本发明涉及一种利用睾酮酯的酶促水解来制备睾酮的方法。
背景技术：
式(I)的睾酮：
也被称为(17β)-17-羟基雄甾-4-烯-3-酮，是一种甾体化合物，一种已知的人类激素，并且是一种主要用于制药目的的活性成分。
众所周知，为了水解酯类化合物，可以成功地使用碱性介质，特别是氢氧化钠水溶液是一种常用试剂。因此，专业技术人员公知，为了制备睾酮，可以使用苛性钠水溶液通过将睾酮酯水解成睾酮进行转化。
然而，使用苛性钠水溶液将睾酮酯转化成睾酮的实验性尝试提供了具有大量的几种未知杂质的睾酮，所述杂质通过例如重结晶程序非常难以从产物中消除。
已经公开了几种用于制备睾酮的其他方法，特别是，这些方法中的一些描述了利用酶促水解进行所述甾体化合物的转化。
具体来说，Tetrahedron Letters,28(52),6549-6552,1987公开了一种通过在有机溶剂中的酶促转酯化反应将甾体化合物的酯转变成相应的醇、即甾体化合物的过程。在对大量水解酶类进行初筛之后，所述酶促转化揭示，来自于柱状假丝酵母(Candida cylyndracea)的脂肪酶被发现是在有机溶剂中水解甾体化合物与辛醇的酯的最好的催化剂。一些反应的结果示出在所述文章的第6551-6552页的表中，特别是使用所述脂肪酶催化剂试验了睾酮酯底物(参见条目9和10)。结果显示了所述来自于柱状假丝酵母(Candida cylyndracea)的脂肪酶不产生任何睾酮乙酸酯向睾酮的转化，以及对睾酮丙酸酯进行的相同反应仅提供12％的转化。此外，这个酶反应在有机溶解中，使用大量酶和少量底物进行。
出版物Steroids,62,482-486,1997公开了一种睾酮衍生物、即7β-羟基睾酮(9)的直接立体选择性合成，所述合成通过酶促氧化和随后的酶促水解来进行。具体来说，所述方法描述了使用猪脂肪酶从酯中间体获得化合物(9)。这种使用所述来自于猪胰的脂肪酶的酶促水解产生7β,17β-二羟基-4-雄甾烯-3-酮17-辛酸酯(8)向7β-羟基睾酮(9)的转化。化合物(9)的H-NMR谱图显示不存在酯基，同时所述转化产生75％的得率，但是产物需要通过快速柱层析进行纯化，因此所述方法不适合于大生产。此外，观察到通过这种酶促水解获得的产物是化合物(9)，其是7β-羟基睾酮，即与睾酮相比不同的化合物。
最后，Acta Chemica Scandinavica 27,1240-1248,1973公开了通过薄青霉(Penicillium lilacinum)NRRL 895的无细胞制备物进行的甾体化合物转化；所述薄青霉显示出含有可诱导的甾体化合物酯酶活性。该文章描述了真菌薄青霉(Penicillium lilacinum)的甾体化合物转化能力，所述能力在几种甾体化合物、特别是睾酮及其酯上进行了试验。
在所述特定情况下，在两个实验中，睾酮乙酸酯被容易地水解成睾酮，转化率为80.3％和83.8％(参见第1246页)；然而，在其他睾酮酯如睾酮丙酸酯上使用来自于所述无细胞制备物的这种酯酶，仅提供部分水解，而睾酮庚酸酯、苯甲酸酯和半琥珀酸酯不受影响。此外，应该考虑到这些结果，特别是睾酮乙酸酯向睾酮的转化的结果，是在非常低的底物浓度下获得的，不适合于商业化和/或工业生产。
技术实现要素：
因此，本发明应对的问题是提供一种用于制备睾酮的改进的方法，所述方法特别是允许睾酮酯向睾酮的高水平转化和/或提供具有高化学纯度的睾酮。
这一问题通过在权利要求书中描述的用于制备睾酮的方法得以解决，所述权利要求书的定义是本说明书的有机组成部分。
具体来说，本发明提供了一种利用式(II)的睾酮酯的酶促水解来生产活性成分睾酮的方法：
其中R是C1-C9直链或支链烷基，或者是C3-C9环烷基或支链环烷基。
优选地，所述酶促水解通过作为来自于米曲霉(Aspergillus oryzae)的脂肪酶的脂肪酶51032或通过来自于南极假丝酵母A(Candida Antarctica A)的脂肪酶来进行。
