s；98℃变性10s,58℃退火30s,72℃延伸2min,40个循环；最后72℃延伸10min。PCR产物经SpeI-SacI酶切后与XbaI-SacI酶切的pBI121连接获得表达载体，命名为pBI121-NiALS。原核表达载体的构建：以克隆基因为模板，F3：CTCCCTTTCCGTGCCACTCG-3，R3：AAGGGCGGCGCTCCCTGAAT为引物，PrimerStarHS高保真聚合酶，扩增NiALS基因，PCR产物纯化后与pEASY-E1原核表达载体连接(全式金)，连接体系按说明书步骤。构建载体命名为pEASY-E1-NiALS。原核表达IPTG诱导融合基因的表达。将鉴定正确的BL21(DE3)菌液在LB(含LB/Amp+)中预培养过夜；按1:50～1:100比例转接过夜培养物到新鲜的LB液体培养液中(含LB/Amp+)，250rpm，37℃培养2～3h，使其OD600值达到0.5-0.6左右；加入终浓度为1mM的IPTG进行诱导，230rpm，37℃分别继续培养2、4、6h，不加IPTG诱导的样品作为对照；在不同时间点收集菌液，空白大肠杆菌对照在4h时收集菌液，8000rpm离心10min，弃上清。沉淀悬浮于100ul1xSDS凝胶加样缓冲液，100度加热3min，室温高速离心1min，冰上放置，待全部样品处理完后电泳检测。SDS-PAGE组分为12％分离胶，5％浓缩胶。120V，电泳2h。考马斯亮蓝染色检测表达结果。如图2所示。NiALS转基因烟草的获得NiALS插入到PBI121载体XbaI-SpeI位点，获得表达载体PBI121-NiALS(图3)。表达载体转化到农杆菌AGL1后，叶盘法转化烟草，经卡那霉素筛选获得再生植株。具体方法如下：质粒pBI121-NiALS，参照BIO-RAD电击仪说明书，将不同载体组合通过电击法转入根癌农杆菌AGL1中。用于烟草转化：剪取新鲜叶子70％乙醇漂洗1min，10％NaClO消毒10min。切掉叶片叶脉和叶片边缘，5-6个外植体叶片，置于预培养基中(MS+0.1mgL-1IAA+1mgL-16-BA)，光照下，预培养2天。预培养2天后，取外植体置于提前准备好的OD600＝1.0的农杆菌菌液中，轻轻晃动，侵染3-5min；用滤纸吸除残留菌液后，置于新的预培养基中，避光共培养2天；2天后将外植体转入诱导培养基中(MS+0.1mgL-1IAA+1mgL-16-BA+160mgL-1Timentin+100mgL-1Kan)；待抗性芽长到约1cm左右时，移到生根培养基上(MS+100mgL-1Kan)，获得转基因再生植株。转基因植株的检测PCR检测T0代再生植株，阳性植株可扩出392bp大小的电泳条带，阴性植株无扩增条带，扩增大小与预期一致，部分结果如图4。PCR检测共获得6棵阳性植株。M：DL2000marker；P：PBI121-NiALS质粒对照；W：野生型烟草对照；1,2,3,4,：PCR检测阳性植株，5：PCR检测隐性植株。再生植株提取DNA，进行PCR检测，设计特异性检测引物F4：GCTCCATCACCAAGCACAAC，R4：CAGAGACAGTGGGTCGTCAC。用2×EasyTaqPCRSuperMix(全式金)进行扩增。PCR反应体系20μL,含2×Mix10μL、10mmolL-1引物各0.5μL、模板DNA1μL。反应条件为94℃预变性4min；94℃变性40s,59℃退火40s,72℃延伸20s,35个循环；最后72℃延伸5min。扩增PCR产物大小为392bp。转基因烟草的抗除草剂验证将上述鉴定阳性的转基因烟草植株，在苗期6-7片叶子时，喷施浓度为0.25％(V/V)的商品化烟嘧黄隆除草剂(玉京香)，该浓度为田间正常用药量，野生型烟草为对照。12天后观察其生长发育情况，结果表明喷施除草剂的野生型植株生长受到抑制，叶片不同程度发黄，萎蔫。而转基因植株可正常生长，具有烟嘧黄隆抗性。说明克隆的NiALS基因在烟草植株内可正常表达，对烟嘧黄隆除草剂具有抗性。NiALS基因在培育抗磺酰脲类除草剂谷子中的应用在一个实施例中，本专利中所述抗烟嘧黄隆基因应用于培育抗除草剂谷子，该基因由SEQIDNO：1或SEQIDNO：2所示的核苷酸序列组成。烟嘧磺隆属于磺酰脲类除草剂之一，黄酰脲类除草剂是ALS类除草剂中应用最广泛的除草剂之一，包括烟嘧黄隆、氯磺隆、苯磺隆、苄嘧磺隆、氟啶嘧黄隆等。该类除草剂作用方式与咪唑乙烟酸相同。本专利中所述抗烟嘧黄隆基因也可用于创制除烟嘧黄隆外的，其它黄酰脲类抗除草剂谷子。本发明从远缘杂交育成的抗烟嘧黄隆谷子种质YM15中克隆了该抗性基因命名为NiALS，基因全长1932bp，编码643个氨基酸。NiALS序列在1877位处存在G—A的单碱基突变，导致626位异亮氨基酸替换丝氨酸，可能是其产生烟嘧黄隆抗性的原因。进一步对该基因进行蛋白表达和功能验证，结果表明该基因可正常表达出目的大小的蛋白，与野生型野草相比，NiALS转基因烟草具有烟嘧黄隆抗性。从分子水平水阐释该基因的功能，为该基因在谷子抗除草剂育种及在其他作物中通过转基因技术培育抗除草品种奠定基础。以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。