另一方面，本发明提供了纯的形式的脂肪酶在式(II)的化合物的酶促水解中的用途，具体来说，其中所述脂肪酶是来自于米曲霉(Aspergillus oryzae)的脂肪酶或来自于南极假丝酵母A(Candida antarctica)A的脂肪酶。
本发明的另一个目的是一种用于制备式(III)的睾酮酯的方法：
其中R是C1-C9直链或支链烷基，或者是C3-C9环烷基或支链环烷基，所述方法是基于本发明的使用本发明的酶进行酶促水解的同一概念。
生产睾酮的几种已知的合成途径之一是水解睾酮酯，特别是在碱性条件下。
然而，这种反应产生许多难以通过例如重结晶消除的杂质，此外这些杂质中的一些以较大的量、特别是高于0.10％的量残留，这在制药活性物质例如睾酮中是不可接受的。
考虑到所述结果，考虑了一种不同且改进的合成以便从睾酮酯开始生产睾酮并生产具有高化学纯度的睾酮。
因此，本发明的目的是一种用于制备式(I)的睾酮的改进的方法：
所述方法通过式(II)的睾酮酯的酶促水解来进行：
其中R是C1-C9直链或支链烷基，或者是C3-C9环烷基或支链环烷基，所述方法的特征在于所述酶是来自于米曲霉(Aspergillus oryzae)的脂肪酶或来自于南极假丝酵母A(Candida antarctica A)的脂肪酶。
事实上，已令人吃惊地发现，特定种类的酶，即来自于米曲霉(Aspergillus oryzae)的脂肪酶或来自于南极假丝酵母A(Candida antarctica A)A的脂肪酶，产生所述酯的完全水解，并在同时提供具有非常高的化学纯度的睾酮，这是因为所述反应是极端区域选择性的，在17位中不对称碳的光学构型被完全保留，并且引人注目的是在所述过程中没有其他杂质形成。由于在式(II)的睾酮酯向睾酮的转化期间不形成其他杂质，因此睾酮的化学纯度反映了起始的睾酮酯的化学纯度。因此，如果起始的睾酮酯具有高的化学纯度，则本发明的方法也提供具有高化学纯度的睾酮。换句话说，所述方法是极端区域特异性和高效的，使得睾酮酯只被转变成睾酮而不转变成其他杂质化合物。
本发明的式(II)的睾酮酯的酶促水解的方法通常在水性缓冲介质中进行。具体来说，它在其中缓冲剂是磷酸盐缓冲剂的水性缓冲介质中进行。更具体来说，所述水性缓冲介质由磷酸盐缓冲剂制成，并具有6至11之间的pH。
在所述式(II)的化合物中，R是C1-C9直链或支链烷基，或者是C3-C9环烷基或支链环烷基。
在所述式(II)的化合物中，R是C1-C9直链或支链烷基，其选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、1-甲基丁基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、1,1-二甲基丙基、1,2-二甲基丙基、2,2-二甲基丙基、1-乙基丙基、正己基、1-甲基戊基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、1,1-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、2,3-二甲基丁基、3,3-二甲基丁基、1-乙基丁基、2-乙基丁基、3-乙基丁基、1,1-二乙基乙基、1-丙基丙基等。
在所述式(II)的化合物中，R也可以是C3-C9环烷基或支链环烷基，其选自环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基、环壬基、环丙基甲基、环丙基乙基、环丙基丙基、3-环戊基乙基等。
所述酶是来自于米曲霉(Aspergillus oryzae)的脂肪酶，即源自于米曲霉(Aspergillus oryzae)微生物的脂肪酶。所述酶是可商购的，例如从Sigma-Aldrich Inc.(USA)在商品编号62285下购买。
所述酶，即来自于米曲霉(Aspergillus oryzae)的脂肪酶，也可以是源自于遗传修饰的米曲霉(Aspergillus oryzae)微生物的脂肪酶。
优选地，所述酶是工程改造过的蛋白质，其通过遗传工程改造的米曲霉(Aspergillus oryzae)微生物的深层发酵来生产，然后从所述生产生物体分离并纯化。
根据本发明的优选实施方式，所述来自于米曲霉(Aspergillus oryzae)的脂肪酶是51032，一种由Novozymes A/S(Denmark)提供的酶。
所述51032被用于水解甘油三酯和聚乙酸乙烯酯。
本发明的方法的酶是来自于特异腐质霉(Humicola insolens)的脂肪酶，所述脂肪酶也可以从不同生物体例如从米曲霉(Aspergillus oryzae)产生。
本发明的方法的酶是来自于特异腐质霉(Humicola insolens)的脂肪酶，其中编码所述特异腐质霉(Humicola insolens)脂肪酶的DNA序列被遗传修饰或者未被遗传修饰。
编码所述特异腐质霉(Humicola insolens)脂肪酶的DNA序列意味着在微生物特异腐质霉(Humicola insolens)内部存在特定DNA序列，正如专业技术人员公知的，所述由含氮碱基构成的序列编码蛋白质的氨基酸序列。具体来说，在本发明中，特异腐质霉(Humicola insolens)的DNA序列含有信息，特别是特异腐质霉(Humicola insolens)的DNA内部的含氮碱基的信息，并且这些信息编码所述酶、即特异腐质霉(Humicola insolens)脂肪酶的氨基酸序列。
编码所述特异腐质霉(Humicola insolens)脂肪酶的DNA序列被遗传修饰或者未被遗传修饰，这意味着在第一种情况下，特异腐质霉(Humicola insolens)脂肪酶包含一个或多个氨基酸残基的置换。具体来说，特异腐质霉(Humicola insolens)脂肪酶的许多变体已在某些文献中被公开，例如US 5,827,719、WO 00/34450、WO 01/95502、WO 2015/085920。
未被遗传修饰意味着特异腐质霉(Humicola insolens)脂肪酶不包含氨基酸残基的置换，因此编码所述特异腐质霉(Humicola insolens)脂肪酶的特定DNA序列是野生型的。具体来说，来自于特异腐质霉(Humicola insolens)的脂肪酶的氨基酸序列已发表在US 5,827,719中。
根据本发明的优选实施方式，特异腐质霉(Humicola insolens)脂肪酶由宿主细胞产生，其中所述宿主细胞是米曲霉(Aspergillus oryzae)。优选地，所述脂肪酶的生产生物体是米曲霉(Aspergillus oryzae)，并且供体生物体是特异腐质霉(Humicola insolens)，更优选地重组形式的特异腐质霉(Humicola insolens)脂肪酶由米曲霉(Aspergillus oryzae)生产。
重组生产意味着被称为宿主的生产生物体在属于另一种供体生物体的编码酶或其他蛋白质的DNA序列的基础上，生产所述酶或所述其他蛋白质。
宿主细胞是指易于转化、转染、转导或包含DNA构建物或表达载体的任何细胞类型，所述构建物或表达载体带有编码本发明的酶、即特异腐质霉(Humicola insolens)脂肪酶的DNA序列。
所述宿主细胞可以是细菌细胞、真菌细胞或其他微生物细胞。
细菌的实例是革兰氏阳性细菌例如迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)，或革兰氏阴性细菌例如大肠埃希氏杆菌(E.coli)。
丝状真菌的实例是米曲霉(Aspergillus oryzae)、黑曲霉(Aspergillus niger)或尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)，并且用于生产所述宿主细胞、特别是真菌宿主的方法，公开在WO 97/35956中。
优选地，在本发明的方法中，所述宿主细胞是米曲霉(Aspergillus oryzae)。
根据本发明的优选实施方式，来自于特异腐质霉(Humicola insolens)的脂肪酶是51032，其中编码所述特异腐质霉(Humicola insolens)脂肪酶的DNA序列被遗传修饰。
根据本发明的更优选的实施方式，所述来自于特异腐质霉(Humicola insolens)的脂肪酶是51032，其中编码所述特异腐质霉(Humicola insolens)脂肪酶的DNA序列被遗传修饰，并且它由米曲霉(Aspergillus oryzae)生产。
51032是一种具有15KLU/g的较低活性的脂肪酶。所述酶的颜色为黄色至浅棕色，并且采取液体形式。
根据本发明的优选实施方式，所述来自于特异腐质霉(Humicola insolens)的脂肪酶是角质酶。
角质酶意味着特定的一类脂肪酶，或者更好地说是一种具有角质酶活性的脂分解酶，即能够水解底物角质素，或者更好地说催化下述反应：本发明的角质酶是能够将式(II)的睾酮酯水解成睾酮(I)的酶。
本发明的优选的角质酶由特异腐质霉(Humicola insolens)编码，其中编码所述特异腐质霉(Humicola insolens)脂肪酶、或更好地说是特异腐质霉(Humicola insolens)角质酶的DNA序列，被遗传修饰或未被遗传修饰。此外，所述特异腐质霉(Humicola insolens)角质酶优选地由米曲霉(Aspergillus oryzae)生产。
因此，51032是一种来自于特异腐质霉(Humicola insolens)的角质酶，即特定的一种脂肪酶，其中编码所述特异腐质霉(Humicola insolens)角质酶的DNA序列被遗传修饰。具体来说，所述51032在宿主细胞、即米曲霉(Aspergillus oryzae)中生产，即最后一种真菌包含编码本发明的酶、即特异腐质霉(Humicola insolens)角质酶的DNA构建物或表达载体。随后，将所述酶从生产生物体即米曲霉(Aspergillus oryzae)分离并纯化，并因此生产51032。
具体来说，在本发明中，将上面提到的51032用于式(II)的睾酮酯向睾酮(I)的水解。
用于本发明的方法的酶也可以是来自于南极假丝酵母A(Candida Antarctica A)的脂肪酶，也被称为来自于南极假丝酵母(Candida antarctica)的脂肪酶A或南极假丝酵母(Candida antarctica)脂肪酶A或CalA，其是一种公知的酶，目前可以在市场上获得，例如从Codexis Inc.()Redwood City,CA 94063,United States)获得。
无论使用何种酶，下列实施方式描述了本发明的各种不同情况。
根据本发明的优选实施方式，在所述式(II)的睾酮酯中，R是C1-C6直链或支链烷基或者是C7支链环烷基。
根据本发明的优选实施方式，在所述式(II)的睾酮酯中，R是甲基、乙基、3-环戊基乙基、2-甲基丁基、正己基或正壬基。
其中R是甲基的式(II)的睾酮酯具有下列结构：
并且也被称为睾酮乙酸酯。
其中R是乙基的式(II)的睾酮酯具有下列结构：
并且也被称为睾酮丙酸酯。
其中R是3-环戊基乙基的式(II)的睾酮酯具有下列结构：
并且也被称为睾酮环戊丙酸丙酸酯。
其中R是2-甲基丁基的式(II)的睾酮酯具有下列结构：
并且也被称为睾酮异己酸酯。
其中R是正己基的式(II)的睾酮酯具有下列结构：
并且也被称为睾酮庚酸酯。
其中R是正壬基的式(II)的睾酮酯具有下列结构：
并且也被称为睾酮癸酸酯。
其中R是乙基、3-环戊基乙基、2-甲基丁基、正己基或正壬基的式(II)的睾酮酯是目前在市场上销售的具有药理活性的物质。
根据本发明的更优选的实施方式，在所述式(II)的睾酮酯中，R是甲基或乙基，因为它们提供更好的转化，其中乙基是最好的，因为它在本发明的方法中提供最好的转化。
根据本发明的优选实施方式，用于执行式(II)的睾酮酯的酶促水解的酶的量相对于每克式(II)的化合物为0.1至0.6克。
根据本发明的优选实施方式，使用的缓冲溶液的体积与所述式(II)的化合物相比在约10至约40体积之间。
体积意味着酶质量单位的溶剂体积，即1体积对应于例如1ml/1g或1升/1Kg或1微升/1mg等。
“缓冲液体积”或“缓冲溶液的体积”是指参照所使用的底物的量，缓冲溶液的以体积计的量。因此，所述定义不是绝对度量，而是如上对体积的意义所描述的或者如实施例5中示例的，是相对度量。
根据本发明的优选实施方式，所述方法在约35℃至约70℃之间、更优选地在65-70℃的温度下进行。
根据本发明的优选实施方式，所述方法在约7.0至约10.0之间、更优选地7.0至7.5之间的pH下进行。
根据本发明的优选实施方式，所述方法按照下列优选条件中的任一种进行：
-温度为约70℃，并且pH为约7.0，或者
-温度在约50℃至约70℃之间，并且pH在约7.0至约8.5之间，或者
-温度为约35℃，pH在约7.0至约10.0之间，并且缓冲溶液的量为约10体积。
根据本发明的更优选实施方式，所述方法按照下列优选条件进行：
-温度为约70℃，pH为约7.0，和10体积的缓冲溶液。
根据本发明的优选实施方式，在所述式(II)的睾酮酯中，R是乙基。
根据本发明的优选实施方式，在所述式(II)的睾酮酯中，R是乙基，并且所述酶是51032。51032是上面已经描述过的角质酶。
根据本发明的实施方式，所述方法可以按照包括下列步骤的下述方法来进行：
a)制备一定量的水解酶，
b)添加一定量的底物式(II)的睾酮酯，
c)用缓冲液稀释所述制备物，
d)搅拌所述悬液，
e)获得所述式(II)的化合物向式(I)的睾酮的转化。
根据本发明的可选实施方式，所述方法可以按照上面描述的方法来进行，其中步骤a)和步骤b)可以颠倒。
根据本发明的优选实施方式，式(II)的睾酮酯的制备：
其中R是C1-C9直链或支链烷基或者是C3-C9环烷基或支链环烷基，通过式(I)的睾酮的酯化来进行：
睾酮(I)的酯化以提供睾酮酯(II)，可以按照有机合成领域的专业技术人员已知的标准程序来进行，其通常包括例如酰基卤或与酸酐的直接反应，优选地在碱存在下。
根据优选实施方式，睾酮的酯化以提供睾酮酯，可以利用丙酸酐或丙酰氯来进行。
根据优选实施方式，睾酮的酯化以提供睾酮酯，可以在碱、优选为DMAP(二甲基氨基吡啶)、吡啶、三乙胺等存在下进行。
根据优选实施方式，睾酮的酯化以提供睾酮酯，可以利用丙酸酐和DMAP来进行。
在这种情况下，即当所述方法还包括这个从睾酮(I)制备起始原料式(II)的睾酮酯的先前反应时，所述整个方法可以被看做通过式(II)的睾酮酯的制备和纯化来纯化睾酮的过程。
本发明的另一方面是脂肪酶用于式(II)的化合物的酶促水解以提供式(I)的睾酮的用途：
其中R是C1-C9直链或支链烷基，或者是C3-C9环烷基或支链环烷基，
其中所述脂肪酶是来自于米曲霉(Aspergillus oryzae)的脂肪酶或者是来自于南极假丝酵母A(Candida Antarctica A)的脂肪酶。
所述来自于米曲霉(Aspergillus oryzae)的脂肪酶是来自于特异腐质霉(Humicola insolens)的脂肪酶，其中编码所述特异腐质霉(Humicola insolens)脂肪酶的DNA序列被遗传修饰或者未被遗传修饰。具体来说，所述来自于特异腐质霉(Humicola insolens)的脂肪酶也可以通过宿主细胞、优选地米曲霉(Aspergillus oryzae)在中生产。
根据本发明的更优选的实施方式，优选地使用来自于米曲霉(Aspergillus oryzae)的脂肪酶，其是51032。
此外，优选地使用51032这种来自于特异腐质霉(Humicola insolens)的脂肪酶，其中编码所述特异腐质霉(Humicola insolens)脂肪酶的DNA序列被遗传修饰。所述51032在宿主细胞中、特别是通过米曲霉(Aspergillus oryzae)来生产。
本发明的51032这种来自于特异腐质霉(Humicola insolens)的脂肪酶具体来说是角质酶，正如上面在描述51032的段落中已经描述过的。
根据本发明的优选实施方式，优选地将脂肪酶用于式(II)的化合物的酶促水解，其中在所述式(II)的化合物中，R是乙基。
根据本发明的优选实施方式，优选地将来自于米曲霉(Aspergillus oryzae)的脂肪酶或来自于南极假丝酵母A(Candida Antarctica A)的脂肪酶用于式(II)的化合物的酶促水解，其中在所述式(II)的化合物中，R是乙基。
根据本发明的优选实施方式，将作为51032的来自于米曲霉(Aspergillus oryzae)的脂肪酶用于式(II)的化合物的酶促水解，其中在所述式(II)的化合物中，R是乙基。
根据本发明的更优选的实施方式，优选地将来自于特异腐质霉(Humicola insolens)的脂肪酶或来自于南极假丝酵母A(Candida Antarctica A)的脂肪酶用于式(II)的化合物的酶促水解，其中编码所述特异腐质霉(Humicola insolens)脂肪酶的DNA序列被遗传修饰或未被遗传修饰，其中在所述式(II)的化合物中，R是乙基。
根据本发明的更特别优选的实施方式，优选地将作为51032的来自于特异腐质霉(Humicola insolens)的脂肪酶用于式(II)的化合物的酶促水解，其中在所述式(II)的化合物中，R是乙基。
本发明的另一个目的是一种制备式(III)的睾酮酯的方法：
其中R是C1-C9直链或支链烷基，或者是C3-C9环烷基或支链环烷基，
所述方法包括下列步骤：
a)上面描述的根据本发明的酶促方法制备式(I)的睾酮的方法；
b)式(I)的睾酮的酯化反应：
以提供式(III)的睾酮酯。
式(III)的化合物的R的意义与上面为式(II)的化合物的R所给出的意义相同。
执行步骤a)的条件和优选实施方式已在上面描述过。
对于执行步骤b)的条件和优选实施方式来说，上面已在描述通过式(I)的睾酮的酯化制备式(II)的睾酮酯的段落中描述过：
这里描述的方法可以被看做通过睾酮的制备来纯化式(II)的睾酮酯的方法。
这里描述的方法也可以被看做从不同的式(II)的睾酮酯开始，通过睾酮的制备来制备式(III)的睾酮酯的方法，正如在下面的反应方案中所示例的：
例如，根据本发明的包括酶促水解步骤的方法，可以通过上述睾酮的制备将睾酮丙酸酯转变成最终产物，其是睾酮丙酸酯或睾酮庚酸酯或睾酮癸酸酯或睾酮异己酸酯。
根据用于制备式(III)的睾酮酯的方法的优选实施方式，在所述式(III)的睾酮酯中，R是乙基、3-环戊基乙基、2-甲基丁基、正己基或正壬基。
根据用于制备式(III)的睾酮酯的方法的优选实施方式，在执行步骤a)的起始原料式(II)的睾酮酯中，R是甲基或乙基，优选为乙基。
根据用于制备式(III)的睾酮酯的方法的更优选实施方式，在最终产品式(III)的睾酮酯中，R是乙基、3-环戊基乙基、2-甲基丁基、正己基或正壬基，并且在用于执行步骤a)的起始原料式(II)的睾酮酯中，R是乙基。
本发明的另一个目的是一种用于制备式(III)的睾酮酯的方法：
其中R是C1-C9直链或支链烷基，或者是C3-C9环烷基或支链环烷基，所述方法包括下列步骤：
a)式(II)的睾酮酯的制备：
其中R是C1-C9直链或支链烷基，或者是C3-C9环烷基或支链环烷基，所述制备通过式(I)的睾酮的酯化来进行：
b)按照上述本发明的酶学方法制备式(I)的睾酮；
c)式(I)的睾酮的酯化反应：
以提供式(III)的睾酮酯，其中式(III)的化合物的R的意义与上面为式(II)的化合物的R所给出的相同。
执行所有步骤的条件和优选实施方式已在上面描述过。
这里描述的方法也可以看做从式(I)的睾酮开始制备式(III)的睾酮酯的方法，通过首先制备式(II)的睾酮酯，然后将它们转变成式(I)的睾酮，最后将它转变成式(III)的睾酮酯。
下面的反应图式示出了本发明的这种方法：
根据用于制备式(III)的睾酮酯的方法的优选实施方式，在所述终产物式(III)的睾酮酯中，R是乙基、3-环戊基乙基、2-甲基丁基、正己基或正壬基。
根据用于制备式(III)的睾酮酯的方法的优选实施方式，在执行步骤b)的中间体式(II)的睾酮酯中，R是甲基或乙基，更优选为乙基。
根据用于制备式(III)的睾酮酯的方法的更优选实施方式，在所述终产物式(III)的睾酮酯中，R是乙基、3-环戊基乙基、2-甲基丁基、正己基或正壬基，并且在用于执行步骤b)的中间体式(II)的睾酮酯中，R是乙基。
下面的反应方案示出了本发明的这种方法的优选实施方式：
其中在式(III)的化合物中，R是乙基、3-环戊基乙基、2-甲基丁基、正己基或正壬基。
正如前面描述的，本发明的方法的另一个优点是用于制备式(III)的睾酮酯的方法。具体来说，所述包括上面提到的程序的特定步骤的后一种方法，通过本发明的酶促水解来进行，具体来说通过利用作为来自于米曲霉(Aspergillus oryzae)的脂肪酶(特异腐质霉(Humicola insolens)角质酶)或来自于南极假丝酵母A(Candida Antarctica A)的脂肪酶的酶来进行。此外，获得的式(III)的睾酮酯具有高的化学纯度，因为正如早些时候描述的，所述反应是极端区域特异性的。
下面的实验给出了由本发明的酶提供的效果的证据，其在睾酮酯向睾酮的转化率方面提供了强烈提高。
此外，由来自于米曲霉(Aspergillus oryzae)的脂肪酶、特别是作为51032的来自于米曲霉(Aspergillus oryzae)脂肪酶或来自于南极假丝酵母A(Candida Antarctica A)的脂肪酶提供给酶促水解的效果，在从睾酮酯获得的睾酮的较高化学纯度方面是突出的，因为在这个转化中不产生杂质，所述酶是极端区域选择性的。
具体实施方式
实验步骤
起始原料睾酮是可商购的物质。
睾酮酯、特别是睾酮乙酸酯和睾酮丙酸酯，可以通过将睾酮分别与乙酸酐或丙酸酐反应来生产。睾酮庚酸酯和睾酮环戊丙酸丙酸酯可以通过将睾酮与相关酰基酸反应来生产。
实施例1：通过式(II)的睾酮酯的化学水解来合成式(I)的睾酮–比较性试验
使用125ul NaOH溶液(30％)将100mg睾酮乙酸酯在3ml甲醇中水解。在室温下搅拌温育24h后，对转化进行评估。使用睾酮环戊丙酸酯、睾酮庚酸酯、睾酮丙酸酯进行类似的反应。在反应结束时(低于0.1％A/A％的反应物)进行的HPLC分析显示，睾酮的化学纯度在60至75％A/A％之间，其余为几种未知杂质(>0.1％)。
实施例2：通过式(II)的睾酮酯的酶促水解来合成式(I)的睾酮–重新进行的现有技术实验(Tetrahedron Letters,28(52),6549-6552,1987，第6551页的表的条目9和10)–使用柱状假丝酵母(Candida cylindracia)(皱褶假丝酵母(C.rugosa))脂肪酶进行的酶促水解
A)使用来自于皱褶假丝酵母(C.rugosa)的脂肪酶(30mg)(购自Sigma-Aldrich编号62316)，将100mg睾酮乙酸酯在3ml的0.1M pH 8磷酸盐缓冲液中试验性水解。在室温下搅拌温育20h后，对转化进行评估，并且睾酮(I)的转化率达到约1.7％。
B)进行类似的试验，其中使用来自于皱褶假丝酵母(Candida rugosa)的脂肪酶(30mg)(购自Sigma-Aldrich编号62316)，将100mg睾酮丙酸酯在3ml的0.1M pH 8磷酸盐缓冲液中试验性水解。在室温下搅拌温育20h后，对转化进行评估，并且睾酮(I)的转化率达到约9％。
这些结果大体上证实了使用现有技术的酶获得的不良结果。
实施例3：通过式(II)的睾酮酯的酶促水解来合成式(I)的睾酮–按照本发明使用来自于南极假丝酵母A(Candida antarctica)A的脂肪酶(CalA)。
A)使用CalA(30mg)(购自Codexis Inc.)，将100mg睾酮庚酸酯在3ml的0.1M pH 8磷酸盐缓冲液中水解。在室温下搅拌温育20h后，对转化进行评估，并且转化率达到约88％。
B)使用CalA(30mg)，将100mg睾酮丙酸酯在3ml的0.1M pH8磷酸盐缓冲液中水解。在室温下搅拌温育20h后，对转化进行评估，并且转化率达到约82％。
实施例4：通过式(II)的睾酮酯的酶促水解来合成式(I)的睾酮–按照本发明使用来自于米曲霉(Aspergillus oryzae)的脂肪酶，特别是51032。
51032是来自于特异腐质霉(Humicola insolens)的角质酶，其中编码所述特异腐质霉(Humicola insolens)角质酶的DNA序列被遗传修饰，并且所述角质酶由米曲霉(Aspergillus oryzae)生产。
A)使用51032(1ml)(购自Novozymes)，将100mg睾酮庚酸酯在3ml的0.1M pH 8磷酸盐缓冲液中水解。在室温下搅拌温育20h后，对转化进行评估，并且转化率达到约64％。
B)使用51032(1ml)，将100mg睾酮环戊丙酸酯在3ml的0.1M pH 8磷酸盐缓冲液中水解。在室温下搅拌温育20h后，对转化进行评估，并且转化率达到约65％。
C)使用51032(1ml)，将100mg睾酮乙酸酯在3ml的0.1M pH 8磷酸盐缓冲液中水解。在室温下搅拌温育20h后，对转化进行评估，并且转化率达到99.13％。睾酮在溶液中并且在该转化阶段的HPLC纯度为99.13％(HPLC A/A％)，其余为残留的睾酮乙酸酯(仅仅0.87％)。
实施例5：通过式(II)的睾酮丙酸酯的酶促水解来合成式(I)的睾酮–按照本发明使用来自于米曲霉(Aspergillus oryzae)的脂肪酶，特别是51032。
使用51032(2.5ml)，将2500mg睾酮丙酸酯在0.1M pH 8磷酸盐缓冲溶液中水解。在下面注明的条件下搅拌6、12、24、32h后，对转化进行评估：
–温度35-70℃
–pH 7.0-10.0
–稀释度(即缓冲溶液的体积)10–40体积
下面的表概述了所述实验性试验的结果：
上表的最后一列清楚地显示了本发明的效果。
实施例6：睾酮丙酸酯的合成
在1升4-RBF中装入150g睾酮、450mL吡啶。
对所述悬液进行搅拌直至完全溶解，然后加入7.5g硅藻土。
将反应混合物在80℃加热30分钟，然后将混合物在硅藻土板上过滤并将滤饼用150mL吡啶洗涤。将该清洗液添加到先前过滤的溶液中。
将全部过滤溶液转移到2升夹套反应器中，然后在25℃下添加4.5g DMAP(4-二甲基氨基吡啶)。
在45分钟内，通过滴加添加91g丙酸酐。
在添加结束后，将溶液在25℃搅拌2小时，然后在25℃下在60分钟内添加1200mL脱矿质水。将所述溶液在滤纸上过滤，并将滤饼用35℃的脱矿质水洗涤。取出滤饼并将其在70℃、在真空下在烤箱中干燥。获得166.5g睾酮丙酸酯。